带有金属结合区的复合多肽及其分子构建体的制作方法

1.本发明涉及一种带有金属结合域的复合多肽，且特别是有关于能和锌离子形成复合物的短的寡肽。


背景技术：

2.生物耦合(bioconjugation)技术可用于在生物分子与另一分子(可以是或不是生物分子)的之间形成共价键。生物分子通常是指存在于生物体中且对生物过程至关重要的分子。所述生物分子包括天然和合成的多肽或蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸与代谢产物。
3.将抗体或抗体片段接上毒素(即抗体
‑
毒素复合体(antibody
‑
toxinconjugate，简称atc))、细胞毒性药物(即抗体
‑
药物复合体(antibody
‑
drug conjugate，简称adc))和放射性核素(即抗体
‑
放射性核素复合体(antibody
‑
radionuclide conjugate，简称arc))的概念萌发于1970年代。此类生物耦合物的合成通常涉及耦合反应，例如与表面可接近的赖氨酸、半胱氨酸或酪氨酸残基的耦合，以及对表面可接近的赖氨酸或色氨酸残基或n
‑
和c
‑
端的修饰。然而，在亲本抗体中可能有大量的上述氨基酸残基，且耦合反应通常是随机发生。因此，这种耦合反应缺乏化学选择性且效率不彰，并且经常导致异质产物。例如，对hun901
‑
dm1(美登木素生物碱类
‑
单株抗体免疫复合物)的先前研究显示，以赖氨酸复合的adc样品的药物
‑
抗体比(drug
‑
to
‑
antibody ration，dar)介于0到6之间，且可能包含超过450万种独特的分子。
4.有鉴于此，本领域亟需一种耦合技术，其能够有效率地将功能性元件耦接到生物分子(特别是多肽类分子)上的特定位置。本发明提供了此一需求的解决方案。


技术实现要素：

5.发明内容旨在提供本公开内容的简化摘要，以使阅读者对本公开内容具备基本的理解。此发明内容并非本公开内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施方式的重要/关键元件或界定本发明的范围。其唯一目的是以一种简化的形式呈现本文所公开的一些概念，作为稍后呈现的实施方式的序言。
6.本发明一实施方案是有关于一种金属结合域，其能够在适当条件下与锌离子形成复合物。
7.根据本公开内容一实施方式，所述金属结合域包含以下氨基酸序列：cx1x2ha(seq id no：1)，由n
‑
端至c
‑
端或由c
‑
端至n
‑
端，其中x1为甘氨酸或脯氨酸、x2为甘氨酸或丙氨酸，且所述金属结合域位于亲本多肽的n
‑
或c
‑
端。所述金属结合域的例示性实施例包括但不限于：cggha(seq id no：2)、cpgha(seq id no：3)、cgaha(seq id no：4)、cpaha(seq id no：5)、gcggha(seq id no：6)、acpgha(seq id no：7)以及gcpgha(seq id no：8)。
8.在另一种实施方案中，本公开内容是关于一种复合多肽，其包含如上述实施方案/实施方式所述的金属结合域。所述复合多肽因此能够在适当的条件下，透过该金属结合域和金属离子形成复合物。如此一来，与金属离子形成复合物的半胱氨酸残基中的硫氢基比
起没有和金属离子形成复合物的半胱氨酸残基中的硫氢基有更强的反应性。当可理解，所述复合物可以和另外一个化学式或生物分子以位置专一性的方式进行化学耦合，以得到一生物耦合物。
9.根据本公开内容一实施方式，所述复合多肽包含一亲本多肽以及位于亲本多肽n
‑
或c
‑
端的一金属结合域。在某些可任选的实施例中，在亲本多肽与金属结合域间有1到10个作为中间序列的甘氨酸残基，然而在其他实施例中，此处提出的金属结合域是直接位于上述亲本多肽之前或之后。
10.在又一种实施方案中，可将一或多个功能性元件共价耦接至本公开内容上述实施方案/实施方式所提出的复合多肽，此一反应是透过所述复合多肽的金属结合域中半胱氨酸残基的硫氢基(sh)来进行，因而可得到一分子构建体(或生物耦合物)。
11.根据本公开内容视需要而采用的实施方式，所述sh
‑
反应性基为顺丁烯二酰亚胺基、碘乙酰基、溴乙酰基、乙烯砜基、单砜基、甲磺酰基苯并噻唑基或2
‑
吡啶基二硫醇基。
12.在某些视需要而采用的实施方式中，所述复合多肽呈二聚体形式；举例来说，所述复合多肽可包含fc区域、f(ab’)2或抗体的一部分。在这些情形中，每一复合多肽链可具有一个与其耦接的功能性元件。
13.根据本公开内容多个实施方式，所述功能性元件为小分子实体，其能够引致所欲的治疗效果。举例来说，所述小分子实体可以是细胞毒性药物、类铎受体(toll
‑
like receptor，tlr)促效剂或与一放射性核种复合的螯合剂。或者是，所述功能性元件为能够改变亲本多肽或分子构建体整体的药动学特性的脂肪酸链。
14.又或者是，所述功能性元件可以是接合单元(又称为“分子束“)的形式。根据某些本公开内容的实施方式，所述接合单元包含一中心核及复数个标的元件、效应元件或药动学元件。
15.具体来说，所述中心核包含2至10个赖氨酸(k)残基。任两个k残基彼此相邻或由一填充物所隔开。在某些例子中，有一sh
‑
反应性基透过与其形成酰胺键而连接于中心核的第一个或最后一个k残基。在其他例子中，上述中心核还包含一末端间隔物，且所述sh
‑
反应性基透过与其形成酰胺键而连接到末端间隔物的末端氨基酸残基。所述末端间隔物可以是连接到第一个k残基n
‑
端的n
‑
端间隔物，或连接到最后一个k残基c
‑
端的c
‑
端间隔物。上述填充物与末端间隔物彼此独立地至少包含：(1)1至12个非k氨基酸残基，或(2)具有2至12个乙二醇(ethylene glycol，eg)重复单元的一聚乙二醇化氨基酸(pegylated amino acid)。
16.根据本公开内容某些实施方式，中心核在与sh
‑
反应性基连接的氨基酸残基或其邻近处带有局部负电荷。举例来说，所述局部负电荷出现在从与sh
‑
反应性基连接的氨基酸残基起算的前5至15个氨基酸残基处。具体来说，所述局部负电荷出现在从与sh
‑
反应性基连接的氨基酸残基起算的前5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基中。可利用一或多个在ph＝7带有负电荷的氨基酸残基(譬如天冬氨酸(d)及谷氨酸(e)残基)来形成所述局部负电荷。或者是，可将中心核和复数个带负电的效应元件耦接。
17.在一些例子中，每一标的元件、效应元件或药动学元件透过与k残基的ε
‑
氨基形成酰胺键而连接到中心核的k残基。在另一些例子中，所述分子构建体还包含2至10个连接臂，其中每一连接臂的一端透过与中心核的k残基的ε
‑
氨基形成酰胺键而连接至该中心核的k残基，且每一连接臂的另一端连接至每一标的元件、效应元件或药动学元件。举例来说，所
述连接臂可以是包含2
‑
12个非k氨基酸残基的一多肽、或是具有2至24个eg重复单元的一聚乙二醇化氨基酸链。
18.根据本公开内容的一些实施方式，上述复合多肽可作为一标的元件，其能够将分子构建体导引至目标部位或提升分子构建体在目标部位的相对量。在这些情形中，所述接合单元(或分子束)可携有复数个效应元件，譬如上文所述的小分子实体。
19.根据本公开内容的一些实施方式，上文所述的复合多肽可作为一效应元件，其能够在个体体内招致所欲的治疗效果。在这些情形中，所述接合单元(或分子束)可携有复数个药动学元件，譬如c8
‑
28脂肪酸衍生物或c8
‑
28二元脂肪酸衍生物，以改变或最佳化分子构建体或复合多肽在个体体内的药动学行为。根据本公开内容多种实施方式，k残基的ε
‑
氨基与c8
‑
28脂肪酸衍生物或c8
‑
28二元脂肪酸衍生物连接。上述脂肪酸分子能够和血清白蛋白结合，因此能够改善经修饰的亲本多肽在活体内的动力学特性。
20.本公开内容的范围亦涵盖上文所述的接合单元，其能够与此处提出的复合多肽形成一分子构建体。
21.在又另一实施方案中，本公开内容是关于一种接合单元，其能够携带复数个如本公开内容上文实施方案/实施方式所述的复合多肽。根据本公开内容的实施方式，所述接合单元有共价连接到中心核的复数个复合多肽，且因此称为多肽束。
22.根据某些本公开内容的实施方式，此处提出的接合单元包含一中心核及复数个连接臂。
23.具体来说，所述中心核包含2至10个赖氨酸(k)残基。任两个k残基彼此相邻或由一填充物所隔开。在某些例子中，有一复合基透过与其形成酰胺键而连接在中心核的第一个或最后一个k残基。复合基的实例包括但不限于：叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基及环辛炔基。在其他例子中，上述中心核还包含一末端间隔物，且所述sh
‑
反应性基透过与其形成酰胺键而连接到末端间隔物的末端氨基酸残基。所述末端间隔物可以是连接到第一个k残基n
‑
端的n
‑
端间隔物，或连接到最后一个k残基c
‑
端的c
‑
端间隔物。上述填充物与末端间隔物彼此独立地至少包含：(1)1至12个非k氨基酸残基，或(2)具有2至12个eg重复单元的一聚乙二醇化氨基酸。
24.根据一些实施方式，每一连接臂的一端透过与中心核的k残基的ε
‑
氨基形成酰胺键而连接至该中心核的k残基，且每一连接臂的另一端连接至每一标的元件、效应元件或药动学元件。举例来说，所述连接臂可以是包含2
‑
12个非k氨基酸残基的一多肽、或是具有2至24个eg重复单元的一聚乙二醇化氨基酸链。
25.根据本公开内容的一些实施方式，所述接合单元更包含2至10个如上述实施方案/实施方式所述的复合多肽以及一功能性元件。每一复合多肽透过sh
‑
反应性交联化学耦接至金属结合域中半胱氨酸残基的硫醇基。
26.根据本公开内容某些视需要而采用的实施方式，每一连接臂在与sh
‑
反应性基连接的氨基酸残基或其邻近处带有局部负电荷。具体来说，所述局部负电荷出现在从与sh
‑
反应性基连接的氨基酸残基起算的前5至15个氨基酸残基处。举例来说，所述局部负电荷出现在从与sh
‑
反应性基连接的氨基酸残基起算的前5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基中。可利用一或多个在ph＝7带有负电荷的氨基酸残基(譬如天冬氨酸(d)及谷氨酸(e)残基)来形成所述局部负电荷。
27.在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中技术人员当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施实施方案。
附图说明
28.为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施方式能更明显易懂，所附图式的说明如下。
29.图1为根据本发明一实施例，mal
‑
多肽1中心核的maldi
‑
tof分析结果；
30.图2为根据本发明一实施例，mal
‑
多肽2
‑
dota束的结构；
31.图3a为mal
‑
多肽2
‑
dota束的反相分析级hplc冲提图谱；
32.图3b为根据本发明一实施例，mal
‑
多肽2
‑
dota束的maldi
‑
tof分析结果；
33.图4a为根据本发明一实施例，重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的结构；
34.图4b为根据本发明一实施例，重组双链(v
l
‑
v
h scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的还原sds
‑
page分析结果；
35.图5为根据本发明一实施例，重组双链(v
l
‑
v
h scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
2的非还原sds
‑
page分析结果；
36.图6为根据本发明一实施例，重组双链(v
l
‑
v
h scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
3的非还原sds
‑
page分析结果；
37.图7a为根据本发明一实施例，抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
1或抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
2的还原sds
‑
page分析结果；
38.图7b为根据本发明一实施例，抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
1或抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
2的还原sds
‑
page分析结果；
39.图8为根据本发明一实施例，四种(scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm分子构建体的非还原sds
‑
page分析结果；
40.图9为根据本发明一实施例，v
l
‑
v
h
及v
h
‑
v
l
两种组态的重组(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的非还原sds
‑
page分析结果；
41.图10a为根据本发明一实施例，重组双链(v
h
‑
v
l scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
2的非还原sds
‑
page分析结果；
42.图10b为根据本发明一实施例，重组双链(v
l
‑
v
h scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
3的非还原sds
‑
page分析结果；
43.图11a为根据本发明一实施例，重组双链(v
l
‑
v
h scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的非还原sds
‑
page分析结果；
44.图11b为根据本发明一实施例，重组双链(v
l
‑
v
h scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
2的非还原sds
‑
page分析结果；
45.图12a为根据本发明一实施例，重组双链(v
l
‑
v
h scfvαcc38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的非还原sds
‑
page分析结果；
46.图12b为根据本发明一实施例，重组双链(v
l
‑
v
h scfvαcc38)
‑
fc
‑
mbm
‑
2的非还原sds
‑
page分析结果；
47.图13a为根据本发明一实施例，重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的结构；
48.图13b为根据本发明一实施例，重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的非还原sds
‑
page分析结果；
49.图14为根据本发明一实施例，重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
2 x 2 dota束的非还原sds
‑
page分析结果；
50.图15为重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
3 x 2 dota束的非还原sds
‑
page分析结果；
51.图16为根据本发明一实施例，全长抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的还原sds
‑
page分析结果；
52.图17为根据本发明一实施例，全长抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
2 x 2 dota束的还原sds
‑
page分析结果；
53.图18为根据本发明一实施例，重组双链(scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的非还原sds
‑
page分析结果；
54.图19为根据本发明一实施例，重组双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的非还原sds
‑
page分析结果；
55.图20为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的阴离子交换管柱fplc冲提图谱；
56.图21为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束以阴离子交换管柱处理收集的馏份的sds
‑
page分析结果；
57.图22为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束以阴离子交换管柱处理收集的馏份的sds
‑
page分析结果；
58.图23为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的maldi
‑
tof分析结果；
59.图24为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2螯合
89
y
3+
离子的dota束的maldi
‑
tof分析结果；
60.图25为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2螯合
175
lu
3+
离子的dota束的maldi
‑
tof分析结果；
61.图26为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 111
in标记的dota束的放射化学纯度的tlc分析结果；
62.图27为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 111
in标记的dota束以蛋白免疫印迹进行的安定性分析结果；
63.图28a至图28d为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的染色分析结果；
64.图29为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束以sds
‑
page进行的安定性分析结果；
65.图30为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束以tlc分析进行的安定性分析结果；
66.图31为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的半衰期；
67.图32为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束
对表达cd1
‑
的异种移植肿瘤的目标效果；
68.图33为根据本发明一实施例，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束在表达cd1
‑
的异种移植肿瘤的生物分布分析结果；
69.图34为根据本发明一实施例，aib
‑
glp
‑
1促效剂
‑
cys的概要结构式；
70.图35为根据本发明一实施例，cys
‑
体抑素多肽的概要结构式；
71.图36为根据本发明一实施例，cys
‑
体抑素多肽的maldi
‑
tof/tof分析结果；
72.图37为根据本发明一实施例，cys
‑
psma配体的概要结构式；
73.图38为根据本发明一实施例，cys
‑
psma配体的esi
‑
ms分析结果；
74.图39为根据本发明一实施例，降钙素
‑
mbm
‑
1的概要结构式；
75.图40为根据本发明一实施例，mal
‑
多肽3
‑
来那度胺束的概要结构式；
76.图41为根据本发明一实施例，mal
‑
多肽3
‑
来那度胺束的esi
‑
ms分析结果；
77.图42为根据本发明一实施例，mal
‑
多肽4
‑
来那度胺束的概要结构式；
78.图43为根据本发明一实施例，mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束的概要结构式；
79.图44为根据本发明一实施例，mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束的esi
‑
ms分析结果；
80.图45为根据本发明一实施例，3
‑
dota臂接合单元的概要结构式；
81.图46为根据本发明一实施例，3
‑
dota臂接合单元的esi
‑
ms分析结果；
82.图47为根据本发明一实施例，mbm
‑1‑
il
‑
2的sds
‑
page分析结果；
83.图48为根据本发明一实施例，双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束的sds
‑
page分析结果；
84.图49为根据本发明一实施例，体抑素多肽x脂肪酸束的概要结构式；
85.图50a为根据本发明一实施例，aib
‑
glp
‑
1促效剂x脂肪酸束的概要结构式；
86.图50b为根据本发明一实施例，特立帕肽
‑
mbm
‑
1 x脂肪酸束；
87.图51a为根据本发明一实施例，亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3 x脂肪酸束的概要结构式；
