针对过继性T细胞疗法中的突变MYD88L265P蛋白表位的特异性T细胞受体

本发明涉及免疫疗法
技术领域：
，尤其涉及过继性t细胞疗法或t细胞受体(tcr)基因疗法。本发明提供了一种可编码tcr构建体的至少一个tcrα或β链构建体的核酸，所述tcr构建体能够在对所述肽/hla复合物具有高亲和力的hla-b*07:02的存在下特异性结合seqidno:2的myd88l265p肽。本发明还提供了上述核酸对应的蛋白质和宿主细胞，优选cd8+t细胞，以及所述核酸、蛋白质或宿主细胞的医学用途，特别是在诊断、预防和/或治疗携带myd88l265p突变的癌症中的用途。所述携带myd88l265p突变的癌症例如选自弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)(例如活化b细胞型dlbcl(abc-dlbcl)或原发性cnsdlbcl、皮肤dlbcl、腿型dlbcl或睾丸dlbcl)的非霍奇金b细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lpl)(例如，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(wm))和igm单克隆丙种球蛋白病(igmmgus)。
背景技术：
：b细胞源性肿瘤仍然是西方世界的主要死亡原因之一。预计德国每年约有1500～2000例高等级b细胞淋巴瘤新发病例。其中高达40％的患者在初始标准治疗后会复发，或者根本没有反应，这表明当前迫切需要替代治疗方案。淋巴瘤的发病率随着年龄的增长而急剧增加，对于许多年龄在75岁或以上的患者而言，预后的效果更差。尽管化疗在毒性和耐药性发展方面存在局限性，但其仍是大多数癌症类型的主要治疗选择。多种化疗方案联合靶向cd20b细胞抗原的单克隆抗体利妥昔单抗被广泛用作弥漫性大b细胞淋巴瘤的一线治疗方法，治愈率约为60％。即使采用干细胞挽救的高剂量化疗，在一线治疗后也只能挽救不到三分之一的复发/难治性疾病患者。原发性cns淋巴瘤预后更差：似乎只有高剂量化疗才有疗效，但由于年龄限制和合并症的原因，仅在少数患者中是可行的，因为其在大于70岁的患者中发生频率较高。嵌合抗原受体(car)是能够识别与tcr结构域结合的细胞表面抗原的抗体的抗原结合结构域的嵌合体。经基因工程改造以表达car的t细胞因此靶向表达car结合的抗原的细胞，而不考虑任何hla限制。靶向cd19的cart细胞已被成功的证明可应用于约50％的难治性和复发性dlbcl患者的治疗中，也证明了过继性t细胞疗法的效力。近年来，采用嵌合抗原受体基因转移对抗b细胞抗原cd19的过继性t细胞疗法(att)的临床研究取得了显著成功，被称为“突破性癌症疗法”。大多数研究人员正在这一相同的策略上开发研究，主要是通过靶向b细胞谱系抗原，如cd19、cd20和cd22。然而，通过调节靶抗原的表面表达而发生肿瘤逃逸是该策略的一个主要限制，导致至少50％接受治疗的患者复发，并且其费用高昂。此外，基于car的过继性t细胞疗法只能靶向细胞表面蛋白，而不能靶向细胞内蛋白。尽管比化疗更具特异性，但基于car的att并非真正的具有肿瘤特异性，因为在b细胞定向car-att后，包括恶性和正常b淋巴细胞在内的整个b细胞区室均被清除，这经常导致严重b细胞耗竭从而可能需要长期的免疫球蛋白替代。tcr是免疫球蛋白超家族的异质二聚体细胞表面蛋白，与参与介导信号转导的cd3复合物的不变蛋白相关。tcr以αβ和γδ的形式存在，这两种形式在结构上相似，但具有非常不同的结构位置和可能的功能。天然异质二聚体αβtcr的α链和β链为跨膜蛋白，每个链均包含两个胞外结构域，即膜近端恒定结构域和膜远端可变结构域。每个恒定区和可变区都包含链内二硫键。可变区含有高度多态性的环，类似于抗体的互补决定区(cdrs)。每个tcr链的可变区包括可变段和连接段，在β链的情况下还包括多样性段。每个可变区由嵌入框架序列的三个cdrs(互补决定区)组成，其中一个是名为cdr3的高变区。多种类型的α链可变区(vα)和多种类型的β链可变区(vβ)，通过它们的框架、cdr1和cdr2序列以及部分定义的cdr3序列来区分。特定的trav或trbv编号由imgt命名法赋予vα或vβs。t细胞受体对识别的表位的特异性主要由cdr3区决定(danska等,1990.j.exp.med.172:27-33；garcia等,2005.cell122(3):333-336)。采用过继性tcr基因疗法可使患者自身的t细胞具备所需的特异性，并在短时间内产生足够数量的t细胞，从而避免其衰竭。tcr可转导至所有t细胞或t细胞亚群，如cd8、中枢记忆t细胞或具有干细胞特征的t细胞，这可确保更好的持久性和转移时的功能。可以将tcr工程改造的t细胞输注到癌症患者中，所述癌症患者具有例如通过化疗或放疗导致的淋巴细胞减少，诱导稳态扩增，从而大大增强移植的具有高治愈率的t细胞的植入和长期持久性。与基于car的策略相反，基于tcr的过继t细胞疗法依赖于传统的在mhc分子背景下存在的抗原的加工表位的tcr识别，而非像cars那样依赖于抗体识别。其优点是表面表达对于tcr识别不是必需的，因此，在cars结合时调节表面抗原表达不会造成限制。此外，癌症突变主要发生在调节细胞增殖、存活的胞质内蛋白或对药物和其他调节信号具有敏感性的胞质内蛋白中，而不是发生在表面分子中：t细胞受体可以靶向独立于细胞定位的任何蛋白，从而大大拓宽了可靶向抗原的范围，所述可靶向抗原包括谱系特异性表面抗原(如cars)和真正的肿瘤特异性细胞内抗原。理想情况下，由肿瘤发展过程中获得的体细胞突变衍生得到的癌症特异性突变抗原，即所谓的“新抗原”，是免疫系统识别的最佳可能靶点，因为它们被癌细胞严格表达，这意味着更高的特异性和更低的脱靶毒性。如果潜在的突变导致高亲和力的mhc分子上产生了异常肽，那么携带致癌驱动突变的癌症对于tcr基因疗法仍然是非常有吸引力的(blankenstein等人,2015.curropinimmunol.33:112-119).myd88是一种细胞内衔接蛋白。将myd88中265位亮氨酸变为脯氨酸(l265p)的错义突变是最常见的驱动突变之一，可在约五分之一比例的所有淋巴恶性肿瘤中发现，在侵袭性和治疗耐药性病例中更为常见。所述突变在b细胞淋巴瘤中以高频率发生，例如在弥漫性大b细胞淋巴瘤中，例如活化b细胞型dlbcl(abc-dlbcl)或原发性cnsdlbcl、皮肤dlbcl、腿型dlbcl或睾丸dlbcl；淋巴浆细胞性淋巴瘤(lpl)，例如igm单克隆丙种球蛋白病和约90％的瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(wm)患者(yu等,2018.cancerres.78(10):2457-62；knittel等,2016.blood127(22):2732-2741；rovira等,2016.clincancerres1-10；lee等,2017.scientificreports7:1785)。已经建议将包含myd88l265p突变的肽用于癌症的免疫治疗(专利de102015106731a1,nelde等,2017.oncoimmunology6(3):e1219825)。基于电子预测，nelde等人(2017年)针对多种hlai类限制，确定了含有hla配体的潜在myd88l265p。一组hla-imyd88l265p衍生配体显示可引发针对hla-b*07和hla-b*15的特异性细胞毒性t细胞应答，nelde等人研究讨论了所述肽是否可以天然存在。尼尔森等人(2017.oncommunology6(7):e1321184)通过检测供体t细胞上所有可能的8-、9-、10-和11-mer突变肽的文库，评估了来自健康供体的t细胞对常见驱动突变的识别，如myd88l265p突变。他们在一名供体中发现了针对由hla-b*07:02表示的myd88l265p的肽rpipikyka(seqidno:1，粗体p表示l265p突变)的cd8+t细胞，并发现了所述肽也可在人b细胞中加工的证据。其他肽，特别是较长的肽rpipikykam(seqidno:2)，也可被用该肽脉冲的靶细胞上的供体t细胞识别，但对所述肽有反应的大多数t细胞系未能识别用myd88l265p转染的b细胞。作者因此得出结论，75％的候选肽未能被自然加工，这将使得识别该肽的tcr不适用于t细胞疗法。关于可加工的与seqidno:1的肽反应的剩余t细胞系，nielsen等人讨论了tcr基因疗法的选择，但他们认为，基于表达hla-b*07的患者数量少，tcr工程的实用性是有限的。t细胞未被克隆，也未提供tcr序列。因此，作者建议转向一个可选的靶抗原的扩展列表，这些抗原经常携带淋巴瘤中的推定驱动突变。此外，作者还教导了通过接种将肽用于治疗目的。技术实现要素：有鉴于此，发明人解决了提供有利的tcr构建体的问题，所述tcr构建体能够特异性靶向包含由于b细胞淋巴瘤的驱动基因突变引起的氨基酸取代的肽，所述b细胞淋巴瘤可以被天然加工并存在于hla上，其中，优选的，所述tcr构建体具备允许所述tcr构建体用于治疗用途的高亲和力。这个问题通过权利要求的主题来解决。发明人提供了识别myd88l265p中所述抗原的表位的tcr构建体，即在hla-b*07:02的存在下结合seqidno:2的myd88l265p肽的tcr构建体，所述tcr具有惊人的高亲和力。与尼尔森等人的教导相反，他们还发现可以对myd88l265p进行天然加工以产生存在于hla-b*07:02的存在下的seqidno:2的肽，并且靶向所述肽的t细胞因此可以有利地用于表达myd88l265p的肿瘤的治疗。本发明提供了一种核酸，其中所述核酸编码在hla-b*07:02的存在下能够特异性结合seqidno:2的myd88l265p肽的tcr构建体的至少一个tcrα链或β链构建体，a)其中所述tcrα链构建体包含seqidno:13的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含seqidno:16的cdr3序列；或者b)其中所述tcrα链构建体包含seqidno:23的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含与seqidno:24具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:25具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:26的cdr3序列；或者c)其中所述tcrα链构建体包含seqidno:33的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含seqidno:36的cdr3序列；或者d)其中所述tcrα链构建体包含seqidno:43的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含seqidno:46的cdr3序列，或者e)其中所述tcrα链构建体包含seqidno:93的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含seqidno:96的cdr3序列，或者f)其中所述tcrα链构建体包含seqidno:103的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含seqidno:106的cdr3序列；或者g)其中所述tcrα链构建体包含seqidno:113的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含seqidno:116的cdr3序列；或者h)其中所述tcrα链构建体包含seqidno:123的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含seqidno:126的cdr3序列；或者i)其中所述tcrα链构建体包含seqidno:133的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含seqidno:136的cdr3序列。由于亲和力和特异性可以通过下文描述的本领域已知的方法进一步优化，本发明还提供了一种核酸，其在hla-b*07:02的存在下能够特异性结合seqidno:2的myd88l265p肽的tcr构建体的至少一个tcrα链或β链构建体，a)其中所述tcrα链构建体包含与seqidno:13具有至少90％序列同一性的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含与seqidno:16具有至少90％序列同一性的cdr3序列；或者b)其中所述tcrα链构建体包含与seqidno:23具有至少90％序列同一性的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含与seqidno:24具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:25具有至少90％序列同一性的cdr2序列和与seqidno:26具有至少90％序列同一性的cdr3序列；或者c)其中所述tcrα链构建体包含与seqidno:33具有至少90％序列同一性的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含与seqidno:36具有至少90％序列同一性的cdr3序列；或者d)其中所述tcrα链构建体包含与seqidno:43具有至少90％序列同一性的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含与seqidno:46具有至少90％序列同一性的cdr3序列，或者e)其中所述tcrα链构建体包含与seqidno:93具有至少90％序列同一性的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含与seqidno:96具有至少90％序列同一性的cdr3序列，或者f)其中所述tcrα链构建体包含与seqidno:103具有至少90％序列同一性的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含与seqidno:106具有至少90％序列同一性的cdr3序列；或者g)其中所述tcrα链构建体包含与seqidno:113具有至少90％序列同一性的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含与seqidno:116具有至少90％序列同一性的cdr3序列；或者h)其中所述tcrα链构建体包含与seqidno:123具有至少90％序列同一性的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含与seqidno:126具有至少90％序列同一性的cdr3序列；或者i)其中所述tcrα链构建体包含与seqidno:133具有至少90％序列同一性的cdr3序列，和/或其中所述tcrβ链构建体包含与seqidno:136具有至少90％序列同一性的cdr3序列。优选的tcr构建体的上述e)中的tcrα和/或链构建体可以是包含tcr2304可变区的部分。优选的tcr构建体的上述a)中的tcrα和/或链构建体可以是包含tcr2207可变区的部分。优选的tcr构建体的上述b)中的tcrα和/或链构建体可能是包含tcr2205可变区的部分。需要注意的是在上述b)中的tcrα和/或链构建体的存在下所述tcr2205的β链的cdr3序列，即seqidno:26，已经在先出版在名为“tissuedistributionadclonaldiversityofthetandb-cellrepertoireintype1diabetesinthesupplementarydata,seay等人,2016,jciinsight.1(20):e88242”的文章上。基因的剩余部分尤其在cdr1和cdr2上不同，变体基因亚型和相应的α链序列有所不同。优选的tcr构建体的上述c)中的tcrα和/或链构建体可以是包含tcr1610可变区的部分。优选的tcr构建体的上述d)中的tcrα和/或链构建体可以是包含tcr1605可变区的部分。优选的tcr构建体的上述f)中的tcrα和/或链构建体可以是包含tcr2705可变区的部分。优选的tcr构建体的上述g)中的tcrα和/或链构建体可以是包含tcr2709可变区的部分。