88.图51b为根据本发明一实施例，亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3 x脂肪酸束的maldi
‑
tof分析结果；
89.图52a为根据本发明一实施例，3
‑
dota臂接合单元x 3 psma配体的概要结构式；
90.图52b为根据本发明一实施例，3
‑
dota臂接合单元x 3 psma配体的esi
‑
ms分析结果；
91.图53为根据本发明一实施例，纯化双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的sds
‑
page分析结果；
92.图54为根据本发明一实施例，纯化双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束的sds
‑
page分析结果；
93.图55为根据本发明一实施例，纯化双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束的maldi
‑
tof分析结果；
94.图56a及图56b为根据本发明一实施例，亲本抗
‑
cd38 higg1.fc抗体以及双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束的半衰期；
95.图57a到图57c为根据本发明一实施例，双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束的目标效果；以及
96.图58a及图58b为根据本发明一实施例，双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺
束的adcc效果。
具体实施方式
97.为了使本公开内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施实施方案与具体实施方式提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施方式的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施方式的特征以及用以建构与操作这些具体实施方式的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施方式来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
98.为了便于说明，此处整理了说明书、实施例与附随申请专利范围中所用的某些词汇。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中技术人员所理解与惯用的意义相同。
99.在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。此外，在本说明书与申请专利范围中，“至少一”与“一或更多”等表述方式的意义相同，两者都代表包含了一、二、三或更多。相似地，“至少二”一词则代表包含了二、三、四或更多。更有甚者，在本说明书与申请专利范围中，“a、b及c其中至少一者”、“a、b或c其中至少一者”以及“a、b和/或c其中至少一者”是指涵盖了仅有a、仅有b、仅有c、a与b两者、b与c两者、与c两者、以及a、b与c三者。
100.虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施方式中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中技术人员的考量而定。除了实施例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所公开的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一段点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。
101.在此处，“标的元件(targeting element)”一词是指分子构建体能够直接或间接结合到一目标标的(如，一细胞表面上的受体或一组织中的蛋白质)的部分，因而能够协助将本发明分子构建体递送到目标标的。在某些例子中，标的元件可将所述分子构建体导引至邻近目标细胞处。在其他情形中，标的元件可专一地结合到目标细胞表面上的分子；或标的元件可和第二分子专一地结合，而此一第二分子能够专一地结合到目标细胞表面上的分子。在某些例子中，一旦标的元件与目标对象接合之后，标的元件可将本发明分子构建体内化，而使其移动到目标细胞的细胞质内。标的元件可以是细胞表面受体的抗体或配体；或者是可和上述抗体或配体结合的分子，因而能够间接地将本发明分子构建体标的到目标部位(譬如所选定的细胞表面)。相较于没有标的功能的治疗药物，利用本发明分子构建体能够加强或有利于效应元件(治疗药剂)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一种程度或相对的比例，而不是让效应元件在疾病部位绝对或完全的局部化。
102.根据本发明，“效应元件(effector element)”一词是指一旦分子构建体到达目标部位后，所述分子构建体中能够发挥生物活性(譬如，诱发或压抑免疫活性、发挥细胞毒性、抑制酵素活性及与其相似者)或其他功能活性(譬如招募免疫细胞或其他治疗用分子)的部分。“效应”可指治疗性或诊断性的效果。效应元件包含能够和细胞和/或细胞外免疫调节因子结合的元件。上述效应元件包含如蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、糖蛋白、药物部分(包含小分子药与生物制剂)、化合物元素及同位素等物质，也包含上述物质的片段。
103.根据本发明，所述“药动学元件”是指能够改变分子构建体至少一种以下特征的元件：溶解度、清除率、半衰期与生物可用性。举例来说，所述药动学元件可以是分子量介于约20,000至50,000道尔顿的长peg链。或者是，所述药动学元件可包含c8
‑
28脂肪酸链或c8
‑
28二元脂肪酸链。
104.本公开内容所述的“生物耦合物”是指包含此处提出的复合多肽以及一或多个功能性元件的分子构建体。
105.虽然在此处利用“第一”、“第二、“第三”等词汇来描述多种元件、部件、区域和/或区段，这些元件(以及部件、区域和/或区段)不受上述修饰词的限制。此外，除非上下文有明示的说明，使用这些序数并未隐含序列或顺序。反之，这些词汇仅是用来区分各元件。因此，亦可将下文所述的第一元件命名为第二元件，而不会悖离例示性实施方式所公开的内容。
106.在此处，“连接(link)”、“耦接(couple)”以及“复合(conjugate)”等词可互换使用，且都是用来指称透过直接或间接的连接关系，将两个元件连接在一起。
[0107]“多肽(polypeptide)”一词在此是指具有至少两个氨基酸残基的聚合物。一般来说，多肽包含2到200个氨基酸残基；在较佳的情形中，是2到50个残基。在本说明书中所提及的氨基酸序列涵盖了此种序列的l
‑
、d
‑
或β
‑
氨基酸等形式。多肽亦包括氨基酸聚合物，其中有一或多个氨基酸残基是与一天然氨基酸相应的人工化学类似物，当然也包括天然产生的氨基酸聚合物。此外，此一词汇亦涵盖以多肽链或其他方式连接的氨基酸，上述其他方式如经修饰的连接(modified linkage)，譬如以α
‑
酯(α
‑
ester)、β
‑
酯(β
‑
ester)、硫酰胺(thioamide)、磷酰胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羟基酯(hydroxylate)键、以及与其相似者来取代多肽键。
[0108]
在一些实施方式中，本发明范围亦涵盖了其他相较于所述序列具有保守性置换的蛋白。在多种实施方式中，有一、二、三、四或五个不同的残基经过置换。在此处，“保守性置换(conservative substitution)”一词是指所述氨基酸置换不会明显地改变分子活性(譬如生物或功能活性和/或专一性)。一般来说，保守性氨基酸置换是利用另一种具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的氨基酸来取代某一氨基酸。某些保守性置换包括“类似物置换”，亦即以非标准(如罕见或合成等)氨基酸来取代标准氨基酸，而上述非标准氨基酸和被取代的原有氨基酸之间的差异极小。可由标准氨基酸经人工修饰而在不会大幅改变原有氨基酸结构的前提下，得到所述的氨基酸类似物，譬如异构物或代谢前驱物等。在本公开内容中，认为以下氨基酸残基分属四种独特的氨基酸类别：(1)离氨酸，其侧链带有氨基；(2)半胱氨酸，其侧链带有硫醇基；(3)丝氨酸与苏氨酸，其侧链带有羟基；以及(4)天冬氨酸与谷氨酸，其侧链带有羧基。这四大类氨基酸的侧链各自带有独特的官能基，可以用来和不同的化学成分复合。也可使用带有此类官能基的非天然氨基酸，以达到类似目的。应注意到，天冬氨酸或谷氨酸的羧基可和一元件的氨基反应而形成酰胺键。此反应化学类似离氨酸残基
的氨基和带有羧基的元件间的酰胺键形成反应。因此，可利用天冬氨酸或谷氨酸残基来取代中心核中的离氨酸残基，而第一元件则同样可透过形成酰胺键的相同反应化学而与中心核连接。
[0109]
在一些实施方式中，本案的范围亦涵盖和任何所述序列具有至少80％序列相似度的任何序列，上述序列相似度较佳为至少85％或90％、更佳为至少95％或98％。
[0110]
此处针对多肽序列所述的“氨基酸序列相似度百分比(percentage(％)amino acid sequence identity)”是指候选序列的氨基酸残基与参考多肽序列的氨基酸残基完全相同的百分比；在进行上述比对时，可将所述的候选多肽片段与所述的特定多肽片段并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在计算相似度时，保守性置换的氨基酸残基视为不同的残基。相关领域已有多种方法可用以进行上述并排，譬如可公开取得的软体如blast、blast
‑
2、align或megalign(dnastar)等。本发明所属技术领域中技术人员在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，二多肽序列间的序列比较是采用美国国家生物科技资讯中心(nationcenter for biotechnology information，ncbi)所提供的蛋白质
‑
蛋白质blast分析资料库blastp来进行。候选多肽序列a相较于参考多肽序列b的氨基酸序列相似度(在本说明书中也称为多肽序列a与多肽序列b具有特定百分比(％)的氨基酸序列相似度)的计算方式如下：
[0111][0112]
其中x是利用blast序列并排程式对序列a、b进行排列后所得到的相同氨基酸残基数目(identical matches)，而y是a、b二序列中较短者的氨基酸残基总数。
[0113]“聚乙二醇化氨基酸(pegylated amino acid)”一词在此是指带有一个氨基(amino group)与一个羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)链。一般来说，聚乙二醇化氨基酸的结构式为nh2‑
(ch2ch2o)
n
‑
cooh。在本公开内容中，n值介于1到20之间；较佳是介于2至12。
[0114]“复合部分(conjugating moiety)”一词带有一或多个功能基的分子，所述功能基具有化学反应性，且能够和其他化学单元共价连接。所述功能基的非限制性实施例包括：羧基、羰基、羟基、硫醇基、氨基、三级丁基二甲硅基(tert
‑
butyldimethylsilyl，tbdms)、n
‑
羟基琥珀酰亚胺(n
‑
hydroxysuccinimidyl，nhs)基、sh
‑
反应性基(如，顺丁烯二酰亚胺基、卤代乙酰基、砜基或吡啶基二硫基)、碘基(iodo)、碘乙酰胺基(iodoacetamide)、叠氮基、炔基、环辛炔基、四嗪基、环辛烯基与环辛炔基。根据本公开内容的实施方式，此处提出的接合单元的复合部分具有两个功能基，其中一个是羧基或氨基，此一功能基用以和间隔物的α
‑
氨基或羧基形成酰胺键，而使复合部分接合到间隔物的n
‑
端或c
‑
端；而另一个则是sh
‑
反应性基，用以透过sh
‑
反应性交联化学和第二元件接合。
[0115]
在此处一多肽的“端”是指位于该多肽n
‑
端或c
‑
端点的氨基酸残基。在描述一聚合物(譬如此处所述的聚乙二醇)的组成单元时，“端”则是指在聚合物骨架末端的部分。在本说明书与申请专利范围中，“自由端”一词是用来指称并未与另一个分子形成化学键结的末端氨基酸残基或构成单元。
[0116]“抗原(antigen或ag)”一词是指能够导致免疫反应的分子。此种免疫反应可能涉及分泌性(secretory)、荷尔蒙性(humoral)和/或细胞级(cellular)的抗原专一反应。在本
公开内容中，“抗原”一词是指蛋白质、多肽(包括其突变株或具有生物活性的片段)、多糖、糖蛋白、脂多糖、核酸或上述的组合。
[0117]
在本说明书与申请专利范围中，“抗体(antibody)”一词应以广义方式解释，且包含完整组装的抗体、可和抗原结合的抗体片段，譬如抗原结合片段(fab/fab’)、f(ab’)2片段(具有彼此以双硫键连接的两个fab部分)、可变片段(variable fragment，fv)、单链可变片段(scfv)、双单一性单链可变片段(bi
‑
scfv)、奈米抗体(nanobodies；亦称为单域抗体(single
‑
domain antibodies，sdab))、单抗体(unibodies)以及双体抗体(diabodies)。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，较佳为包括完整抗体的抗原结合区域或可变区域。抗体片段可包含一对scfv，其连接于源自于人类γ4或γ1免疫求蛋白的成对ch2
‑
ch3区段的n
‑
或c
‑
端。在典型的例子中，“抗体”是指实质上由免疫球蛋白基因或其片段所编码的一或多种多肽所组成的蛋白质。习知的免疫球蛋白基因包括κ(kappa)、λ(lambda)、α(α)、γ(gamma)、δ(gamma)、ε(epsilon)与μ(mu)等恒定区基因(constant regiongene)、以及无数的免疫球蛋白可变区基因(variable region genes)。轻链通常归类为κ(kappa)或λ(lambda)。重链通常归类为γ(gamma)、μ(mu)、α(α)、δ(gamma)或ε(epsilon)，基于这些结构，定义出了以下类型的免疫球蛋白：igg、igm、iga、igd以及ige。典型的免疫球蛋白抗体结构是一种四聚物(tetramer)。每一个四聚物是由两条相同的多肽链所组成，且每一对分别有一“轻”链(约25kda)与一“重”链(约50
‑
70kda)。每一链的n
‑
端界定了一个可变区域，包含约100至110个或更多的氨基酸，其主要负责抗原辨识。可变轻链(variable light chain，v
l
)与可变重链(variable heavy chain，v
h
)等词就是分别指上述的轻链与重链。根据本公开内容的实施方式，可藉由改变天然抗体或利用重组dna方式重新合成上述抗体片段。在本公开内容一些实施方式中，上述抗体和/或抗体片段可具有双专一性，且可有多种不同的构形。举例来说，双专一性抗体可包含二个不同的抗原结合部位(可变区域)。在多种实施方式中，可利用融合瘤技术或重组dna技术来制备双专一性抗体。在一些实施方式中，双专一性抗体对至少两种不同的表位(epitope)有结合专一性。在许多运用抗体片段的分子构型中，可使用拟抗体(antibody mimetics)来取代片段，此种拟抗体可结合至与抗体片段相同的抗原成分。拟抗体包含模拟抗体(anticalins)、预设计锚蛋白重复蛋白(darpins)、亲和体(affibodies)、结合蛋白(fynomer)、锚蛋白(ankyrins)、高亲和力多聚体(avimers)及其他类似物。
[0118]“专一地结合(specifically bind)”一词在此处是指抗体或其抗原结合片段能够和抗原结合的能力，上述结合的解离常数(dissociation constant，kd)小于约1
×
10
‑6m、1
×
10
‑7m、1
×
10
‑8m、1
×
10
‑9m、1
×
10
‑
10
m、1
×
10
‑
11
m或1
×
10
‑
12
m；或者是或额外地，相较于其对于非专一性抗原的结合亲和力，上述抗体或其抗原结合片段与抗原结合的亲和力为两倍以上。
[0119]“治疗(treatment)”一词是指预防性(如，预防用药)、疗愈性或缓和性的处置，藉以达到所欲的药学和/或生理学效果；而治疗的行为在此包括上述预防性、疗愈性或缓和性的处置。具体来说，治疗在此是指对于可能患有一医疗疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常、或易于罹患一疾患的个体施用或投予本发明分子构建体或包含此分子构建体的药学组合物，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻特定异常和/或病症的一或多种症状或特征，或是延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对尚未表出现疾病、异常和/或病症征兆的个体和/或出现早期征兆的个体进行治疗，以期降低发展出与该疾病、
异常和/或病症相关的病理变化的风险。
[0120]
在此处，“有效量(effective amount)”一词是指本发明分子构建体的用量足以招致所欲的治疗反应。药剂的有效量不必然能够治愈疾病或病症，但能够延缓、阻碍或防止该疾病或病症的发生，或是可缓减与疾病或病症相关的病征。可将治疗有效量可分成一、二或更多剂，而以适当的剂型在指定期间内施用一次、二次或更多次。具体的治疗有效量取决于多种因素，例如欲治疗的特定状况、个体的生理条件(如，个体体重、年龄或性别)、接受治疗的个体类型、治疗持续时间、并行治疗(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将治疗有效量表示成活性成分的总重量，譬如以克、毫克或微克来表示；或表示成活性成分重量相对于体重的比例，譬如表示为每公斤体重若干毫克(mg/kg)。
[0121]
所述“施用(application)”与“投予(administration)”等词在此可交替使用，其是指将本发明的分子构建体或药学组合物提供给需要治疗的个体。
[0122]“个体(subject)”或“患者(patient)”等词在此可交互使用，且是指可接受本公开内容的分子构建体、药学组合物和/或方法处置的动物(包含人类)。除非另有指明，“个体”或“患者”一般包含雄性与雌性。“个体”或“患者”包含任何可因本公开内容的处置而获益的哺乳类动物。所述“个体”或“患者”的例示包含，但不限于：人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、猪、山羊、牛、马、狗、猫、鸟和禽类。在一实例中，所述患者为人类。所述哺乳类动物涵盖哺乳动物纲的所有成员，包括人类、灵长类动物、家畜和农畜(如兔子、猪、绵羊和牛)、动物园动物或竞赛用动物、宠物，以及啮齿类动物(如，小鼠和大鼠)。“非人类哺乳动物”一词则涵盖除了人类以外的所有哺乳动物纲成员。
[0123]
根据本公开内容的数种实施方式，“金属结合域”一词是指一种段的寡肽，其能够与金属离子结合，如zn
2+
、ni
2+
、co
2+
、fe
2+
、mn
2+
或cu
2+
。在某些实施方式中，能够与锌离子结合的金属结合域亦称为“锌结合域”；然而，本发明所属技术领域中技术人员当可理解，此种结合域亦可能和其他和锌离子具有相近物理和/或化学性质的金属离子结合。
[0124]
本公开内容至少是基于多种新颖的金属结合域，其可附接至亲本多肽的n
‑
或c
‑
端。此处提出的金属结合域在建构生物耦合物方面有以下数种优点。首先，此处提出的金属结合域是源自人类的序列，因此其免疫源性低于既有非属人类基因组的其他金属结合域。其次，带有此处提出的金属结合域的复合多肽有理想的表达量，且所表达出来的复合多肽在储存、耦接与纯化过程中相当稳定。第三，此处提出的金属结合域可在亲本多肽的半胱氨酸残基大多不具反应性的状况下，在金属结合域的半胱氨酸残基的sh基和功能性元件的sh
‑
反应性基轻易地进行部位专一的耦接反应。因此，本公开内容提出了能够建构多功生物耦合物的方法。下文公开本公开内容的多种实施方案与实施方式。
[0125]
(i)金属结合域
[0126]
本公开内容的第一种实施方案是关于一种金属结合域，其可在适当条件下，和一金属离子形成复合物，上述金属离子如zn
2+
、ni
2+
、co
2+
、fe
2+
、mn
2+
或cu
2+
。
[0127]
根据本公开内容一实施方式，所述金属结合域包含以下氨基酸序列：cx1x2ha(seq id no：1)，由n
‑
端至c
‑
端或由c
‑
端至n
‑
端，其中x1为甘氨酸或脯氨酸、x2为甘氨酸或丙氨酸。例示性实施例金属结合域包括但不限于：cggha(seq id no：2)、cpgha(seq id no：3)、cgaha(seq id no：4)、cpaha(seq id no：5)、gcggha(seq id no：6)、acpgha(seq id no：7)
以及gcpgha(seq id no：8)。
[0128]
(ii)带有金属结合域的复合多肽
[0129]
本公开内容的另一种实施方案是关于一复合多肽，其包含如上述实施方案/实施方式所示的金属结合域。因此，所述复合多肽可在适当条件下，透过金属结合域和金属离子形成复合物。
[0130]
根据本公开内容一实施方式，上述复合多肽包含亲本多肽以及根据本公开内容上述实施方案/实施方式的金属结合域。在多种实施方式中，上述金属结合域是接附接至亲本多肽的n
‑
或c
‑
端，或透过一或多个中间氨基酸残基而连接。在可任选的实施方式中，上述中间序列可以是2至10个甘氨酸残基。
[0131]
根据本公开内容多个实施方式，当金属结合域位于亲本多肽的n
‑
端时，金属结合域的序列可以是cx1x2ha(seq id no：1)，由n
‑
端至c
‑
端或由c
‑
端至n
‑
端，其中x1为甘氨酸或脯氨酸且x2为甘氨酸或丙氨酸。相似地，当金属结合域位于亲本多肽的c
‑
端时，金属结合域的序列可以是cx1x2ha(seq id no：1)，由n
‑
端至c
‑
端或由c
‑
端至n
‑
端，其中x1为甘氨酸或脯氨酸且x2为甘氨酸或丙氨酸。
[0132]
根据本公开内容多个实施方式，所述亲本多肽可以是一肽激素或其均等物。肽激素的均等物包含本发明所属技术领域中技术人员所知的功能性片段、前驱物、类似物或衍生物。此处所述的肽激素的例示性实例包括：促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，acth)、胰岛淀粉样多肽(amylin)、血管紧张素(angiotensin)、心房利钠肽(atrial natriuretic peptide，anp)、c型利钠肽(c
‑
type natriuretic peptide，cnp)、降钙素(calcitonin)、胆囊收缩素(cholecystokinin，cck)、胃泌素(gastrin)、生长素释放肽(ghrelin)、胰高血糖素(glucagon)、生长激素(growth hormone)、促卵泡激素(follicle
‑
stimulating hormone，fsh)、胰岛素(insulin)、瘦素(leptin)、促黑素细胞激素(melanocyte
‑
stimulating hormone，msh)、催产素(oxytocin)、甲状旁腺激素(parathyroid hormone，pth)、催乳激素(prolactin)、肾素(renin)、体抑素(somatostatin)、促甲状腺激素(thyroid
‑
stimulating hormone，tsh)、促甲状腺激素释放激素(thyrotropin
‑
releasing hormone，trh)、血管加压素(vasopressin)、及血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide)。举例来说，胰岛素的等价物包括但不限于赖脯胰岛素(lispro)、天冬胰岛素(aspart)、格林辛胰岛素(glulisine)、地特米尔胰岛素(detemir)、德谷胰岛素(degludec)和甘精胰岛素(glargine)。降钙素的等效物包括但不限于降钙素和肾上腺髓质素。体抑素的等效物包括但不限于奥曲肽(octreotide)和兰瑞肽(lanreotide)。
[0133]
在某些实施方式中，所述亲本多肽可以是能够和某些细胞表面受体结合的拟肽配体。拟肽是类蛋白的短链，经设计能够模拟多肽的功能。举例来说，已设计出一系列以谷氨酸
‑
尿素
‑
离氨酸为基础且具有psma结合力的拟肽分子。
[0134]
在可任选的实施方式中，亲本多肽可以是抗体，譬如单株抗体、免疫球蛋白a(iga)、igd、ige、igg或igm。本公开内容的范围亦涵盖完整抗体的功能性片段或衍生物，其例示包括但不限于：双单一性抗体、嵌合抗体(chimeric antibodies)、人源抗体(human antibodies)、人源化抗体(humanized antibodies)、单链抗体(scab)、单链可变片段(scfv)、串联二
‑
scfvs、串联三
‑
scfvs、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体
(tetrabodies)、fab片段、f(ab')2片段、fds、结构域抗体(domain antibodies)、以及微型抗体(minibodies)。
[0135]
或者是，亲本多肽可以是一细胞介素或其均等物。细胞介素的均等物包含本发明所属技术领域中技术人员所知的功能性片段、前驱物、类似物或衍生物。此处所述的例示性实施例细胞介素包括但不限于：介白素
‑
2(interleukin
‑
2，il
‑
2)、il
‑
10、il
‑
12、干扰素
‑
α(interferon
‑
α，ifn
‑
α)、ifn
‑
γ、转型生长因子
‑
β(transforming growth factor beta，tgf
‑
β)及肿瘤坏死因子
‑
α(tumor necrosis factor
‑
α，tnf
‑
α)。
[0136]
在某些实施方式中，亲本多肽可以是一单链抗体片段、譬如单域抗体(single domain，sdab)、单链抗体(scab)、单链可变片段(scfv)、双单一性t细胞衔接物(bi
‑
specific t
‑
cell engager，bite)、串联二
‑
scfv以及串联三
‑
scfv。在另一些实施方式中，亲本多肽可以是源自免疫球蛋白的重链或轻链的抗体片段，且此处提出的复合多肽包含完整抗体的一部分、可结晶区片段(fragment crystallizable region，fc区)、抗原结合片段(fragment antigen binding fragment，fab)、fab’、f(ab’)2、fab’、fv、(scfv)2、sc(fv)2、双抗体(diabody)、fd、fd’或迷你抗体。所述免疫球蛋白可源自免疫球蛋白d(igd)、ige或igg。所述抗体可以是双单一性抗体、嵌合抗体、人源抗体或人源化抗体。
[0137]
在某些实施方式中，所述抗体(及其功能性片段)对一细胞表面抗原专一，上述细胞表面抗原和液态肿瘤相关或在其上过度表达。此种细胞表面抗原的例示性实施例包括：cd5、cd19、cd20、cd22、cd23、cd27、cd30、cd33、cd34、cd37、cd38、cd43、cd72a、cd78、cd79a、cd79b、cd86、cd134、cd137、cd138及cd319。可利用这些细胞表面抗原的抗体(或其片段或衍生物)作为标的元件，以将带有标的元件的分子构建体带到疾病部位。在其他视需要而采行的实施方式中，所述抗体(及其功能性片段或衍生物)可对其他细胞表面抗原专一，且此种抗体可在人体内发挥治疗效果；此种细胞表面抗原的例示包括：cd3、cd16a、cd28、cd134、细胞毒性t淋巴瘤细胞相关蛋白(cytotoxic t
‑
lymphocyte
‑
associated protein 4，ctla
‑
4)、程序性细胞死亡因子1(programmed cell death 1，pd
‑
1)或程序性细胞死亡因子1配体1(programmed cell death 1ligand 1，pd
‑
l1)。又或者是，所述抗体(或其片段)可对肿瘤相关抗原(tumor
‑
associated antigen，taa)专一，譬如人类上皮生长因子受体1(human epidermal growth factor receptor
‑
1，her1)、her2、her3、her4、糖类抗原19
‑
9(carbohydrate antigen 19
‑
9，ca 19
‑
9)、糖类抗原125(ca 125)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，cea)、黏蛋白1(mucin1，muc 1)、神经节苷脂gd2(ganglioside gd2)、黑色素瘤相关抗原(melanoma
‑
associated antigen，mage)、前列腺专一膜抗原(prostate
‑
specific membrane antigen，psma)、前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen，psca)、间皮素(mesothelin)、粘蛋白关联tn抗原、唾液酸tn抗原(sialyl tn)、globo h、阶段专一性胚胎抗原(stage
‑
specific embryonic antigen
‑
4，ssea
‑
4)以及上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，epcam)。每一种taa通常会在一或多种固态肿瘤的细胞表面上过度表达，此种taa的抗体可作为一种标的元件，并用以制备此处所述的分子构建体。在另一些可任选的实施方式中，所述抗体(或其片段)对一生长因子具专一性，上述生长因子是选自以下物质所组成群组：上皮生长因子(epidermal growth factor，egf)、突变型egf、表皮调节素(epiregulin)、肝素结合上皮生长因子(heparin
‑
binding epidermal growth factor，hb
‑
egf)、血管内皮生长因子a
(vascular endothelial growth factor，vegf
‑
a)、碱性纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bfgf)以及肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，hgf)。在某些实施方式中，所述抗体(或其片段)对上文所述的细胞介素具专一性。
[0138]
(iii)功能性元件与带有金属结合域的复合多肽形成的分子构建体
[0139]
在又另一种实施方案中，可将一或多个功能性元件共价耦接于根据本公开内容上述实施方案/实施方式的复合多肽，其是藉由和所述复合多肽的金属结合域中的半胱氨酸残基的硫氢基(sh)反应，以形成本发明所示的分子构建体(或生物耦合物)。具体来说，复合多肽的金属结合活性使得能够进行位置专一的复合反应，故能得到均质的分子构建体。
[0140]
根据本公开内容视需要而采用的实施方式，所述sh
‑
反应性基为顺丁烯二酰亚胺基、碘乙酰基、溴乙酰基、乙烯砜基、单砜基、甲磺酰基苯并噻唑基或2
‑
吡啶基二硫醇基。
[0141]
当可理解，所述功能性元件可以是能够在个体体内产生所欲疗效的效应元件。或者是，所述功能性元件可以是能够将分子构建体导引至个体体内目标部位的标的元件。又或者是，所述功能性元件可以是能够改变分子构建体在个体体内的药动学表达的药动学元件。又或者是，所述功能性元件是以接合单元(或分子束)的形式呈现。根据某些本公开内容的实施方式，所述接合单元包含一中心核以及复数个标的元件、效应元件或药动学元件；所述接合单元的结构如下文第(iv)节所述。
[0142]
可用于本公开内容的效应分子包括但不限于细胞毒性药物、tlr促效剂或螯合剂(单独或与放射性核种复合)。
[0143]
当可理解，可对肿瘤细胞发挥细胞毒杀效果的细胞毒性药物可以是：抗雌性素(anti
‑
estrogen，如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)及甲地孕酮(megestrol))、黄体释素促效剂(lhrh agonist，如戈舍瑞林(goscrclin)及亮丙瑞林(leuprolide))、抗雄性素(anti
‑
androgen，如氟他胺(flutamide)及比卡鲁胺(bicalutamide))、光动力治疗剂(photodynamic therapies，如维替泊芬(vertoporfin)、酞菁(phthalocyanine)、光敏剂pc4(photosensitizer pc4)及去甲氧基竹红菌素(demethoxy
‑
hypocrellin a))、氮芥(nitrogen mustard，如环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雌莫司汀(estramustine)及美法仑(melphalan))、亚硝基尿素(nitrosoureas，如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、烷基磺酸(alkylsulphonate，如白消安(busulfan)及苏消安(treosulfan))、三氮烯(triazene，如达卡巴嗪(dacarbazine)及替莫唑胺(temozolomide))、含铂化合物(如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)及奥沙利铂(oxaliplatin))、长春花生物碱(vinca alkaloid，如长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)及长春瑞滨(vinorelbine))、类紫杉醇(taxoid，如紫杉醇(paclitaxel)及欧洲紫杉醇(docetaxeal))、表鬼臼毒素(epipodophyllin，如依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、9
‑
氨基喜树咸(9
‑
aminocamptothecin)、康托替康(camptoirinotecan)、伊立替康(irinotecan)、甲磺酸(crisnatol)及丝裂霉素c(mytomycin c))、抗代谢药物(anti
‑
metabolite)、二氢叶酸还原酶抑制剂(dhfr inhibitor，如胺甲喋呤(methotrexate)、二氯甲胺蝶呤(dichloromethotrexate)、三甲蝶呤(trimetrexate)及依达曲沙(edatrexate))、肌苷
‑
5'
‑
单磷酸去氢酶抑制剂(imp dehydrogenase inhibitor，如霉酚酸(mycophenolic acid)、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韦林(ribavirin)及eicar))、核糖核苷酸还原酶抑制剂(ribonuclotide reductase inhibitor，如羟基尿素(hydroxyurea)及去铁胺(deferoxamine))、尿嘧啶类似物(如5
‑
氟尿嘧啶(5
‑
fluorouracil，5
‑
fu)、氟尿苷(floxuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、雷替曲塞(ratitrexed)、替加氟尿嘧啶(tegafur
‑
uracil)及卡培他滨(capecitabine))、胞嘧啶类似物(如阿糖胞苷(cytarabine，又称ara c)、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosine arabinoside)及氟达拉滨(fludarabine))、嘌呤类似物(如硫氢基嘌呤(mercaptopurine)及硫鸟嘌呤(thioguanine))、维生素d3类似物(如eb 1089、cb 1093及kh 1060)、异戊二烯抑制剂(isoprenylation inhibitor，如洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神经毒素(dopaminergic neurotoxin，如1
‑
甲基
‑4‑
苯基吡啶离子(1
‑
methyl
‑4‑
phenylpyridinium ion))、细胞周期抑制剂(如星形孢菌素(staurosporine))、放线菌素(actinomycin，如放线菌素d)、博莱霉素(bleomycin，如博莱霉素a2、博莱霉素b2及培洛霉素(peplomycin))、蒽环类药物(anthracycline，如柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone))、多重抗药性抑制剂(mdr inhibitor，如维拉帕米(verapamil))、钙离子三磷酸腺苷酶抑制剂(ca
2+
atpase inhibitor，如毒胡萝卜素(thapsigargin))、伊马替尼(imatinib)、沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，如阿西替尼(axitinib)、波舒替尼(bosutinib)、西地尼布(cediranib)、达沙替尼(dasatinib)、厄罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来他替尼(lestaurtinib)、那替尼(neratinib)、尼洛替尼(nilotinib)、司马沙尼(semaxanib)、舒尼替尼(sunitinib)、托赛拉尼(toceranib)、凡德他尼(vandetanib)、瓦他拉尼(vatalanib)、利妥昔单抗(rituximab)、索拉非尼(sorafenib)、依维莫司(everolimus)、西罗莫司(temsirolimus)、蛋白酶抑制剂(如硼替佐米(bortezomib))、哺乳类斥消灵标的蛋白抑制剂(mtor inhibitor，例如雷帕霉素(rapamycin)、西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、及雷帕霉素衍生物(ridaforolimus))、奥利默森(oblimersen)、吉西他滨(gemcitabine)、洋红霉素(carminomycin)、亚叶酸钙(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甲基芐肼(procarbizine)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、喜树碱(campathecin)、普卡霉素(plicamycin)、天门冬酰胺酶(asparaginase)、氨基蝶呤(aminopterin)、甲胺蝶呤(methopterin)、紫菜霉素(porfiromycin)、美法仑(melphalan)、异长春碱(leurosidine)、环氧长春碱(leurosine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、曲贝替定(trabectedin)、丙卡巴肼(procarbazine)、海绵内酯(discodermolide)、洋红霉素(carminomycin)、氨基蝶呤(aminopterin)或六甲基三聚氰胺(hexamethyl melamine)。根据本公开内容一具体实施方式，所述细胞毒性药物为美登素(mertansine)、奥里斯他汀(auristatin)、美登木素(maytansine)、阿霉素(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)或喜树碱(camptothecin)。
[0144]
tlr促效剂的非限制性例示包括：脂磷壁酸(lipoteichoic acid)、葡聚糖
(glucan)、莫托立莫特(motolimod)、咪喹莫特(imiquimod)、瑞西喹莫特(resiquimod)、加德喹莫特(gardiquimod)、cpg寡聚去氧核苷酸(cpg oligodeoxynucleotide，cpg don)、脂多糖(lipopolysaccharide，lps)、单磷酰脂a(monophosphoryl lipid a)以及酵母聚糖(zymosan)。
[0145]
在多种实施方式中，所述螯合剂可选自以下物质所组成的群组：1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7,10
‑
四乙酸(1,4,7,10
‑
tetraazacyclododecane
‑
1,4,7,10
‑
tetraacetic acid，dota)、n,n
″‑
双[2
‑
羟基
‑5‑
(羧乙基)芐基]乙二胺
‑
n，n
″‑
二乙酸(n,n
″‑
bis[2
‑
hydroxy
‑5‑
(carboxyethyl)benzyl]ethylenediamine
‑
n,n
″‑
diacetic acid，hbed
‑
cc)、1,4,7
‑
三氮杂环壬烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸(1,4,7
‑
triazacyclononane
‑
1,4,7
‑
triacetic acid，nota)、2
‑
(4,7
‑
双(羧甲基)
‑
1,4,7
‑
三唑烷
‑1‑
基)戊二酸(2
‑
(4,7
‑
bis(carboxymethyl)
‑
1,4,7
‑
triazonan
‑1‑
yl)pentanedioic acid，nodaga)、2
‑
(4,7,10
‑
三(羧甲基)
‑
1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑1‑
基)戊二酸(2
‑
(4,7,10
‑
tris(carboxymethyl)
‑
1,4,7,10
‑
tetraazacyclododecan
‑1‑
yl)pentanedioic acid，dotaga)、1,4,7
‑
三氮杂环壬烷次膦酸(1,4,7
‑
triazacyclo
‑
nonane phosphinic acid，trap)、1,4,7