优选的tcr构建体的上述h)中的tcrα和/或链构建体可以是包含tcr2716可变区的部分。优选的tcr构建体的上述i)中的tcrα和/或链构建体可以是包含tcr2719可变区的部分。在hla-b*07:02的存在下，本发明的所有tcr构建体都能够特异性结合seqidno:2的myd88l265p肽。发明人可以证明，组织相容性抗原hla-b7:02可以有效地呈现该突变以进行t细胞受体识别，并且它是相对常见的mhc单倍型，在德国人中的出现的频率为15-25％，在北美高加索人中约为30％。本发明的tcr构建体之一，其中所述tcrα链构建体包含与seqidno:13具有至少90％序列同一性的cdr3序列，并且其中所述tcrβ链构建体，例如tcr2207，包含与seqidno:16具有至少90％序列同一性的cdr3序列，其还能够特异性识别9-mer、11-mer和12-mermyd88l265p肽，特别是seqidno:1、seqidno:3或seqidno:4的肽。所述tcr构建体可以特异性识别seqidno:2的肽，特别的，它们不识别seqidno:3的相应myd88野生型肽。优选的，它们也对非myd88l265p自身肽，特别是待接受tcr治疗患者的hla上出现的自身肽没有显著的交叉反应性。本文使用的术语“能够特异性结合”或“识别”或“特异于”给定抗原，是指tcr构建体可以特异性结合和免疫识别所述表位和hla，更优选具有高亲和力。例如，在hla*b07:02的存在下，如果表达tcr的t细胞在与用低浓度的各自肽(例如，约10-11m、10-10m、10-9m、10-8m、10-7m、10-6m、10-5m)脉冲的靶细胞进行共培养(但是具有表位或具有不相关的对照肽表位或seqidno:3的野生型myd88肽)分泌至少约200pg/ml或更多(例如，250pg/ml或更高、500pg/ml或更高、750pg/ml或更高、1000pg/ml或更高、2000pg/ml或更高、2500pg/ml或更高、5000pg/ml或更高)的干扰素-γ(ifnγ)，那么tcr将被认为是可以对seqidno:2的myd88l265p的肽进行特异性结合。上述记载的“特异性”可以采用例如elisa法进行分析。在本发明的背景下，“约”应理解为是指规定值+/-10％，优选+/-5％。亲和力(或亲合力，因为典型的tcr具有两个结合位点)可以通过本领域技术人员熟知的方法进行分析，例如，通过biacore，通过用mhc-肽多聚体染色和分析facs上的平均荧光强度(mfi)，或优选通过ifnγ响应的非线性曲线分析，其中亲和力与kd值成反比，如本文中实施例3或图3a或c所示。具有kd值为10-7mol(m)或更低的tcr亲和力被视为高亲和力。优选的，在整个发明中，由tcr构建体编码的tcr在hla-b*07:02存在下对seqidno:2的肽具有kd值为7.4×10-9m或更低的亲合力，其中亲合力更优选为约2.4×10-9m或更低。这种亲和力已被证明是本发明的具有两个抗原结合位点的tcr构建体(图3a和3c)之间的亲和力。在一个实施方式中，在本发明的核酸中，编码的tcrα链构建体包含与seqidno:91具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:92具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:93的cdr3序列，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:94具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:95具有至少90％序列同一性的cdr2序列以及seqidno:96的cdr3序列。优选的，在本发明的所述核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:97具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:98具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区。所述核酸可包含分别编码所述可变区的seqidno:99和seqidno:100，其代表针对在人细胞中为了表达而密码子优化的核酸。在一个实施方式中，在本发明的核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:11具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:12具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:13的cdr3序列，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:14具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:15具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:16的cdr3序列。优选的，在本发明的所述核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:17具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:18具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区。所述核酸可包含分别编码所述可变区的seqidno:19和seqidno:20，其代表密码子优化的核酸。在一个实施方式中，在本发明的核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:21具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:22具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:23的cdr3序列，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:24具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:25具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:26的cdr3序列。优选的，在本发明的所述核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:27具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:28具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区。所述核酸可包含分别编码所述可变区的seqidno:29和seqidno:30，其代表密码子优化的核酸。在一个实施方式中，在本发明的核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:31具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:32具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:33的cdr3序列，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:34具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:35具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:36的cdr3序列。优选的，在本发明的所述核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:37具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:38具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区。