‑
三氮杂环壬烷
‑1‑
[甲基(2
‑
羧乙基)次膦酸]
‑
4,7
‑
双[甲基(2
‑
羟甲基)次膦酸](1,4,7
‑
triazacyclononane
‑1‑
[methyl(2
‑
carboxyethyl)phosphinic acid]
‑
4,7
‑
bis[methyl(2
‑
hydroxymethyl)phosphinic acid]，nopo)、3,6,9,15
‑
四氮杂双环[9.3.1.]十五
‑
1(15)，11,13
‑
三烯
‑
3,6,9
‑
三乙酸(3,6,9,15
‑
tetraazabicyclo[9.3.1.]pentadeca
‑
1(15),11,13
‑
triene
‑
3,6,9
‑
triacetic acid，pcta)、n'{5
‑
[乙酰基(羟基)氨基]戊基}
‑
n
‑
[5
‑
({4
‑
[(5
‑
氨基戊基)(羟基)氨基]
‑4‑
氧代丁酰基}氨基]戊基]
‑
n
‑
羟基琥珀酰胺(n’{5
‑
[acetyl(hydroxy)amino]pentyl}
‑
n
‑
[5
‑
({4
‑
[(5
‑
aminopentyl)(hydroxy)amino]
‑4‑
oxobutanoyl}amino)pentyl]
‑
n
‑
hydroxysuccinamide，dfo)、二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid，dtpa)、反式环己基
‑
二亚乙基三胺五乙酸(trans
‑
cyclohexyl
‑
diethylenetriaminepenta
‑
aceticacid，chx
‑
dtpa)、1
‑
氧杂
‑
4,7,10
‑
三氮杂环十二烷
‑
4,7,10
‑
三乙酸(1
‑
oxa
‑
4,7,10
‑
triazacyclododecane
‑
4,7,10
‑
triacetic acid，oxo
‑
do3a)、对
‑
异硫氰酸根合芐基
‑
dtpa(p
‑
isothiocyanatobenzyl
‑
dtpa，scn
‑
bz
‑
dtpa)、1
‑
(对
‑
异硫氰酸根合芐基)
‑3‑
甲基
‑
dtpa(1
‑
(p
‑
isothiocyanatobenzyl)
‑3‑
methyl
‑
dtpa，1b3m)、2
‑
(对异硫氰酸根合芐基)
‑4‑
甲基
‑
dtpa(2
‑
(p
‑
isothiocyanatobenzyl)
‑4‑
methyl
‑
dtpa，1m3b)以及1
‑
(2)
‑
甲基
‑4‑
异氰酸根合芐基
‑
dtpa(1
‑
(2)
‑
methyl
‑4‑
isocyanatobenzyl
‑
dtpa，mx
‑
dtpa)。在某些实施方式中，所述放射性核种为
111
in、
131
i或
177
lu，在其他实施方式中，所述放射性核种可以是
90
y、
68
ga、
99m
tc、
64
cu、
153
gd、
155
gd、
157
gd、
213
bi、
225
ac或fe。
[0146]
在其他实施方式中，本发明分子构建体的效应元件的选择亦涵盖了多种多肽类分子，包括(1)对发炎性细胞介素(譬如tnf
‑
α、il
‑
12/il
‑
23、il
‑
17、il
‑
1、il
‑
6、baff)专一的抗体片段、(2)对rankl专一的抗体片段、(3)对表达于t细胞与nk细胞上的cd3及cd16a专一的抗体片段、(4)对pd
‑
1、pd
‑
l1、ctla
‑
4及其他免疫检查点蛋白专一的抗体片段、以及(5)免疫强化细胞介素(ifn
‑
α、ifn
‑
γ、il
‑
2、tnf
‑
α)。
[0147]
可视欲治疗的疾病来选择适用于本公开内容的实施方式的标的元件。举例来说，用以治疗各种疾病的标的元件包含(1)对关节、皮肤或骨胳中细胞外基质的成分专一的抗体片段，上述成分如第i型胶原蛋白、第ii型胶原蛋白、第iii型胶原蛋白、第v型胶原蛋白、
第vii型胶原蛋白、第ix型胶原蛋白、第xi型胶原蛋白、α
‑
蛋白聚糖以及骨结合素(osteonectin)；(2)对分化标记丛集专一的抗体片段，上述标记丛集如cd19、cd20、cd22、cd30、cd52、cd79a、cd79b；、cd38、cd56、cd74、cd78以及cd138；或cd319、cd5、cd4、cd7、cd8、cd30；或cd13、cd14、cd15、cd33、cd34、cd36、cd37、cd41、cd61、cd64、cd65以及cd11c；以及淋巴样细胞系、骨髓样细胞系与浆细胞的其他细胞表面抗原，或(3)对在固态肿瘤细胞表面上过度表达的受体或抗原专一的抗体片段，上述受体或抗原如her1、her2/neu、her3、tn、globo h、gd
‑
2、ca125、ca19
‑
9、与cea。
[0148]
肿瘤细胞或其他患病细胞上会表达某些荷尔蒙、生长因子或细胞介素的受体，所以标的元件也可以是此类荷尔蒙、生长因子或细胞介素的抗体。在另一些可任选的实施方式中，此处提出的分子构建体的标的元件为生长因子。
[0149]
根据本公开内容某些实施方式，本公开内容的亲本多肽与功能性元件其中至少一者为对生长因子专一的抗体片段。在某些实施方式中，所述生长因子选自以下物质所组成的群组：egf、突变型egf、表皮调节素、hb
‑
egf、vegf
‑
a、bfgf与hgf。与上文所述的概念相似，当标的元件为生长因子(如，egf)时，此处提出的分子构建体能够专一地标的到表达相关受体的细胞/组织/器官(如，其上表达有egf受体的肿瘤细胞)。当效应元件是对生长因子(如，vegf
‑
a)专一的抗体片段时，其可捕捉并中和与该生长因子相关的信息传导路径(譬如vegf
‑
a
‑
诱发的血管生成)。根据一实施例，本发明分子构建体可用以治疗固态肿瘤，其中效应元件是对vegf
‑
a专一的抗体片段。
[0150]
药动学元件的例示如c8
‑
28脂肪酸衍生物或c8
‑
28二元脂肪酸衍生物。每一药动学元件透过k残基的ε
‑
氨基而连接至一k残基。根据本公开内容多个实施方式，所述功能性元件为一脂肪酸衍生物，其是衍生自辛酸(octanoic acid)、壬酸(pelargonic acid)、癸酸(decanoic acid)、十一酸(undecanoic acid)、月桂酸(lauric acid)、十三酸(tridecanoic acid)、肉豆蔻酸(myristic acid)、十五酸(pentadecanoic acid)、棕榈酸(palmitic acid)、十七酸(margaric acid)、硬脂酸(stearic acid)、十九酸(nonadecanoic acid)、花生酸(arachidic acid)、二十一酸(heneicosanoic acid)、二十二酸(behenic acid)、二十三酸(tricosanoic acid)、二十四酸(lignoceric acid)、棕榈油酸(palmitoleic acid)、油酸(oleic acid)、亚麻油酸(lionleic acid)、蓖麻油酸(ricinoleic acid)、异柠檬酸(vaccenic acid)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，epa)或二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，dha)。根据本公开内容某些实施方式，所述功能性元件为二元脂肪酸衍生物，其衍生自：1,8
‑
辛二酸(suberic acid)、1,7
‑
庚二甲酸(azelaic acid)、1,10
‑
癸二酸(undecanedioic acid)、十一烷二酸(dodecanedioic acid)、十二烷二酸(brassylic acid)、十三烷二酸(sebacic acid)、十四烷二酸(tetradecanedioic acid)、十五烷二酸(pentadecanedioic acid)、十六烷二酸(thapsic acid)、十七烷二酸(heptadecanedioic acid)或十八烷二酸(octadecanedioic acid)。在某些实施方式中，此处提出的功能性元件是衍生自肉豆蔻酸或棕榈酸。在其他实施方式中，此处提出的功能性元件是衍生自十四烷二酸或十六烷二酸。
[0151]
(iv)用以与带有金属结合域的复合多肽耦接的接合单元
[0152]
在某些视需要而采用的实施方式中，用以与上述复合多肽耦接的功能性元件是以分子束(或接合单元)形式呈现。根据某些本公开内容的实施方式，所述接合单元包含一中
心核及复数个标的元件、效应元件或药动学元件。当可理解，此种接合单元也属于本公开内容保护的范围。
[0153]
根据某些本公开内容的实施方式，所述接合单元包含一中心核及复数个如上述实施方案/实施方式所述的元件、效应元件或药动学元件。
[0154]
具体来说，中心核是长度为3
‑
120个氨基酸残基的多肽，且至少包含两个离氨酸(k)残基；举例来说，此处提出的中心核可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个k残基。根据某些实施方式，任两个k残基可彼此相邻或由一填充物所隔开。在某些例子中，一sh
‑
反应性基透过与其形成酰胺键而连接于中心核的第一个或最后一个k残基。在其他例子中，上述中心核还包含一末端间隔物，且所述sh
‑
反应性基透过与其形成酰胺键而连接到末端间隔物的末端氨基酸残基。如此一来，能够在亲本多肽的半胱氨酸残基大多不具反应性的适当的条件下，使此处提出的接合单元的末端sh
‑
反应性基和复合多肽中金属结合域的半胱氨酸残基的sh基耦接，因而能够实现位置专一的耦接，并得到均质的分子构建体。
[0155]
所述末端间隔物可以是连接到第一个k残基n
‑
端的n
‑
端间隔物，或连接到最后一个k残基c
‑
端的c
‑
端间隔物。上述填充物与末端间隔物彼此独立地至少包含：(1)1至12个非k氨基酸残基，或(2)具有2至12个eg重复单元的一聚乙二醇化氨基酸。
[0156]
在接合单元不具连接臂的情形中，每一标的元件、效应元件或药动学元件透过与k残基的ε
‑
氨基形成酰胺键而连接至中心核的k残基。另一方面，当所述分子构建体的接合单元更包含2至10个连接臂时，每一连接臂的一端透过与中心核的k残基的ε
‑
氨基形成酰胺键而连接至该中心核的k残基，且每一连接臂的另一端连接至每一标的元件、效应元件或药动学元件。举例来说，所述连接臂可以是包含2
‑
12个非k氨基酸残基的一多肽、或是具有2至24个eg重复单元的一聚乙二醇化氨基酸链。
[0157]
根据本公开内容视需要而采用的实施方式，在和标的元件、效应元件或药动学元件耦接前，连接臂的自由端(即，未与中心核离氨酸残基连接的该端)可带有一连接基，其是选自以下物质所组成的群组：氨基、羧基、羟基、nhs、叠氮基、炔基、环辛炔、四嗪基或环辛烯基。随着修饰离氨酸残基的侧链氨基的连接基(即，氨基、羧基、nhs、叠氮基、炔基、环辛炔、四嗪基或环辛烯基)不同(在无连接臂的情况下)，或随着出现在连接臂自由端的连接基不同，能够设计带有相应官能基的功能性元件(譬如，标的元件、治疗效应元件或能够提升药动学特性的元件)，而使得功能性元件可以透过以下任一种化学反应而连接到连接基：
[0158]
(1)于其间形成酰胺键：在此种情形中，连接基为氨基、羧基或nhs基，而功能性元件则带有氨基或羧基；
[0159]
(2)铜催化的迭氮化物
‑
炔羟环加成(copper(i)
‑
catalyzed alkyne
‑
azide cycloaddition；cuaac)反应：连接基与功能性元件其中之一带有叠氮基或吡啶甲基迭氮(picolyl azide)基，而另一个则带有炔基；
[0160]
(3)逆电子需求狄尔斯
‑
阿德(inverse electron demand diels
–
alder，iedda)反应：连接基与功能性元件其中之一带有四嗪基，而另一个则带有环辛烯基(如，tco或降莰烯(norbornene)基)；或
[0161]
(4)应力促进的迭氮化物
‑
炔羟链接化学(strain
‑
promoted azide
‑
alkyne click chemistry，spaac)：连接基与功能性元件其中之一带有叠氮基，而另一个则带有环辛炔基。
[0162]
根据本公开内容多个实施方式，所述四嗪基为1,2,3,4
‑
四嗪基、1,2,3,5
‑
四嗪基、
1,2,4,5
‑
四嗪基或其衍生物；环辛烯基为降莰烯基(norbornene)或反式
‑
环辛烯基(trans
‑
cyclooctene，tco)基；且环辛炔基是选自以下所组成的群组：二苯并环辛炔基(dibenzocyclooctyne，dibo)、二氟化环辛炔基(difluorinated cyclooctyne，difo)、二环壬炔基(bicyclononyne，bcn)以及二苯并杂氮环辛炔基(dibenzoazacyclooctyne，dibac或dbco)。根据本公开内容一实施方式，四嗪基为6
‑
甲基
‑
四嗪。
[0163]
根据本公开内容某些视需要而采用的实施方式，中心核在与sh
‑
反应性基连接的氨基酸残基或其邻近处带有局部负电荷。举例来说，所述局部负电荷出现在从与sh
‑
反应性基连接的氨基酸残基起算的前5至15个氨基酸残基处。具体来说，所述局部负电荷出现在从与sh
‑
反应性基连接的氨基酸残基起算的前5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基中。可利用一或多个在ph＝7带有负电荷的氨基酸残基(譬如天冬氨酸(d)及谷氨酸(e)残基)来形成所述局部负电荷。
[0164]
或者是，可将中心核和复数个带负电的效应元件耦接，以使中心核在与sh
‑
反应性基或其邻近处带有局部负电荷。举例来说，所述效应元件可以是一螯合剂(如，dota、dotaga及与其相似者)，其可增加接合单元整体的净负电荷。
[0165]
上文参照第(iii)节所述的标的、效应及药动学元件同样适用于第(iv)节所述的实施方式，在此为求简洁不再赘述。在多种实施方式中，携有复数个效应元件的接合单元称为“效应分子束”或“载药束”；携有复数个螯合剂的接合单元称为“螯合剂束”；携有复数个标的元件的接合单元称为“标的分子束”；携有复数个scfv的接合单元称为“scfv束”；携有复数个药动学元件的接合单元称为“药动分子束”或“pk束”；且携有复数个脂肪酸链及/或二元脂肪酸链的接合单元称为“脂肪酸束”或“fa束”。
[0166]
在某些实施方式中，脂肪酸(或二元脂肪酸)衍生物是一种经化学修是的脂肪酸(或二元脂肪酸)分子。举例来说，脂肪酸分子的羧基(或二元脂肪酸分子的其中一个羧基)可和带有两个官能基的化学实体反应，其中一个官能基可和羧基反应，因而可和该(二元)脂肪酸分子形成共价键；而另一官能基则可和离氨酸残基的侧链氨基反应。根据本公开内容视需要而采用的实施方式，修饰(二元)脂肪酸分子的化学实体为谷氨酸残基、天冬氨酸残基、氨基
‑
eg2
‑
酸、γ
‑
氨基丁酸(gamma
‑
aminobutyric acid)，或与其相似者；然本公开内容不限于此。
[0167]
当可理解，当亲本多肽中不带有半胱氨酸残基或其他含硫氢基的氨基酸残基时，可引入一末端半胱氨酸残基来取代末端金属结合域，以得到一复合多肽，且此处提出的接合单元能够透过这种末端半胱氨酸残基和所述复合多肽形成偶联物。
[0168]
(v)接有复数个带有金属结合域的复合多肽的接合单元
[0169]
本公开内容又另一种实施方案是关于一接合单元，其携有复数个如本公开内容上述实施方案/实施方式所示的复合多肽。在某些实施方式中，此种接合单元亦称为“多肽束”。
[0170]
根据某些本公开内容的实施方式，接合单元包含一中心核、2至10个连接臂以及2至10个如上述实施方案/实施方式所示的复合多肽。此种接合单元的连接臂自由端带有一sh
‑
反应性基，而由于每一复合多肽带有此处提出的金属结合域，所以能够在亲本多肽的半胱氨酸残基大多不具反应性的适当的条件下，以位置专一的方式将复合多肽耦接至连接臂上。
[0171]
具体来说，中心核是长度为3
‑
120个氨基酸残基的多肽，且至少包含两个离氨酸(k)残基，举例来说，此处提出的中心核可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个k残基。根据某些实施方式，任两个k残基可彼此相邻或由一填充物所隔开。
[0172]
在某些例子中，中心核更包含一复合基基，透过与其形成酰胺键而连接于中心核的第一个或最后一个k残基。复合基的实例包括但不限于：叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基及环辛炔基。
[0173]
在其他例子中，上述中心核还包含一末端间隔物，且所述sh
‑
反应性基透过与其形成酰胺键而连接到末端间隔物的末端氨基酸残基。所述末端间隔物可以是连接到第一个k残基n
‑
端的n
‑
端间隔物，或连接到最后一个k残基c
‑
端的c
‑
端间隔物。
[0174]
上述填充物与末端间隔物彼此独立地至少包含：(1)1至12个非k氨基酸残基，或(2)具有2至12个eg重复单元的一聚乙二醇化氨基酸。一般来说，上述间隔物可以是，(1)由1
‑
12个(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)k氨基酸残基以外的氨基酸残基所组成的多肽，或(2)具有1
‑
12个(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)eg单元的聚乙二醇化氨基酸。具体来说，当此处提出的中心核至少包含复数个k残基时，间隔物可包含具有2
‑
12个eg单元的聚乙二醇化氨基酸、或可包含1
‑
12个非
‑
k氨基酸残基，其中每一个非
‑
k氨基酸残基分别且独立地选自以下组成的群组：甘氨酸(g)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、丝氨酸(s)、精氨酸(r)、组氨酸(h)、苏氨酸(t)、天冬酰胺酸(n)、谷酰胺酸(q)、脯氨酸(p)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、异白氨酸(i)、白氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、苯基丙氨酸(f)、酪氨酸(y)与色氨酸(w)残基；在较佳的情形中，每一个非
‑
k氨基酸残基分别且独立地选自选自以下所组成的群组：g、s、r、h、t、n、q、p、a、v、i、l、m、f、y与w残基；在更佳的情形中，每一个非
‑
k氨基酸残基分别为g及/或s残基。
[0175]
根据一些实施方式，每一连接臂的一端透过与中心核的k残基的ε
‑
氨基形成酰胺键而连接至该中心核的k残基，且每一连接臂的另一端带有硫氢基(sh)
‑
反应性基。举例来说，所述连接臂可以是包含2
‑
12个非k氨基酸残基的一多肽、或是具有2至24个eg重复单元的一聚乙二醇化氨基酸链。
[0176]
例示性的sh
‑
反应性基包括顺丁烯二酰亚胺基、卤代乙酰基(如，碘乙酰基或溴乙酰基)、砜基(如，乙烯砜基、单砜基、甲磺酰基苯并噻唑基)、以及吡啶基二硫基(如，2
‑
吡啶基二硫醇基)。
[0177]
根据本公开内容某些实施方式，所述连接臂为至少包含2
‑
12个(即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)非
‑
k氨基酸残基(各自可为天然或非天然氨基酸残基)的多肽。举例来说，连接臂为至少包含2
‑
12个非
‑
k氨基酸残基(即，独立选自以下群组的氨基酸残基：g、e、d、s、r、h、t、n、q、p、a、v、i、l、m、f、y及w残基)的多肽。根据一实施例，此处提出的连接臂为一多肽，其至少包含5
‑
10个独立选自g、s、e与r残基的氨基酸残基。或者是，连接臂可以是带有2
‑
24个(即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个)eg重复单元的peg链；在较佳的情形中，为5
‑
15个eg重复单元；在更佳的情形中，为6
‑
12个eg重复单元。当可理解，可利用具有大致上相同长度的聚合物来取代此处所述的连接臂多肽或peg链。可以使用如碳水化合物或其他亲水性结构单元等聚合物来作为连接臂。
[0178]
根据本公开内容的一些实施方式，每一连接臂在与sh
‑
反应性基连接的氨基酸残基或其邻近处带有局部负电荷。具体来说，所述局部负电荷出现在从与sh
‑
反应性基连接的
氨基酸残基起算的前5至15个氨基酸残基处。举例来说，所述局部负电荷出现在从与sh
‑
反应性基连接的氨基酸残基起算的前5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基中。可利用一或多个在ph＝7带有负电荷的氨基酸残基(譬如天冬氨酸(d)及谷氨酸(e)残基)来形成所述局部负电荷。
[0179]
当可理解，当此处提出的中心核包含至少两个末端间隔物或填充物时，每一末端间隔物或填充物可以相同或不同；亦即，每一末端间隔物或填充物可包含相同或不同的氨基酸序列及/或eg单元。根据本公开内容一实施方式，此处提出的中心核包含三个填充物，其中第一个填充物为有8个eg单元的聚乙二醇化氨基酸，而另外两个填充物分别为一个s残基以及一个g残基。根据本公开内容另一种实施方式，此处提出的中心核包含一个末端间隔物及四个填充物，其中一个末端间隔物四个g残基与两个s残基所组成，而其他四个填充物各由一个g残基与一个s残基组成。根据本公开内容又一实施方式，此处提出的中心核包含两个末端间隔物与三个填充物，各自为有四个eg单元的聚乙二醇化氨基酸。
[0180]
根据本发明可任选的实施方式，可将包含复数个复合多肽的接合单元(或称多肽束)和一额外的接合单元耦接，譬如可透过与中心核的复合基反应，以形成分子构建体。举例来说，所述额外的接合单元可以是一效应分子束、标的分子束或pk束。举例来说，所述额外的接合单元的结构，类似申请人先前提出的申请案所记载的结构。简而言之，此额外的接合单元的结构可与上文第(iii)节所述类似，不同之处在将末端sh
‑
反应性基置换为能够与多肽数的复合基反应的相对应复合基。
[0181]
当所述额外接合单元所携带的标的或效应元件为多肽类元件时，所述多肽类元件亦可具有上文提出的锌结合域，且此额外的接合单元可采用此处提出的多肽束的结构，因而可得到一种由两个携带不同功能性元件的多肽束所组成的分子构建体。
[0182]
在某些可任选的实施方式中，复合基是一复合部分的一部分，所述复合部分有一官能基能够和和末端氨基酸残基(即，第一个连接氨基酸残基或n
‑
端间隔物的n
‑
端氨基酸残基)的α
‑
氨基(
‑
nh2)或是末端氨基酸残基(即，最后一个连接氨基酸残基或c
‑
端间隔物的c
‑
端氨基酸残基)的羧基(
‑
cooh)形成共价键，而将复合部位与其连接。在某些实施方式中，中心核可能只有n
‑
端与c
‑
端间隔物其中一种，且有第一与第二复合部分分别连接到两个末端氨基酸残基(可以是末端连接氨基酸残基或末端间隔物的末端氨基酸残基)。在某些实施方式中，中心核包含n
‑
端与c
‑
端间隔物两者，且两个复合部分分别连接到两个末端间隔物的末端氨基酸残基。在较佳的实施方式中，复合部分与末端氨基酸残基间形成的共价键为酰胺键。当可理解，为了确保能够得到均质的分子束，一个复合部分上的官能基仅能与α
‑
氨基或羧基其中一种反应。
[0183]
视需要地，所述复合部分可更包含有2
‑
10个(即，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)eg重复的peg链，以将羧基或氨基和和复合基连接在一起；举例来说，所述peg链可能有4、6、7或8个eg单元。
[0184]
根据本公开内容多个实施方式，两个复合部分可具有相同或不同的反应性。较佳地，当复合部分的第二个复合基是叠氮基、炔基或环辛炔基时，连接臂的连接基不能是叠氮基、炔基或环辛炔基，以避免第二复合基与连接基间的反应；此时，连接基可以是四嗪基、环辛烯基、氨基、羧基、或nhs基。或者是，当第二复合基是四嗪基或环辛烯基时，连接基不能是四嗪基或环辛烯基；此时，连接基可以是叠氮基、炔基、环辛炔基、氨基、羧基或nhs基。
[0185]
当可理解，连接到中心核的可任选的连接臂的数目取决于中心核中连接氨基酸残基(即，k残基)的数目。由于此处提出的中心核中有至少两个连接氨基酸残基，此处提出的标的或效应分子束可包含复数个连接臂。
[0186]
当可理解，上文针对效应、标的或药动学元件的相关叙述适用于所有涉及此类元件的实施方案/实施方式，除非上下文另有相反的说明。
[0187]
当可理解，在多肽中心核的固态合成过程中，除了在合成中心核之后再接上功能性元件之外，也可将经过特定功能性元件修饰的k氨基酸残基加入合成中的多肽链。因此，根据多种实施方式，可在固态合成过程中依序加入经过不同功能性元件的k残基，以制得均质的pk束，其中每一pk束可含有二或更多个不同的功能性元件连接于其上。
[0188]
下文提出多个实施例来说明本发明的某些实施方案，以利本发明所属技术领域中技术人员实作本发明。这些实施例仅为例示，且不应将其视为对本发明范围的限制。据信本领域普通技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。
[0189]
实施例
[0190]
实施例1
[0191]
mal
‑
多肽1中心核的合成
[0192]
在本实施例中，本发明的发明人设计了带有五个赖氨酸残基多肽，并委由karebay co.,ltd.(monmouth junction,usa)合成。此多肽可作为一中心核，用以建构一接合单元或一功能分子束。利用标准fmoc固态合成法来合成mal
‑
多肽1(顺丁烯二酰亚胺乙基ggsggskgskgskgskgsk；seq id no：11)。mal
‑
多肽1的纯度为95.67％。
[0193]
利用质谱maldi
‑
tof分析来确认所合成的多肽。于台湾地区“中研院”分子生物研究院(imb，台湾地区，中国)质谱核心设施实施质谱分析。所用的设备为bruker autoflex iii maldi
‑
tof/tof质谱仪(bruker daltonics,bremen,germany)。
[0194]
图1为maldi
‑
tof质谱分析结果，由图中可以看出mal
‑
多肽1的分子量为1,790.916道尔顿。
[0195]
实施例2
[0196]
mal
‑
多肽2
‑
dota束的合成
[0197]
在本实施例中，本发明的发明人设计的螯合剂束(参见图2)是以带有三个赖氨酸残基且含顺丁烯二酰亚胺的多肽作为中心核，并有三个dota分子耦接至该中心核(mal
‑
多肽2
‑
dota束)，此螯合剂束委由karebay co.,ltd.(monmouth junction,usa)合成。
[0198]
利用标准fmoc固态合成法来合成mal
‑
多肽2(顺丁烯二酰亚胺乙基ggsggsgkggsggsgkggsggsgk，seq id no：12)，且之后利用液态合成将dota分子耦接到中心核上。
[0199]
利用反相高效液态层析(hplc)来分析所合成的螯合剂束的纯化样本，使用supelco c18管柱(250mm
×
4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈及0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为0％至100％、30分钟，流速为1.0ml/min且管柱温度为35℃。图3a为实施例2的螯合剂束的反相hplc图谱，图中显示在滞留时间7.06分钟可观察到螯合剂束的峰值。
[0200]
利用质谱maldi
‑
tof分析来确认所合成的mal
‑
多肽2
‑
dota束。图3b的maldi
‑
tof质谱分析结果显示此处提出的螯合剂束的分子量为3,093.454道尔顿。
[0201]
实施例3
[0202]
重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的建构、表达与纯化
[0203]
对人类cd19专一的scfv的v
l
及v
h
来自单株抗体rb4v1.2。编码scfv
‑
ch2
‑
ch3(人类γ1)重组链的基因序列的建构方式如下：将编码对人类cd19专一的scfv的基因序列接到编码igg1.fc的可挠性绞链区域与ch2域的上游位置，并将编码金属结合域(mbm)
‑
1，即acpgha序列(seq id no：7)的基因序列接到编码igg1.fc的ch3域以及一短的可挠性接合物gggg(seq id no：9)的下游位置。
[0204]
将scfv建构为两种方向，即，v
l
‑
接合物
‑
v
h
及v
h
‑
接合物
‑
v
l
，其中v
l
及v
h
是透过一亲水性接合物所连接，其序列为gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no：10)。此处提出的(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的v
l
‑
接合物
‑
v
h
及v
h
‑
接合物
‑
v
l
组态的重组链的氨基酸序列分别如seq id no：13及14所示，且图4a公开了该等双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1分子构建体的一般结构。
[0205]
在利用哺乳类动物表达系统来制备重组蛋白时，采用以expi293f
tm
细胞为基础的过度表达系统。所用系统使用expifectamine
tm
293转染套组(life technologies,carlsbad,usa)，其包含expi293f
tm
细胞株、阳离子脂质是expifectamine
tm
293试剂、expifectamine
tm
293转染强化剂1与2、以及培养基(gibco,new york,usa)。
[0206]
将编码基因的序列置于pcdna3表达盒中。将expi293f细胞以每毫升2.0
×
106个活细胞的密度播于expi293f表达培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有7.5
×
108个细胞的255ml培养基置于2
‑
l艾氏烧瓶中，并加入expifectamine
tm
293转染试剂。在转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器((125rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入expifectamine
tm
293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育5到6天。收集培养上清液，并使用蛋白a亲和力层析法纯化培养基中的higg1.fc融合重组蛋白。
[0207]
将缓冲液置换为pbs，之后利用10％sds
‑
page测定此处提出的(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的浓度并进行分析。分析结果显示，在非还原sds
‑
page上，此处提出的(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的分子量为约120kda，比预期分子量110kda大了一些。图4b为双链(v
l
‑
v
h scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的非还原sds
‑
page分析结果，请见箭头所指处的主要条带。当可理解，sds
‑
page结果仅是用来快速地确认所合成的分子构建体的大约分子量，且可利用质谱分析来测定更为精确的分子量。举例来说，此处提出的分子构建体的maldi
‑
tof分析结果如图23所示。
[0208]
实施例4
[0209]
重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
2的建构、表达与纯化
[0210]
在本实施例中，利用与上文实施例相似的方式来建构、表达与纯化v
l
‑
接合物
‑
v
h
组态的重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
2，差异之处在于此处使用了不同的金属结合域，其序列为gcpgha(seq id no：8，下称mbm
‑
2)。此处提出的(v
l
‑
v
h scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
2的重组链的氨基酸序列如seq id no：15所示。
[0211]
图5的sda
‑
page结果显示此处提出的分子构建体的重组链大小为约120kda(如箭头所示)，略大于预期大小。
[0212]
实施例5
[0213]
重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
3的建构、表达与纯化
[0214]
在本实施例中，利用与上文实施例相似的方式来建构、表达与纯化v
l
‑
接合物
‑
v
h
组态的重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
3，差异之处在于此处使用了不同的金属结合域，其序列为gcggha(seq id no：6，下称mbm
‑
3)。此处提出的v
l
‑
接合物
‑
v
h
组态的(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
3重组链的氨基酸序列如seq id no：16所示。
[0215]
利用sds
‑
page来鉴定(v
l
‑
v
h scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
3分子构建体。图6的sda
‑
page结果显示此一新分子构建体的重组链大小为约110kda(如箭头所示)，与预期大小相符。
[0216]
实施例6
[0217]
重组抗
‑
cd19抗体
‑
mbm的建构、表达与纯化
[0218]
将短的可挠性接合物gggg(seq id no：9)及mbm序列(在本实施例中，mbm
‑
1或mbm
‑
2)接到对c19专一的完整抗体的重链c
‑
端，以建构出重组igg(人类γ1)分子构建体。将上述基因序列插入带有多个选殖位点的pg1k表达盒中。利用与上文实施例相似的方式来表达与纯化此处提出的重组抗
‑
cd19抗体
‑
mbm。
[0219]
对人类cd19专一抗体的重链
‑
mbm
‑
1或mbm
‑
2的氨基酸序列分别如seq id no：17及18所示，而全长抗
‑
cd19抗体轻链的氨基酸序列如seq id no：19所示。
[0220]
利用sds
‑
page来鉴定所述分子构建体。图7a的还原sda
‑
page结果显示对照蛋白(电泳条1)、人类cd19抗体
‑
mbm
‑
1(电泳条2)以及人类cd19抗体
‑
mbm
‑
2(电泳条3)有一个较大的分子量条带为约55kda以及一个较小的分子量条带为约25kda，分别与本分子构建体的重链及轻链的预期大小相符。
[0221]
抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
1分子构建体的一般结构如图7b所示。
[0222]
实施例7
[0223]
重组双链(scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm的建构、表达与纯化
[0224]
对人类cd33专一的scfv的v
l
及v
h
来自单株抗体humy9
‑
6。编码(scfvαcd33)
‑
ch2
‑
ch3(人类γ1)重组链的基因序列的建构方式如下：将编码对人类cd33专一的scfv的基因序列接到编码igg1.fc的可挠性绞链区域与ch2域的上游位置，并将编码mbm
‑
1或mbm
‑
2的基因序列接到编码igg1.fc的ch3域以及一短的可挠性接合物gggg(seq id no：9)的下游位置。
[0225]
将scfv建构为两种方向，即，v
l
‑
接合物
‑
v
h
及v
h
‑
接合物
‑
v
l
，其中v
l
及v
h
是透过一亲水性接合物所连接，其序列为gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no：10)。此处提出的(scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的v
l
‑
接合物
‑
v
h
及v
h
‑
接合物
‑
v
l
组态的重组链的氨基酸序列分别如seq id no：20及21所示，而此处提出的(scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm
‑
2的v
l
‑
接合物
‑
v
h
及v
h
‑
接合物
‑
v
l
组态的重组链的氨基酸序列分别如seq id no：22及23所示。
[0226]
利用与上文实施例相似的方式来表达与纯化此处提出的重组双链(scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm。
[0227]
利用非还原sds
‑
page来鉴定所述分子构建体。图8的sda
‑
page结果显示(v
l
‑
v
h scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm
‑
1(电泳条1)、(v
h
‑
v
l scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm
‑
1(电泳条2)、(v
l
‑
v
h scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm
‑
2(电泳条3)以及(v
h
‑
v
l scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm
‑
2(电泳条4)各有一个约120kda大小的条带，略大于110kda的预期大小。
[0228]
实施例8
[0229]
重组双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm的建构、表达与纯化
[0230]
对人类cd20专一的scfv的v
l
及v
h
来自奥珠单抗(ocrelizumab)。将金属结合域mbm
‑
1、mbm
‑
2或mbm
‑
3分别过一短的可挠性接合物gggg(seq id no：9)接到(scfvαcd20)
‑
ch2
‑
ch3(人类γ1)重组链ch3域的c
‑
端。将scfv建构为两种方向，即，v
l
‑
接合物
‑
v
h
及v
h
‑
接合物
‑
v
l
，其中v
l
及v
h
是透过一亲水性接合物所连接，其序列为gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no：10)。
[0231]
利用与上文实施例相似的方式来表达与纯化此处提出的重组双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1、
‑
mbm
‑
2或
–
mbm
‑
3。此处提出的(v
l
‑
v
h scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1、(v
h
‑
v
l scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1、(v
h
‑
v
l scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
2、(v
l
‑
v
h scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
3以及(v
h
‑
v
l scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
3重组链的序列分别如seq id no：24、25、26、27与28所示。
[0232]
利用与上文实施例相似的方式来表达与纯化此处提出的重组双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm。
[0233]
利用非还原sds
‑
page来鉴定所述分子构建体。图9的sda
‑
page结果显示(v
l
‑
v
h scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1(电泳条1)以及(v
h
‑
v
l scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1(电泳条2)两种分子构建体的大小为约120kda，略大于110kda的预期大小。图10a及图10b的sda
‑
page结果分别显示(v
h
‑
v
l scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
2以及(v
l
‑
v
h scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
3两种分子构建体的大小为约120kda，略大于110kda的预期大小。
[0234]
实施例9
[0235]
重组双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm的建构、表达与纯化
[0236]
生产抗ca19
‑
9抗体的小鼠b细胞融合瘤细胞hb8059购自艾荷华大学的developmental studies hybridoma bank。利用superscript iii rt
‑
pcr系统(invitrogen,waltham,usa)将poly(a)+rna反转录，并合成第一股cdna。hb8059的v
h
与v
l
的核苷酸与氨基酸序列先前未曾发表过。为了决定hb8059可变区域的序列，使用ig
‑
primer sets(novagen,madison,usa)提供的引子并根据制造商的指引透过pcr来扩增v
h
与v
l
的cdna。对人类ca19
‑
9专一的hb8059单株抗体的v
h
及v
l
的氨基酸序列分别如seq id no：29及30所示。
[0237]
将mbm
‑
1或mbm
‑
3分别过一短的可挠性接合物gggg(seq id no：9)接到(scfvαca19
‑
9)
‑
ch2
‑
ch3(人类γ1)重组链ch3域的c
‑
端。scfv的方向为v
l
‑
接合物
‑
v
h
，其中v
l
及v
h
是透过一亲水性接合物所连接，其序列为gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no：10)。此处提出的(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1及(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