所述核酸可包含分别编码所述可变区的seqidno:39和seqidno:40，其代表密码子优化的核酸。在一个实施方式中，在本发明的核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:41具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:42具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:43的cdr3序列，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:44具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:45具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:46的cdr3序列。优选的，在本发明的所述核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:47具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:48具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区。所述核酸可包含分别编码所述可变区的seqidno:49和seqidno:50，其代表密码子优化的核酸。在一个实施方式中，在本发明的核酸中，编码的tcrα链构建体包含与seqidno:101具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:102具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:103的cdr3序列，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:104具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:105具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:106的cdr3序列。优选的，在本发明的所述核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:107具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:108具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区。所述核酸可包含分别编码所述可变区的seqidno:109和seqidno:110，其代表针对在人细胞中表达而密码子优化的核酸。在一个实施方式中，在本发明的核酸中，编码的tcrα链构建体包含与seqidno:111具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:112具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:113的cdr3序列，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:114具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:115具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:116的cdr3序列。优选的，在本发明的所述核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:117具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:118具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区。所述核酸可包含分别编码所述可变区的seqidno:119和120，其代表针对在人细胞中表达而密码子优化的核酸。在一个实施方式中，在本发明的核酸中，编码的tcrα链构建体包含与seqidno:121具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:122具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:123的cdr3序列，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:124具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:125具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:126的cdr3序列。优选的，在本发明的所述核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:127具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:128具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区。所述核酸可包含分别编码所述可变区的seqidno:129和seqidno:130，其代表针对在人细胞中表达而密码子优化的核酸。在一个实施方式中，在本发明的核酸中，编码的tcrα链构建体包含与seqidno:131具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:132具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:133的cdr3序列，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:134具有至少90％序列同一性的cdr1序列、与seqidno:135具有至少90％序列同一性的cdr2序列和seqidno:136的cdr3序列。优选的，在本发明的所述核酸中，tcrα链构建体包含与seqidno:137具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区，和/或tcrβ链构建体包含与seqidno:138具有至少90％、优选至少95％或100％序列同一性的可变区。所述核酸可包含分别编码所述可变区的seqidno:139和seqidno:140，其代表针对在人细胞中表达而密码子优化的核酸。tcrα链和/或β链构建体可具有图2所示的tcr2304、tcr2207、tcr2205、tcr1610或tcr1605，或tcr2705、tcr2709、tcr2716或tcr2719的特征。在一个实施方式中，本发明的tcr构建体不包含含有trbv28的β链。优选的，本发明的核酸编码tcrα链构建体和tcrβ链构建体。在本发明的背景下，“一个”应理解为表示“一个或多个”，除非另有明确说明。因此，例如，由于本发明的tcr构建体同时含有α链和β链构建体，因此它可以由一个或两个核酸编码。α链和β链构建体一起能够在hla-b*07:02的存在下与myd88l265p肽特异性结合。作为中间产物，所述α链和β链构建体或编码它们的核酸本身也是本发明的主题。优选的，在本发明的所有tcr和/或β链构建体中，与本文定义的cdr区域的序列同一性是100％。然而，基于本发明提供的定义的cdr3和可变区序列，可以进行tcr序列的亲和成熟(chervin等人,2008.jimmunolmethods.339(2):175–84)；robbins等人,2008.jimmunol.180:6116–31)。导致cdr3序列中氨基酸交换的非同义核苷酸的取代，可能导致tcr对靶抗原的亲和力增强。此外，可变tra和trb区域其他部分的tcr序列变化可能会改变tcr对肽-mhc复合物的亲和力。