3的重组链的序列分别如seq id no：31及32所示。
[0238]
利用与上文实施例相似的方式来表达与纯化此处提出的重组双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm。
[0239]
利用sds
‑
page来鉴定所述分子构建体。图11a及图11b的sda
‑
page结果显示(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1以及(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
3两种分子构建体的重组链的大小为约120kda(电泳条1)，略大于110kda的预期大小。
[0240]
实施例10
[0241]
重组双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm的建构、表达与纯化
[0242]
对人类cd38专一的scfv的v
l
及v
h
来自达拉他单抗(daratumumab)。将金属结合域mbm
‑
1与mbm
‑
2分别过一短的可挠性接合物gggg(seq id no：9)接到(scfvαcd38)
‑
ch2
‑
ch3(人类γ1)重组链ch3域的c
‑
端。将scfv建构为两种方向，即，v
l
‑
接合物
‑
v
h
及v
h
‑
接合物
‑
v
l
，
其中v
l
及v
h
是透过一亲水性接合物所连接，其序列为gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no：10)。利用与上文实施例相似的方式来表达与纯化此处提出的重组双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1或
‑
mbm
‑
2。此处提出的(v
l
‑
v
h scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1、(v
h
‑
v
l scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1、(v
l
‑
v
h scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
2以及(v
h
‑
v
l scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
2的重组链的序列分别如seq id no：33、34、35与36所示。
[0243]
利用sds
‑
page来鉴定所述分子构建体。图12a的sda
‑
page结果指出(v
l
‑
v
h scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1(电泳条1)重组链的大小为约120kda，略大于110kda的预期大小。图12b的sda
‑
page结果指出，(v
l
‑
v
h scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
2重组链的大小为约120kda，略大于110kda的预期大小。
[0244]
实施例11
[0245]
重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的制备
[0246]
在本实施例中，制备一分子构建体，其带有两个dota束，分别耦接于双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的金属结合域的半胱氨酸残基；图13a绘示此分子构建体的概要结构。为了还原实施例3的纯化重组双链(v
l
‑
v
h scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1在c
‑
端的半胱氨酸残基，将琥珀酸钠缓冲液(10mm琥珀酸钠、ph6.0及30mm蔗糖)中的重组蛋白和45μm的三(2
‑
羧乙基)膦(tris(2
‑
carboxyethyl)phosphine，简称tcep)在室温下轻轻摇晃以培育30分钟。在还原反应后，以10mm琥珀酸钠缓冲液(ph 6.0含30mm蔗糖)含60μm zn(ii)离子进行透析，以移除多余的tcep。之后，以15μm实施例2的mal
‑
多肽2
‑
dota束来处理还原蛋白样本，接着在室温下培育1小时。利用脱盐柱移除未反应的dota束，并利用sds
‑
page来分析产物。
[0247]
图13b为此处提出的分子构建体的sds
‑
page分析结果，图中显示此处提出的分子构建体的分子量为约120kda(电泳条2，如箭头所示)，略小于预期大小。电泳条1为未经耦接的融合蛋白样本。如图13b所示，dota束与重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的耦接产率约为90％。利用image j来定量sds
‑
page上的蛋白条带。
[0248]
实施例12
[0249]
重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
2 x 2 dota束的制备
[0250]
在本实施例中，利用上文实施例所述的方法将两个dota束耦接至实施例4的重组双链(v
l
‑
v
h scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
2。
[0251]
图14为此处提出的分子构建体的sds
‑
page分析结果，图中显示此处提出的分子构建体的分子量为约120kda(电泳条2，如箭头所示)，与预期大小相符或略小。电泳条1为未经耦接的融合蛋白样本。如图14所示，dota束与重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
2的耦接产率约为90％。
[0252]
实施例13
[0253]
重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
3 x 2 dota束的制备
[0254]
在本实施例中，利用上文实施例所述的方法将两个dota束耦接至实施例5的重组双链(v
l
‑
v
h scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
3。
[0255]
图15为此处提出的分子构建体的sds
‑
page分析结果，图中显示此处提出的分子构建体的分子量为约120kda(电泳条2，如箭头所示)，与预期大小相符或略小。电泳条1为未经耦接的融合蛋白样本。如图15所示，dota束与重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
3的耦接产率约为90％。
[0256]
实施例14
[0257]
抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的制备
[0258]
在本实施例中，利用上文实施例所述的方法将两个dota束耦接至实施例6的c端接有mbm
‑
1的全长人类抗
‑
cd19抗体。
[0259]
图16为此处提出的抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束分子构建体的sds
‑
page分析结果。如图16所示，重链的分子量约为54kda(如电泳条2中箭头#1所示)，与预期大小相符。电泳条2中箭头#2为抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
1的未经耦接的重链，及箭头#3为抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
1的轻链。
[0260]
实施例15
[0261]
抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
2 x 2 dota束的制备
[0262]
在本实施例中，利用上文实施例所述的方法将两个dota束耦接至实施例6的c端接有mbm
‑
2的全长人类抗
‑
cd19抗体。
[0263]
图17为此处提出的分子构建体的sds
‑
page分析结果。如图17所示，重链的分子量约为54kda(如电泳条2中箭头#1所示)，与预期大小相符。电泳条2中箭头#2为抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
1的未经耦接的重链，及箭头#3为抗
‑
cd19抗体
‑
mbm
‑
2的轻链。
[0264]
实施例16
[0265]
重组双链(scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm x 2 dota束的制备
[0266]
在本实施例中，利用上文实施例所述的方法将两个dota束耦接至实施例7的重组双链(v
l
‑
v
h scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm
‑
1或
–
mbm
‑
2。
[0267]
图18为将dota束耦接至重组双链(scfvαcd33)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的sds
‑
page分析结果。如图18所示，本分子构建体的分子量为约120kda(如电泳条2中箭头#1所示)，与预期大小相符或略小。电泳条1中箭头#2为未经耦接的融合蛋白。sds
‑
page分析结果显示dota束与重组双链(scfvαcd33)
‑
higg1.fc
–
mbm
‑
1的耦接产率约为65％。
[0268]
实施例17
[0269]
重组双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的制备
[0270]
在本实施例中，利用上文实施例所述的方法将两个dota束耦接至实施例8的重组双链(v
l
‑
v
h scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1。
[0271]
图19为将dota束耦接至重组双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的sds
‑
page分析结果。如图19所示，本分子构建体的分子量为约120kda(如电泳条2中箭头#1所示)，与预期大小相符或略小。电泳条1中箭头#2为未经耦接的融合蛋白。图19的sds
‑
page分析结果显示dota束与重组双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的耦接产率约为65％。
[0272]
实施例18
[0273]
重组双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm x 2 dota的制备
[0274]
在本实施例中，利用上文实施例所述的方法将两个dota束耦接至实施例9的重组双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1或
–
mbm
‑
3。sds
‑
page分析结果显示，dota束与重组双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1及
–
mbm
‑
3的耦接产率分别为约65％与70％(资料未示出)。
[0275]
实施例19
[0276]
双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的稳定化
[0277]
利用以下方法进行开环反应以使双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束更为稳
定。
[0278]
利用nap
‑
10sephadex g
‑
25管柱(ge healthcare)以tris缓冲液(100mm tris、ph 9.0，100mml
‑
精氨酸，以及100mm氯化钠)来置换实施例14制得的分子构建体反应产物的缓冲液。之后将所得溶液加热至37℃并持续5小时。待溶液冷却后，藉由离心将缓冲液置换为50mm bis
‑
tris缓冲液、ph 5.5。将最终样本离心以得到约1至3mg/ml蛋白。
[0279]
纯化时，调整经稳定的产物至ph 5.5，之后加入预平衡的(50mmbis
‑
tris缓冲液、ph 5.5)阴离子交换管柱hi
‑
traptm q hp(ge healthcare)。利用阶梯式冲提法处理经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束，所用条件为：250mm nacl、15分钟，且线性梯度为250mm至324mm的nacl、流速1.0ml/分、进行50分钟。
[0280]
之后使用阴离子交换管柱q hp将经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束与未耦接的双链融合蛋白、和三或四个dota束耦接的双链融合蛋白以及团聚物分离开来。将纯化产物，即双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束，浓缩并将缓冲液置换为tris缓冲液(50mmtris缓冲液、ph7.0及290mm nacl)。
[0281]
图20为经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的阴离子交换管柱fplc q hp冲提图谱。如图20所示，在69.91分钟可观察到经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的冲提峰值。图21显示对收集自阴离子交换管柱q hp不同馏份的sds
‑
page分析结果。电泳条a、b、c、d分别对应于未耦接的分子构建体，耦接一个dota束的分子构建体、储备溶液中的经稳定的耦接两个dota束的分子构建体以及载入管柱前的储备溶液中的经稳定的耦接两个dota束的分子构建体。
[0282]
由图21的馏份#53、#54及#55收集纯的产物，即，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束。
[0283]
实施例20
[0284]
双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的稳定化
[0285]
经稳定的双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的纯化
[0286]
利用与上文实施例19类似的方法来稳定化双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束。
[0287]
纯化时，调整经稳定的产物至ph 5.1，之后加入预平衡的(50mm醋酸、ph 5.1)阴离子交换管柱hi
‑
traptm q hp(ge healthcare)。利用阶梯式冲提法处理经稳定的双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束，所用条件为：300mm nacl、18分钟，且线性梯度为300mm至1,000mm的nacl、流速1.0ml/分、进行80分钟。
[0288]
之后使用阴离子交换管柱q hp将经稳定的双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束与未耦接的双链融合蛋白、和三或四个dota束耦接的双链融合蛋白以及团聚物分离开来。
[0289]
图22显示对收集自阴离子交换管柱q hp不同馏份的sds
‑
page分析结果。电泳条a、b、c分别对应于未耦接的分子构建体，耦接一个dota束的分子构建体以及载入管柱前的经稳定的耦接两个dota束的分子构建体。
[0290]
由图22的馏份#40及#41收集纯的产物，即，经稳定的双链(scfvαcd20)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束。
[0291]
实施例21
[0292]
经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的maldi
‑
tof分析
[0293]
利用maldi
‑
tof质谱仪来分析实施例19的经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束。图23的maldi
‑
tof分析结果显示经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束样本的分子量是114,435及57,306道尔顿，分别对应于m/z(z＝1):[m+h]
+
及m/z(z＝2):[m+2h]
2+
。
[0294]
实施例22
[0295]
89
y
‑
标记双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的制备
[0296]
在本实施例中，将y(no3)3溶液加入含有来自实施例19的经纯化的稳定双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的溶液中，摩尔比为6:1[y
3+
离子：蛋白]；在室温下将反应混合物培育6小时。利用nap
‑
10sephadex g
‑
25管柱自溶液中移除游离的y
3+
离子。利用maldi
‑
tof质谱仪来分析经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2[
89
y]
3+
螯合
‑
dota束。图24的maldi
‑
tof分析结果显示此处提出的分子构建体的分子量为114,391道尔顿。
[0297]
实施例23
[0298]
175
lu
‑
标记双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的制备
[0299]
在本实施例中，将lucl3溶液加入含有经纯化的稳定双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的溶液中，摩尔比为60:1[lu
3+
离子：蛋白]；接着在45℃将反应混合物培育1.5小时，以得到
175
lu
‑
dota
‑
蛋白螯合物。利用旋转过滤(amicon离心过滤机，10kda)，自溶液中移除游离的lu
3+
离子。利用maldi
‑
tof质谱仪来分析经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 175
lu螯合
‑
dota束。图25的maldi
‑
tof分析结果显示此处提出的分子构建体的分子量为114,928道尔顿。
[0300]
实施例24
[0301]
111
ln
‑
标记双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的制备
[0302]
在制备
111
in
‑
标记融合蛋白时，将不含载体的
111
in于50mm hci中的等分试样转移到试管中，并加入20倍体积的不含金属的0.1m hepes缓冲液，以将溶液的ph值调整至4.5。之后，加入双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束(30
‑
50μg)的0.1m hepes缓冲液(ph 4.5)溶液，蛋白最终浓度为0.3
‑
0.6mg/ml。将所得到的溶液轻轻混合，并在40
‑
45℃下培育60分钟。加入蛋白质1,000倍量的二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid，简称dtpa)以捕捉游离的
111
in
3+
离子并使反应淬灭。在37℃下培育30分钟后，自
111
in
‑
标记产物移除
111
in
‑
dtpa螯合物，并以旋转过滤(amicon离心过滤机，10kda)将溶剂置换为0.9％食盐水。
[0303]
利用一γ
‑
计数器测量适量等分试样样本的放射活度，以决定收集到的
111
in
‑
标记产物的比活度。
[0304]
实施例25
[0305]
111
in
‑
标记双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的放射掺入分析
[0306]
以即时薄层色层分析法(instant thin
‑
layer chromatography，itlc)来进行放射化学纯度分析。利用原始溶剂将实施例24的放射标记产物溶液以1:10或1:20稀释；之后，将1μl的样本点在1
×
10cm的tlc sg试纸条的一端。利用生色谱法以0.5m柠檬酸钠(ph 4.5)使试纸显影。利用放射
‑
tlc扫描仪来测定放射活度。与蛋白质相关的放射活度表示为总放射活度的百分比。如图26所示，
111
in标记双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的放射化
学纯度高于98％。
[0307]
实施例26
[0308]
111
in
‑
标记双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束在血清中的安定性测试
[0309]
以小鼠血清在37℃下将
111
in
‑
标记双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束处理96小时也测定其活体外安定性。将实施例24的
111
in
‑
标记的分子构建体悬浮于0.2m醋酸铵(ph 5)中。利用小鼠血清以1:10的比例稀释
111
in
‑
标记的分子构建体，之后再培育于37℃下96小时。在选定的时间点(0、12、24、48及96小时)，移除
111
in
‑
标记分子并以实施例25所述的放射
‑
tlc法分析。
[0310]
如图27所示，将
111
in
‑
标记双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束在小鼠血清中于37℃下培育96小时后能可展现理想的放射活性。
[0311]
实施例27
[0312]
重组双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的位置专一耦接
[0313]
为了确认双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1中与dota束耦接的半胱氨酸残基，将样本分解后利用lc
‑
ms进行分析。简而言之，将来自实施例11的5μl样本(0.4μg/ml)以含15μl的25mm四乙硼酸四乙铵(tetraethylammonium tetrahydroborate，teab)以及2μl的200mm tcep的溶液稀释，并于55℃下培育1小时。之后，向反应混合物加入2μl的375mm醋酸碘(iaa)并在室温下培育30分钟。在经过iaa烷基化之后，将酵素(胰蛋白酶与glu
‑
c)加入溶液中，并于37℃下反应一夜以使酵素分解样本。
[0314]
质谱分析资料(资料未示出)显示ms光谱中片段的m/z值对应于4,530.99道尔顿，与含有slslspggggacpgha(seq id no：13的第468
‑
483个氨基酸残基)氨基酸序列的分子构建体以及一个dota束的判断的分子量相符。
[0315]
实施例28
[0316]
经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束对人类b淋巴瘤细胞株的结合活性
[0317]
分析两种经稳定的分子构建体，即(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束以及(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
3 x 2 dota束，对人类b淋巴瘤细胞株raji上的人类cd19的结合能力。将1
×
106个表达cd19的raji细胞和0.001μg/ml的分子构建体pbs溶液一起在1％bsa中于冰上一起培育30分钟，抗
‑
cd19抗体(rb4v1.2)、(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束以及(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
3 x 2 dota束作为正对照组。抗
‑
her2抗体(曲妥珠单抗)作为负对照组。利用facs(facscanto ii,bd biosciences)来分析细胞染色情形，以fitc
‑
复合的山羊抗人类igg.fc(于pbs/bsa以1:200稀释)(caltag,buckingham,uk)在4℃下于黑暗中处理20分钟。图27a及27b显示含mbm
‑
1及mbm
‑
3的两种分子构建体在表达cd19的raji细胞上的细胞染色结果，结果指出这两种分子构建体都能够实质地和raji细胞结合。
[0318]
分析上述分子构建体对人类b淋巴瘤细胞株ramos上的人类cd19的结合能力。利用与上文针对raji细胞进行细胞结合分析类似的方法来进行此处的分析。以fitc
‑
复合的山羊抗人类igg.fc利用facs(facscanto ii,bd biosciences)来分析ramos细胞染色情形，其中抗
‑
cd19 igg作为正对照组。抗
‑
her2抗体(曲妥珠单抗)作为负对照组。图27c及27d显示含mbm
‑
1及mbm
‑
3的两种分子构建体在表达cd19的ramos细胞上的细胞染色结果。这两种分子构建体都能够实质地和ramos细胞结合。
[0319]
实施例29
[0320]
经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的安定性
[0321]
为了平经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的安定性，将分子构建体置于含谷胱甘肽或人类血清白蛋白(hsa)的tris缓冲液(100mmtris缓冲液、ph 7.3，50mm bis
‑
tris缓冲液以及290mm nacl)中，并于37℃下培育30天。
[0322]
如图28所示，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束在和谷胱甘肽或人类血清白蛋白一起在37℃下培育30天后仍可展现理想的安定性。如图28所示，在谷胱甘肽和人类血清白蛋白处理的两个组别中，溶液中仍保有约90％的全长分子构建体而无逆向迈克尔加成(michael addition)产物。电泳条u及c分别对应于未耦接的分子构建体及储存于4℃下的经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束，以作为对照。
[0323]
实施例30
[0324]
经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的逆向迈克尔加成产物的检视
[0325]
为了进一步确认双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的安定性，将经稳定的分子构建体和谷胱甘肽或has一起培育，之后再利用蛋白免疫印迹分析。
[0326]
简单来说，在对经稳定的样本进行蛋白免疫印迹时，先以8％sds
‑
page凝胶分离样本，并转移至及聚偏二氟乙烯(poly(vinylidene fluoride，pvdf)膜(millipore)上。以含5％bsa与0.05％tween 20的pbs在室温下处理1小时，以阻断膜上的墨点。在以含pbs与0.05％tween
‑
20的磷酸盐缓冲液
‑
tween20(pbst)冲洗3次后，接着再将墨点和与山葵过氧化酶(hrp)复合的山羊抗人类igg.fc抗体(millipore)一起培育。之后，以pbst清洗膜3次，利用ecltm蛋白免疫印迹侦测试剂(millipore)来侦测免疫反应条带并曝光于fujifilm(tokyo,japan)上。
[0327]
图30为经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的蛋白免疫印迹分析结果。如图29所示，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束在和谷胱甘肽或人类血清白蛋白一起在37℃下培育30天后仍可展现理想的安定性，相较于储存于4℃下经稳定的分子构建体(电泳条c)。电泳条u为作为对照的未耦接的分子构建体。
[0328]
实施例31
[0329]
经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的半衰期
[0330]
对小鼠体以静脉内注射经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束后，测定其半衰期。利用elisa来分析血清中的(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束。本实验使用购自biolasco(台湾地区，中国)8至10周龄的balb/c小鼠。将小鼠分为每组6只，并静脉内注射约200μl的3.33μm蛋白。
[0331]
图31示出抗
‑
cd19抗体(rb4v1.2)与双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1融合蛋白的药动学图谱，由图中可以看出抗
‑
cd19抗体(rb4v1.2)、实施例3的(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1融合蛋白、实施例18的分子构建体(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束以及实施例19的经稳定的分子构建体(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束from实施例19的半衰期分别为约129、179.6、153.6以及193.5小时。总结来说，稳定化处理可以延长经稳定的分子构建体的半衰期。
[0332]
实施例32
[0333]
经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束对表达cd19的异种移植肿瘤的
标的效果
[0334]
在本实施例中，利用活体内显影系统(in vivo imaging system，ivis)来测定经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束对小鼠异种移植模型中表达cd19的肿瘤的标的效果。在ivis显影前，根据制造商的指示，以dylight680抗体标记套组(thermo scientific)来标记实施例19的经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束以及抗
‑
cd19抗体(rb4v1.2)。
[0335]
本实验使用购自台湾地区“中研院”细胞与个体生物学研究所实验动物工厂(台湾地区，中国)8至10周龄的nod
‑
scid(nod.cb17
‑
prkdcscid/jnarl)。在处理前两周，将1
×
107个b细胞淋巴瘤raji细胞以腹膜内注射至每只小鼠体内。将小鼠分为每组三只小鼠，并静脉内注射约200μl的6.65μm标记分子。在不同的时间点，在氧气中以异氟烷麻醉小鼠并以仰卧姿放置于ivis spectrum in vivo imaging system (perkinelmer)中。利用living image software v3.2在ex/em＝675/720条件下撷取萤光影像。在指定时间ivis spectrum imager获取影像后，利用living image软体分析。
[0336]
在注射dylight 680
‑
复合蛋白后的第0、24、48及72小时撷取nod
‑
scid小鼠萤光影像并进行分析。图32显示萤光标记分子在小鼠模型中的分布。nod
‑
scid小鼠经静脉内注射抗
‑
cd19抗体(rb4v1.2)(1及2)以及经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束(3及4)。
[0337]
如图32所示，在静脉内注射后第24、48与72小时后，经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束及抗
‑
cd19抗体(rb4v1.2)进入位于右方的肿瘤内的量远高于进入左方正常器官的量。因此，经稳定的分子构建体对小鼠异种移植模型中表达cd19的肿瘤展现了理想的标的效果。
[0338]
实施例33
[0339]
经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束在表达cd19的异种移植肿瘤小鼠内的生体分布
[0340]
利用实施例32所述方法并稍加改变，以评估经稳定的(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束在异种移植小鼠模型体内的生体分布。
[0341]
简而言之，在处理前2至3周，对每只小鼠皮下注射1
×
107个b细胞淋巴瘤raji细胞。小将小鼠分为每组三只小鼠，并静脉内注射约200μl的6.65μm标记分子。
[0342]
在注射经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束以及抗
‑
cd19抗体的后7天进行组织elisa以分析nod
‑
scid小鼠的生体分布。简而言之，在注射后第7天将动物牺牲。将心脏血液放血，并收集11个器官的组织样本。以均质机将组织样本均质化，并以elisa进一步分析其中的注射分子浓度。
[0343]
图33为小鼠模型中经稳定的双链(scfvαcd19)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束(te
‑
1122)的分布。生物分布图中y轴代表组织对血液的比例。此处的结果亦显示经稳定的分子构建体能够标的到小鼠异种移植模型中表达cd19的肿瘤。
[0344]
实施例34
[0345]
带有末端半胱氨酸残基的aib
‑
glp
‑
1促效剂的合成
[0346]
在本实施例中，制备c
‑
端含自由半胱氨酸且带有一个ε
‑
氨基异丁酸(ε
‑
aminoisobutyric acid，aib)取代基的似升糖素多肽1(glucagon
‑
like peptide 1，glp
‑
1)
促效剂(seq id no：37)。图34为本分子构建体的概要结构。与索马鲁肽(semaglutide)类似，其第二个氨基酸残基经aib(或u)残基取代，使其较能抵抗二肽基肽酶iv(dipeptidyl peptidase iv，dpp 4)引发的降解；然而，在本分子构建体中，在索马鲁肽的最后一个甘氨酸残基(即，seq id no：37的第46个氨基酸残基之前加入了长度为15个氨基酸残基的可挠性接合物(即，seq id no：37的第31至45个氨基酸残基)，并在c
‑
端加入一末端半胱氨酸残基。
[0347]
本发明的发明人设计了aib
‑
glp
‑
1促效剂
‑
cys的结构，并委由shanghai wuxi apptech co.,ltd.(上海，中国)合成。
[0348]
利用反相分析级在hplc在supelco c18管柱(250mm
×
4.6mm；5μm)上分析aib
‑
glp
‑
1促效剂
‑
cys的纯化样本，流动相使用乙腈及0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为0％至100％、30分钟，流速为1.0ml/min且管柱温度为25℃。
[0349]
利用esi
‑
ms质谱分析来鉴定aib
‑
glp
‑
1促效剂
‑
cys产物。aib
‑
glp
‑
1促效剂
‑
cys产物样本在1,483.4处显现出强的分子离子，对应于[m+h]
+
，这代表此处提出的aib
‑
glp
‑
1促效剂
‑
cys促效剂的真实分子量为1,482.4道尔顿。
[0350]
实施例35
[0351]
带有末端半胱氨酸残基的体抑素类似物的合成
[0352]
在本实施例中，制备n
‑
端带有自由半胱氨酸的体抑素类似物；此一cys
‑
体抑素多肽分子构建体的氨基酸序列如seq id no：38所示。图35为本分子构建体的概要结构。本分子构建体有14个氨基酸残基，其中加入一n
‑
末端半胱氨酸残基，之后接着5个氨基酸残基的可挠性接合物以及体抑素多肽序列。与原始的体抑素多肽相似，此处提出的cys
‑
体抑素多肽分子构建体的第七个氨基酸残基(phe)以及第十个氨基酸残基(trp)为d型，且在第8与第13个半胱氨酸残基间形成一双硫桥，且c
‑
端的苏氨酸残基为苏胺醇。此外，cys
‑
体抑素多肽分子构建体的n
‑
端经乙酰基修饰。
[0353]
本发明的发明人设计了此处提出的cys
‑
体抑素多肽分子构建体的结构，并委由ontores biotechnologies co.,ltd.(杭州，中国)以标准固态合成法合成。cys
‑
体抑素多肽产物的纯度高于95％。
[0354]
利用maldi
‑
tof质谱仪来分析cys
‑
体抑素多肽产物。于台湾地区“中研院”分子生物研究院(imb，台湾地区，中国)质谱核心设施实施质谱分析。所用的设备为bruker autoflex iii maldi
‑
tof/tof质谱(购自bruker daltonics，bremen，德国)。图36的maldi
‑
tof质谱分析结果显示，此处提出的分子构建体的分子量为1,493.587道尔顿。
[0355]
实施例36
[0356]
带有半胱氨酸残基的psma配体的合成
[0357]
在本实施例中，制备带有自由半胱氨酸残基的psma配体，此分子构建体的结构如图37所示。
[0358]
本发明的发明人设计了此处提出的cys
‑
psma配体分子构建体的结构，并委由shanghai wuxi apptech co.,ltd.(上海，中国)合成。cys
‑
psma配体产物的纯度高于95.0％。
[0359]
利用esi
‑
ms质谱分析来鉴定cys
‑
psma配体。图38的esi
‑
ms质谱分析结果显示，此处提出的分子构建体在522.4处显现出强的分子离子，对应于[m+h]
+
，这代表cys
‑
psma配体
的真实分子量为521.4道尔顿。
[0360]
实施例37
[0361]
降钙素
‑
mbm
‑
1的合成
[0362]
在本实施例中，制备c
‑
端带有金属结合域的降钙素的分子构建体；此降钙素
‑
mbm
‑
1分子构建体的氨基酸序列如seq id no：39所示。图39为本分子构建体的概要结构。与降钙素相似，在与第七个半胱氨酸残基间形成一双硫桥；然而，在本分子构建体中，在降钙素的最后一个脯氨酸残基(即，seq id no：39的第32个氨基酸残基)之后引入长度为8个氨基酸残基(seq id no：39的第33
‑
40个氨基酸残基)的可挠性接合物，并将mbm
‑
1域(acpgha，seq id no：7)加入至可挠性接合物的c
‑
端。
[0363]
本发明的发明人设计了此处提出的降钙素
‑
mbm
‑
1分子构建体的结构，并委由shanghai wuxi apptech co.,ltd.(上海，中国)合成。cys
‑
psma配体产物的纯度高于95.0％。
[0364]
实施例38
[0365]
特立帕肽
‑
mbm
‑
1的合成
[0366]
在本实施例中，制备c
‑
端带有金属结合域的特立帕肽的分子构建体；此特立帕肽
‑
mbm
‑
1分子构建体的氨基酸序列如seq id no：40所示。特立帕肽是一种甲状旁腺(pth)激素，其是由该激素的前34个氨基酸的活性部位所组成。其可用以至郎某些型式的骨质酥松症。在特立帕肽
‑
mbm
‑
1分子构建体中，在特立帕肽的最后一个苯丙氨酸残基(即，seq id no：40的第34个氨基酸残基)之后引入长度为15个氨基酸残基(seq id no：40的第35
‑
49个氨基酸残基)的可挠性接合物，并将mbm
‑
1域(acpgha，seq id no：7)加入至可挠性接合物的c
‑
端。
[0367]
本发明的发明人设计了此处提出的特立帕肽
‑
mbm
‑
1分子构建体的结构，并委由shanghai wuxi apptech co.,ltd.(上海，中国)合成。cys
‑
psma配体产物的纯度高于95.0％。
[0368]
实施例39
[0369]
亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3的合成
[0370]
在本实施例中，制备c
‑
端带有金属结合域的亮丙瑞林的分子构建体；此亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3分子构建体的氨基酸序列如seq id no：41所示。亮丙瑞林(亦称为柳菩林)是一种促性腺激素释放激素(gonadotropin
‑
releasing hormone，gnrh)类似物，可作为多种gnrh受体的促效剂，并可用于治疗前列腺癌与乳癌。可商业购得的亮丙瑞林是有9个氨基酸残基的寡肽。在此处提出的亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3分子构建体中，在亮丙瑞林的最后一个脯氨酸残基(即，seq id no：41的第9个氨基酸残基)之后引入长度为8个氨基酸残基(seq id no：41的第10
‑
17个氨基酸残基)的可挠性接合物，并将mbm
‑
3域(gcggha，seq id no：6)加入至可挠性接合物的c
‑
端。
[0371]
本发明的发明人设计了此处提出的亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3分子构建体的结构，并委由shanghai wuxi apptech co.,ltd.(上海，中国)合成。利用esi
‑
ms质谱分析来鉴定此处提出的亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3分子构建体。esi
‑
ms质谱分析结果显示，此处提出的分子构建体在1,091.97处显现出强的分子离子，对应于[m+2h]
2+
，这代表亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3分子构建体的真实分子量为2,181.35道尔顿。
[0372]
实施例40
[0373]
来那度胺束的合成
[0374]