这可能会增加tcr对肽-mhc的总体亲和力，但存在非特异性识别和交叉反应性增加的风险(linette等人,2013.blood122(6):863–72)。优选的，不同于所提供的特异性序列的tcr对所提供的靶抗原保留排他特异性，即，它们不交叉反应，最重要的是，它们对人自身肽不具有交叉反应性。tcr的潜在交叉反应性可以针对带有正确mhc等位基因的细胞上载的已知自身肽进行测试(morgan等人,2013,j.immunother.36,133-151).因此，优选的，表达本发明的tcr构建体的过继转移t细胞对健康组织没有负面影响。本发明的tcrα链和/或β链构建体可包含与其天然配对物对应的所有特征或结构域，但这不是必需的。优选的，tcrα链和/或β链构建体包含至少一个可变区或一个可变区和一个恒定区，所述可变和/或恒定区与人可变或恒定tcr区具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性。对于过继性tcr疗法，优选的是tcr构建体包含全长tcrα链和β链，该链包含可变区、恒定区和跨膜区。优选的，tcr构建体基本上或专门来源于人，以使免疫原性最小化。人tcr和β恒定区是例如显示在seqidno:7(α)和seqidno:10(β、tcrbc2，或者也可以使用tcrrbc1)。然而，为了防止与内源性tcr链配对，本发明的构建体优选含有一个或多个，例如，1-5、1-10或1-20个与人序列相比的氨基酸交换、插入或缺失，例如，提供额外的半胱氨酸以能够形成另外的二硫键(sommermeyer等，2010,j.immunol.184,6223-31).这种tcr的恒定区可以通过用鼠序列替换人恒定区序列的几个氨基酸(通常为9)而被最小程度地“鼠化”(例如，seqidno:6(α)和seqidno:9(β))。tcrα链和β链构建体的恒定区也可以是鼠恒定区(seqidno:5(α)和seqidno:8(β、tcrbc2，或者也可以使用tcrrbc1))。α链和β链恒定区都是相同类型的，例如，两者都可以被最小程度地鼠化。所述构建体也可以是嵌合抗原受体或其一部分，其中，例如，人tcr可变区可以与不同的免疫球蛋白恒定区连接，例如，igg恒定结构域，或能够特异性结合抗原(如cd3t细胞抗原)的抗体结构域。本发明所述的构建体包括单链构建体(sctcr)和异质二聚体tcr构建体。sctcr可以包含第一tcr链构建体的可变区(例如，α链)和整个(全长)第二tcr链(例如，β链)，反之亦然。此外，sctcr可以任选的包含一个或多个将两种或多种多肽连接在一起的接头。所述接头可以是例如将如本文所述的两条单链连接在一起的肽。本发明还提供了与细胞因子融合的本发明的这种sctcr，例如，一种人细胞因子，如il-2、il-7或il-15。本发明的tcr构建体还可以以多聚体复合物的形式提供，其包含至少两个sctcr分子，其中所述sctcr分子各自与至少一个生物素部分融合，并且其中所述sctcr通过生物素-链霉菌(streptamer)相互作用相互连接以形成所述多聚体复合物。本发明还提供了更高级的多聚体复合物，其包含两个以上(例如四个)的sctcr。本发明的tcr构建体可以被修饰以包含可检测的标记，例如放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红蛋白(pe))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和颗粒(例如，金颗粒或磁性颗粒)。本发明的核酸，特别是如果所述核酸编码tcr构建体的至少一个tcrα链和tcrβ链构建体，可以是例如，允许所编码的蛋白质在宿主细胞中表达的载体，例如，人t细胞，例如病毒载体、转座子或适用于基于crispr/cas的重组的载体((legut等人,2018.blood131:311-322；eyquem等人,2017.nature543:113-117；roth等人,2018.nature559:405-409)。在一个实施方式中，载体允许将所述核酸整合到宿主基因组中。优选的，本发明的tcrα链构建体和/或tcrβ链构建体或tcr构建体是载体。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或两者兼有的载体，如质粒和病毒。所述载体可以是适于表达的表达载体，所述表达载体是选自人t细胞或人t细胞前体的宿主细胞，优选人t细胞例如cd8+t细胞，cd8+中枢记忆t细胞，cd8+效应记忆t细胞，cd8+干细胞样t细胞。所述载体可以是病毒载体，例如，逆转录病毒，特别是γ-逆转录病毒或慢病毒载体。合适的表达载体的实例包括逆转录病毒载体mp71。重组表达载体包含调控序列，例如转录和翻译起始和终止密码子、调控非翻译区、核糖体间进入位点，所述调控序列对宿主细胞(例如细菌、真菌、植物或动物细胞，例如，如上定义的人cd8+t细胞)的类型具有特异性，其中载体将被导入该宿主细胞中，并且本发明核酸的表达将在该细胞中进行。此外，本发明的载体可以包括一个或多个标记基因，其允许选择转化或转染的宿主。重组表达载体可包含天然或优选的异源启动子，所述异源启动子可操作地连接到编码本发明所述构建体的核苷酸序列，或连接到与编码本发明构建体的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择包括，例如，强启动子、弱启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育特异性启动子。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子。优选的，它是异源启动子，即，一种在人t细胞中不与tcr天然连接的启动子，如长末端重复启动子，其适用于在人t细胞中表达。本发明的重组表达载体可被设计用于瞬时表达、稳定表达或两者兼有。此外，重组表达载体可被制备用于组成型表达或诱导型表达。本发明还提供了一种蛋白质，即，α或β链构建体，或优选包含α链和β链构建体的tcr受体构建体，其能够将hla-*b07:02与seqidno:2的表位特异性结合。所述蛋白质优选被本发明的核酸编码。优选的，所述蛋白质被宿主细胞表达为跨膜蛋白。本发明还提供了包含本发明的核酸或蛋白的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞，植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即，直接从生物体(例如，人类)分离得到的。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即，悬浮生长的细胞。为了产生重组tcr、多肽或蛋白质，宿主细胞优选为哺乳动物细胞。最优选的，宿主细胞是人细胞。虽然宿主细胞可以是任何细胞类型，可以来源于任何类型的组织，并且可以是任何发育阶段，但是宿主细胞优选是外周血白细胞(pbl)或外周血单核细胞(pbmc)。更优选的，宿主细胞是t细胞或t细胞前体，特别是人t细胞。t细胞可以是任何t细胞，如培养的t细胞，例如，原代t细胞，或来自培养的t细胞系的t细胞，或获得自哺乳动物的t细胞，优选的，它是来自人类患者，特别是来自待治疗的人类患者的t细胞或t细胞前体。自体或异体来源的t细胞可从多种来源获得，如血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或液体。t细胞也可以富集或纯化。优选的，所述t细胞是人t细胞。更优选的，所述t细胞是从人分离的t细胞，例如人类病人。t细胞可以是任何类型的t细胞，但优选为cd8+细胞。它可以是任何发育阶段，包括但不限于肿瘤浸润细胞(tils)、效应细胞、中枢效应细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞等，优选中枢记忆t细胞。本发明的宿主细胞优选包含本发明的核酸和/或本发明的蛋白质，其中所述宿主细胞优选是cd8+t细胞，任选的，人cd8+t细胞。本发明还提供了一种药物组合物，其包含a)本发明的核酸，其中所述核酸编码在hla-b*07:02的存在下能够特异性结合seqidno:2的myd88l265p肽的tcr构建体；或者b)本发明的蛋白质，其中所述蛋白质包含在hla-b*07:02的存在下能够特异性结合seqidno:2的myd88l265p肽的tcr构建体；或者c)本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞可以表达在hla-b*07:02存在下能够特异性结合seqidno:2的myd88l265p肽的tcr构建体。优选的，所述药物组合物包含本文所定义的人cd8+宿主细胞。所述宿主细胞可以包括，例如，编码tcr构建体的载体，所述tcr构建体包含在hla-b*07:02存在下能够特异性识别seqidno:2的肽的tcrα链构建体和tcrβ链构建体。优选的，所述载体是用于在一个核酸上表达α链和β链构建体的表达载体，例如，被p2a元素隔开。本文定义的tcr链的可变区，例如，tcr2304、tcr2207、tcr2205、tcr1610或tcr1605，优选tcr2304，与恒定区连接，优选与最小鼠化的恒定区连接。可选的，也可对患者施用本发明的核酸，特别是表达载体，用于t细胞的体内转导。所述药物组合物也可以是包含其他治疗剂的试剂盒的一部分，例如，抗体如利妥昔单抗、免疫毒素(如奥英妥珠单抗)、或car，其可靶向b细胞谱系抗原(如cd19、cd20、cd22或cd79)的car，优选能够靶向cd19的car、小分子如激酶抑制剂或化疗剂，包括联合化疗和甚至高剂量化疗。所述药物组合物可以与任何上述其他治疗剂联合使用，在所述药物组合物之前、伴随或之后施用。本发明的药物组合物还可以与能够诱导靶肿瘤细胞中的ifnγ表达以增强idno:2的肽的加工的试剂组合在一种组合物或试剂盒中。本发明的药物组合物或本发明的试剂盒可用于疾病的诊断、预防和/或治疗，特别是在怀疑包含表达具有l265p突变的myd88蛋白的细胞的患者中。所述疾病优选为肿瘤疾病，例如一种良性或恶性肿瘤疾病。在一个优选的实施方式中，所述肿瘤细胞已经被证实可以表达myd88l265p和/或hla-b*07:02，特别是两者同时表达。优选的，所述患者患有选自下述的非霍奇金b细胞淋巴瘤：-弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)，优选活化b细胞型dlbcl(abc-dlbcl)或原发性cnsdlbcl、皮肤dlbcl、腿型dlbcl或睾丸dlbcl；-淋巴浆细胞性淋巴瘤(lpl)，优选瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(wm)；和-igm单克隆丙种球蛋白病(igmmgus)。优选的，所述疾病得到治疗。患病风险的降低也被认为是疾病的预防，其中，优选的，受治疗的受试者的风险在比较人群中降低至正常水平以下，优选的，所述风险降低至少10％、至少25％、至少50％或至少75％或100％。本发明还提供了一种治疗患有上述疾病，特别是肿瘤或肿瘤疾病的受试者的方法，包括施用本发明的核酸、蛋白或宿主细胞。优选的，所述受试者是需要这种治疗的受试者，即，病人。优选实施方式中的受试者是患有肿瘤或肿瘤疾病的哺乳动物受试者，优选人患者。活性药物以有效的剂量进行给药。本发明的一个优选药物用途涉及免疫治疗，优选过继性t细胞疗法。本发明的产品和方法特别适用于过继性t细胞疗法。本发明化合物的给药可以包括例如，向所述患者输注本发明的t细胞。优选的，所述t细胞是患者的自体t细胞，其已经被遗传修饰以表达本发明的tcr，例如，其被本发明的核酸进行体外转导。本发明的治疗可以是对患者的一线治疗。优选的，它是对患者的二线治疗，如果患者已经复发或用一种或多种替代药物(例如，小分子抑制剂、化疗、抗体或基于car的治疗，例如针对b细胞谱系抗原如cd19)的疗法很难治愈。本发明的蛋白tcr构建体还可以用于，例如，诊断目的，以查明受试者是否表达myd88l265p，特别是根据seqidno:2的表位是否由hla*b07:02表示。为此，这样的构建体优选被标记以促进检测。优选的，对发现在hla*b07:02上存在所述表位的患者采用本发明的过继性t细胞疗法，或可选地，采用本发明的tcr基因疗法进行治疗。本发明还提供了一种测试人类受试者的方法，例如一种表达myd88l265p的b细胞淋巴瘤患者，所述方法包括接触来自于包含肿瘤细胞的受试者的样品，所述肿瘤细胞例如源自受试者的血液、具有(优选进行标记)本发明的tcr构建体，或具有本发明表达构建体的宿主细胞。所述方法可以进一步包括检测所述标记，通过facs或显微镜方法，或检测所述t细胞的活化，其可以是基于facs的。检测所述t细胞的活化可以包括检测t细胞活化标记如cd137(和任选的，本发明的tcr构建体的表达)，通过facs，检测细胞因子的表达，例如，通过elisa、elispot或基于pcr的方法。所述方法还可以包括将myd88l265p的表达或缺乏表达告知受试者，并且任选的，如果患者表达myd88l265p，则用本发明的药物组合物治疗患者受试者。当然，也可以通过其他方式确定myd88l265p的存在与否，例如，通过测序、基于pcr的方法或基于抗体的方法。本发明还涉及制备本发明的宿主细胞的方法，包括将编码本发明的tcr构建体的表达载体导入合适的宿主细胞，所述宿主细胞优选从患者分离的人cd8+t细胞。然后可以将所述宿主细胞重新引入患者体内。本发明将通过下面的实施例结合参考附图和序列进行进一步说明，然而，本发明不限于此。出于本发明的目的，本文引用的所有参考文献都通过引用的方式整体结合于此。附图说明图1:突变特异性t细胞的产生a.产生突变特异性t细胞的方法学示意图。b.单次再刺激后克隆-10(tcr1610)的代表性链霉菌(streptamer)染色。c.在链霉菌(streptamer)阳性细胞的facs分离之前，通过与载有肽的自体pbmcs共培养过夜，检测了大量t细胞克隆对突变肽的选择性反应性。用ifnγelisa法测定反应。图2:突变特异性t细胞受体(tcrs)的鉴定tcr基因盒的代表性构建体。图3:tcr亲和力分析a./c.当与用hla*b07:02转导并载有不同浓度的突变肽(seqidno:2)的k562细胞共培养时，来自健康供体的tcr转导的cd8+t细胞的ifnγ响应的非线性曲线分析。对突变肽应答的可检测浓度可低至10-4μg/ml，kd值在纳米摩尔(高亲和力)范围内。b./d.对相应野生型(wt)肽(idno:6)的ifnγ反应。突变特异性tcr显示了对突变肽10000倍以上的亲和力。图4:tcr工程化t细胞的突变特异性激活a.经tcr2207转导的t细胞在有或无hla-b7表达的情况下针对k562细胞的突变特异性激活，也可经病毒转导以表达全长野生型或突变体(l265p)myd88，共培养16小时后通过流式细胞术分析显示。b./c.tcr转导t细胞的比较突变特异性激活分析。elisa法测得的ifnγ应答具有突变特异性和hla-b7限制性应答。该表位可由人细胞加工和呈现。图5:tcr工程化t细胞的突变特异性细胞毒性a.与表达本发明tcr的t细胞共培养16小时的hla-b7阳性靶细胞的存活率通过流式细胞术进行分析(显示:3种最高亲和力tcr)。将细胞门控为gfp阳性，作为野生型或突变myd88表达的报告基因，并通过激活的caspase-3(a-caspase-3)的细胞内染色与可固定的死细胞染色相结合来分析生存能力。左下象限提供了存活细胞的数量。b./c.不同tcr转导的t细胞的比较细胞毒性分析的靶细胞的存活率。表达突变和hla*b07:02的靶细胞被tcr转导的t细胞特异性杀死。细胞毒性强度与tcr亲和力密切相关。图6:针对淋巴瘤细胞系的tcr工程化t细胞的突变特异性激活a.在与oci-ly3(abc样dlbcl，纯合子myd88-l265p)和hbl-1(abc样dlbcl，杂合子myd88-l265p)淋巴瘤细胞系共培养16小时后，用2种最高亲和力tcr中的一种转导的t细胞的流式细胞仪活化分析。由于两种细胞系的hla-b7均为阴性，因此对它们进行病毒转导以表达该抗原(显示为:“细胞系_b7”)。用hla-b7转导的oci-ly3细胞被tcr工程化t细胞高度识别。针对杂合突变hbl-1细胞观察到了较弱的应答，当在共培养之前用50ng/ml人ifnγ对靶细胞预处理过夜时，这种应答稍微得到改善，已知这改善了肽的蛋白酶体加工和mhc呈递。b.tcr2304转导的t细胞的突变特异性和hla-b7限制性激活。图7:对淋巴瘤细胞系的突变特异性细胞毒性a.与tcr2304转导的t细胞共培养16小时后，对oci-ly3淋巴瘤细胞进行流式细胞术生存力分析(如图5所示)。b.tcr2304转导的t细胞的突变特异性杀伤力。c.与hla-b7阳性oci-ly3细胞共培养72小时后，tcr2304转导t细胞的抗原诱导增殖。在共培养前用csfe标记t细胞以追踪增殖情况。图8:通过丙氨酸扫描的tcrs的肽-mhc结合行为的表征a.通过用丙氨酸逐一交换突变表位(seqidno:2)中的每个氨基酸进行丙氨酸扫描，以研究单个氨基酸对肽-mhc-tcr关系的影响。将所有肽分别加载到表达hla-b7的k562细胞上，并与tcr转导的t细胞共培养16小时，以通过elisa法测定ifnγ的生产。b.超过50％影响ifnγ反应的氨基酸位置被认为对于肽-mhc-tcr关系是重要的，并且使用在线工具expitope将该结合基序用于靶外交叉反应性预测(jaravine等，2017)。通过该分析对tcr2304具有预测的hla-b7结合的肽(seqidno:141-152)再次装载在表达hla-b7的k562细胞上，并与来自3个不同供体的tcr转导的t细胞共培养16小时。未观察到针对这些肽的交叉反应。图9:a.经过与su-dhl-6(gbc样dlbcl，野生型myd88)oci-ly3(abc样dlbcl，纯合子myd88-l265p)和tmd8(abc样dlbcl，杂合子myd88l265p)淋巴瘤细胞系共培养16小时后，通过ifnγelisa法对tcr2304转导的t细胞进行活化分析。由于所有细胞系对hla-b7均为阴性，因此对它们可以进行病毒转导以表达该抗原(显示为:“细胞系_b7”)。用hla-b7转导的oci-ly3和tmd8细胞被tcr工程化t细胞高度识别。b.与经tcr2304转导的t细胞共培养16小时后，对淋巴瘤细胞进行流式细胞术生存力分析(如图5所示)，结果显示出突变特异性杀伤力。实施例实施例1:突变特异性t细胞的产生pbmcs是从hla-b7阳性的健康供血者血液中分离出来的。通过塑料粘附分离单核细胞以产生树突细胞(dc)，随后用含有800iu/mlgm-csf和10ng/mlil-4的1％人血清的rpmi中培养3天，随后在加入10ng/mllps和50ng/ml干扰素γ(ifnγ)的情况下培养未成熟树突细胞(imdc)过夜以使其成熟。然后成熟树突细胞(mdc)加载上突变肽(rpipikykam，seqidno:2)，并用于引发自体cd8阳性幼稚t细胞(48孔培养板中5×105t细胞/孔，以供体依赖的dc-t细胞比率变化)。10天后，用特定的链霉菌(streptamer)(hla*b07:02-rpipikykam)对每个孔中的细胞进行染色，或在短(～6小时)肽再刺激后对t细胞活化标记物(如cd137(4-1bb))进行染色。用装载肽的自体pbmcs重新刺激阳性染色孔，以进行扩增，在这种情况下，有必要获得足够的细胞用于facs分离。产生突变特异性t细胞的方法学示意图如图1a所示。图1b示出了单次再刺激后，克隆-10(tcr1610)的代表性链霉菌(streptamer)染色情况。在链霉菌(streptamer)阳性或肽反应性细胞的facs分离之前，通过与负载肽的自体pbmcs共培养过夜，检测出了大量t细胞克隆对突变肽的选择性反应性。用ifnγelisa法测定应答(图1c)。实施例2:突变特异性t细胞受体(tcr)的鉴定在用ifnγelisa进行最终检测后，通过facs从每个反应性t细胞克隆中分别分离出活的cd8和链霉菌(streptamer)阳性细胞。进行总rna分离。tcrα和β基因通过5'-racepcr扩增并克隆。对来自于每个tcr链的多个细菌克隆进行测序，以分析t细胞克隆性。表1示出了myd88-l265p突变特异性tcr的cdr3、其序列号和基因亚型，表2示出了cdr1和cdr2的氨基酸序列列表。表1表2将鉴定出的可变结构域与鼠恒定结构域的序列相结合，用于tcr的实验表征，并通过密码子优化进行合成，以在人细胞中表达。由p2a信号分离的编码trbv结合鼠trbc和trav结合trac的tcr基因试剂盒按照obenaus等人(2015)和sommermeyer等人(2010)所详细描述的方法进行构建(参见图2)。实施例3:tcr亲和力分析来自于hla-b7阳性健康供体的外周cd8+t细胞被成功转导以表达突变特异性tcr，无分裂(fratricide)迹象，并与经hla*b07:02转导并负载不同浓度突变肽的k562细胞共培养。用elisa法测定ifnγ反应。图3a/c示出了tcr工程化t细胞对突变肽滴定的ifnγ响应的非线性曲线分析。对突变肽应答的可检测浓度低至10-4μg/ml，kd值在纳米摩尔(高亲和力)范围内。图3b/d示出了对相应的野生型肽滴定的ifnγ响应的非线性曲线分析。突变特异性tcr显示出了对突变肽10000倍以上的亲和力。表3示出了所分析的不同tcr的亲和力。表3:在hla-b*07:02的情况下，tcr对seqidno:2的亲和力(显示为kd)。肽seqidno:2的*分子量为1216.54g/mol。tcrkd(μg/ml)kd(m)*22070.0032.4×10-923040.0032.4×10-922050.0043.2×10-916050.0097.4×10-916100.0097.4×10-922020.0332.7×10-822190.1231×10-713360.3873.1×10-722110.5604.6×10-727050.0201.6×10-827090.1028.3×10-827160.0998.1×10-827190.0241.9×10-8tcr2304和tcr2207对突变肽的亲和力最高，对seqidno:2的kd为0.003g/ml，即等于2.4nm。实施例4:tcr工程化t细胞的突变特异性激活对含有或不含hla-b7的k562细胞进行病毒转导，以表达全长野生型或突变体(l265p)myd88，所述突变体通过p2a偶联至表达标记gfp并用作评估tcr工程t细胞细胞毒性反应性的人工靶细胞。当共培养16小时时，6个tcr实现了表达突变myd88的靶细胞的识别，而无需事先加载肽，这表明该表位可被人细胞成功加工和呈递。图4a通过流式细胞术分析染色活化标记cd137，示出了用tcr之一的tcr2207转导的t细胞的突变特异性活化。图4b/c示出了通过elisa法测量用不同tcr转导的t细胞的比较的突变特异性ifnγ应答，示出了突变特异性和hla-b7限制性应答。实施例5:tcr转导的t细胞的突变特异性细胞毒性在有或无hla-b7的相同启动子控制下，将经tcr转导的t细胞与表达全长野生型或用p2a连接至gfp(作为表达标记)的突变型myd88的k562细胞共培养16小时。表达突变和hla*b07:02的靶细胞被tcr转导的t细胞特异性杀死。图5a显示与表达3种最高亲和力tcr之一的t细胞共培养16小时的hla-b7阳性靶细胞的存活率，其通过流式细胞术进行分析。将细胞门控为gfp阳性，作为野生型或突变myd88表达的报告基因，并通过激活的caspase-3(a-caspase-3)的细胞内染色与可固定的死细胞染色相结合来分析生存能力。图5b/c显示用不同tcr转导的t细胞的比较细胞毒性分析的靶细胞的生存能力。实施例6:针对淋巴瘤细胞系的tcr工程化t细胞的突变特异性激活为了研究tcr工程化t细胞在更类自然的表达水平中抗突变的功能潜力，在与oci-ly3(abc样dlbcl，纯合myd88-l265p)或hbl-1(abc样dlbcl，杂合myd88-l265p)淋巴瘤细胞系共培养16小时后，通过流式细胞术分析了用2种最高亲和力tcr之一转导的t细胞的活化情况。由于两种细胞系对hla-b7均为阴性，因此对它们进行病毒转导以表达该抗原(显示为:“细胞系_b7”)。用hla-b7转导的oci-ly3细胞被tcr工程化t细胞高度识别。针对杂合突变hbl-1细胞观察到较弱的应答，当在共培养之前用50ng/ml人ifnγ对靶细胞预处理过夜时，这种应答略微改善。已知ifnγ可改善肽的蛋白酶体加工和某些情况下的mhc呈递。图6a示出了针对oci-ly3和hbl-1细胞的t细胞应答的流式细胞术分析。图6b示出了用tcr2304转导的t细胞对oci-ly3细胞的突变特异性和hla-b7限制性激活。实施例7:针对淋巴瘤细胞系的突变特异性细胞毒性用tcr2304转导的t细胞用csfe标记，并与含或不含hla-b7的oci-ly3细胞共培养。靶淋巴瘤细胞的存活能力按照前面实施例5中所述进行分析。图7a示出了与经tcr2304转导的t细胞共培养16小时后，有或无hla-b7表达的oci-ly3细胞的存活率。图7b显示tcr2304转导的t细胞对突变特异性淋巴瘤细胞的杀伤作用。图7c示出了与hla-b7阳性oci-ly3细胞共培养72小时后，tcr2304转导的t细胞的抗原诱导增殖，因为csfe荧光强度降低表明细胞分裂仅发生在tcr转导细胞中。实施例8:通过丙氨酸扫描的tcrs的肽-mhc结合行为表征通过用丙氨酸逐一交换突变表位(seqidno:2)中的每个氨基酸进行丙氨酸扫描，以研究单个氨基酸对肽-mhc-tcr关系的影响。将所有肽分别加载到表达hla-b7的k562细胞上，并与tcr转导的t细胞共培养16小时。不同数量和组的氨基酸被观察到并被认为对于不同tcr(结合基序)的识别是必不可少的。然而，反映突变体myd88上氨基酸取代l265p的2位脯氨酸对所有tcr来说是绝对必需的，证明了tcr对突变的特异性(图8a)。作为安全筛选的一部分，使用在线工具expitope(jaravine等人,2017)单独分析了与其他人类蛋白质的结合序列相似性可能引起的交叉反应的可能性。对于tcr2304，该分析显示人蛋白质组中有12种肽具有结合基序相似性(最多5个错配位置)和对hla-b7的不同亲和力预测(seqidno:141-152)。再次将所有这些肽加载到表达hla-b7的k562细胞上，用于与来自3个不同供体的经tcr转导的t细胞共培养。未观察到针对任何肽的tcr识别(图8b)。示例9:为了更好地了解tcr识别和针对天然携带myd88l265p突变的细胞的t细胞功能，将3个不同健康供体的tcr2304转导t细胞与dlbcl细胞系共培养16小时；su-dhl-6(野生型myd88)、oci-ly3(纯合子myd88l265p)或tmd8(杂合子myd88l265p)，有或没有hla-b7表达。图9a示出了hla-b7表达的oci-ly3和tmd8细胞系的突变特异性识别。具有hla-b7的su-dhl-6对照细胞系仅在共培养前加载突变肽时被识别。图9b示出了tcr转导的t细胞对oci-ly3和tmd8细胞系的有效突变特异性和hla限制性杀伤力。sequencelisting<110>柏林夏瑞蒂医科大学<120>针对过继性t细胞疗法中的突变myd88l265p蛋白表位的特异性t细胞受体<130>11731p6821ep<150>ep19152801.7<151>2019-01-21<160>152<170>bissap1.3.6<210>1<211>9<212>prt<213>智人<220><223>myd88l265p9mer<400>1argproileproilelystyrlysala15<210>2<211>10<212>prt<213>智人<220><223>myd88l265p10mer<400>2argproileproilelystyrlysalamet1510<210>3<211>10<212>prt<213>智人<220><223>wtmyd8810mer<400>3argleuileproilelystyrlysalamet1510<210>4<400>4000<210>5<211>136<212>prt<213>小家鼠<220><223>鼠恒定区tcralpha链<400>5ileglnasnprogluproalavaltyrglnleulysaspproargser151015glnaspserthrleucysleuphethrasppheaspserglnileasn202530valprolysthrmetgluserglythrpheilethrasplysthrval354045leuaspmetlysalametaspserlysserasnglyalailealatrp505560serasnglnthrserphethrcysglnaspilephelysgluthrasn65707580alathrtyrproserseraspvalprocysaspalathrleuthrglu859095lysserphegluthraspmetasnleuasnpheglnasnleuserval100105110metglyleuargileleuleuleulysvalalaglypheasnleuleu115120125metthrleuargleutrpserser130135<210>6<211>140<212>prt<213>人工序列<220><223>小鼠最小恒定区-tcralpha链<400>6ileglnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspserlysser151015serasplysservalcysleuphethrasppheaspserglnthrasn202530valserglnserlysaspseraspvaltyrilethrasplysthrval354045leuaspmetargsermetaspphelysserasnseralavalalatrp505560serasnlysseraspphealacysalaasnalapheasnasnserile65707580ileprogluaspthrphepheproserseraspvalprocysaspval859095lysleuvalglulysserphegluthraspthrasnleuasnphegln100105110asnleuservalileglypheargileleuleuleulysvalalagly115120125pheasnleuleumetthrleuargleutrpserser130135140<210>7<211>140<212>prt<213>智人<220><223>人类恒定区-tcralpha链<400>7ileglnasnproaspproalavaltyrglnleuargaspserlysser151015serasplysservalcysleuphethrasppheaspserglnthrasn202530valserglnserlysaspseraspvaltyrilethrasplysthrval354045leuaspmetargsermetaspphelysserasnseralavalalatrp505560serasnlysseraspphealacysalaasnalapheasnasnserile65707580ileprogluaspthrphepheproserproglusersercysaspval859095lysleuvalglulysserphegluthraspthrasnleuasnphegln100105110asnleuservalileglypheargileleuleuleulysvalalagly115120125pheasnleuleumetthrleuargleutrpserser130135140<210>8<211>173<212>prt<213>小家鼠<220><223>鼠恒定区-tcrbeta链mtcrbc2<400>8gluaspleuargasnvalthrproprolysvalserleupheglupro151015serlysalagluilealaasnlysglnlysalathrleuvalcysleu202530alaargglyphepheproasphisvalgluleusertrptrpvalasn354045glylysgluvalhisserglyvalserthraspproglnalatyrlys505560gluserasntyrsertyrcysleuserserargleuargvalserala65707580thrphetrphisasnproargasnhispheargcysglnvalglnphe859095hisglyleuserglugluasplystrpprogluglyserprolyspro100105110valthrgln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