在本实施例中，本案发明任设计了两种载药束，其以带有三个赖氨酸残基的含顺丁烯二酰亚胺多肽作为中心核，并有三个来那度胺分子耦接至中心核上。利用综合的方法来合成此处提出的来那度胺束，其中使用fmoc标准固态合成法来合成中心核，之后再进行液态合成以将经过连接臂修饰的来那度胺分子连接到中心核赖氨酸残基的侧链。本分子构建体由shanghai wuxi apptech co.,ltd.(上海，中国)合成。
[0375]
图40绘示mal
‑
多肽3
‑
来那度胺束，其中心核的序列为egegeaggkgagkgagkg(seq id no：42)，其中第一个氨基酸残基经顺丁烯二酰亚胺乙烯基修饰。另一方面，在将其耦接至中心核之前，利用对氨基芐基氨基甲酸酯(para
‑
amino benzyl carbamate，pabc)
‑
丙氨酸
‑
缬氨酸
‑
peg连接臂来修饰来那度胺分子。来那度胺分子透过连接臂的自由端连接至中心核的赖氨酸残基的ε
‑
氨基。
[0376]
利用esi
‑
ms质谱分析来鉴定mal
‑
多肽3
‑
来那度胺束。图41的esi
‑
ms质谱分析结果显示，此处提出的载药束在1,321.9处显现出强的分子离子，对应于[m+3h]
3+
，这代表mal
‑
多肽3
‑
来那度胺束的真实分子量为3,962.02道尔顿。
[0377]
图42绘示mal
‑
多肽4
‑
来那度胺束，其中心核的序列为ededeaggkgagkgagkg(seq id no：43)，其中第一个氨基酸残基经顺丁烯二酰亚胺乙烯基修饰。另一方面，在将其耦接至中心核之前，利用上述连接臂来修饰来那度胺分子，并透过连接臂的自由端连接至中心核的赖氨酸残基的ε
‑
氨基。
[0378]
利用esi
‑
ms质谱分析来鉴定mal
‑
多肽4
‑
来那度胺束。esi
‑
ms质谱分析结果显示，此处提出的载药束在1,379.2处显现出强的分子离子，对应于[m+3h]
3+
，这代表mal
‑
多肽4
‑
来那度胺束的真实分子量为4,135.15道尔顿。
[0379]
实施例41
[0380]
mal
‑
脂肪酸束的合成
[0381]
在本实施例中，制备由mal
‑
多肽5中心核以及一个硬脂酰二酸链与一个棕榈酸链所组成的分子构建体。
[0382]
图43绘示本mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束的结构，其中心核的序列为顺丁烯二酰亚胺乙基egege
‑
x1‑
k
‑
x2‑
k
‑
ome(seq id no：44)，其中第一个氨基酸残基经顺丁烯二酰亚胺乙烯基修饰，最后一个赖氨酸残基则经甲氧基(
‑
ome)修饰，且x1与x2皆为有4个eg重复单元的聚乙二醇化氨基酸。一条硬脂酰二酸链与一条棕榈酸链分别透过与脂肪酸的co2h基和k残基的氨基间所形成的酰胺键而连接到多肽中心核的k残基。本发明的发明人设计了此处提出的mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束的结构，并委由shanghai wuxi apptech co.,ltd.(上海，中国)合成。mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束产物的纯度高于97.0％。
[0383]
利用esi
‑
ms质谱分析来鉴定所合成的脂肪酸束。图44的esi
‑
ms质谱分析结果显示，此处提出的载药束在1,143.6处显现出强的分子离子，对应于[m+2h]
2+
，这代表mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束的真实分子量为2,285.66道尔顿。
[0384]
实施例42
[0385]3‑
dota臂接合单元的合成
[0386]
在本实施例中，制备用以携带三个多肽的3
‑
dota臂接合单元。图45为此种3
‑
臂接
合物的结构。具体来说，所述接合单元包含一中心核，其序列为乙酰
‑
kgaggkgaggkg(seq id no：45，多肽核6)，其中第一个赖氨酸残基经乙酰基修饰。所述接合单元亦包含三个连接臂，其序列为顺丁烯二酰亚胺乙基egegeagkgag(seq id no:46)，其中第一个谷氨酸残基经顺丁烯二酰亚胺乙烯基修饰，且赖氨酸残基经dota分子修饰。
[0387]
本发明的发明人设计了此处提出的3
‑
dota臂接合单元的结构，并委由shanghai wuxi apptech co.,ltd.(上海，中国)合成。利用esi
‑
ms质谱分析来鉴定所合成的3
‑
dota臂接合单元。图46的esi
‑
ms质谱分析结果显示，此处提出的载药束在1,357.8处显现出强的分子离子，对应于[m+4h]
4+
，这代表3
‑
dota臂接合单元的真实分子量为5,427.2道尔顿。
[0388]
实施例43
[0389]
重组mbm
‑1‑
il
‑
2的建构、表达与纯化
[0390]
在本实施例中，利用与上文实施例相似的方法，建构、表达与纯化如seq id no：47所示的复合蛋白。具体来说，此处提出的mbm
‑1‑
il
‑
2分子构建体带有mbm
‑
1域，其后接着一个短的可挠性接合物(seq id no：9)以及il
‑
2序列。
[0391]
收集培养物上清液，并纯化利用阴离子交换管柱纯化培养基中表达的重组融合蛋白。在纯化前，将重组mbm
‑1‑
il
‑
2融合蛋白调整至ph 8.5。之后，将蛋白加入预平衡的(50mmbis
‑
tris缓冲液、ph 8.5)q sepharose阴离子交换管柱(ge healthcare)。利用3
‑
阶冲提法处理mbm
‑1‑
il
‑
2融合蛋白，分别是200mm、500mm及1m nacl的4m尿素溶液、ph 8.5。
[0392]
利用10％sds
‑
page分析冲提产物，结果如图47所示。mbm
‑1‑
il
‑
2融合蛋白的主要条带位于约16kda，与预期大小相符(如箭头所示)。
[0393]
实施例44
[0394]
双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束的合成
[0395]
在本实施例中，将实施例10的(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1融合蛋白和实施例40的mal
‑
多肽4
‑
来那度胺束耦接，所得到的分子构建体带有双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1融合蛋白以及两个来那度胺束分别耦接至融合蛋白的个别金属结合域的半胱氨酸残基。简而言之，将纯化的(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1融合蛋白置于琥珀酸钠缓冲液(30mm琥珀酸钠、ph5.3，0.02％tween 20以及100mm蔗糖)并和45μm tcep在室温下轻轻摇晃以培育30分钟，以将其还原。在还原反应后，以10mm琥珀酸钠缓冲液(ph 5.3含0.02％tween 20以及100mm蔗糖)含60μm zn(ii)离子进行透析，以移除多余的tcep。之后，以15μm的mal
‑
多肽4
‑
来那度胺束来处理还原蛋白样本，接着在室温下培育1小时。利用脱盐柱移除未反应的来那度胺束，并利用sds
‑
page来分析产物。
[0396]
图48为此处提出的分子构建体的sds
‑
page分析结果，图中显示本分子构建体的分子量为约120kda(如电泳条2中箭头#1所示)，略小于预期大小。电泳条3为未经耦接的融合蛋白样本(如箭头#2所示)。如图48所示，双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1与来那度胺束的耦接产率约为85％。
[0397]
实施例45
[0398]
体抑素多肽x脂肪酸束的合成
[0399]
在本实施例中，利用与上文实施例相似的方法，将实施例41的mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束和实施例35的cys
‑
体抑素多肽进行耦接，以使得mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束的顺丁烯二酰亚胺乙基和cys
‑
体抑素多肽的末端半胱氨酸残基的sh基耦接，因而得到体抑素多肽x脂肪酸束
的分子构建体(参见，图49)。
[0400]
实施例46
[0401]
aib
‑
glp
‑
1促效剂x脂肪酸束的合成
[0402]
在本实施例中，利用与上文实施例相似的方法，将实施例41的mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束和实施例34的aib
‑
glp
‑
1促效剂
‑
cys进行耦接，以使得mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束的顺丁烯二酰亚胺乙基和aib
‑
glp
‑
1促效剂
‑
cys的末端半胱氨酸残基的sh基耦接，因而得到aib
‑
glp
‑
1促效剂x脂肪酸束的分子构建体(参见，图50a)。
[0403]
实施例47
[0404]
特立帕肽
‑
mbm
‑
1 x脂肪酸束的合成
[0405]
在本实施例中，利用与上文实施例相似的方法，将实施例41的mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束和实施例38的特立帕肽
‑
mbm
‑
1进行耦接，以得到特立帕肽
‑
mbm
‑
1 x脂肪酸束的分子构建体(参见，图50b)。
[0406]
实施例48
[0407]
亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3x脂肪酸束的合成
[0408]
在本实施例中，利用与上文实施例相似的方法，将实施例41的mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸束和实施例39的亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3进行耦接，以得到亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3x脂肪酸束的分子构建体(参见，图51a)。利用maldi
‑
tof质谱分析来鉴定所合成的亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3x脂肪酸束，其结果如图51b所示，本分子构建体的分子量为4,466.019道尔顿。分子量2,181.038道尔顿显示本反应在[亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3:mal
‑
多肽5
‑
脂肪酸]摩尔比1.5:1的条件下，亮丙瑞林
‑
mbm
‑
3为过量的。
[0409]
实施例49
[0410]3‑
dota臂接合单元x 3 psma配体的合成
[0411]
在本实施例中，利用与上文实施例相似的方法，将实施例42的3
‑
dota臂接合单元和三个来自实施例36的cys
‑
psma配体进行耦接，以得到3
‑
dota臂接合单元x 3 psma配体的分子构建体(参见，图52a)。利用esi
‑
ms质谱分析来鉴定所合成的3
‑
dota臂接合单元x 3 psma配体，其结果如图52b所示，此处提出的分子构建体在1,79处显现出强的分子离子，对应于[m+4h]
4+
，这代表3
‑
dota臂接合单元x 3 psma配体的真实分子量为6,992.18道尔顿。
[0412]
实施例50
[0413]
经稳定的双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束的纯化
[0414]
利用如上文实施例所述的方式使重组双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束稳定。
[0415]
将上述实施例的与两个dota束耦接的双链融合调整至ph 5.0，之后加入预平衡的(0.1m medta、50mm bis
‑
tris、ph 5.0)阴离子交换管柱qsepharose(ge healthcare)。利用3
‑
阶冲提法处理样本；第一次冲提使用320mm nacl、70分钟，之后第二次冲提使用330mm、100分钟，且最后一次冲提使用1,000mm nacl、50分钟，流速为1.0ml/分。
[0416]
之后使用阴离子交换管柱q sepharose将双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束与未耦接的双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1融合蛋白、和三或四个dota束耦接的双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1融合蛋白以及团聚物分离开来。
[0417]
收集纯化产物，即双链(scfvαca19
‑
9)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2 dota束。图53所示的电泳条
1及电泳条2分别对应至未耦接的分子构建体以及耦接两个dota束的分子构建体。
[0418]
实施例51
[0419]
经稳定的双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束的纯化
[0420]
利用如上文实施例所述的方式使实施例44的双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束分子建构体稳定。
[0421]
将经稳定的双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束分子建构体调整至ph 7.0，之后加入预平衡的(50mm na2hpo4、ph 7.0、1m nacl)疏水互动管柱(hip)phenyl hp(ge healthcare)。利用线性梯度冲提经稳定的分子构建体，条件如下：1,000mm至0mm nacl，流速1.0ml/分，进行80分钟。
[0422]
将从前述hic纯化管柱收集到的样本加入尺寸排阻层析管柱enrichtm sec650(bio
‑
rad)，以将经稳定的分子构建体和团聚物分离开来。收集纯化产物。图54为10％非还原sds
‑
page分析结果，其中电泳条1与电泳条2分别对应至未耦接的分子构建体以及耦接两个来那度胺束的分子构建体。
[0423]
进一步利用maldi
‑
tof质谱仪来分析纯化后的经稳定双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束分子构建体。图55下方所示的质谱分析结果显示样本的分子量为58,382与116,705道尔顿，分别对应于m/z(z＝1):[m+h]
+
及m/z(z＝2):[m+2h]
2+
。
[0424]
图55上方为作为对照的双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1的质谱分析结果，其分子量为54,300及108,537道尔顿，分别对应于m/z(z＝1):[m+h]
+
及m/z(z＝2):[m+2h]
2+
。
[0425]
实施例52
[0426]
经稳定的双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束于nod
‑
scid小鼠中的半衰期
[0427]
对小鼠体以静脉内注射经稳定的双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束后，测定其半衰期。利用elisa来分析血清中的分子构建体。本实验使用购自biplasco(台湾地区，中国)的8至10周龄的nod
‑
scid小鼠。将小鼠分为每组3只，并静脉内注射约100μl的7.6μm蛋白。
[0428]
分析结果显示亲本抗
‑
cd38 higg1.fc抗体(图56a)以及双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束(图56b)的半衰期分别是约13.1及23.9小时。利用非分室药动学模型计算的结果显示，此处提出的双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束的半衰期比传统抗
‑
cd38抗体来得长。
[0429]
实施例53
[0430]
纯化双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束对h929与cd38
‑
阳性u266细胞的细胞毒性
[0431]
将h929细胞(5
×
103/孔)加入96孔盘的孔中，所用培养基为rpmi1640，含10％胎牛血清。2小时后，将20μm的纯化双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1(不含来那度胺束)或双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束以2倍序列稀释后，加入各孔中。培育2小时后，以400g离心5分钟，以移除培养基并置换新鲜培养基，其后将细胞再培育120小时(5天)与168小时(7天)。接着利用alamarblue细胞存活率试剂套组(invitrogen)根据制造伤的指示，分析细胞存活率。
[0432]
利用与上文针对h929细胞类似的方式，来决定带有或不带有两个来那度胺束的纯
化双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1对cd38
‑
阳性的u266细胞的细胞毒性。
[0433]
图57a显示四个处理组别中，h929细胞的存活率。以20μm的双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束(标记为scfv
‑
fc
‑
len)处理5天后，约有80％的h929细胞发生细胞溶解。作为负对照的双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1(标记为scfv
‑
fc)则没有细胞毒杀效果。
[0434]
图57b显示四个处理组别中，cd38
‑
阳性的u266细胞的存活率。以20μm的双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束(标记为scfv
‑
fc
‑
len)处理5天后，约有80％的cd38
‑
阳性的u266细胞发生细胞溶解。
[0435]
图57c显示四个处理组别中，cd38
‑
阴性的u266细胞的存活率。不论是何种摩尔浓度的双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束(标记为scfv
‑
fc
‑
len)都不能引致cd38
‑
阴性的u266细胞发生细胞溶解。
[0436]
总结来说，图57a至57c的结果显示双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束有很强的标的效果。
[0437]
实施例54
[0438]
纯化双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束对表达cd38的h929与u266细胞的抗体介导细胞毒性(adcc)
[0439]
在本实施例中，进行活体外分析以探讨双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束的抗体介导细胞毒性(antibody
‑
dependent cell
‑
mediated cytotoxicity，adcc)对表达cd38的h929细胞以及cd38
‑
阳性的u266细胞的细胞溶解有何影响。
[0440]
自捐赠者取得人类全周边血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)以分析adcc功能。将h929细胞或cd38
‑
阳性的u266细胞和双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束一起培育，最终浓度为200、40、8、1.6、0.32或0.064nm，且之后和人类pbmc以e:t比25的比例混合，并于37℃下培育5小时。以亲本抗
‑
cd38 mab作为正对照。利用ldh细胞毒性分析套组(enzo life sciences)来分析细胞溶解。
[0441]
此处所示的资料指出，纯化双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束(标记为scfv
‑
fc
‑
len)可运用和亲本抗
‑
cd38单珠抗体类似的方式招募效应细胞，以引发细胞溶解活性(图58a)。以亲本抗
‑
cd38抗体(标记为igg)作为正对照，且亦使用了同型对照抗体(标记为对照igg)。
[0442]
如图58b所述，纯化双链(scfvαcd38)
‑
fc
‑
mbm
‑
1 x 2来那度胺束(标记为scfv
‑
fc
‑
len)在cd38
‑
阳性u266细胞中可展现与亲本物相近的溶胞活性。当可理解，上文实施方式的说明仅为例示，且本发明所属技术领域技术人员可对其进行各种修饰。上文的说明、实施例与资料完整地说明了本发明例示性实施方式的结构与用途。虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中技术人员，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰。