可活化多特异性抗原结合蛋白复合物的制作方法

可活化多特异性抗原结合蛋白复合物
1.对相关申请的交叉引用
2.根据35u.s.c.
§
119，本技术要求2019年4月12日提交的美国临时申请第62/833,360号和2019年9月12日提交的美国临时申请第62/899,347号的优先权。所有前述申请的公开内容以全文引用的方式并入。
3.在本技术中，引用各种公开案、专利案和/或专利申请案。所述公开案、专利和/或专利申请案的公开内容特此以全文引用的方式并入本技术中，以便更充分地描述本公开所涉及的本领域技术状态。
4.序列表
5.本技术含有序列表，所述序列表已经以ascii格式以电子方式提交并且通过全文引用的方式并入本文中。所述ascii副本创建于2020年4月7日，被命名为01223-0018-00pct_st25.txt并且大小为143kb。
发明领域
6.本公开提供具有免疫球蛋白样抗原结合活性的多特异性抗原结合蛋白复合物、其生产方法、药物组合物和其用途。


背景技术：

7.已知肿瘤含有异质细胞(heterogenous cell)类型，包含恶性细胞、基质细胞和免疫细胞，其在肿瘤的血管形成、生长和癌转移中起各种作用。肿瘤癌转移为一种复杂过程，涉及肿瘤细胞过度表达蛋白酶，所述蛋白酶降解包围肿瘤细胞的细胞结构，促进细胞侵入和癌转移。确切地说，在肿瘤进展中起作用的某些类别的人类蛋白酶包含丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酰蛋白酶。肿瘤细胞产生在肿瘤块的细胞外附近分泌和积聚的数种不同的蛋白酶。肿瘤中和肿瘤附近的细胞以及非常接近肿瘤的分泌蛋白酶是肿瘤微环境的一部分。肿瘤提取物含有与较差患者预后相关的某些蛋白酶，包含ii型跨膜丝氨酸蛋白酶、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(upa)系统、包含mmp和adam的金属蛋白酶以及包含半胱氨酸组织蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶。
8.经设计以产生免疫细胞突触的双特异性抗体可以结合效应细胞上的抗原和由肿瘤表达的肿瘤相关抗原，此引起肿瘤选择性细胞毒性细胞杀伤。然而，双特异性抗体有时结合于表达低水平的肿瘤相关抗原的健康细胞，从而引起在靶肿瘤外细胞杀伤。为了解决此问题，已开发出可活化双特异性抗体以利用位于肿瘤微环境中的蛋白酶。蛋白酶可活化的抗体(也称为可活化前抗体(probody))携带具有蛋白酶可识别序列的可裂解肽。完整状态下的可裂解肽干扰抗体与效应细胞的结合能力，但不干扰与肿瘤相关抗原的结合能力。该蛋白酶可活化的抗体在非活化状态下选择性地结合于肿瘤和健康细胞所表达的肿瘤相关抗原，然而由于可裂解连接子为完整的而不引发细胞杀伤。直到双特异性抗体极为接近含有可以裂解连接子的蛋白酶的肿瘤微环境，可裂解连接子才裂解，产生活化形式的抗体，进而结合效应t细胞，导致细胞毒性细胞杀伤，由此不伤害健康细胞和组织。蛋白酶可活化的
双特异性抗体不需要物理接触肿瘤细胞，也不需要进入肿瘤细胞，而是需要位于含有肿瘤分泌型蛋白酶的肿瘤微环境中。
9.本文公开了多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括(i)两个不同fab区，其各自能够结合两个不同表位，和(ii)fc区。多特异性抗原结合蛋白复合物可包括彼此缔合以形成蛋白复合物的两条或三条多肽链。在一些实施方式中，如当两条多肽链形成复合物时，多特异性抗原结合蛋白复合物可包括可裂解连接子，其减少、抑制或阻止fab区中的一者与其目标抗原的结合，除非可裂解连接子被裂解(其将使双链复合物转化成三链复合物)。在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物与现有多特异性抗体相比相对简单，因为每一复合物仅使用两条或三条多肽链，其比由四条链组成的标准人类igg分子少。在一些实施方式中，根据本公开将半fab重链区和半fab轻链区定位在复合物的两条或三条链上将有利于有效形成结合两个不同表位的异二聚体蛋白复合物，或至少向公众提供有用选择。
10.在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物可以在目标细胞存在下活化免疫细胞。在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物可提供一个或多个益处，如在癌细胞或目标肿瘤环境存在下对免疫细胞活化的高特异性，和/或促进免疫细胞介导的目标细胞杀伤的高功效，或至少向公众提供有用选择。


技术实现要素：

11.本公开提供双链多特异性抗原结合蛋白复合物的各种实施方式，所述复合物可以同时结合相同目标抗原上的两个不同表位或不同目标抗原上的两个不同表位，其中蛋白复合物包括：两个不同fab区、fc区以及第一和第二连接子。
12.在一个实施方式中，两个不同fab区和fc区由第一多肽链与第二多肽链的缔合形成，其中第一和第二多肽链中的每一条均携带两个不同半fab区和半fc区，其中第一多肽链携带第一连接子，第二多肽链携带第二连接子，且第二连接子可裂解。
13.在一个实施方式中，第一和第二多肽链彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物，所述多特异性抗原结合蛋白复合物具有能够结合第一表位的第一fab区、能够结合与第一表位不同的第二表位的第二fab区、能够结合fc受体的完整fc区以及第一连接子和第二连接子。
14.在一个实施方式中，第一fab区展现与第一目标表位的结合，并且与当第二连接子裂解时相比，当第二连接子未裂解时，第二fab区展现与第二目标表位的结合降低。在一个实施方式中，与当第二连接子未裂解时相比，当第二连接子裂解时，第二fab区展现与第二目标表位的结合增加。在一个实施方式中，在第二连接子裂解后，第一fab区和第二fab区能够同时分别结合于第一和第二目标表位。
15.在一个实施方式中，第一连接子可经基质金属蛋白酶裂解，其中基质金属蛋白酶为mmp1、mmp2、mmp3、mmp8、mmp9、mmp11、mmp13、mmp14或mt1-mmp(膜型基质金属蛋白酶1)。
16.在一个实施方式中，第一连接子包括以下氨基酸序列：tsgsggsggsv(seq id no:156)、(sg)n(seq id no:157)、(sgg)n(seq id no:158)、(sggg)n(seq id no:159)、(ssg)n(seq id no:160)、(gs)n(seq id no:161)、(ggg)n(seq id no:162)、(gsggs)n(seq id no:163)、(gsg)n(seq id no:164)、(ggggs)n(seq id no:165)、(gggs)n(seq id no:166)、(ggggsgs)n(seq id no:167)、(ggggsggs)n(seq id no:168)或(ggs)n(seq id no:169)，其
中n是1-6的整数。
17.在一个实施方式中，第二连接子包括以下氨基酸序列：ggsgsgsggssgggsggggs(dp连接子)、tsgsggsggsv(eg或eh连接子)、tsgsggsplgmggsgsv(ei或eu连接子)、tsgsggsplgvggsgsv(ej或ev连接子)、tsgsggspaalggsgsv(ek或ew连接子)、tsgsggspaglggsgsv(el或ex连接子)、tsgsggsplgmvgv(em或ey连接子)、tsgsggsplgvvgv(en或ez连接子)、tsgsggspaalvgv(eo或fa连接子)、tsgsggspaglvgv(ep或fb连接子)、tsgsggsplgmvlv(eq或fc连接子)、tsgsggsplgvvlv(er或fd连接子)、tsgsggspaalvlv(es或fe连接子)或tsgsggspaglvlv(st或ff连接子)(分别为seq id no；11-24，或分别为seq id no:43-56)。
18.在双链多特异性抗原结合蛋白复合物的一个实施方式中，两个不同fab区串联排列并且蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一连接子，(iii)第二半fab重链区，及(iv)第一半fc区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；和(b)第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区，(ii)第二连接子，(iii)第二半fab轻链区，及(iv)第二半fc区，其中所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区，并且其中所述第二连接子为可裂解的。串联蛋白复合物的非限制性实例显示于图1、5、6和7中。
19.在双链多特异性抗原结合蛋白复合物的一个实施方式中，两个不同fab区以非串联方式排列并且蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一半fc区，(iii)第一连接子，及(iv)第二半fab重链区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；和(b)第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区，(ii)第二半fc区，(iii)第二连接子，及(iv)第二半fab轻链区，其中所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区，并且其中所述第二连接子为可裂解的。非串联蛋白复合物的非限制性实例示于图3、8、9和10中。
20.在一个实施方式中，本文所描述的双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种包括(i)在第一半fc区中具有臼突变的第一多肽链和在第二半fc区中具有杵突变的第二多肽链，或(ii)在第一半fc区中具有杵突变的第一多肽链和在第二半fc区中具有臼突变的第二多肽链。
21.在一个实施方式中，本文所描述的双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种包括具有两个或更多个杵和臼突变中的任一种或其任何组合的第一和第二多肽链，所述杵和臼突变根据kabat编号包括t366y、t366w、t366s、l368a、t394s、t394w、f405a、f405w、y407a、y407v和/或y407t。
22.在一个实施方式中，本文所描述的双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种包括以10-5
m或更小、或10-6
m或更小、或10-7
m或更小、或10-8
m或更小、或10-9
m或更小、或10-10
m或更小的解离常数kd结合第一目标表位的第一fab区。
23.在一个实施方式中，本文所描述的双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种
包括第二fab区，其中当第二连接子裂解时，该第二fab区以10-5
m或更小、或10-6
m或更小、或10-7
m或更小、或10-8
m或更小、或10-9
m或更小、或10-10
m或更小的解离常数kd结合第二目标表位。
24.在双链多特异性抗原结合蛋白复合物的一个实施方式中，两个不同fab区串联排列并且蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:1至少95％一致的氨基酸序列的第一重链可变结构域；(ii)包括与seq id no:2至少95％一致的氨基酸序列的第一重链恒定结构域；(iii)包括与seq id no:3至少95％一致的氨基酸序列的第一连接子；(iv)包括与seq id no:4至少95％一致的氨基酸序列的第二重链可变结构域；(v)包括与seq id no:5至少95％一致的氨基酸序列的第二重链恒定结构域；(vi)包括与seq id no:6至少95％一致的氨基酸序列的第一铰链序列；(vii)包括与seq id no:7至少95％一致的氨基酸序列的第一ch2结构域；及(viii)包括与seq id no:8至少95％一致的氨基酸序列的第一ch3结构域；以及(b)第二多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:9至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链可变结构域；(ii)包括与seq id no:10至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链恒定结构域；(iii)包括与seq id no:11-24中的任一者至少95％一致的氨基酸序列的第二连接子；(iv)包括与seq id no:25至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链可变结构域；(v)包括与seq id no:26至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链恒定结构域；(vi)包括与seq id no:27至少95％一致的氨基酸序列的第二铰链序列；(vii)包括与seq id no:28至少95％一致的氨基酸序列的第二ch2结构域；及(viii)包括与seq id no:29至少95％一致的氨基酸序列的第二ch3结构域(例如kv6.1，图31a-c)。
25.在双链多特异性抗原结合蛋白复合物的一个实施方式中，两个不同fab区以非串联方式排列并且蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:30至少95％一致的氨基酸序列的第一重链可变结构域；(ii)包括与seq id no:31至少95％一致的氨基酸序列的第一重链恒定结构域；(iii)包括与seq id no:32至少95％一致的氨基酸序列的第一铰链；(iv)包括与seq id no:33至少95％一致的氨基酸序列的第一ch2结构域；(v)包括与seq id no:34至少95％一致的氨基酸序列的第一ch3结构域；(vi)包括与seq id no:35至少95％一致的氨基酸序列的第一连接子序列；(vii)包括与seq id no:36至少95％一致的氨基酸序列的第二重链可变结构域；及(viii)包括与seq id no:37至少95％一致的氨基酸序列的第二重链恒定结构域；以及(b)第二多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:38至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链可变结构域；(ii)包括与seq id no:39至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链恒定结构域；(iii)包括与seq id no:40至少95％一致的氨基酸序列的第二铰链；(iv)包括与seq id no:41至少95％一致的氨基酸序列的第二ch2结构域；(v)包括与seq id no:42至少95％一致的氨基酸序列的第二ch3结构域；(vi)包括与seq id no:43-56中的任一者至少95％一致的氨基酸序列的第二连接子序列；(vii)包括与seq id no:57至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链可变结构域；及(viii)包括与seq id no:58至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链恒定结构域(例如kv6.2，图32a-c)。
26.本公开提供一种药物组合物，其包括本文所描述的双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种和药学上可接受的赋形剂。
27.在一个实施方式中，本文所描述的双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种可以用作药。
28.本公开提供一种或多种核酸，其编码(i)本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链，并且编码(ii)本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链。
29.本公开提供一种或多种载体，其包括可操作地连接于一种或多种启动子的本文所描述的一种或多种核酸中的任一种。
30.本公开提供一种宿主细胞，其携带本文所描述的一种或多种载体中的任一种。
31.本公开提供一种用于制备本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的方法，其包括：在适合于表达第一和第二多肽链的条件下培养本文所描述的宿主细胞的细胞群。在一个实施方式中，所述方法进一步包括：分离(例如回收)第一和第二多肽链。在一个实施方式中，所述方法进一步包括使第一和第二多肽链经受适合于使第一和第二多肽链彼此缔合以形成双链多特异性抗原结合蛋白复合物的条件。在一个实施方式中，所形成的双链多特异性抗原结合蛋白复合物包括异二聚分子。
32.本公开提供(i)编码本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链的第一核酸，和(ii)编码本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链的第二核酸。
33.本公开提供(i)可操作地连接于第一核酸的第一载体，所述第一核酸编码本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链，和(ii)可操作地连接于第二核酸的第二载体，所述第二核酸编码本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链。在一个实施方式中，第一载体为包括至少一种启动子的第一表达载体，所述至少一种启动子可操作地连接于编码第一多肽链的第一核酸。在一个实施方式中，第二载体为包括至少一种启动子的第二表达载体，所述至少一种启动子可操作地连接于编码第二多肽链的第二核酸。
34.本公开提供一种宿主细胞，其携带本文所描述的第一和第二载体中的任一种。
35.本公开提供用于制备本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的方法，其包括：在适合于表达第一和第二多肽链的条件下培养携带第一和第二载体的宿主细胞的细胞群，其中第一载体可操作地连接于第一核酸，所述第一核酸编码本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链，并且其中第二载体可操作地连接于第二核酸，所述第二核酸编码本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链。在一个实施方式中，所述方法进一步包括：分离(回收)第一和第二多肽链。在一个实施方式中，所述方法进一步包括使第一和第二多肽链经受适合于使第一和第二多肽链彼此缔合以形成双链多特异性抗原结合蛋白复合物的条件。在一个实施方式中，所形成的双链多特异性抗原结合蛋白复合物包括异二聚分子。
36.本公开提供(i)第一宿主细胞，其携带包括启动子的第一载体，所述启动子可操作地连接于编码本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链的第一核酸；和(ii)第二宿主细胞，其携带包括启动子的第二载体，所述启动子可操作地连接于编码本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链的第二核酸。
37.本公开提供一种用于制备本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的方法，其包括：(a)在适合于表达第一多肽链的条件下培养携带第一载体的第一宿主细胞的细胞群，和(b)在适合于表达第二多肽链的条件下培养携带第二载体的第二宿主细胞的细胞群。在一个实施方式中，所述方法进一步包括：分离(回收)第一和第二多肽链。在一个实施方式中，所述方法进一步包括使第一和第二多肽链经受适合于使第一和第二多肽链彼此缔合以形成双链多特异性抗原结合蛋白复合物的条件。在一个实施方式中，所形成的双链多特异性抗原结合蛋白复合物包括异二聚分子。
38.本公开提供一种用于治疗个体的疾病的方法，其包括：向所述个体施用治疗有效量的本文所描述的双链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种。
39.在一个实施方式中，疾病包括以下癌症：前列腺癌、乳癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、皮肤癌、结直肠癌、肛门癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、平滑肌瘤癌、脑癌、神经胶质瘤癌、胶质母细胞瘤癌、食道癌、肝癌、肾癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、外阴癌、喉癌、阴道癌、骨癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉癌、下喉癌、唾液腺癌、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌或睾丸癌。
40.在一个实施方式中，疾病包括血液癌症，其中所述血液癌症为b慢性淋巴细胞白血病(b-cll)、b细胞和t细胞急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓系白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、毛细胞白血病(hcl)、骨髓增生性病症/赘瘤(mpds)、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤(nhl)(包含伯基特氏淋巴瘤(bl)、华氏巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、aids相关淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤(hl)、t细胞淋巴瘤(tcl)、多发性骨髓瘤(mm)、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤或轻链或本斯-琼斯氏骨髓瘤。
41.本公开提供一种用于结合第一和第二目标表位的方法，其包括：(a)使第一目标表位与本文所描述的任一种双链多特异性抗原结合蛋白复合物中接触，其中第二连接子呈非裂解态并且蛋白复合物为非活化的；并且(b)使第一目标表位与第一fab区结合，其中第一fab区结合第一目标表位并且在第二连接子呈非裂解态时第二fab区展现出与第二目标表位的降低的结合。在一个实施方式中，所述方法进一步包括：(c)使第二连接子裂解以产生活化的双链多特异性抗原结合蛋白复合物，其中第二fab区可以结合于第二目标表位。在一个实施方式中，所述方法进一步包括：(d)使第二目标表位与活化的双链多特异性抗原结合蛋白复合物接触；以及(e)使第二目标表位与第二fab区结合。
42.在一个实施方式中，第一目标表位包括由肿瘤或癌细胞表达的细胞表面抗原。
43.在一个实施方式中，第二表位包括由效应t细胞表达的细胞表面抗原。在一个实施方式中，活化的双链多特异性抗原结合蛋白复合物通过结合由肿瘤或癌细胞表达的细胞表面抗原和通过结合由效应t细胞表达的细胞表面抗原来形成细胞突触。
44.在一个实施方式中，细胞突触中的效应t细胞通过介导细胞毒性细胞杀伤来杀死肿瘤或癌细胞。
45.本公开提供三链多特异性抗原结合蛋白复合物的各种实施方式，所述复合物可以同时结合相同目标抗原上的两个不同表位或不同目标抗原上的两个不同表位，其中蛋白复合物包括：两个不同fab区、fc区以及第一和第二连接子。
46.在一个实施方式中，两个不同fab区和fc区由第一、第二和第三多肽链的缔合形
成。
47.在一个实施方式中，第一、第二和第三多肽链彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物，所述多特异性抗原结合蛋白复合物具有能够结合第一表位的第一fab区、能够结合与第一表位不同的第二表位的第二fab区、能够结合fc受体的完整fc区以及第一连接子和第二连接子。
48.在三链多特异性抗原结合蛋白复合物的一个实施方式中，两个不同fab区串联排列并且蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一连接子，(iii)第二半fab重链区，及(iv)第一半fc区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；(b)第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区，其中所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区；以及(c)第三多肽链，其包括(i)第二半fab轻链区，及(ii)第二半fc区，其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区。图2、11、12和13中示出了串联蛋白复合物的非限制性实例。
49.在三链多特异性抗原结合蛋白复合物的一个实施方式中，两个不同fab区以非串联方式排列并且蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一半fc区，(iii)第一连接子，及(iv)第二半fab重链区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；以及(b)第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区，(ii)第二半fc区，其中所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区；以及(c)第三多肽链，其包括(i)第二半fab轻链区，其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区。图4、14、15和16中示出了非串联蛋白复合物的非限制性实例。
50.在一个实施方式中，如本文所描述具有两个串联排列的不同fab区的三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种包括(i)在第一半fc区中具有臼突变的第一多肽链和在第二半fc区中具有杵突变的第三多肽链，或(ii)在第一半fc区中具有杵突变的第一多肽链和在第二半fc区中具有臼突变的第三多肽链。
51.在一个实施方式中，如本文所描述具有两个串联排列的不同fab区的三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种包括具有两个或更多个杵和臼突变中的任一种或其任何组合的第一和第三多肽链，所述杵和臼突变根据kabat编号包括t366y、t366w、t366s、l368a、t394s、t394w、f405a、f405w、y407a、y407v和/或y407t。
52.在一个实施方式中，如本文所描述具有两个以非串联方式排列的不同fab区的三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种包括(i)在第一半fc区中具有臼突变的第一多肽链和在第二半fc区中具有杵突变的第二多肽链，或(ii)在第一半fc区中具有杵突变的第一多肽链和在第二半fc区中具有臼突变的第二多肽链。
53.在一个实施方式中，如本文所描述具有两个以非串联方式排列的不同fab区的三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种包括具有两个或更多个杵和臼突变中的任一种或其任何组合的第一和第二多肽链，所述杵和臼突变根据kabat编号包括t366y、t366w、t366s、l368a、t394s、t394w、f405a、f405w、y407a、y407v和/或y407t。
54.在一个实施方式中，本文所描述的三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种
包括以10-5
m或更小、或10-6
m或更小、或10-7
m或更小、或10-8
m或更小、或10-9
m或更小、或10-10
m或更小的解离常数kd结合第一目标表位的第一fab区。
55.在一个实施方式中，本文所描述的三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种包括以10-5
m或更小、或10-6
m或更小、或10-7
m或更小、或10-8
m或更小、或10-9
m或更小、或10-10
m或更小的解离常数kd结合第二目标表位的第二fab区。
56.在三链多特异性抗原结合蛋白复合物的一个实施方式中，两个不同fab区串联排列并且蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:59至少95％一致的氨基酸序列的第一重链可变结构域；(ii)包括与seq id no:60至少95％一致的氨基酸序列的第一重链恒定结构域；(iii)包括与seq id no:61至少95％一致的氨基酸序列的第一连接子；(iv)包括与seq id no:62至少95％一致的氨基酸序列的第二重链可变结构域；(v)包括与seq id no:63至少95％一致的氨基酸序列的第二重链恒定结构域；(vi)包括与seq id no:64至少95％一致的氨基酸序列的第一铰链序列；(vii)包括与seq id no:65至少95％一致的氨基酸序列的第一ch2结构域；及(viii)包括与seq id no:66至少95％一致的氨基酸序列的第一ch3结构域；以及(b)第二多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:67至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链可变结构域；(ii)包括与seq id no:68至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链恒定结构域；以及(c)第三多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:69至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链可变结构域；(ii)包括与seq id no:70至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链恒定结构域；(iii)包括与seq id no:71至少95％一致的氨基酸序列的第二铰链序列；(iv)包括与seq id no:72至少95％一致的氨基酸序列的第二ch2结构域；和(v)包括与seq id no:73至少95％一致的氨基酸序列的第二ch3结构域(例如kv5.1，图33a-b)。
57.在三链多特异性抗原结合蛋白复合物的一个实施方式中，两个不同fab区串联排列并且蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:105至少95％一致的氨基酸序列的第一重链可变结构域；(ii)包括与seq id no:106至少95％一致的氨基酸序列的第一重链恒定结构域；(iii)包括与seq id no:107至少95％一致的氨基酸序列的第一连接子；(iv)包括与seq id no:108至少95％一致的氨基酸序列的第二重链可变结构域；(v)包括与seq id no:109至少95％一致的氨基酸序列的第二重链恒定结构域；(vi)包括与seq id no:110至少95％一致的氨基酸序列的第一铰链序列；(vii)包括与seq id no:111至少95％一致的氨基酸序列的第一ch2结构域；及(viii)包括与seq id no:112至少95％一致的氨基酸序列的第一ch3结构域；以及(b)第二多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:113至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链可变结构域；(ii)包括与seq id no:114至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链恒定结构域；以及(c)第三多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:115至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链可变结构域；(ii)包括与seq id no:116至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链恒定结构域；(iii)包括与seq id no:117至少95％一致的氨基酸序列的第二铰链序列；(iv)包括与seq id no:118至少95％一致的氨基酸序列的第二ch2结构域；和(v)包括与seq id no:119至少95％一致的氨基酸序列的第二ch3结构域(例如kv5.1，图36a-b)。
58.在三链多特异性抗原结合蛋白复合物的一个实施方式中，两个不同fab区串联排
id no:96至少95％一致的氨基酸序列的第二重链可变结构域；及(viii)包括与seq id no:97至少95％一致的氨基酸序列的第二重链恒定结构域；以及(b)第二多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:98至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链可变结构域(ii)包括与seq id no:99至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链恒定结构域；(iii)包括与seq id no:100至少95％一致的氨基酸序列的第二铰链；(iv)包括与seq id no:101至少95％一致的氨基酸序列的第二ch2结构域；(v)包括与seq id no:102至少95％一致的氨基酸序列的第二ch3结构域；以及(c)(i)包括与seq id no:103至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链可变结构域；及(ii)包括与seq id no:104至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链恒定结构域(例如kv4.33，图35a-b)。
61.在三链多特异性抗原结合蛋白复合物的一个实施方式中，两个不同fab区以非串联方式排列并且蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:120至少95％一致的氨基酸序列的第一重链可变结构域；(ii)包括与seq id no:121至少95％一致的氨基酸序列的第一重链恒定结构域；(iii)包括与seq id no:122至少95％一致的氨基酸序列的第一铰链；(iv)包括与seq id no:123至少95％一致的氨基酸序列的第一ch2结构域；(v)包括与seq id no:124至少95％一致的氨基酸序列的第一ch3结构域；(vi)包括与seq id no:125至少95％一致的氨基酸序列的第一连接子序列(vii)包括与seq id no:126至少95％一致的氨基酸序列的第二重链可变结构域；及(viii)包括与seq id no:127至少95％一致的氨基酸序列的第二重链恒定结构域；以及(b)第二多肽链，其包括(例如以n端至c端顺序)：(i)包括与seq id no:128至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链可变结构域(ii)包括与seq id no:129至少95％一致的氨基酸序列的第一轻链恒定结构域；(iii)包括与seq id no:130至少95％一致的氨基酸序列的第二铰链；(iv)包括与seq id no:131至少95％一致的氨基酸序列的第二ch2结构域；(v)包括与seq id no:132至少95％一致的氨基酸序列的第二ch3结构域；以及(c)(i)包括与seq id no:133至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链可变结构域；及(ii)包括与seq id no:134至少95％一致的氨基酸序列的第二轻链恒定结构域(例如kv4.33，图37a-b)。
62.本公开提供一种药物组合物，其包括本文所描述的三维多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种和药学上可接受的赋形剂。
63.在一个实施方式中，本文所描述的三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种可以用作药。
64.本公开提供一种或多种核酸，其编码(i)本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链，并且编码(ii)本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链，并且编码(iii)本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第三多肽链。
65.本公开提供一种可操作地连接于一种或多种核酸的载体，所述一种或多种核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链，并且编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链，并且编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第三多肽链。
66.本公开提供一种携带载体的宿主细胞，所述载体可操作地连接于一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的
第一多肽链，并且编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链，并且编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第三多肽链。
67.本公开提供一种用于制备本文所描述的三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种的方法，其包括：在适合于表达第一、第二和第三多肽链的条件下培养携带载体的宿主细胞的细胞群，其中载体可操作地连接于一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链，并且编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链，并且编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第三多肽链。在一个实施方式中，所述方法进一步包括：分离(回收)第一、第二和第三多肽链。在一个实施方式中，所述方法进一步包括使第一、第二和第三多肽链经受适合于使第一、第二和第三多肽链彼此缔合以形成/组装三链多特异性抗原结合蛋白复合物的条件。在一个实施方式中，所形成/组装的三链多特异性抗原结合蛋白复合物包括异二聚分子。
68.本公开提供(i)第一核酸，其编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链，和(ii)第二核酸，其编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链，(ii)第三核酸，其编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第三多肽链。
69.本公开提供一种载体系统，其包括第一载体，所述第一载体可操作地连接于第一核酸和任选地可操作地连接于第二和/或第三核酸中的任一种或其任何组合；以及第二载体，所述第二载体可操作地连接于第二和/或第三核酸中的任一种或其任何组合，其中第一核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链，其中第二核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链，并且其中第三核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第三多肽链。
70.在一个实施方式中，(i)第一载体可操作地连接于编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链的第一核酸，并且(ii)第二载体可操作地连接于编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链的第二核酸，并且第二载体可操作地连接于编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第三多肽链的第三核酸。在一个实施方式中，第一载体为包括至少一种启动子的第一表达载体，所述至少一种启动子可操作地连接于编码第一多肽链的第一核酸。在一个实施方式中，第二载体为包括至少一种启动子的第二表达载体，所述至少一种启动子可操作地连接于编码第二多肽链的第二核酸并且可操作地连接于编码第三多肽链的第三核酸。
71.本公开提供一种宿主细胞，其携带载体系统，其中所述载体系统包括第一载体，所述第一载体可操作地连接于第一核酸和任选地可操作地连接于第二和/或第三核酸中的任一种或其任何组合；并且包括第二载体，所述第二载体可操作地连接于第二和/或第三核酸中的任一种或其任何组合，其中第一核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链，其中第二核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链，并且其中第三核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第三多肽链。
72.在一个实施方式中，宿主细胞携带第一和第二载体，其中(i)第一载体可操作地连接于第一核酸，所述第一核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链，并且(ii)第二载体可操作地连接于第二核酸，所述第二核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链，并且第二载体可操作地连接于第三核酸，所述第三核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第三多肽链。
73.本公开提供用于制备本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的方法，其包括：在适合于表达第一、第二和第三多肽链的条件下培养携带第一和第二载体的宿主细胞的细胞群，其中(i)第一载体可操作地连接于第一核酸，所述第一核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一多肽链，并且(ii)第二载体可操作地连接于第二核酸，所述第二核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第二多肽链，并且第二载体可操作地连接于第三核酸，所述第三核酸编码本文所描述的任一种三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的第三多肽链。在一个实施方式中，所述方法进一步包括：分离(回收)第一、第二和第三多肽链。在一个实施方式中，所述方法进一步包括使第一、第二和第三多肽链经受适合于使第一、第二和第三多肽链彼此缔合以形成/组装三链多特异性抗原结合蛋白复合物的条件。在一个实施方式中，所形成/组装的三链多特异性抗原结合蛋白复合物包括异二聚分子。
74.本公开提供一种用于治疗个体的疾病的方法，其包括：向所述个体施用治疗有效量的本文所描述的三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种。
75.在一个实施方式中，疾病包括以下癌症：前列腺癌、乳癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、皮肤癌、结直肠癌、肛门癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、平滑肌瘤癌、脑癌、神经胶质瘤癌、胶质母细胞瘤癌、食道癌、肝癌、肾癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、外阴癌、喉癌、阴道癌、骨癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉癌、下喉癌、唾液腺癌、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌或睾丸癌。
76.在一个实施方式中，疾病包括血液癌症，其中所述血液癌症为b慢性淋巴细胞白血病(b-cll)、b细胞和t细胞急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓系白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、毛细胞白血病(hcl)、骨髓增生性病症/赘瘤(mpds)、骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤(nhl)(包含伯基特氏淋巴瘤(bl)、华氏巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、aids相关淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤(hl)、t细胞淋巴瘤(tcl)、多发性骨髓瘤(mm)、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤或轻链或本斯-琼斯氏骨髓瘤。
77.本公开提供一种用于结合第一和第二目标表位的方法，其包括：(a)使所述第一目标表位和所述第二目标表位与本文所描述的三链多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种接触，和(b)使所述第一目标表位与所述第一fab区结合并且使所述第二目标表位与所述第二fab区结合。
78.在一个实施方式中，第一目标表位包括由肿瘤或癌细胞表达的细胞表面抗原。
79.在一个实施方式中，第二表位包括由效应t细胞表达的细胞表面抗原。在一个实施方式中，三链多特异性抗原结合蛋白复合物通过结合由肿瘤或癌细胞表达的细胞表面抗原和通过结合由效应t细胞表达的细胞表面抗原来形成细胞突触。
80.在一个实施方式中，细胞突触中的效应t细胞通过介导细胞毒性细胞杀伤来杀死肿瘤或癌细胞。
附图说明
81.图1为显示包括2条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以串联方式排列(例如，kv6.1)。
82.图2为显示包括3条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以串联方式排列(例如，kv5.1)。
83.图3为显示包括2条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以非串联方式排列(例如，kv6.2)。
84.图4为显示包括3条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以非串联方式排列(例如，kv4.33)。
85.图5为显示包括2条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以串联方式排列(例如，替代性排列)。
86.图6为显示包括2条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以串联方式排列(例如，替代性排列)。
87.图7为显示包括2条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以串联方式排列(例如，替代性排列)。
88.图8为显示包括2条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以非串联方式排列(例如，替代性排列)。
89.图9为显示包括2条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以非串联方式排列(例如，替代性排列)。
90.图10为显示包括2条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以非串联方式排列(例如，替代性排列)。
91.图11为显示包括3条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以串联方式排列(例如，替代性排列)。
92.图12为显示包括3条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以串联方式排列(例如，替代性排列)。
93.图13为显示包括3条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以串联方式排列(例如，替代性排列)。
94.图14为显示包括3条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以非串联方式排列(例如，替代性排列)。
95.图15为显示包括3条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以非串联方式排列(例如，替代性排列)。
96.图16为显示包括3条多肽链的蛋白复合物的非限制性实施方式的示意图，其中两个不同fab区以非串联方式排列(例如，替代性排列)。
97.图17a为显示双特异性抗体与egfr的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗egfr第一fab区和抗pd-l1第二fab区的3链非串联蛋白复合物(kv4.33)。
98.图17b为显示双特异性抗体与egfr的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗
efgr第一fab区和抗pd-l1第二fab区的3链串联蛋白复合物(kv5.1)。
99.图17c为显示对照抗egfr抗体(小鼠-人类嵌合moab；参见图43)与egfr的结合的spr传感图。
100.图17d为显示抗egfr mab(亲本抗体)与egfr的结合的spr传感图。
101.图18a为显示双特异性抗体与pd-l1的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗egfr第一fab区和抗pd-l1第二fab区的3链非串联蛋白复合物(kv4.33)。
102.图18b为显示双特异性抗体与pd-l1的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗efgr第一fab区和抗pd-l1第二fab区的3链串联蛋白复合物(kv5.1)。
103.图18c为显示抗pd-l1 mab(亲本抗体)与pd-l1的结合的spr传感图。
104.图19a为显示双特异性抗体与cd38的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗cd38第一fab区和抗cd3第二fab区的3链非串联蛋白复合物(kv4.33)。
105.图19b为显示双特异性抗体与cd38的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗cd38第一fab区和抗cd3第二fab区的3链串联蛋白复合物(kv5.1)。
106.图19c为显示抗cd38 mab(亲本抗体)与cd38的结合的spr传感图。
107.图19d为显示双特异性抗体与cd38的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗cd38第一fab区和抗cd3第二fab区的2链串联蛋白复合物(kv6.1)。
108.图19e为显示双特异性抗体与cd38的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗cd38第一fab区和抗cd3第二fab区的2链非串联蛋白复合物(kv6.2)。
109.图20a为显示双特异性抗体与bcma的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗bcma第一fab区和抗cd3第二fab区的3链非串联蛋白复合物(kv4.33)。
110.图20b为显示抗bcma mab(亲本抗体)与bcma的结合的spr传感图。
111.图21a为显示双特异性抗体与固定化egfr的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗egfr第一fab区和抗pd-l1第二fab区的3链非串联蛋白复合物(kv4.33)。
112.图21b为显示双特异性抗体与固定化egfr的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗efgr第一fab区和抗pd-l1第二fab区的3链串联蛋白复合物(kv5.1)。
113.图21c为显示双特异性抗体与固定化pd-l1的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗egfr第一fab区和抗pd-l1第二fab区的3链非串联蛋白复合物(kv4.33)。
114.图21d为显示双特异性抗体与固定化pd-l1的结合的spr传感图。双特异性抗体包括具有抗efgr第一fab区和抗pd-l1第二fab区的3链串联蛋白复合物(kv5.1)。
115.图22a为显示双特异性抗体与egfr和pd-l1抗原结合结构域两者的结合的spr传感图。egfr抗原是固定的，其结合双特异性抗体，所述双特异性抗体包括具有抗efgr第一fab区和抗pd-l1第二fab区的3链串联蛋白复合物(kv5.1)，并且pd-l1抗原呈流动相。
116.图22b为来自图22a的矩形区域的减去参考的传感图。
117.图23a为显示双特异性抗体与egfr和pd-l1抗原结合结构域两者的结合的spr传感图。pd-l1抗原是固定的，其结合双特异性抗体，所述双特异性抗体包括具有抗efgr第一fab区和抗pd-l1第二fab区的3链串联蛋白复合物(kv5.1)，并且egfr抗原呈流动相。
118.图23b为来自图23a的矩形区域的减去参考的传感图。
119.图24a为各自携带不同可裂解连接子并且用mmp9蛋白酶裂解1小时的各种双链串联(kv6.1)cd38/cd3双特异性抗体的抗人类fc蛋白质印迹(还原条件)。箭头表示裂解产物。
ei、ej、ek、el em、en、eo、ep、eq、er、es、et和eg的可裂解连接子序列在实例4中的表1中列出。
120.图24b为各自携带不同可裂解连接子并且用mmp9蛋白酶裂解1小时的各种双链非串联(kv6.2)cd38/cd3双特异性抗体的抗人类fc蛋白质印迹(还原条件)。箭头表示裂解产物。eu、ev、ew、ex、ey、ez、fa、fb、fc、fd、fe、ff和eh的可裂解连接子序列在实例4中的表1中列出。
121.图24c为各自携带不同可裂解连接子并且用mmp9蛋白酶裂解2小时的各种双链非串联(kv6.2)cd38/cd3双特异性抗体的抗人类fc蛋白质印迹(还原条件)。箭头表示裂解产物。eu、ev、ew、ex、ey、ez、fa、fb、fc、fd、fe、ff和eh的可裂解连接子序列在实例4中的表1中列出。
122.图24d为各自携带不同可裂解连接子并且用mmp2蛋白酶裂解1小时的各种双链非串联(kv6.2)cd38/cd3双特异性抗体的抗人类fc蛋白质印迹(还原条件)。箭头表示裂解产物。eu、ev、ew、ex、ey、ez、fa、fb、fc、fd、fe、ff和eh的可裂解连接子序列在实例4中的表1中列出。
123.图24e为各自携带不同可裂解连接子并且用mmp2蛋白酶裂解2小时的各种双链非串联(kv6.2)cd38/cd3双特异性抗体的抗人类fc蛋白质印迹(还原条件)。箭头表示裂解产物。eu、ev、ew、ex、ey、ez、fa、fb、fc、fd、fe、ff和eh的可裂解连接子序列在实例4中的表1中列出。
124.图25a显示与表达cd3的t细胞结合的各种完整双链和三链、以及串联和非串联cd38/cd3双特异性抗体的剂量依赖性结合曲线。
125.图25b显示与表达cd3的t细胞结合的完整bcma/cd3双特异性抗体(三链非串联；kv4.33)的剂量依赖性结合曲线。
126.图25c显示与表达cd3的t细胞结合的完整bcma/cd3双特异性抗体(三链串联kv5.1和非串联kv4.33)的剂量依赖性结合曲线。
127.图26a显示与表达cd3的t细胞结合的各自携带不同可裂解连接子序列、用mmp9蛋白酶裂解或完整的各种双链串联(kv6.1)cd38/cd3双特异性抗体的剂量依赖性结合曲线。包含三链(kv5.1)串联双特异性抗体的结合能力以用于比较。
128.图26b显示与表达cd3的t细胞结合的各自携带不同可裂解连接子序列、用mmp9蛋白酶裂解或完整的各种双链非串联(kv6.2)cd38/cd3双特异性抗体的剂量依赖性结合曲线。包含三链(kv4.33)非串联双特异性抗体的结合能力以用于比较。
129.图27a显示来自抗体介导的肿瘤相关抗原依赖性t细胞细胞毒性分析的三链串联(kv5.1)和非串联(kv4.33)cd38/cd3双特异性抗体的ifnγ释放曲线。
130.图27b显示来自抗体介导的肿瘤相关抗原依赖性t细胞细胞毒性分析的三链串联(kv5.1)和非串联(kv4.33)cd38/cd3双特异性抗体的il2释放曲线。
131.图27c显示来自抗体介导的肿瘤相关抗原依赖性t细胞细胞毒性分析的三链串联(kv5.1)和非串联(kv4.33)cd38/cd3双特异性抗体的tfnα释放曲线。
132.图27d为显示来自图27a-c中所示的抗体介导的肿瘤相关抗原依赖性t细胞细胞毒性分析的三链串联(kv5.1)和非串联(kv4.33)cd38/cd3双特异性抗体的细胞介素释放分布曲线的并排比较的条形图。
133.图28a为显示测试不同浓度的三链串联(kv5.1)和非串联(kv4.33)、bcma/cd3和cd38/cd3双特异性抗体的体外剂量反应t细胞活化分析的结果的条形图。
134.图28b为显示在不存在肿瘤细胞的情况下且测试不同浓度的三链串联(kv5.1)和非串联(kv4.33)、bcma/cd3和cd38/cd3双特异性抗体的体外剂量反应t细胞活化分析的结果的条形图。
135.图28c为显示体外剂量反应t细胞活化分析的结果的条形图，所述体外剂量反应t细胞活化分析还显示三链非串联(kv4.33)bcma/cd3双特异性抗体的目标特异性。
136.图28d为显示体外剂量反应t细胞活化分析的结果的条形图，所述体外剂量反应t细胞活化分析还显示三链非串联(kv4.33)cd38/cd3双特异性抗体的目标特异性。
137.图28e为显示体外剂量反应t细胞活化分析的结果的条形图，所述体外剂量反应t细胞活化分析还显示三链串联(kv5.1)cd38/cd3双特异性抗体的目标特异性。
138.图28f为显示对照亲本抗bcmamab和抗cd3 mab的混合物的体外剂量反应t细胞活化分析的结果的条形图。
139.图28g为显示对照亲本抗cd38 mab和抗cd3 mab的混合物的体外剂量反应t细胞活化分析的结果的条形图。
140.图29a显示体外肿瘤相关抗原(tumor associated antigen；taa)依赖性t细胞细胞毒性分析的结果，所述分析比较两种不同的串联(kv4.33)和非串联(kv5.1)结合cd38/cd3的三链双特异性抗体对rpmi8226细胞的杀伤活性。
141.图29b显示体外肿瘤相关抗原(tumor associated antigen；taa)依赖性t细胞细胞毒性分析的结果，所述分析比较两种不同的串联(kv4.33)和非串联(kv5.1)结合cd38/cd3或bcma/cd3的三链双特异性抗体对mm1.r细胞的杀伤活性。包含抗bcma mab和抗cd3 mab的组合的杀伤活性以用于比较。
142.图29c显示体外肿瘤相关抗原(tumor associated antigen；taa)依赖性t细胞细胞毒性分析的结果，所述分析比较三种不同的串联(kv4.33)和非串联(kv5.1)结合cd38/cd3或bcma/cd3的三链双特异性抗体对mm1.r细胞的杀伤活性。包含抗cd38 mab和抗cd3 mab的组合的杀伤活性以用于比较。
143.图30a为显示使用流式细胞测量术对经转导以表达gfp和萤火虫荧光素酶的六个细胞系进行cd38表达水平表征的结果的条形图。
144.图30b为显示通过流式细胞测量术对供体效应细胞细胞毒性t细胞和nk细胞进行定量的图。
145.图30c为一系列6个图，其显示与通过细胞毒性t细胞或nk细胞针对cd38(+)肿瘤细胞系的darzalex相比，cd38/cd3三链双特异性抗体(串联kv5.1)的体外剂量依赖性细胞毒性的结果。
146.图31a为结合cd38和cd3的双链串联双特异性抗体(kv6.1)的第一多肽链的各个区的氨基酸序列。
147.图31b为包含不同第二连接子序列的实施方式的图31a中所示的双链串联双特异性抗体(kv6.2)的第二多肽链的各个区的氨基酸序列。
148.图31c为图31b的续图，其显示双链串联双特异性抗体(kv6.2)的第二多肽链的各个区的氨基酸序列。
149.图32a为结合cd38和cd3的双链非串联双特异性抗体(kv6.2)的第一多肽链的各个区的氨基酸序列。
150.图32b为包含不同第二连接子序列的实施方式的图32a中所示的双链非串联双特异性抗体(kv6.2)的第二多肽链的各个区的氨基酸序列。
151.图32c为图32b的续图，其显示双链非串联双特异性抗体(kv6.2)的第二多肽链的各个区的氨基酸序列。
152.图33a为结合cd38和cd3的三链串联双特异性抗体(kv5.1)的第一多肽链的各个区的氨基酸序列。
153.图33b为图33a中所示的双链串联双特异性抗体(kv5.1)的第二和第三多肽链的各个区的氨基酸序列。
154.图34a为结合cd38和cd3的三链非串联双特异性抗体(kv4.33)的第一多肽链的各个区的氨基酸序列。
155.图34b为图33a中所示的双链非串联双特异性抗体(kv4.33)的第二和第三多肽链的各个区的氨基酸序列。
156.图35a为结合bcma和cd3的三链非串联双特异性抗体(kv4.33)的第一多肽链的各个区的氨基酸序列。
157.图35b为图35a中所示的双链非串联双特异性抗体(kv4.33)的第二和第三多肽链的各个区的氨基酸序列。
158.图36a为结合egfr和pd-l1的三链串联双特异性抗体(kv5.1)的第一多肽链的各个区的氨基酸序列。
159.图36b为图36a中所示的双链串联双特异性抗体(kv5.1)的第二和第三多肽链的各个区的氨基酸序列。
160.图37a为结合pd-l1和egfr的三链非串联双特异性抗体(kv4.33)的第一多肽链的各个区的氨基酸序列。
161.图37b为图37a中所示的双链非串联双特异性抗体(kv4.33)的第二和第三多肽链的各个区的氨基酸序列。
162.图38a为结合bcma和cd3的三链串联双特异性抗体(kv5.1)的第一多肽链的各个区的氨基酸序列。
163.图38b为图38a中所示的双链串联双特异性抗体(kv5.1)的第二和第三多肽链的各个区的氨基酸序列。
具体实施方式
164.定义：
165.除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。一般来说，与本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、转基因细胞生产、蛋白质化学和核酸化学以及杂交技术有关的术语是本领域中众所周知和常用的。除非另外指示，否则通常根据本领域中熟知以及如在本文中引用和讨论的各个一般和更具体的参考文献中所描述的常规方法进行本文提供的方法和技术。参见例如sambrook等人《分子克隆：实验指南(molecular cloning:a laboratory manual)》,第2版,
冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press),纽约冷泉港(cold spring harbor,n.y.)(1989)和ausubel等人,《现代分子生物学实验技术(current protocols in molecular biology)》,格林出版协会(greene publishing associates)(1992)。许多基础文本描述了标准抗体生产过程，包含borrebaeck(编)《抗体工程(antibody engineering)》，第2版，纽约弗里曼公司(freeman and company,ny),1995；mccafferty等人《抗体工程，实践方法(antibody engineering,a practical approach)》英国牛津的牛津出版社irl(irl at oxford press,oxford,england),1996；和paul(1995)《抗体工程方案(antibody engineering protocols)》新泽西州托瓦塔胡马纳出版社(humana press,towata,n.j.),1995；paul(编),《基础免疫学(fundamental immunology)》,纽约雷文出版社(raven press,n.y),1993；coligan(1991)《免疫学最新方案(current protocols in immunology)》纽约威立/格林(wiley/greene,ny)；harlow和lane(1989)《抗体：实验室手册(antibodies:a laboratory manual)》纽约冷泉港出版社；stites等人(编)《基础临床免疫学(basic and clinical immunology)》(第4版)加利福尼亚州洛斯拉图斯兰格医学出版(lange medical publications,los altos,calif.)和其中引用的参考文献；《编码单克隆抗体：原理和实践(coding monoclonal antibodies:principles and practice)》(第2版)纽约州纽约学术出版社(academic press,new york,n.y.),1986，和kohler和milstein《自然(nature)》256:495-497,1975。本文中所引用的所有参考文献都以全文引用的方式并入本文中。酶促反应和富集/纯化技术也是众所周知的，并根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所描述。与本文所描述的分析化学、合成有机化学以及药物和制药化学相关使用的术语以及实验室程序和技术都是本领域中众所周知和常用的。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及对患者的治疗。
166.本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，所述方面可以通过整体参考本说明书来理解。
167.除非上下文另有要求，否则单数术语应包含复数并且复数术语应包含单数。单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”以及任何词语的单数使用均包含多个指示物，除非明确且无误地限制于一个指示物。
168.应理解，本文使用的替代词(例如“或”)意指替代物中的一个或两个或其任何组合。
169.本文使用的术语“和/或”意指每个特定特征或组分的具体公开伴随或不伴随其它特征或组分。例如，在本文如“a和/或b”的短语中使用的术语“和/或”旨在包含“a和b”、“a或b”、“a”(单独)和“b”(单独)。同样，在如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下各个方面：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
170.如本文所用，术语“包括”、“包含”、“具有”和“含有”以及它们的语法变体如本文所用旨在为非限制性的，使得列表中的一个项目或多个项目并不排除可以被替换或添加到所列项目中的其它项目。应理解，每当本文用语言“包括”描述的方面时，也提供按照“由
……
组成”和/或“基本上由
……
组成”描述的其它类似方面。
171.如本文所用，术语“约”是指在如本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接
受误差范围内的值或组成，这将部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。举例来说，“约”或“大约”可以意指按照本领域的实践在一个或多于一个标准差内。或者，取决于测量系统的限制，“约”或“大约”可意味着高达10％(即，
±
10％)或更大的范围。例如，约5mg可以包含4.5mg与5.5mg之间的任何数字。此外，特别是就生物系统或过程而言，所述术语可以意指至多一个数量级或至多5倍的值。当本公开中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则“约”或“大约”的含义应假定为在所述特定值或组成的可接受误差范围内。
172.术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”和本文使用的其它相关术语可互换使用，且是指氨基酸的聚合物并且不限于任何特定长度。多肽可以包括天然和非天然氨基酸。多肽包含重组形式或化学合成形式。多肽还包含尚未经历裂解，例如在某些氨基酸残基处通过分泌信号肽裂解或通过非酶裂解的前体分子。多肽包含已经历裂解的成熟分子。这些术语涵盖原生和人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物(如突变蛋白、变异体、嵌合蛋白和融合蛋白)以及翻译后或以其它方式共价或非共价修饰的蛋白质。两种或更多种多肽(例如2或3条多肽链)可经由共价和/或非共价缔合彼此缔合以形成多聚体多肽复合物(例如多特异性抗原结合蛋白复合物)。多肽链的缔合还可包含肽折叠。因此，取决于形成复合物的多肽链的数目，多肽复合物可以是二聚、三聚、四聚的或更高阶复合物。
173.术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”以及本文使用的其它相关术语可互换使用且是指核苷酸的聚合物并且不限于任何特定长度。核酸包含重组形式和化学合成形式。核酸包含dna分子(cdna或基因组dna)、rna分子(例如mrna)、使用核苷酸类似物生成的dna或rna的类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)及其杂交物。核酸分子可以是单股的或双股的。在一个实施方式中，本公开的核酸分子包括编码抗体或其片段或scfv、衍生物、突变蛋白或变异体的连续开放阅读框。
174.术语“回收(recover/recovery/recovering)”和其它相关术语是指从宿主细胞培养基或宿主细胞溶解物或宿主细胞膜中获得蛋白质(例如，抗体或其抗原结合部分)。在一个实施方式中，蛋白质由宿主细胞表达为与分泌信号肽序列融合的重组蛋白，所述分泌信号肽序列介导所表达的蛋白质的分泌。分泌的蛋白可以从宿主细胞培养基回收。在一个实施方式中，蛋白质由宿主细胞表达为不具有分泌信号肽序列的重组蛋白，其可从宿主细胞溶解物回收。在一个实施方式中，蛋白质由宿主细胞表达为膜结合蛋白，其可以使用清洁剂从宿主细胞膜释放表达的蛋白质来进行回收。在一个实施方式中，无论使用何种方法回收蛋白质，都可以对蛋白质进行从回收的蛋白质中去除细胞碎片的程序。例如，回收的蛋白质可以进行色谱、凝胶电泳和/或透析。在一个实施方式中，色谱包括任何一种或任何组合或两种或更多种的程序，包含亲和色谱、羟基磷灰石色谱、离子交换色谱、反相色谱和/或硅土色谱。在一个实施方式中，亲和色谱包括蛋白a或g(来自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的细胞壁组分)。
175.术语“分离的”是指基本上不含其它细胞物质的蛋白质(例如，抗体或其抗原结合部分)或多核苷酸。蛋白质可以通过使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术进行分离，使其基本上不含天然结合组分(或与细胞表达系统或用于产生抗体的化学合成方法相关的组分)。术语分离的在一些实施方式中还指基本上不含同一物种的其它分子的蛋白质或多核苷酸，例如分别具有不同氨基酸或核苷酸序列的其它蛋白质或多核苷酸。所需分子的均一性纯度可以使用本领域众所周知的技术进行分析，包含低分辨率方法如凝胶电泳和高分辨
region；cdr)片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体和含有至少免疫球蛋白的足以赋予抗体片段抗原结合特性的部分的多肽。
188.术语“fab”、“fab片段”和其它相关术语是指包括可变轻链区(v
l
)、恒定轻链区(c
l
)、可变重链区(vh)和第一恒定区(c
h1
)的单价片段。半fab重链区包括可变重链区(vh)和第一恒定区(c
h1
)。半fab轻链区包括可变轻链区(v
l
)和恒定轻链区(c
l
)。fab能够结合抗原。f(ab')2片段是包括两个在铰链区由二硫桥键连接的fab片段的二价片段。f(ab')2具有抗原结合能力。fd片段包括vh和c
h1
区。fv片段包括v
l
和vh区。fv可以结合抗原。dab片段具有vh结构域、v
l
结构域或vh或具有v
l
结构域的抗原结合片段(美国专利6,846,634和6,696,245；美国公开申请第2002/02512号、第2004/0202995号、第2004/0038291号、第2004/0009507号、第2003/0039958号；和ward等人,《自然》341:544-546,1989)。
189.单链抗体(scfv)是其中v
l
和vh区通过连接子(例如，氨基酸残基的合成序列)接合以形成连续蛋白质链的抗体。优选地，连接子足够长以允许蛋白质链自身回折并形成单价抗原结合位点(参见例如bird等人,1988,《科学(science)》242:423-26和huston等人,1988,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.aci.usa)》85:5879-83)。
190.双功能抗体是包括两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包括通过连接子接合的vh和v
l
结构域，所述连接子太短以使在同一链上的两个结构域之间无法配对，因此允许每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对(参见例如holliger等人,1993,《美国国家科学院院刊》90:6444-48和poljak等人,1994,《结构(structure)》2:1121-23)。如果双功能抗体的两条多肽链相同，则由其配对产生的双功能抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可用于制造具有两个不同抗原结合位点的双功能抗体。类似地，三功能抗体和四功能抗体是分别包括三条和四条多肽链并分别形成三个和四个抗原结合位点的抗体，所述抗原结合位点可以相同或不同。
191.术语“人抗体”是指具有一个或多个源自人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。在一个实施方式中，所有可变结构域和恒定结构域都源自人免疫球蛋白序列(例如全人抗体)。这些抗体可以通过多种方式制备，其实例如下所描述，包含通过重组方法或通过用小鼠的相关抗原进行免疫，所述小鼠经基因修饰以表达源自人重链和/或轻链编码基因的抗体。
[0192]“人源化”抗体是指序列通过一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加而与源自非人物种的抗体的序列不同的抗体，从而使人源化抗体与非人物种抗体相比，在施用于人类受试者时，不太可能诱发免疫反应，和/或诱发较不严重的免疫反应。在一个实施方式中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定结构域中的某些氨基酸经突变以产生人源化抗体。在另一实施方式中，来自人抗体的恒定结构域与非人物种的可变结构域融合。在另一实施方式中，改变非人抗体的一个或多个cdr序列中的一个或多个氨基酸残基以降低非人抗体施用于人类受试者时可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对于抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键性的，或者对氨基酸序列所作的改变是保守的改变，使得人源化抗体与抗原的结合不会比非人抗体与抗原的结合明显更差。如何制造人源化抗体的实例可见于美国专利第6,054,297号、第5,886,152号和第5,877,293号中。
[0193]
本文所用的术语“嵌合抗体”和相关术语是指含有来自第一抗体的一个或多个区和来自一个或多个其它抗体的一个或多个区的抗体。在一个实施方式中，一个或多个cdr源
可以通过使用gap计算机程序(gcg wisconsin package的一部分，版本10.3(accelrys,san diego,calif.))使用其默认参数比较序列来确定。关于测试序列，如“包括与y至少x％一致的序列”的表达意味着当与如上所描述的序列y比对时，测试序列包括与y的残基至少x％相同的残基。
[0200]
在一个实施方式中，测试抗体的氨基酸序列可以与构成本文所描述的多特异性抗原结合蛋白复合物的多肽中的任一个氨基酸序列类似但不相同。测试抗体与多肽之间的相似性可以是与构成本文所描述的多特异性抗原结合蛋白复合物的任何多肽至少95％、或至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同、或至少99％相同。在一个实施方式中，类似的多肽可以含有重链和/或轻链内的氨基酸取代。在一个实施方式中，氨基酸取代包括一个或多个保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(r基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代不会实质性改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列一致百分比或相似性程度，以校正取代的保守本质。用于作出此调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参见例如pearson(1994)《分子生物学方法(methods mol.biol.)》24:307-331，其以全文引用的方式并入本文中。具有化学特性类似的侧链的氨基酸基团的实例包含(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链是半胱氨酸和蛋氨酸。
[0201]
抗体可以获自含有具有不同的抗原特异性的免疫球蛋白的来源，如血清或血浆。如果对此类抗体进行亲和纯化，其可以富集特定的抗原特异性。此类富集的抗体制剂通常由少于约10％的对特定抗原具有特异性结合活性的抗体构成。对这些制剂进行几轮亲和纯化可以增加对抗原具有特异性结合活性的抗体的比例。以这种方式制备的抗体通常被称为“单特异性”。单特异性抗体制剂可以由约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％的对特定抗原具有特异性结合活性的抗体构成。抗体可以使用如下文所描述的重组核酸技术产生。
[0202]
本文所用的“载体”和相关术语是指可与外来遗传物质(例如核酸转基因)可操作地连接的核酸分子(例如dna或rna)。载体可以用作将外来遗传物质引入细胞(例如宿主细胞)中的运载工具。载体可以包含至少一个限制性核酸内切酶识别序列，用于将转基因插入载体中。载体可以包含至少一个赋予抗生素抗性或可选择的特征的基因序列，以帮助选择携带载体-转基因构建体的宿主细胞。载体可以是单股或双股核酸分子。载体可以是线性或环状核酸分子。用于采用锌指核酸酶、talen或crispr/cas的基因编辑方法的供体核酸可以是一种类型的载体。一种类型的载体是“质粒”，其是指线性或环状的双股染色体外dna分子，其可以与转基因连接，并能够在宿主细胞中复制，且转录和/或翻译转基因。病毒载体通常含有可与转基因连接的病毒rna或dna主链序列。病毒主链序列可以经修饰以使感染失效，但保留病毒主链和共同连接的转基因插入宿主细胞基因组中。病毒载体的实例包含逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、乳多空病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒和爱泼斯坦巴尔(epstein barr)病毒载体。某些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，包括细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型
哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中时被集成到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。
[0203]“表达载体”为可含有一个或多个调控序列，如诱导型和/或组成型启动子和增强子的载体的类型。表达载体可以包含核糖体结合位点和/或多腺苷酸化位点。调控序列引导与转导到宿主细胞中的表达载体连接的转基因的转录或转录和翻译。调控序列可以控制转基因的表达水平、时间和/或位置。例如，调控序列可以直接或通过一种或多种其它分子(例如，与调控序列和/或核酸结合的多肽)的作用对转基因施加影响。调控序列可以是载体的一部分。调控序列的其它实例描述于例如goeddel,1990,《基因表达技术：酶学方法(gene expression technology:methods in enzymology)》185,学术出版社(academic press),加利福尼亚州圣地亚哥(san diego,calif.)和baron等人,1995,《核酸研究(nucleic acids res.)》23:3605-3606中。
[0204]
当转基因与载体之间存在联系以允许载体中包含的转基因序列发挥功能或表达时，转基因与载体“可操作地连接”。在一个实施方式中，当调控序列影响到转基因的表达(例如表达的水平、时间或位置)时，转基因与至少一个调控序列“可操作地连接”。
[0205]
本文所用的术语“转染”或“转化”或“转导”或其它相关术语是指将外源核酸(例如转基因)转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”的宿主细胞是已经用外源核酸(转基因)转染、转化或转导的宿主细胞。宿主细胞包含原代个体细胞和其后代。
[0206]
如本文所用的术语“宿主细胞”或“或宿主细胞的细胞群”或相关术语是指其中已经引入外来(外源性或转基因)核酸的细胞(或其细胞群)。外来核酸可以包含与转基因可操作地连接的表达载体，并且宿主细胞可用于表达外来核酸(转基因)所编码的核酸和/或多肽。宿主细胞(或其细胞群)可以是经培养的细胞或可以从个体提取。宿主细胞(或其细胞群)包含原代个体细胞和其后代，而不考虑传代次数。与亲本细胞相比，后代细胞可能具有或可能不具有相同的遗传物质。宿主细胞涵盖后代细胞。在一个实施方式中，宿主细胞描述以任何方式被修饰、转染、转导、转化和/或操纵以表达如本文所公开的抗体的任何细胞(包含其后代)。在一个实例中，宿主细胞(或其细胞群)可以引入有与编码本文所描述的所需抗体或其抗原结合部分的核酸可操作地连接的表达载体。宿主细胞和其细胞群可以具有稳定集成到宿主基因组中的表达载体或可以具有染色体外表达载体。在一个实施方式中，宿主细胞和其细胞群可以具有染色体外载体，所述载体在几次细胞分裂后存在，或暂时存在并在几次细胞分裂后消失。
[0207]
转基因宿主细胞可以使用非病毒方法，包含众所周知的设计者核酸酶，包含锌指核酸酶、talens或crispr/cas制备。转基因可以使用基因组编辑技术，如锌指核酸酶引入到宿主细胞的基因组中。锌指核酸酶包含一对嵌合蛋白质，其各自含有与来自工程改造锌指基序的dna结合结构域融合的限制性核酸内切酶(例如foki)的非特异性核酸内切酶结构域。dna结合结构域可以经工程改造以结合宿主基因组中的特定序列并且核酸内切酶结构域进行双股切割。供体dna携带转基因，例如编码本文所描述的car或dar构建体的核酸中的任一种，和与宿主细胞基因组中的预期插入位点的任一侧上的区域同源的侧接序列。宿主细胞的dna修复机制能够实现通过同源dna修复的转基因的精确插入。转基因哺乳动物宿主细胞已使用锌指核酸酶制备(美国专利第9,597,357号、第9,616,090号、第9,816,074号和第8,945,868号)。转基因宿主细胞可以使用转录活化因子样效应物核酸酶(talen)制备，所
述talen类似于锌指核酸酶，因为其包含与可以递送精确转基因插入的dna结合结构域融合的非特异性核酸内切酶结构域。如同锌指核酸酶，talen还将双股切割引入到宿主dna中。转基因宿主细胞可以使用规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)制备。crispr采用与引导rna偶合以用于目标特异性供体dna集成的cas核酸内切酶。引导rna包含在目标dna中的grna结合区上游含有前间隔子邻近基序(pam)序列的保守多核苷酸并且与cas核酸内切酶使双股目标dna裂解的宿主细胞目标位点杂交。引导rna可以被设计成与特定目标位点杂交。类似于锌指核酸酶和talen，crispr/cas系统可以用于引入具有与插入位点同源的侧接序列的供体dna的位点特异性插入。用于修饰基因组的crispr/cas系统的实例描述于例如美国专利第8,697,359号、第10,000,772号、第9,790,490号和美国专利申请公开第us 2018/0346927号。在一个实施方式中，转基因宿主细胞可以使用锌指核酸酶、talen或crispr/cas系统制备，并且宿主目标位点可以是trac基因(t细胞受体α恒定)。供体dna可以包含例如编码本文所描述的car或dar构建体的核酸中的任一种。电穿孔、核转染或脂质体转染可用于将供体dna与锌指核酸酶、talen或crispr/cas系统共递送到宿主细胞中。
[0208]
宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或者可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如酵母或其它真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、哺乳动物细胞(例如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。在一个实施方式中，宿主细胞可以引入有与编码所需抗体的核酸可操作地连接的表达载体，从而产生转染/转化的宿主细胞，其在适于转染/转化的宿主细胞表达抗体的条件下进行培养，且可选的从转染/转化的宿主细胞回收抗体(例如，从宿主细胞溶解物回收)或从培养基回收。在一个实施方式中，宿主细胞包括非人细胞，包含cho、bhk、ns0、sp2/0和yb2/0。在一个实施方式中，宿主细胞包括人细胞，包含hek293、ht-1080、huh-7和per.c6。宿主细胞的实例包含猴肾细胞cos-7系(atcc crl 1651)(参见gluzman等人,1981,《细胞(cell)》23:175)、l细胞、c127细胞、3t3细胞(atcc ccl 163)、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或其衍生物如veggie cho和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见rasmussen等人,1998,《细胞工程技术(cytotechnology)》28:31)或缺乏dhfr的cho品系dx-b11(参见urlaub等人,1980,《美国国家科学院院刊》77:4216-20)、hela细胞、bhk(atcc crl 10)细胞系、源自非洲绿猴肾细胞系cv1(atcc ccl 70)的cv1/ebna细胞系(参见mcmahan等人,1991,《欧洲分子生物学杂志(embo j.)》10:2821)、人胚胎肾细胞如293、293ebna或msr 293、人表皮a431细胞、人colo 205细胞、其它转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、源自原代组织体外培养的细胞品系、原代外植体、hl-60、u937、hak或jurkat细胞。在一个实施方式中，宿主细胞包含淋巴细胞，如y0、ns0或sp20。在一个实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，但不是人类宿主细胞。通常，宿主细胞是可以用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，所述核酸随后可以在宿主细胞中表达。短语“转基因宿主细胞”或“重组宿主细胞”可用于表示已用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以是包括核酸但不以期望的水平表达核酸的细胞，除非将调控序列引入宿主细胞，使其与核酸可操作地连接。应理解，术语宿主细胞不仅指特定个体细胞，而且还指此类细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于例如突变或环境影响而在后代中发生，所以此类后代实际上可能不与亲本细胞相同，但仍包含在本文中所使用的术语的范围内。
[0209]
本公开的多肽(例如抗体和抗原结合蛋白)可以使用本领域已知的任何方法产生。
在一个实例中，多肽是通过重组核酸方法，通过将编码多肽的核酸序列(例如dna)插入重组表达载体中，将重组表达载体引入宿主细胞并由宿主细胞在促进表达的条件下表达而产生。
[0210]
重组核酸操纵的一般技术描述于例如sambrook等人,《分子克隆：实验指南(molecular cloning:a laboratory manual)》,第1-3卷,冷泉港实验室出版社,第2版,1989或f.ausubel等人,《现代分子生物学实验技术(current protocols in molecular biology)》(格林出版和威立国际科学：纽约(green publishing and wiley-interscience:new york),1987)和定期更新，其以全文引用的方式并入本文中。编码多肽的核酸(例如dna)与携带一种或多种源自哺乳动物、病毒或昆虫基因的适合的转录或翻译调控元件的表达载体可操作地连接。此类调控元件包含转录启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。表达载体可以包含在宿主细胞中赋予复制能力的复制起点。表达载体可以包含赋予选择以促进转基因宿主细胞(例如转化体)识别的基因。
[0211]
重组dna还可以编码任何类型的蛋白质标签序列，其可能对蛋白质纯化有用。蛋白质标签的实例包含但不限于组氨酸标签、flag标签、myc标签、ha标签或gst标签。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当克隆和表达载体可见于《克隆载体：实验室手册(cloning vectors:a laboratory manual)》,(纽约埃尔塞维尔(elsevier,n.y.),1985)。
[0212]
表达载体构建体可以使用适合于宿主细胞的方法引入宿主细胞中。将核酸引入宿主细胞的各种方法是本领域已知的，包含但不限于电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其它物质的转染；病毒转染；非病毒转染；微弹轰击；脂转染；以及感染(例如，当载体是感染物时)。合适的宿主细胞包含原核生物、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。
[0213]
适合细菌包含革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌属(bacillus spp.)。酵母，优选来自酵母物种，如酿酒酵母(s.cerevisiae)，也可用于生产多肽。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可用于表达重组蛋白。luckow和summers,(《生物技术(bio/technology)》,6:47,1988)综述了用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包含内皮细胞、cos-7猴肾细胞、cv-1、l细胞、c127、3t3、中国仓鼠卵巢(cho)、人胚胎肾细胞、hela、293、293t和bhk细胞系。通过培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白来制备纯化的多肽。对于许多应用，本文公开的许多多肽的小尺寸将使在大肠杆菌中表达成为优选的表达方法。接着从培养基或细胞提取物纯化蛋白质。
[0214]
本文公开的抗体和抗原结合蛋白也可以使用细胞翻译系统产生。出于此类目的，编码多肽的核酸必须经修饰以允许体外转录产生mrna，并允许mrna在所利用的特定无细胞系统(真核生物，如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统或原核生物，如细菌无细胞翻译系统)中进行无细胞翻译。
[0215]
编码本文公开的各种多肽中的任一种的核酸可以化学合成。可以选择密码子使用以改进在细胞中的表达。此类密码子使用将取决于所选的细胞类型。已经为大肠杆菌和其它细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞开发了专门的密码子使用模式。参见例如：mayfield等人,《美国国家科学院院刊》2003 100(2):438-42；sinclair等人.《蛋白質表達和純化(protein expr.purif.)》2002(1):96-105；connell n d.《生物技术当前
述评(curr.opin.biotechnol.)》2001 12(5):446-9；makrides等人.《微生物评论(microbiol.rev.)》1996 60(3):512-38；和sharp等人.《酵母(yeast)》.1991 7(7):657-78。
[0216]
本文所描述的抗体和抗原结合蛋白也可以通过化学合成(例如，通过《固相肽合成(solid phase peptide synthesis)》,第2版,1984,the pierce chemical公司,rockford,ill.中描述的方法)来生产。对蛋白质的修饰也可以通过化学合成产生。
[0217]
本文所描述的抗体和抗原结合蛋白可以通过蛋白质化学领域普遍已知的蛋白质的分离/纯化方法进行纯化。非限制性实例包含萃取、重结晶、盐析(例如用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱、离子交换色谱、疏水色谱、正相色谱、反相色谱、凝胶过滤、凝胶渗透色谱、亲和色谱、电泳、逆流分布或这些的任何组合。纯化后，多肽可以交换到不同的缓冲液中和/或通过本领域已知的多种方法中的任一种进行浓缩，包含但不限于过滤和透析。
[0218]
本文所描述的纯化的抗体和抗原结合蛋白优选为至少65％纯、至少75％纯、至少85％纯、更优选至少95％纯并且最优选至少98％纯。不管纯度的确切数值如何，多肽对于用作药物产品足够纯。
[0219]
在某些实施方式中，本文的抗体和抗原结合蛋白还可以包括翻译后修饰。示例性的翻译后蛋白质修饰包含磷酸化、乙酰化、甲基化、adp-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、苏素化、生物素化或添加多肽侧链或疏水基团。因此，修饰的多肽可含有非氨基酸元件，如脂质、多糖或单糖和磷酸酯。糖基化的优选形式是唾液酸化，其将一个或多个唾液酸部分与多肽缀合。唾液酸部分改善了溶解度和血清半衰期，同时也降低了蛋白质的可能免疫原性。参见raju等人.《生物化学(biochemistry)》.2001 31；40(30):8868-76。
[0220]
在一个实施方式中，本文所描述的抗体和抗原结合蛋白可以经修饰以变为可溶性多肽，其包括将抗体和抗原结合蛋白与非蛋白质聚合物连接。在一个实施方式中，非蛋白质聚合物包括聚乙二醇(“peg”)、聚丙二醇或聚氧化烯，其方式如美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号或第4,179,337号中所阐述。
[0221]
peg是一种水溶性聚合物，其可商购或可以根据本领域众所周知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(sandler和karo,《聚合物合成(polymer synthesis)》,学术出版社,纽约,第3卷,第138-161页)。术语“peg”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，不考虑大小或peg末端的修饰，并且可以由下式表示：x-o(ch2ch2o)
n-ch2ch2oh(1)，其中n为20至2300并且x为h或末端修饰，例如c
1-4
烷基。在一个实施方式中，peg在一端以羟基或甲氧基终止，即x是h或ch3(“甲氧基peg”)。peg可以含有结合反应所必需的其它化学基团；其由分子的化学合成产生；或者其是分子各部分最佳距离的间隔物。此外，此类peg可以由一个或多个peg侧链组成，这些侧链连接在一起。具有超过一个peg链的peg被称为多臂或支链peg。例如，支链peg可以通过将聚氧化乙烯加入各种多元醇，包含甘油、季戊四醇和山梨糖醇来制备。例如，四臂支链peg可以由季戊四醇和氧化乙烯制备。支链peg描述于例如ep-a 0 473 084和美国专利第5,932,462号中。peg的一种形式包含经由赖氨酸的伯氨基连接的两条peg侧链(peg2)(monfardini等人,《生物结合化学(bioconjugate chem.)》6(1995)62-69)。
[0222]
相对于未修饰的抗体和抗原结合蛋白结合多肽的清除率，peg修饰的多肽的血清清除率可被调节(例如增加或减少)约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至
90％。peg修饰的抗体和抗原结合蛋白可具有相对于未修饰多肽的半衰期增加的半衰期(t
1/2
)。peg修饰的多肽的半衰期相对于未修饰的抗体和抗原结合蛋白的半衰期可增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％，或甚至1000％。在一些实施方式中，蛋白质半衰期是在体外测定的，如在缓冲盐水溶液中或在血清中。在其它实施方式中，蛋白质半衰期是体内半衰期，如蛋白质在动物血清或其它体液中的半衰期。
[0223]
本公开提供治疗性组合物，其包括本文所描述的多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种与药学上可接受的赋形剂的掺合物。赋形剂涵盖载剂、稳定剂和赋形剂。药学上可接受的赋形剂的赋形剂包含例如惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助滑剂和抗粘剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。额外实例包含缓冲剂、稳定剂、防腐剂、非离子型清洁剂、抗氧化剂和等渗剂。
[0224]
治疗性组合物和其制备方法是本领域众所周知的，并且见于例如《雷明顿：药学科学和实践(remington:the science and practice of pharmacy)》(第20版，a.r.gennaro a r.编,2000,利平科特威廉姆斯和维尔金斯出版社(lippincott williams&wilkins),宾夕法尼亚州费城(philadelphia,pa.))。治疗性组合物可经调配用于肠胃外施用，并且可以例如含有赋形剂、无菌水、生理盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘。生物兼容性、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物可用于控制本文所描述的抗体(或其抗原结合蛋白)的释放。纳米粒子制剂(例如，生物可降解的纳米粒子、固体脂质纳米粒子、脂质体)可用于控制抗体(或其抗原结合蛋白)的生物分布。其它潜在有用的非经肠递送系统包含乙烯-乙酸乙烯酯共聚物粒子、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。制剂中抗体(或其抗原结合蛋白)的浓度取决于多种因素，包含待施用的药物剂量和施用途径而变化。
[0225]
多特异性抗原结合蛋白复合物(或其抗原结合蛋白)可以任选地以药学上可接受的盐，如制药行业中常用的无毒酸加成盐或金属复合物形式施用。酸加成盐的实例包含有机酸，如乙酸、乳酸、双羟萘酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸等；聚合酸，如单宁酸、羧甲基纤维素等；和无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸磷酸等。金属复合物包含锌、铁等。在一个实例中，抗体(或其抗原结合蛋白)在乙酸钠存在下调配以增加热稳定性。
[0226]
多特异性抗原结合蛋白复合物(或其抗原结合蛋白)可经调配成用于口服使用，包含含有活性成分与无毒药学上可接受的赋形剂的混合物的片剂。用于口服使用的制剂也可提供为咀嚼片剂，或硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，或提供为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合。
[0227]
如本文所用，术语“个体”是指人和非人动物，包含脊椎动物、哺乳动物和非哺乳动物。在一个实施方式中，个体可以是人、非人灵长类动物、猿猴、猿、鼠(例如小鼠和大鼠)、牛、猪、马、犬、猫、山羊、狼、蛙或鱼。
[0228]
术语“施用(administering/administered)”和语法变体是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将药剂物理引入个体体内。本文公开的制剂的示例性施用途径包含静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊髓或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除经肠内和局部施用以外的施用模式，通常
通过注射，且包含但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。在一些实施方式中，制剂经由非肠胃外途径施用，例如口服。其它非肠胃外途径包含局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、经阴道、经直肠、舌下或局部。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时段内执行施用。
[0229]
术语“有效量”、“治疗有效量”或“有效剂量”或相关术语可以互换使用并且是指抗体或抗原结合蛋白(例如，多特异性抗原结合蛋白复合物)的量，当施用于个体时，足以实现与肿瘤或癌症抗原表达相关的疾病或病症的可测量的改善或预防。本文提供的抗体在单独或组合使用时的治疗有效量将取决于抗体和组合的相对活性(例如，在抑制细胞生长方面)，并取决于所治疗的个体和疾病状况、个体的体重、年龄和性别、个体的疾病状况的严重程度、施用方式等而变化，这些都可以由本领域的普通技术人员容易地确定。
[0230]
在一个实施方式中，治疗有效量将取决于待治疗的个体和待治疗的病症的某些方面，并且可由本领域的技术人员使用已知技术确定。一般来说，多肽以每天约0.01g/kg至约50mg/kg，优选每天0.01mg/kg至约30mg/kg，最优选每天0.1mg/kg至约20mg/kg施用。多肽可以每天(例如，每天一次、两次、三次或四次)或优选地以较低频率(例如，每周、每两周、每三周、每月或每季度)施用。此外，如本领域已知，可能需要根据年龄以及体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和疾病的严重程度进行调整。
[0231]
本公开提供用于治疗患有与一种或多种肿瘤相关抗原的表达(例如过度表达)相关的疾病的个体的方法。疾病包括表达肿瘤相关抗原的癌症或肿瘤细胞。在一个实施方式中，癌症或肿瘤包含以下癌症：前列腺癌、乳癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、皮肤癌、结直肠癌、肛门癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、平滑肌瘤癌、脑癌、神经胶质瘤癌、胶质母细胞瘤癌、食道癌、肝癌、肾癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、外阴癌、喉癌、阴道癌、骨癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉癌、下喉癌、唾液腺癌、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌和睾丸癌。
[0232]
在一个实施方式中，癌症包括血液癌症，包含白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和b细胞淋巴瘤。血液癌症包含多发性骨髓瘤(mm)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)(包含伯基特氏淋巴瘤(bl))、b慢性淋巴细胞白血病(b-cll)、全身性红斑狼疮(sle)、b细胞和t细胞急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓系白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、弥漫性大b细胞淋巴瘤、慢性髓性白血病(cml)、毛细胞白血病(hcl)、滤泡性淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(hl)、浆细胞骨髓瘤、前体b细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤、浆细胞瘤、巨细胞骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤、轻链或本斯-琼斯氏骨髓瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴增生病症、免疫调节失调症、类风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯氏病(chagas'disease)、格雷夫氏病(grave's disease)、韦格纳氏肉牙肿病(wegener's granulomatosis)、结节性多动脉炎、休格连氏综合征(sjogren's syndrome)、寻常型天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、抗磷脂综合征、anca相关血管炎、古德帕斯彻氏病(goodpasture's disease)、川崎病(kawasaki disease)、自身免疫性溶血性贫血和急进性肾小球肾炎、重链病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性和意义未明的单克隆丙种球蛋白病。
[0233]
如本文所使用，在多肽的情形下，“连接子”是指将第一区(例如，可变或恒定的重
链或轻链结构域、半fab区或fc区)连接到第二区(例如，可变或恒定的重链或轻链结构域、半fab区或fc区)的氨基酸的片段。免疫球蛋白的可变和恒定重链和轻链结构域不被视为连接子。在一些实施方式中，连接子可与第一区和第二区区分，因为其不包括邻近于第一区和第二区天然存在的序列。在一些实施方式中，连接子由蛋白酶或一种或多种蛋白酶识别。在一些实施方式中，连接子基本上不具有除由蛋白酶或一种或多种蛋白酶识别以外的已知结合活性。示例性连接子序列在本文中其它地方提供。
[0234]
如本文中关于蛋白复合物中的区(如fab区)所用的术语“串联”意指所述区在fab区之间无介入不同区(例如fc区)的情况下头接尾排列。串联fab区可以通过连接子分离。图1中所示的例示性结构包括串联fab区。
[0235]
如本文中关于蛋白复合物中的区(如fab区)所使用的术语“非串联”意指所述区不呈“串联”排列。图3中所示的例示性结构包括非串联fab区。在一些实施方式中，fc区或ch2或ch3结构域位于呈非串联排列的fab区之间。
[0236]
本公开提供多特异性抗原结合蛋白复合物的各种实施方式、包括多特异性抗原结合蛋白复合物的组合物(包含药物组合物和试剂盒)以及其制备和使用其的方法。术语“多特异性抗原结合蛋白复合物”和“蛋白复合物”可在本文中可互换地使用，且是指由多条多肽链的缔合形成的蛋白复合物，其中蛋白复合物包括两个不同fab区，所述两个不同fab区各自能够结合两个不同表位，且其中蛋白复合物包括fc区。在一个实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物各自包括彼此缔合以形成蛋白复合物的两条或三条多肽链。在一个实施方式中，两个不同fab区按串联或非串联方式排列。在一个实施方式中，蛋白复合物包括展现fc效应功能的fc区或fc区含有减少/消除fc效应功能的突变。在一个实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括结合两个不同表位的双特异性抗体。
[0237]
本公开提供简单的多特异性抗原结合蛋白复合物的若干实施方式，所述多特异性抗原结合蛋白复合物由彼此组装以形成可结合两个不同表位的异二聚体或异三聚体分子的两条或三条多肽链构成。在双链实施方式中，两条多肽链可以经修饰以包含例如在fc区中的突变，其促进第一和第二多肽链之间的链间缔合以增加异二聚体分子的产率，而非形成均二聚体分子。在一个实施方式中，所述修饰包含引入额外的链间二硫键、链间二硫键的优化和/或链间空间互补性，例如，包括杵入臼结构。在三链实施方式中，第一多肽链与第二和第三链缔合以形成异二聚体分子，其中第一、第二和第三多肽链以类似于2链实施方式的方式经修饰以有利于形成异二聚体复合物。
[0238]
多特异性抗原结合蛋白复合物的另一特征为例如在双链实施方式中，半fab重链区(例如vh和ch结构域)承载于第一多肽链上，并且半fab轻链区(例如vl和cl结构域)承载于第二多肽链上，使得两条链之间的缔合更密切地类似于天然存在的免疫球蛋白分子中重链和轻链之间的缔合。以相同方式，在三链实施方式中，半fab重链区(例如vh和ch结构域)承载于第一多肽链上，并且半fab轻链区(例如vl和cl结构域)承载于第二和第三多肽链上。因此，双链和三链实施方式的简单性以及将半fab重链和半fab轻链区定位在两条链上可有利于有效形成结合两个不同表位的异二聚体蛋白复合物。
[0239]
适用于根据本公开的多特异性抗原结合蛋白复合物的例示性免疫球蛋白恒定序列包含以下。在一些实施方式中，重链恒定结构域(例如cha或chb)包括seq id no:2、5、31、37、60、63、75、82、91、97、91、97、106、109、121、127、136或139或与其至少95％、96％、97％、
98％或99％一致的序列。在一些实施方式中，铰链序列包括seq id no:6、32、40、64、71、76、92、100、110、117、122、130、140或147，或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施方式中，ch2结构域包括seq id no:7、33、65、72、77、93、101、111、118、123、131、141或148或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施方式中，ch3结构域包括seq id no:8、34、66、73、78、94、102、112、119、124、132、142或149，与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施方式中，轻链恒定结构域(例如cla或clb)包括seq id no:10、39、58、68、70、84、89、99、104、114、116、134、144或146或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。此类恒定序列的额外实施方式和其组合描述于本文中的其它地方，且可通常用于所公开的多特异性抗原结合蛋白复合物中，而不管其是否在具有特定可变结构域或其它元件的复合物的上下文中描述。在一些实施方式中，ch1结构域(例如cha或chb)、铰链结构域、ch2结构域和ch3结构域中的两个或更多个或每一个以在图式中的任一个中所示的组合存在于多特异性抗原结合蛋白复合物中。
[0240]
适用于根据本公开的多特异性抗原结合蛋白复合物的例示性免疫球蛋白可变序列包含以下。在一些实施方式中，重链可变结构域(例如vha或vhb)包括seq id no:1、4、30、36、59、62、74、81、105、108、120、126、135或138或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施方式中，轻链可变结构域(例如vla或vlb)包括seq id no:9、25、38、57、67、69、83、88、98、103、113、115、128、133、143或145，或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括形成抗原结合位点的一对vh和vl，其中vh和vl分别包括以下序列：seq id no:1和9；4和25；30和38；36和57；59和67；62和69；74和83；81和88；90和98；96和103；105和113；108和115；120和128；126和133；135和143；或138和145。在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括形成抗原结合位点的一对vh和vl，其中vh和vl分别包括与seq id no:1和9；4和25；30和38；36和57；59和67；62和69；74和83；81和88；90和98；96和103；105和113；108和115；120和128；126和133；135和143；或138和145的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括形成抗原结合位点的一对vh和vl，其选自图或图的相关图组中所示的vha和vla序列(例如图36a显示vha序列并且图36b显示与图36a的vha成对的vla序列)。在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括形成抗原结合位点的一对vh和vl，其选自图或图的相关图组中所示的vhb和vlb序列。在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括形成抗原结合位点的第一对vh和vl，其选自图或图的相关图组中所示的vha和vla序列，并且包括形成抗原结合位点的第二对vh和vl，其选自图或图的相关图组中所示的vhb和vlb序列。
[0241]
在一些实施方式中，重链可变结构域(例如vha或vhb)包括seq id no:1、4、30、36、59、62、74、81、105、108、120、126、135或138的互补决定区(complementarity-determining region；cdr)。在一些实施方式中，轻链可变结构域(例如vla或vlb)包括seq id no:9、25、38、57、67、69、83、88、98、103、113、115、128、133、143或145的互补决定区(cdr)。在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括形成抗原结合位点的一对vh和vl，其中vh和vl分别包括以下cdr：seq id no:1和9；4和25；30和38；36和57；59和67；62和69；74和83；81和88；90和98；96和103；105和113；108和115；120和128；126和133；135和143；或138和145。在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括形成抗原结合位点的一对vh和vl，其
中vh和vl的cdr为图或图的相关图组中所示的vha和vla序列的cdr(例如图36a显示vha序列并且图36b显示与图36a的vha成对的vla序列)。在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括形成抗原结合位点的一对vh和vl，其中vh和vl的cdr为图或图的相关图组中所示的vhb和vlb序列的cdr。在一些实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括形成抗原结合位点的第一对vh和vl，其中第一对的cdr为图或图的相关图组中所示的vha和vla序列的cdr，并且包括形成抗原结合位点的第二对vh和vl，其中第二对的cdr为图或图的相关图组中所示的vhb和vlb序列的cdr。在前述实施方式中的任一个中，vh和/或vl序列可进一步包括与本文所公开的含有cdr的vh和/或vl序列的构架序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的构架序列。
[0242]
本公开提供“可活化”多特异性抗原结合蛋白复合物或“可活化”蛋白复合物的各种实施方式，其是指彼此缔合以形成蛋白复合物的多条多肽链，其中多肽链中的至少一个携带可裂解连接子并且蛋白复合物包括两个不同抗原结合结构域，其中一个或两个可通过可裂解连接子的裂解活化。在其完整(未裂解)状态下，第一抗原结合结构域可以结合其目标表位，然而完整的可裂解连接子抑制第二抗原结合结构域结合其目标抗原，因此使蛋白复合物处于非活化状态。在可裂解连接子裂解后，第二抗原结合结构域可以结合其目标抗原。因此，可裂解连接子的裂解产生活化的多特异性抗原结合蛋白复合物或活化的蛋白复合物。可裂解连接子可以是可用蛋白酶、酯酶、还原性条件或氧化条件裂解的肽连接子。在其非活化状态下，多特异性抗原结合蛋白复合物可以向需要肿瘤治疗的个体施用，因为第一抗原结合结构域结合于其目标表位(例如，由肿瘤细胞表达的抗原)，但细胞杀伤未起始直到可裂解连接子被裂解为止。在一个实施方式中，可裂解连接子通过存在于肿瘤微环境中的裂解条件(例如，蛋白酶)裂解，所述裂解条件产生活化形式的蛋白复合物，所述蛋白复合物又允许第二抗原结合结构域结合其目标表位(例如，由效应t细胞表达的表面抗原)。活化的蛋白复合物当同时结合于第一和第二表位时可形成可导致细胞毒性细胞杀伤的免疫细胞突触。另外，当活化的蛋白复合物包含功能性fc区时，那么fc区可以结合fc受体，从而形成三方免疫细胞突触，包括同时结合于效应t细胞、表达目标肿瘤抗原的肿瘤细胞和表达fc受体的细胞(例如巨噬细胞、自然杀伤细胞或树突状细胞)的蛋白复合物。三方免疫细胞突触可以介导细胞毒性细胞杀伤。完整的蛋白酶可活化的蛋白复合物不需要物理地接触肿瘤细胞，也不进入肿瘤细胞，而是完整的蛋白酶可活化的蛋白复合物在位于含有裂解条件(例如肿瘤分泌型蛋白酶)的肿瘤微环境中时转化成活化的蛋白复合物。
[0243]
具有三条多肽链配置的多特异性抗原结合蛋白复合物不携带可裂解连接子并且已经处于“活化状态”。三多肽链蛋白复合物可同时结合第一和第二表位，且fc区具有效应功能，且以类似于双链蛋白复合物的方式，三链蛋白复合物可形成可导致细胞毒性细胞杀伤的免疫细胞突触。
[0244]
本公开还提供多特异性抗原结合蛋白复合物或蛋白复合物的各种实施方式，包括可用于同时结合第一和第二目标表位的任何三条多肽链配置，由此通过竞争性抗原结合分子(例如抗体)阻断结合于第一和第二表位。
[0245]
多特异性抗原结合蛋白复合物为可以用于治疗与肿瘤或癌症抗原表达相关的疾病或病症的双特异性抗体。本文所描述的蛋白复合物包括两个不同fab区和经突变fc区(尽管本文中描述了具有功能性fc区的实施方式)。蛋白复合物通过同时结合两种不同抗原(例
如效应细胞上的抗原和通过肿瘤表达的肿瘤相关抗原)来介导免疫细胞突触的形成，这使得效应细胞(例如t细胞)极为接近肿瘤细胞，导致肿瘤细胞选择性细胞杀伤。
[0246]
多特异性抗原结合蛋白复合物携带两个fab区，其中呈活化形式或呈三链配置，至少一个或两个fab区结合其同源目标抗原，其亲和力水平类似于来源于所述fab区的亲本抗体所展现的亲和力水平。呈活化形式或呈三链配置的多特异性抗原结合蛋白复合物诱导抗原特异性细胞激素释放、诱导细胞毒性并且诱导t细胞活化。
[0247]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其可结合相同目标抗原上的两个不同表位或不同目标抗原上的两个不同表位，所述多特异性抗原结合蛋白复合物包括：两个不同fab区、fc区和可裂解连接子。在一个实施方式中，两个不同fab区、fc区和可裂解连接子由两条多肽链形成，并且其中每一多肽链携带两个不同的半fab区和半fc区(图1和3)。多肽链中的一个携带可裂解肽连接子。在一个实施方式中，一条多肽链携带单个可裂解肽连接子。第一和第二多肽链可以彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物，所述多特异性抗原结合蛋白复合物具有能够结合第一表位的第一fab区并且具有能够结合与第一表位不同的第二表位的第二fab区。第一和第二多肽链可以彼此缔合以形成具有fc区的多特异性抗原结合蛋白复合物，所述fc区能够结合fc受体或展现与fc受体的减少或空结合。第一和第二多肽链可以经由共价和/或非共价键彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，共价键包括二硫键。在一个实施方式中，非共价键包括空间或静电互补性。在一个实施方式中，第一fab区展现与其目标表位的结合，并且当可裂解连接子处于未裂解状态(例如，完整的可裂解连接子)时，第二fab区展现与其目标表位的结合降低。在一个实施方式中，当可裂解连接子处于未裂解状态时，归因于空间障碍，第二fab区展现与其目标表位的结合降低。在一个实施方式中，当裂解可裂解连接子时，第二fab区展现与其目标表位的结合增加(例如活化)。在可裂解连接子裂解后，第一fab区和第二fab区能够同时分别结合于第一和第二目标表位。在一个实施方式中，第一和第二多肽链携带串联排列的第一半fab区和第二半fab区，以及半fc区。在一个实施方式中，第一和第二多肽链携带第一半fab区和第二半fab区以及插入的半fc区(例如以非串联方式排列的第一和第二半fab区)。在一个实施方式中，fc区经突变，其减少或消除与fc受体的结合。
[0248]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其可以结合相同目标抗原上的两个不同表位或不同目标抗原上的两个不同表位，所述多特异性抗原结合蛋白复合物包括：两个不同fab区和fc区。在一个实施方式中，两个不同fab区和fc区由三条多肽链形成(图2和图4)。第一多肽链可携带第一和第二半fab的半fab重链区和第一半fc区。第一多肽链可携带第一肽连接子。第二和第三多肽链一起可携带第一和第二半fab的半fab轻链区和第二半fc区。第一、第二和第三多肽链可以彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物，其具有能够结合第一表位的第一fab区并且具有能够结合与第一表位不同的第二表位的第二fab区。第一、第二和第三多肽链可以彼此缔合以形成具有fc区的多特异性抗原结合蛋白复合物，所述fc区能够结合fc受体或展现与fc受体的减少或空结合。第一、第二和第三多肽链可经由共价和/或非共价键彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，共价键包括二硫键。在一个实施方式中，非共价键包括空间或静电互补性。在一个实施方式中，第一fab区展现与其目标表位的结合并且第二fab区展现与其目标表位的结合。在一个实施方式中，第一fab区和第二fab区能够同时分别结合于第一和第二目标表位。在
一个实施方式中，第一、第二和第三多肽链携带串联排列的第一半fab区和第二半fab区，以及半fc区。在一个实施方式中，第一、第二和第三多肽链携带第一半fab区和第二半fab区以及插入的半fc区(例如以非串联方式排列的第一和第二半fab区)。在一个实施方式中，fc区经突变，其减少或消除与fc受体的结合。
[0249]
本公开提供可结合相同目标抗原上的两种不同表位或不同目标抗原上的两种不同表位的双链多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一连接子，(iii)第二半fab重链区，及(iv)第一半fc区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；和(b)第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区，(ii)第二连接子，(iii)第二半fab轻链区，及(iv)第二半fc区，其中所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区，并且其中所述第二连接子为可裂解的或不可裂解的。在一个实施方式中，第一和第二多肽链各自包括以串联方式安排的第一和第二半fab区(图1)。
[0250]
在一个实施方式中，双链多特异性抗原结合蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括5个自氨基端至羧基端排序的区：(i)第一重链可变区(vha)和第一重链恒定区(cha)，(ii)第一连接子(l1)，(iii)第二重链可变区(vhb)和第二重链恒定区(chb)，(iv)第一铰链区，和(v)包括第一ch2区和第一ch3区的第一fc区；以及(b)第二多肽链，其包括5个自氨基端至羧基端排序的区：(i)第一轻链可变区(vla)和第一轻链恒定区(cla)，(ii)第二连接子(l2)，(iii)第二轻链可变区(vlb)和第二轻链恒定区(clb)，(iv)第二铰链区，和(v)包括第二ch2区和第二ch3区的第二fc区，其中第一和第二多肽链彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物具有能够结合第一表位的第一fab区并且具有能够结合与第一表位不同的第二表位的第二fab区，并且其中第一连接子不可裂解并且第二连接子可裂解。任选地，第二连接子不可裂解。在一个实施方式中，第一和第二多肽链各自包括以串联方式安排的第一和第二半fab区(图1)。
[0251]
第一和第二多肽链可以彼此缔合以形成具有能够结合fc受体的fc区的多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，fc区经突变，其减少或消除与fc受体的结合。在一个实施方式中，fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如，与l234a、l235a、p329g比对)的等效物。第一和第二多肽链可以经由共价和/或非共价键彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，共价键包括二硫键。在一个实施方式中，非共价键包括空间互补性(例如，杵入臼)或静电互补性。在一个实施方式中，杵入臼结构位于如图1中所示的fc区中。
[0252]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括：第一多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)包含与seq id no:1至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列的重链可变结构域；重链恒定结构域(例如seq id no:2或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第一连接子(例如seq id no:3或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；与seq id no:4至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；重链恒定结构域(例如seq id no:5或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致
的序列)；铰链序列(例如seq id no:6或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:7或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及ch3结构域(例如seq id no:8或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及第二多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:9至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；轻链恒定结构域(例如seq id no:10或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第二连接子(例如seq id no:11-24中的任一种或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；与seq id no:25至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；轻链恒定结构域(例如seq id no:26或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:27或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:28或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及ch3结构域(例如seq id no:29或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)。
[0253]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第一多肽链(或其部分)，所述第一多肽链包括与图31a-c(例如kv6.1、cd38/cd3)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、或至少99％一致的氨基酸序列。
[0254]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第二多肽链(或其部分)，所述第二多肽链包括与图31a-c(例如kv6.1、cd38/cd3)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、或至少99％一致的氨基酸序列。
[0255]
当可裂解连接子处于未裂解状态时，第一fab区可以结合于其目标表位，并且第二fab区展现与其目标表位的结合降低。当可裂解连接子裂解时，第二fab区展现与其目标表位的结合增加(例如活化)。在一个实施方式中，在可裂解连接子裂解后，第一fab区和第二fab区能够同时分别结合于第一和第二目标表位。
[0256]
在一个实施方式中，第一和第二连接子包括肽连接子。在一个实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括单一可裂解连接子。在一个实施方式中，连接子可经选自由以下组成的群组的蛋白酶裂解：基质金属蛋白酶(mmp)、mmp1、mmp2、mmp3、mmp8、mmp9、mmp11、mmp13、mmp14、mt1-mmp(膜型基质金属蛋白酶1)、adam蛋白酶、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(upa)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。在一个实施方式中，可裂解连接子包括可用至少一种基质金属蛋白酶裂解的氨基酸序列(美国公布申请案第2015/0087810号)。在一个实施方式中，连接子可以用图31a-c或32a-c中列出的其它类型的蛋白酶裂解。在一个实施方式中，可裂解连接子包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：ggsgsgsggssgggsggggs(dp连接子)、tsgsggsggsv(eg或eh连接子)、tsgsggsplgmggsgsv(ei或eu连接子)、tsgsggsplgvggsgsv(ej或ev连接子)、tsgsggspaalggsgsv(ek或ew连接子)、tsgsggspaglggsgsv(el或ex连接子)、tsgsggsplgmvgv(em或ey连接子)、tsgsggsplgvvgv(en或ez连接子)、tsgsggspaalvgv(eo或fa连接子)、tsgsggspaglvgv(ep或fb连接子)、tsgsggsplgmvlv(eq或fc连接子)、tsgsggsplgvvlv(er或fd连接子)、tsgsggspaalvlv(es或fe连接子)、tsgsggspaglvlv(st或ff连接子)(分别为seq id no:11-24，或分别为seq id no:43-56)。
[0257]
在一个实施方式中，第一连接子包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：(sg)n(seq id no:157)、(sgg)n(seq id no:158)、(sggg)n(seq id no:159)、(ssg)n(seq id no:160)、(gs)n(seq id no:161)、(ggg)n(seq id no:162)、(gsggs)n(seq id no:163)、(gsg)n(seq id no:164)、(ggggs)n(seq id no:165)、(gggs)n(seq id no:166)、(ggggsgs)n(seq id no:167)、(ggggsggs)n(seq id no:168)和(ggs)n(seq id no:169)，其中n为1-6的整数。在一个实施方式中，第一连接子包括tsgsggsggsv的氨基酸序列(seq id no:156)。
[0258]
本领域的技术人员将了解，可包括具有替代性安排的多肽链的双链多特异性抗原结合蛋白复合物是可能的。在一个实例中，第一多肽链包括：来自第一fab重链的第一可变区(vha)和第一恒定区(cha)、第一或第二连接子(l1或l2)、来自第二fab轻链的第二可变区(vlb)和第二恒定区(clb)，以及第一fc区(ch2和ch3)。第二多肽链包括：来自第一fab轻链的第一可变区(vla)和第一恒定区(cla)、第二或第一连接子(l2或l1)、来自第二fab重链的第二可变区(vhb)和第二恒定区(chb)，以及第二fc区(ch2和ch3)。在一个实施方式中，第一或第二连接子为可裂解的(图5)。任选地，第一和第二连接子不可裂解。
[0259]
在另一实例中，第一多肽链包括：来自第一fab轻链的第一可变区(vla)和第一恒定区(cla)、第一或第二连接子(l1或l2)、来自第二fab重链的第二可变区(vhb)和第二恒定区(chb)，以及第一fc区(ch2和ch3)。第二多肽链包括：来自第一fab重链的第一可变区(vha)和第一恒定区(cha)、第二或第一连接子(l2或l1)、来自第二fab轻链的第二可变区(vlb)和第二恒定区(clb)，以及第二fc区(ch2和ch3)。在一个实施方式中，第一或第二连接子为可裂解的(图6)。任选地，第一和第二连接子不可裂解。
[0260]
在又另一个实例中，第一多肽链包括：来自第一fab轻链的第一可变区(vla)和第一恒定区(cla)、第一或第二连接子(l1或l2)、来自第二fab轻链的第二可变区(vlb)和第二恒定区(clb)，以及第一fc区(ch2和ch3)。第二多肽链包括：来自第一fab重链的第一可变区(vha)和第一恒定区(cha)、第二或第一连接子(l2或l1)、来自第二fab重链的第二可变区(vhb)和第二恒定区(chb)，以及第二fc区(ch2和ch3)。在一个实施方式中，第一或第二连接子为可裂解的(图7)。任选地，第一和第二连接子不可裂解。
[0261]
在一个实施方式中，图5、6和7中所示的替代性蛋白复合物包括野生型fc区或突变型fc区，其中突变型fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如在l234a、l235a、p329g处比对)的等效物。在一个实施方式中，第一或第二连接子可用蛋白酶(如基质金属蛋白酶)裂解。在一个实施方式中，第一或第二连接子包括根据seq id no:11-24或43-56的可裂解连接子中的一个的氨基酸序列。在一个实施方式中，第一或第二连接子不可用蛋白酶裂解并且包括根据seq id no:3、35、61、79、80、95、107或125的不可裂解连接子中的一个的氨基酸序列。
[0262]
本公开提供可结合相同目标抗原上的两种不同表位或不同目标抗原上的两种不同表位的双链多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一半fc区，(iii)第一连接子，及(iv)第二半fab重链区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；和(b)第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区，(ii)第二半fc区，(iii)第二连接子，及(iv)第二半fab轻链区，其中所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，
并且其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区，并且其中所述第二连接子为可裂解的或不可裂解的。在一个实施方式中，第一和第二多肽链各自包括以非串联方式安排的第一和第二半fab区(图3)。
[0263]
在一个实施方式中，可结合相同目标抗原上的两种不同表位或不同目标抗原上的两种不同表位的双链多特异性抗原结合蛋白复合物，包括：(a)第一多肽链，其包括5个自氨基端至羧基端排序的区：(i)第一重链可变区(vha)和第一重链恒定区(cha)，(ii)第一铰链区，(iii)包括第一ch2区和第一ch3区的第一fc区，(iv)第一连接子(l1)，和(v)第二重链可变区(vhb)和第二重链恒定区(chb)；以及(b)第二多肽链，其包括5个自氨基端至羧基端排序的区：(i)第一轻链可变区(vla)和第一轻链恒定区(cla)，(ii)第二铰链区，(iii)包括第二ch2区和第二ch3区的第二fc区，(iv)第二连接子(l2)，和(v)第二轻链可变区(vlb)和第二轻链恒定区(clb)，其中第一和第二多肽链彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物具有能够结合第一表位的第一fab区并且具有能够结合与第一表位不同的第二表位的第二fab区，并且其中第二连接子可裂解。任选地，第二连接子不可裂解。在一个实施方式中，第一和第二多肽链各自包括以非串联方式安排的第一和第二半fab区(图3)。
[0264]
第一和第二多肽链可以彼此缔合以形成具有能够结合fc受体的fc区的多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如，在l234a、l235a、p329g处比对)的等效物。第一和第二多肽链可以经由共价和/或非共价键彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，共价键包括二硫键。在一个实施方式中，非共价键包括空间互补性(例如，杵入臼)或静电互补性。在一个实施方式中，杵入臼结构位于如图3中所示的完整fc结构域中。
[0265]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括：第一多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)包含与seq id no:30至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列的重链可变结构域；重链恒定结构域(例如seq id no:31或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:32或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:33或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch3结构域(例如seq id no:34或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第一连接子(例如seq id no:35或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；与seq id no:36至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；以及重链恒定结构域(例如seq id no:37或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及第二多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:38至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；轻链恒定结构域(例如seq id no:39或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:40或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:41或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch3结构域(例如seq id no:42或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第二连接子(例如seq id no:43-56中的任一种或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；与seq id no:57至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少
99％一致或100％一致的氨基酸序列；以及轻链恒定结构域(例如seq id no:58或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)。
[0266]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第一多肽链(或其部分)，所述第一多肽链包括与图32a-c(例如kv6.2，cd38/cd3)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0267]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第二多肽链(或其部分)，所述第二多肽链包括与图32a-c(例如kv6.2，cd38/cd3)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0268]
当可裂解连接子处于未裂解状态时，第一fab区可以结合于其目标表位，并且第二fab区展现与其目标表位的结合降低。当可裂解连接子裂解时，第二fab区展现与其目标表位的结合增加(例如活化)。在一个实施方式中，在可裂解连接子裂解后，第一fab区和第二fab区能够同时分别结合于第一和第二目标表位。
[0269]
在一个实施方式中，第一和第二连接子包括肽连接子。在一个实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括单一可裂解连接子。在一个实施方式中，连接子可经选自由以下组成的群组的蛋白酶裂解：基质金属蛋白酶(mmp)、mmp1、mmp2、mmp3、mmp8、mmp9、mmp11、mmp13、mmp14、mt1-mmp(膜型基质金属蛋白酶1)、adam蛋白酶、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(upa)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。在一个实施方式中，可裂解连接子包括可用至少一种基质金属蛋白酶裂解的氨基酸序列(美国公布申请案第2015/0087810号)。在一个实施方式中，连接子可以用图31a-c和32a-c中列出的其它类型的蛋白酶裂解。在一个实施方式中，可裂解连接子包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：ggsgsgsggssgggsggggs(dp连接子)、tsgsggsggsv(eg或eh连接子)、tsgsggsplgmggsgsv(ei或eu连接子)、tsgsggsplgvggsgsv(ej或ev连接子)、tsgsggspaalggsgsv(ek或ew连接子)、tsgsggspaglggsgsv(el或ex连接子)、tsgsggsplgmvgv(em或ey连接子)、tsgsggsplgvvgv(en或ez连接子)、tsgsggspaalvgv(eo或fa连接子)、tsgsggspaglvgv(ep或fb连接子)、tsgsggsplgmvlv(eq或fc连接子)、tsgsggsplgvvlv(er或fd连接子)、tsgsggspaalvlv(es或fe连接子)或tsgsggspaglvlv(st或ff连接子)(分别为seq id no:11-24，或分别为seq id no:43-56)。
[0270]
在一个实施方式中，第一连接子包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：(sg)n(seq id no:157)、(sgg)n(seq id no:158)、(sggg)n(seq id no:159)、(ssg)n(seq id no:160)、(gs)n(seq id no:161)、(ggg)n(seq id no:162)、(gsggs)n(seq id no:163)、(gsg)n(seq id no:164)、(ggggs)n(seq id no:165)、(gggs)n(seq id no:166)、(ggggsgs)n(seq id no:167)、(ggggsggs)n(seq id no:168)和(ggs)n(seq id no:169)，其中n为1-6的整数。在一个实施方式中，第一连接子包括tsgsggsggsv的氨基酸序列(seq id no:156)。
[0271]
本领域的技术人员将了解，可包括具有替代性安排的多肽链的双链多特异性抗原结合蛋白复合物是可能的。在一个实例中，第一多肽链包括来自第一fab重链的第一可变区(vha)和第一恒定区(cha)、第一fc区(ch2和ch3)、第一或第二连接子(l1或l2)、第二可变区(vlb)和来自第二fab轻链的第二恒定区(clb)。第二多肽链包括来自第一fab轻链的第一可变区(vla)和第一恒定区(cla)、第二fc区(ch2和ch3)、第二或第一连接子(l2或l1)和来自
第二fab重链的第二可变区(vhb)和第二恒定区(chb)。在一个实施方式中，第一或第二连接子为可裂解的(图8)。任选地，第一和第二连接子不可裂解。
[0272]
在另一实例中，第一多肽链包括来自第一fab轻链的第一可变区(vla)和第一恒定区(cla)、第一fc区(ch2和ch3)、第一或第二连接子(l1或l2)、第二可变区(vhb)和来自第二fab重链的第二恒定区(chb)。第二多肽链包括来自第一fab重链的第一可变区(vha)和第一恒定区(cha)、第二fc区(ch2和ch3)、第二或第一连接子(l2或l1)和来自第二fab轻链的第二可变区(vlb)和第二恒定区(clb)。在一个实施方式中，第一或第二连接子为可裂解的(图9)。任选地，第一和第二连接子不可裂解。
[0273]
在又另一实例中，第一多肽链包括来自第一fab轻链的第一可变区vla)和第一恒定区(cla)、第一fc区(ch2和ch3)、第一或第二连接子(l1或l2)、第二可变区(vlb)和来自第二fab轻链的第二恒定区(clb)。第二多肽链包括来自第一fab重链的第一可变区(vha)和第一恒定区(cha)、第二fc区(ch2和ch3)、第二或第一连接子(l2或l1)和来自第二fab重链的第二可变区(vhb)和第二恒定区(chb)。在一个实施方式中，第一或第二连接子为可裂解的(图10)。任选地，第一和第二连接子不可裂解。
[0274]
在一个实施方式中，图8、9和10中所示的替代性蛋白复合物包括野生型fc区或突变型fc区，其中突变型fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如在l234a、l235a、p329g处比对)的等效物。在一个实施方式中，第一或第二连接子可用蛋白酶(如基质金属蛋白酶)裂解。在一个实施方式中，第一或第二连接子包括根据seq id no:11-24或43-56的可裂解连接子中的一个的氨基酸序列。在一个实施方式中，第一或第二连接子不可用蛋白酶裂解并且包括根据seq id no:3、35、61、79、80、95、107或125的不可裂解连接子中的一个的氨基酸序列。
[0275]
本公开提供一种可结合相同目标抗原上的两种不同表位或不同目标抗原上的两种不同表位的三链多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一连接子，(iii)第二半fab重链区，及(iv)第一半fc区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；(b)第二多肽链，其包括第一半fab轻链区，所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区；以及(c)第三多肽链，其包括(i)第二半fab轻链区，及(ii)第二半fc区，其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区。在一个实施方式中，第一多肽链包括以串联方式安排的第一和第二半fab区，并且第二和第三多肽链与第一多肽链组装并且包括以串联方式安排的第一和第二半fab区(图2)。
[0276]
在一个实施方式中，三链多特异性抗原结合蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括5个自氨基端至羧基端排序的区：(i)第一重链可变区(vha)和第一重链恒定区(cha)，(ii)第一连接子(l1)，(iii)第二重链可变区(vhb)和第二重链恒定区(chb)，(iv)第一铰链区，和(v)包括第一ch2区和第一ch3区的第一fc区；(b)第二多肽链，其包括第一轻链可变区(vla)和第一轻链恒定区(cla)；以及(c)第三多肽链，其包括3个自氨基端至羧基端排序的区：(i)第二轻链可变区(vlb)和第二轻链恒定区(clb)，(ii)第二铰链区，和(iii)包括第二ch2区和第二ch3区的第二fc区，其中第一、第二和第三多肽链彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物具有能够结合第一表位的第一fab区并且具
有能够结合与第一表位不同的第二表位的第二fab区。在一个实施方式中，第一多肽链包括以串联方式安排的第一和第二半fab区，并且第二和第三多肽链与第一多肽链组装并且包括以串联方式安排的第一和第二半fab区(图2)。
[0277]
第一、第二和第三多肽链可以彼此缔合以形成具有能够结合fc受体的fc区的多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如，与l234a、l235a、p329g比对)的等效物。第一多肽链可以经由共价和/或非共价键与第二和第三多肽链缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，共价键包括二硫键。在一个实施方式中，非共价键包括空间互补性(例如，杵入臼)或静电互补性。在一个实施方式中，杵入臼结构位于如图2中所示的完整fc结构域中。
[0278]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第一多肽链(或其部分)，所述第一多肽链包括与图32a-b(例如cd38/cd3)或35a-b(例如egfr/pd-l1)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0279]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第二多肽链(或其部分)，所述第二多肽链包括与图32a-b(例如cd38/cd3)或35a-b(例如egfr/pd-l1)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0280]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第三多肽链(或其部分)，所述第三多肽链包括与图32a-b(例如cd38/cd3)或35a-b(例如egfr/pd-l1)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0281]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括：第一多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)包含与seq id no:59至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列的重链可变结构域；重链恒定结构域(例如seq id no:60或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第一连接子(例如seq id no:61或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；与seq id no:62至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；和重链恒定结构域(例如seq id no:63或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:64或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:65或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch3结构域(例如seq id no:66或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第二多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:67至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；轻链恒定结构域(例如seq id no:68或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及第三多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:69至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；以及轻链恒定结构域(例如seq id no:70或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)，铰链序列(例如seq id no:71或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:72或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及ch3结构域
(例如seq id no:73或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)。
[0282]
在一个实施方式中，第一fab区和第二fab区能够同时分别结合于第一和第二目标表位。
[0283]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第一多肽链(或其部分)，所述第一多肽链包括与图33a-b(例如kv5.1，cd38/cd3)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0284]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第二多肽链(或其部分)，所述第二多肽链包括与图33a-b(例如kv5.1，cd38/cd3)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0285]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第三多肽链(或其部分)，所述第三多肽链包括与图33a-b(例如kv5.1，cd38/cd3)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0286]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括：第一多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)包含与seq id no:105至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列的重链可变结构域；重链恒定结构域(例如seq id no:106或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第一连接子(例如seq id no:107或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；与seq id no:108至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；重链恒定结构域(例如seq id no:109或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:110或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:111或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；和ch3结构域(例如seq id no:112或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第二多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:113至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；和轻链恒定结构域(例如seq id no:114或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及第三多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:115至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；轻链恒定结构域(例如seq id no:116或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:117或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:118或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及ch3结构域(例如seq id no:119或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)。
[0287]
在一个实施方式中，第一fab区和第二fab区能够同时分别结合于第一和第二目标表位。
[0288]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第一多肽链(或其部分)，所述第一多肽链包括与图36a-b(例如kv5.1，egfr/pd-l1)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0289]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第二多肽链(或其部分)，所述第二多肽链包括与图36a-b(例如kv5.1，egfr/pd-l1)中的氨基酸序列至少95％一致、
至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0290]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第三多肽链(或其部分)，所述第三多肽链包括与图36a-b(例如kv5.1，egfr/pd-l1)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0291]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括：第一多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)包含与seq id no:135至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列的重链可变结构域；重链恒定结构域(例如seq id no:136或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第一连接子(例如seq id no:137或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；与seq id no:138至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；和重链恒定结构域(例如seq id no:139或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:140或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:141或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch3结构域(例如seq id no:142或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第二多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:143至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；轻链恒定结构域(例如seq id no:144或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及第三多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:145至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；以及轻链恒定结构域(例如seq id no:146或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)，铰链序列(例如seq id no:147或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:148或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及ch3结构域(例如seq id no:149或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)。
[0292]
在一个实施方式中，第一fab区和第二fab区能够同时分别结合于第一和第二目标表位。
[0293]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第一多肽链(或其部分)，所述第一多肽链包括与图38a-b(例如kv5.1，bcma/cd3)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0294]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第二多肽链(或其部分)，所述第二多肽链包括与图38a-b(例如kv5.1，bcma/cd3)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0295]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第三多肽链(或其部分)，所述第三多肽链包括与图38a-b(例如kv5.1，bcma/cd3)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0296]
本领域的技术人员将了解，可包括具有替代性安排的多肽链的三链多特异性抗原结合蛋白复合物是可能的。在一个实例中，第一多肽链包括：来自第一fab重链的第一可变区(vha)和第一恒定区(cha)、第一连接子(l1)、来自第二fab轻链的第二可变区(vlb)和第二恒定区(clb)，以及第一fc区(ch2和ch3)。第二多肽链包括：来自第一fab轻链的第一可变
区(vla)和第一恒定区(cla)。第三多肽链包括：来自第二fab重链的第二可变区(vhb)和第二恒定区(chb)，以及第二fc区(ch2和ch3)。在一个实施方式中，第一连接子不可裂解(图11)。
[0297]
在另一实例中，第一多肽链包括：来自第一fab轻链的第一可变区(vla)和第一恒定区(cla)、第一连接子(l1)、来自第二fab重链的第二可变区(vhb)和第二恒定区(chb)，以及第一fc区(ch2和ch3)。第二多肽链包括：来自第一fab重链的第一可变区(vha)和第一恒定区(cha)。第三多肽链包括：来自第二fab轻链的第二可变区(vlb)和第二恒定区(clb)，以及第二fc区(ch2和ch3)。在一个实施方式中，第一连接子不可裂解(图12)。
[0298]
在又另一实例中，第一多肽链包括：来自第一fab轻链的第一可变区(vla)和第一恒定区(cla)、第一连接子(l1)、来自第二fab轻链的第二可变区(vlb)和第二恒定区(clb)，以及第一fc区(ch2和ch3)。第二多肽链包括：来自第一fab重链的第一可变区(vha)和第一恒定区(cha)。第三多肽链包括：来自第二fab重链的第二可变区(vhb)和第二恒定区(chb)，以及第二fc区(ch2和ch3)。在一个实施方式中，第一连接子不可裂解(图13)。
[0299]
在一个实施方式中，图11、12和13中所示的替代性蛋白复合物包括野生型fc区或突变型fc区，其中突变型fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如在l234a、l235a、p329g处比对)的等效物。在一个实施方式中，第一或第二连接子可用蛋白酶(如基质金属蛋白酶)裂解。在一个实施方式中，第一或第二连接子包括根据seq id no:11-24或43-56的可裂解连接子中的一个的氨基酸序列。在一个实施方式中，第一或第二连接子不可用蛋白酶裂解并且包括根据seq id no:3、35、61、79、80、95、107或125的不可裂解连接子中的一个的氨基酸序列。
[0300]
本公开提供一种可结合相同目标抗原上的两种不同表位或不同目标抗原上的两种不同表位的三链多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一半fc区，(iii)第一连接子，及(iv)第二半fab重链区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；(b)第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区，和(ii)第二半fc区；以及(c)第三多肽链，其包括第二半fab轻链区，其中所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区。在一个实施方式中，第一多肽链包括以非串联方式安排的第一和第二半fab区，并且第二和第三多肽链与第一多肽链组装并且包括以非串联方式安排的第一和第二半fab区(图4)。
[0301]
在一个实施方式中，三链多特异性抗原结合蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括5个自氨基端至羧基端排序的区：(i)第一重链可变区(vha)和第一重链恒定区(cha)，(ii)第一铰链区，(iii)包括第一ch2区和第一ch3区的第一fc区，(iv)第一连接子(l1)，和(v)第二重链可变区(vhb)和第二重链恒定区(chb)；以及(b)第二多肽链，其包括三个自氨基端至羧基端排序的区：(i)第一轻链可变区(vla)和第一轻链恒定区(cla)，(ii)第二铰链区，(iii)包括第二ch2区和第二ch3区的第二fc区；以及(c)第三多肽链，其包括自氨基端至羧基端排序的区：第二轻链可变区(vlb)和第二轻链恒定区(clb)，其中第一、第二和第三多肽链彼此缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物具有能够结合第一表位的第一fab区并且具有能够结合与第一表位不同的第二表位的第二fab区。在一
个实施方式中，第一多肽链包括以非串联方式安排的第一和第二半fab区，并且第二和第三多肽链与第一多肽链组装并且包括以非串联方式安排的第一和第二半fab区(图4)。
[0302]
第一、第二和第三多肽链可以彼此缔合以形成具有能够结合fc受体的fc区的多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如，与l234a、l235a、p329g比对)的等效物。第一多肽链可以经由共价和/或非共价键与第二和第三多肽链缔合以形成多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，共价键包括二硫键。在一个实施方式中，非共价键包括空间互补性(例如，杵入臼)或静电互补性。在一个实施方式中，杵入臼结构位于如图4中所示的完整fc结构域中。
[0303]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第一多肽链(或其部分)，所述第一多肽链包括与图33a-b(例如kv4.33，cd38/cd3)、34a-b(例如kv4.33，bcma/cd3)和36a-b(例如kv4.33，pd-l1/egfr)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0304]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第二多肽链(或其部分)，所述第二多肽链包括与图33a-b(例如kv4.33，cd38/cd3)、34a-b(例如kv4.33，bcma/cd3)和36a-b(例如kv4.33，pd-l1/egfr)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0305]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第三多肽链(或其部分)，所述第三多肽链包括与图33a-b(例如kv4.33，cd38/cd3)、34a-b(例如kv4.33，bcma/cd3)和36a-b(例如kv4.33，pd-l1/egfr)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0306]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括：第一多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)包含与seq id no:74至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列的重链可变结构域；重链恒定结构域(例如seq id no:75或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:76或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:77或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch3结构域(例如seq id no:78或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第一连接子(例如seq id no:79或80或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；与seq id no:81至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；和重链恒定结构域(例如seq id no:82或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第二多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:83至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；轻链恒定结构域(例如seq id no:84或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:85或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:86或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；和ch3结构域(例如seq id no:87或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及第三多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:88至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；以及轻链恒定结构域(例如seq id no:89或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)。
[0307]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第一多肽链(或其部分)，所述第一多肽链包括与图34a-b(例如kv4.33，cd38/cd3)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0308]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第二多肽链(或其部分)，所述第二多肽链包括与图34a-b(例如kv4.33，cd38/cd3)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0309]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第三多肽链(或其部分)，所述第三多肽链包括与图34a-b(例如kv4.33，cd38/cd3)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0310]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括：第一多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)包含与seq id no:90至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列的重链可变结构域；重链恒定结构域(例如seq id no:91或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:92或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:93或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch3结构域(例如seq id no:94或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第一连接子(例如seq id no:95或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；与seq id no:96至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；和重链恒定结构域(例如seq id no:97或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第二多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:98至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；轻链恒定结构域(例如seq id no:99或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:100或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:101或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；和ch3结构域(例如seq id no:102或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及第三多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:103至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；以及轻链恒定结构域(例如seq id no:104或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)。
[0311]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第一多肽链(或其部分)，所述第一多肽链包括与图35a-b(例如kv4.33，bcma/cd3)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0312]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第二多肽链(或其部分)，所述第二多肽链包括与图35a-b(例如kv4.33，bcma/cd3)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0313]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第三多肽链(或其部分)，所述第三多肽链包括与图35a-b(例如kv4.33，bcma/cd3)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0314]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括：第一多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)包含与seq id no:120至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、
至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列的重链可变结构域；重链恒定结构域(例如seq id no:121或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:122或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:123或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch3结构域(例如seq id no:124或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第一连接子(例如seq id no:125或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；与seq id no:126至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；和重链恒定结构域(例如seq id no:127或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；第二多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:128至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；轻链恒定结构域(例如seq id no:129或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；铰链序列(例如seq id no:130或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；ch2结构域(例如seq id no:131或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；和ch3结构域(例如seq id no:132或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)；以及第三多肽链，其包括(例如以n端至c端的顺序)与seq id no:133至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致或100％一致的氨基酸序列；以及轻链恒定结构域(例如seq id no:134或与其至少95％、96％、97％、98％或99％一致的序列)。
[0315]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第一多肽链(或其部分)，所述第一多肽链包括与图37a-b(例如kv4.33，pdl1/egfr)中所示的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0316]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第二多肽链(或其部分)，所述第二多肽链包括与图37a-b(例如kv4.33，pdl1/egfr)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0317]
本公开提供一种多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括第三多肽链(或其部分)，所述第三多肽链包括与图37a-b(例如kv4.33，pdl1/egfr)中的氨基酸序列至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。
[0318]
在一个实施方式中，第一fab区和第二fab区能够同时分别结合于第一和第二目标表位。
[0319]
在一个实施方式中，第一多肽链携带第一肽连接子。在一个实施方式中，第一肽连接子不可裂解。
[0320]
在一个实施方式中，第一连接子包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：(sg)n(seq id no:157)、(sgg)n(seq id no:158)、(sggg)n(seq id no:159)、(ssg)n(seq id no:160)、(gs)n(seq id no:161)、(ggg)n(seq id no:162)、(gsggs)n(seq id no:163)、(gsg)n(seq id no:164)、(ggggs)n(seq id no:165)、(gggs)n(seq id no:166)、(ggggsgs)n(seq id no:167)、(ggggsggs)n(seq id no:168)、and(ggs)n(seq id no:169)，其中n为1-6的整数。在一个实施方式中，第一连接子包括tsgsggsggsv的氨基酸序列(seq id no:156)。
[0321]
本领域的技术人员将了解，可包括具有替代性安排的多肽链的三链多特异性抗原结合蛋白复合物是可能的。在一个实例中，第一多肽链包括来自第一fab重链的第一可变区
(vha)和第一恒定区(cha)、第一fc区(ch2和ch3)、第一连接子(l1)、来自第二fab轻链的第二可变区(vlb)和第二恒定区(clb)。第二多肽链包括来自第一fab轻链的第一可变区(vla)和第一恒定区(cla)，以及第二fc区(ch2和ch3)。第三多肽链包括来自第二fab重链的第二可变区(vhb)和第二恒定区(chb)。在一个实施方式中，第一不可裂解(图14)。
[0322]
在另一实例中，第一多肽链包括来自第一fab轻链的第一可变区(vla)和第一恒定区(cla)、第一fc区(ch2和ch3)、第一连接子(l1)、来自第二fab重链的第二可变区(vhb)和第二恒定区(chb)。第二多肽链包括来自第一fab重链的第一可变区(vha)和第一恒定区(cha)，以及第二fc区(ch2和ch3)。第三多肽链包括来自第二fab轻链的第二可变区(vlb)和第二恒定区(clb)。在一个实施方式中，第一连接子不可裂解(图15)。
[0323]
在又另一实例中，第一多肽链包括来自第一fab轻链的第一可变区(vla)和第一恒定区(cla)、第一fc区(ch2和ch3)、第一连接子(l1)、来自第二fab轻链的第二可变区(vlb)和第二恒定区(clb)。第二多肽链包括来自第一fab重链的第一可变区(vha)和第一恒定区(cha)，以及第二fc区(ch2和ch3)。第三多肽链包括来自第二fab重链的第二可变区(vhb)和第二恒定区(chb)。在一个实施方式中，第一连接子不可裂解(图16)。
[0324]
在一个实施方式中，图14、15和16中所示的替代性蛋白复合物包括野生型fc区或突变型fc区，其中突变型fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如在l234a、l235a、p329g处比对)的等效物。在一个实施方式中，第一或第二连接子可用蛋白酶(如基质金属蛋白酶)裂解。在一个实施方式中，第一或第二连接子包括根据seq id no:11-24或43-56的可裂解连接子中的一个的氨基酸序列。在一个实施方式中，第一或第二连接子不可用蛋白酶裂解并且包括根据seq id no:3、35、61、79、80、95、107或125的不可裂解连接子中的一个的氨基酸序列。
[0325]
本公开提供一种试剂盒，其包括：本文所描述的多特异性抗原结合蛋白复合物中的至少一者，包含结合第一和第二目标表位的双多肽链蛋白复合物和/或三多肽蛋白复合物。在一个实施方式中，试剂盒包括一种或多种选自由以下组成的群组的辅助化合物：三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐、碳酸盐、稳定剂、赋形剂、杀生物剂和牛血清白蛋白。在一个实施方式中，试剂盒包括一种或多种选自由以下组成的群组的辅助化合物：三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐、碳酸盐、稳定剂、赋形剂、杀生物剂和牛血清白蛋白。在一个实施方式中，试剂盒包括含有至少一种多特异性抗原结合蛋白复合物和任选地一种或多种辅助化合物的一个容器。在一个实施方式中，试剂盒包括两个或更多个容器，其中一个容器含有至少一种多特异性抗原结合蛋白复合物并且单独容器含有一种或多种辅助化合物。
[0326]
本公开提供核酸，其编码构成本文所描述的任一种多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一、第二和/或第三多肽链。
[0327]
本公开提供分别编码第一和第二多肽链的第一和第二核酸，其中第一和第二多肽链可以组装以形成双链蛋白复合物(例如图1中所示)。本公开提供编码第一多肽链的第一核酸，所述第一多肽链包括第一半fab重链区、连接子、第二半fab重链区和第一半fc区，其中第一和第二半重链fab区串联安排。本公开提供编码第二多肽的第二核酸，所述第二多肽包括第一半fab轻链区、可裂解连接子、第二半fab轻链区和第二半fc区，其中第一和第二半轻链fab区串联安排。在一个实施方式中，第一核酸编码第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一连接子，(iii)第二半fab重链区，和(iv)第一半fc区，其中第一半fab重链
区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区。在一个实施方式中，第二核酸编码第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区，(ii)第二连接子，(iii)第二半fab轻链区，和(iv)第二半fc区，其中第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，并且其中第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区，并且其中第二连接子为可裂解的。在一个实施方式中，fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如，与l234a、l235a、p329g比对)的等效物。在一个实施方式中，第一和/或第二核酸进一步编码信号肽以用于多肽分泌。
[0328]
在一个实施方式中，第一核酸编码包括图31a-c(例如kv6.1，cd38/cd3)中所示的氨基酸序列的第一多肽链。在一个实施方式中，第二核酸编码包括图31a-c(例如kv6.1，cd38/cd3)中所示的氨基酸序列的第二多肽链。
[0329]
本公开提供分别编码第一和第二多肽链的第一和第二核酸，其中第一和第二多肽链可以组装以形成双链蛋白复合物(例如图3中所示)。本公开提供编码第一多肽的第一核酸，所述第一多肽包括第一半fab重链区、第一半fc区、连接子和第二半fab重链区，其中第一和第二半重链fab区以非串联方式安排。本公开提供编码第二多肽的第二核酸，所述第二多肽包括第一半fab轻链区、第二半fc区、可裂解连接子和第二半fab轻链区，其中第一和第二半重链fab区以非串联方式安排。在一个实施方式中，第一核酸编码第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一半fc区，(iii)第一连接子，和(iv)第二半fab重链区，其中第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区。在一个实施方式中，第二核酸编码第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区，(ii)第二半fc区，(iii)第二连接子，和(iv)第二半fab轻链区，其中第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，并且其中第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区，并且其中第二连接子为可裂解的。在一个实施方式中，fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如，与l234a、l235a、p329g比对)的等效物。在一个实施方式中，第一和/或第二核酸进一步编码信号肽以用于多肽分泌。
[0330]
在一个实施方式中，第一核酸编码包括图32a-c(例如kv6.1，cd38/cd3)中所示的氨基酸序列的第一多肽链。在一个实施方式中，第二核酸编码包括图32a-c(例如kv6.1，cd38/cd3)中所示的氨基酸序列的第二多肽链。
[0331]
本公开提供分别编码第一、第二和第三多肽链的第一、第二和第三核酸，其中第一、第二和第三多肽链可以组装以形成三链蛋白复合物(例如图2中所示)。本公开提供编码第一多肽的核酸，所述第一多肽包括第一半fab重链区、连接子、第二半fab重链区和第一半fc区，其中第一和第二半重链fab区串联安排。本公开提供核酸，其编码包括第一半fab轻链区的第二多肽。本公开提供编码第三多肽的核酸，所述第三多肽包括第二半fab轻链区和第二半fc区。在一个实施方式中，第一核酸编码第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一连接子，(iii)第二半fab重链区，和(iv)第一半fc区，其中第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区。在一个实施方式中，第二核酸编码包括第一半fab轻链区的第二多肽链，所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定
区。在一个实施方式中，第三核酸编码第三多肽链，所述第三多肽链包括(i)第二半fab轻链区，和(ii)第二半fc区，其中第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区。在一个实施方式中，fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如，与l234a、l235a、p329g比对)的等效物。在一个实施方式中，第一、第二和/或第三核酸进一步编码信号肽以用于多肽分泌。
[0332]
在一个实施方式中，第一核酸编码第一多肽链，所述第一多肽链包括图33a-b(例如kv5.1，cd38/cd3)或36a-b(例如kv5.1，egfr/pd-l1)或38a-b(例如kv5.1，bcma/cd3)中所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，第二核酸编码第二多肽链，所述第二多肽链包括图33a-b(例如kv5.1，cd38/cd3)或36a-b(例如kv5.1，egfr/pd-l1)或38a-b(例如kv5.1，bcma/cd3)中所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，第三核酸编码第三多肽链，所述第三多肽链包括图33a-b(例如kv5.1，cd38/cd3)或36a-b(例如kv5.1，egfr/pd-l1)或38a-b(例如kv5.1，bcma/cd3)中所示的氨基酸序列。
[0333]
本公开提供分别编码第一、第二和第三多肽链的第一、第二和第三核酸，其中第一、第二和第三多肽链可以组装以形成三链蛋白复合物(例如图4中所示)。本公开提供编码第一多肽的第一核酸，所述第一多肽包括第一半fab重链区、第一半fc区、连接子和第二半fab重链区，其中第一和第二半fab重链区以非串联方式安排。本公开提供编码第二多肽的第二核酸，所述第二多肽包括第一半fab轻链区和第二半fc区。本公开提供编码第三多肽的第三核酸，所述第三多肽包括第二半fab轻链区。在一个实施方式中，第一核酸编码第一多肽，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一半fc区，(iii)第一连接子，和(iv)第二半fab重链区，其中第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区。在一个实施方式中，第二核酸编码第二多肽，所述第二多肽包括(i)第一半fab轻链区，和(ii)第二半fc区，其中第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区。在一个实施方式中，第三核酸编码包括第二半fab轻链区的第三多肽，其中第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区。在一个实施方式中，fc区包括等效于降低效应功能的lala或lala-pg突变(例如，与l234a、l235a、p329g比对)的等效物。在一个实施方式中，第一、第二和/或第三核酸进一步编码信号肽以用于多肽分泌。
[0334]
在一个实施方式中，第一核酸编码第一多肽链，所述第一多肽链包括图34a-b(例如kv4.33，cd38/cd3)或35a-b(例如kv4.33，bcma/cd3)或37a-b(例如kv4.33，pd-l1/egfr)中所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，第二核酸编码第二多肽链，所述第二多肽链包括图34a-b(例如kv4.33，cd38/cd3)或35a-b(例如kv4.33，bcma/cd3)或37a-b(例如kv4.33，pd-l1/egfr)中所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，第三核酸编码第三多肽链，所述第三多肽链包括图34a-b(例如kv4.33，cd38/cd3)或35a-b(例如kv4.33，bcma/cd3)或37a-b(例如kv4.33，pd-l1/egfr)中所示的氨基酸序列。
[0335]
本公开提供独立载体，包含表达载体，其可操作地接合于一种或多种核酸(例如核酸转基因)，所述一种或多种核酸编码构成本文所描述的任一种多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一、第二和/或第三多肽链。在一个实施方式中，表达载体包括一种或多种启动子，其控制编码第一、第二和/或第三多肽链的核酸的转录。
[0336]
在一个实施方式中，载体包括至少一个调控序列，例如启动子和任选地增强子，其
可操作地接合于编码第一、第二或第三多肽链的核酸，其中启动子以单顺反子方式控制编码第一、第二或第三多肽链的核酸的转录。
[0337]
在一个实施方式中，载体包括启动子(和任选地增强子)，其可操作地接合于编码第一、第二和/或第三多肽链的多个核酸中的任何两个或任何组合，其中启动子控制编码第一、第二和/或第三多肽链的多顺反子转录物的转录。
[0338]
在一个实施方式中，载体包括多个启动子(和任选地至少一个增强子序列)以允许将独立启动子可操作地接合于独立核酸，所述独立核酸各自编码第一、第二或第三多肽链，其中单个载体内的多个启动子控制编码第一、第二和/或第三多肽链的不同转录物的转录。
[0339]
在一个实施方式中，将一个载体引入到宿主细胞中，其中宿主细胞内的载体携带启动子(和任选地增强子序列)，所述启动子可操作地接合于编码多肽链(例如第一、第二或第三多肽链)的一种核酸。因此，宿主细胞可以表达构成任一种多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一、第二或第三多肽链。
[0340]
在一个实施方式中，将一个载体引入到宿主细胞中，其中宿主细胞内的载体携带启动子(和任选地增强子序列)，所述启动子可操作地接合于编码第一、第二和/或第三多肽链的两种或更多种核酸。因此，宿主细胞可以表达构成任一种多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一、第二和/或第三多肽链。
[0341]
在一个实施方式中，将多个载体引入到宿主细胞中，其中宿主细胞内的独立载体携带至少一个启动子(和任选地增强子序列)，并且编码多肽链的一种核酸在一个载体中接合于一个启动子。因此，独立宿主细胞可以表达构成任一种多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一、第二和/或第三多肽链的任何两种或任何组合。
[0342]
载体包括作为诱导型或组成型启动子的启动子。载体和宿主细胞可经选择以产生瞬时或稳定地表达本文所描述的任何多肽链的转基因宿主细胞。
[0343]
本公开提供带有可操作地接合于一种或多种核酸的单一载体的宿主细胞，所述一种或多种核酸编码构成任一种多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一、第二和/或第三多肽链。
[0344]
本公开提供带有两个或更多个载体的宿主细胞，每一载体可操作地接合于一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码构成任一种多特异性抗原结合蛋白复合物中的第一、第二和/或第三多肽链。
[0345]
宿主细胞可以是细菌或哺乳动物细胞。在一个实施方式中，宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
[0346]
在一个实施方式中，经由以下将至少一个载体引入到宿主细胞中：脂转染(例如使用脂质表面活性剂)；电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其它物质的转染；病毒转染；非病毒转染；微弹轰击；以及感染(例如，当载体是感染物时)。
[0347]
在一个实施方式中，宿主细胞带有两个载体，其中第一载体可操作地接合于编码第一多肽的核酸，并且第二载体可操作地接合于编码第二多肽的核酸。宿主细胞带有的两个载体可以1:1、1:1.5、1.5:1、1:2、2:1、1:3或3:1的第一多肽:第二多肽的摩尔比存在。如本领域中众所周知，其它摩尔比也是可能的。
[0348]
在一个实施方式中，宿主细胞带有三个载体，其中第一载体可操作地接合于编码第一多肽的核酸，第二载体可操作地接合于编码第二多肽的核酸，并且第三载体可操作地
接合于编码第三多肽的核酸。宿主细胞带有的三个载体可以1:1:1、1:1.5:1、1:1:1.5、1.5:1:1、1:2:1、1:1:2、2:1:1、1:3:1、1:1:3或3:1:1的第一多肽:第二多肽:第三多肽的摩尔比存在。如本领域中众所周知，其它摩尔比也是可能的。
[0349]
本公开提供用于制备本文所描述的任一种多特异性抗原结合蛋白复合物中的方法，所述方法包括：培养宿主细胞的细胞群，其中所述细胞群中的独立宿主细胞带有至少一种表达载体，所述表达载体可操作地连接于两种或更多种第一、第二和/或第三核酸中的任何一种或任何组合，所述第一、第二和/或第三核酸编码本文所描述的第一、第二和/或第三多肽链中的两种或更多种的任何一种或任何组合，其中所述培养在适合于通过宿主细胞的细胞群表达多肽链的条件下进行。
[0350]
在一个实施方式中，编码第一、第二和/或第三多肽链中的两种或更多种的任何一个或任何组合的核酸进一步编码信号肽以用于分泌所表达的多肽链。在一个实施方式中，培养在适合于通过宿主细胞的细胞群分泌第一、第二和/或第三多肽链的条件下进行。
[0351]
在一个实施方式中，编码第一、第二和/或第三多肽链中的两种或更多种的任何一种或任何组合的核酸进一步编码亲和标签序列以用于富集多肽。例示性亲和标签序列包含组氨酸标签、flag标签、myc标签、ha标签和gst标签。
[0352]
在一个实施方式中，所述方法进一步包括分离所表达的第一、第二和/或第三多肽链。
[0353]
在一个实施方式中，培养在适合于组装或缔合第一、第二和/或第三多肽链以形成多特异性抗原结合蛋白复合物的条件下进行。在一个实施方式中，第一和第二多肽链彼此缔合以形成包括第一和第二fab区和fc区的异二聚体蛋白复合物。在一个实施方式中，第一、第二和第三多肽链彼此缔合以形成包括第一和第二fab区和fc区的异二聚体蛋白复合物。
[0354]
在一个实施方式中，所述方法进一步包括分离或回收经组装的多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，使用亲和色谱法进行分离。在一个实施方式中，使用亲和色谱法用来自金黄色葡萄球菌的蛋白质a或g、谷胱甘肽s转移酶(gst)或免疫亲和力进行分离。在一个实施方式中，进行选自由以下组成的群组的一或多个额外分离步骤：阳离子和/或阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱、混合模式色谱和羟基磷灰石色谱。
[0355]
在一个实施方式中，经组装的多特异性抗原结合蛋白复合物包括能够结合第一表位的第一fab区，和能够结合与第一表位不同的第二表位的第二fab区。在一个实施方式中，经组装的多特异性抗原结合蛋白复合物包括能够结合fc受体的fc区，所述fc受体包括fc-γ受体。
[0356]
可以使用本领域中众所周知的方法使用转基因宿主细胞表达、噬菌体呈现、酵母呈现和人类抗体基因转基因小鼠，制备多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，使用转基因宿主细胞表达的异二聚体蛋白复合物的产率可以是所形成的总蛋白复合物的约20％-80％，或约30％-90％，或约40％-95％或约50％-99％。
[0357]
在一个实施方式中，在用于制备多特异性抗原结合蛋白复合物的方法中，第一核酸编码第一多肽链，所述第一多肽链包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一连接子，(iii)第二半fab重链区和(iv)第一半fc区，其中第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，其中第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定
区，并且其中第一半fc区包括ch2和ch3。在一个实施方式中，第二核酸编码包括第二多肽链的第二多肽链，所述第二多肽链包括(i)第一半fab轻链区，(ii)第二连接子，(iii)第二半fab轻链区和(iv)第二半fc区，其中第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，并且其中第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区，其中第二半fc区包括ch2和ch3，并且其中第二连接子为可裂解的。在一个实施方式中，第一和第二多肽链彼此缔合以形成包括第一完整fab结构域、第二完整fab结构域和完整fc结构域的多特异性抗原结合蛋白复合物。
[0358]
在一个实施方式中，在用于制备多特异性抗原结合蛋白复合物的方法中，第一核酸编码第一多肽链，所述第一多肽链包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一半fc区，(iii)第一连接子和(iv)第二半fab重链区，其中第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，其中第一半fc区包括ch2和ch3，并且其中第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区。在一个实施方式中，第二核酸编码第二多肽链，所述第二多肽链包括(i)第一半fab轻链区，(ii)第二半fc区，(iii)第二连接子和(iv)第二半fab轻链区，其中第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，其中第二半fc区包括ch2和ch3，其中第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区，并且其中第二连接子为可裂解的。在一个实施方式中，第一和第二多肽链彼此缔合以形成包括第一完整fab结构域、完整fc结构域和第二完整fab结构域的多特异性抗原结合蛋白复合物。
[0359]
在一个实施方式中，在用于制备多特异性抗原结合蛋白复合物的方法中，第一核酸编码第一多肽链，所述第一多肽链包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一连接子，(iii)第二半fab重链区和(iv)第一半fc区，其中第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，其中第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区，并且其中第一半fc区包括ch2和ch3。在一个实施方式中，第二核酸编码包括第一半fab轻链区的第二多肽链，所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区。在一个实施方式中，第三核酸编码第三多肽链，所述第三多肽链包括(i)第二半fab轻链区，和(ii)第二半fc区，其中第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区，并且其中第二半fc区包括ch2和ch3。在一个实施方式中，第一、第二和第三多肽链彼此缔合以形成包括第一完整fab结构域、第二完整fab结构域和完整fc结构域的多特异性抗原结合蛋白复合物。
[0360]
在一个实施方式中，在用于制备多特异性抗原结合蛋白复合物的方法中，第一核酸编码第一多肽链，所述第一多肽链包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一半fc区，(iii)第一连接子和(iv)第二半fab重链区，其中第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，其中第一半fc区包括ch2和ch3，并且其中第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区。在一个实施方式中，第二核酸编码第二多肽链，所述第二多肽链包括(i)第一半fab轻链区，和(ii)第二半fc区，其中第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，并且其中第二半fc区包括ch2和ch3。在一个实施方式中，第三核酸编码第三多肽链，所述第三多肽链包括第二半fab轻链区，所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区。在一个实施方式中，第一、第二和第三多肽链彼此缔合以形成包括第一完整fab结构域、完整fc结构域和第二完整fab结
构域的多特异性抗原结合蛋白复合物。
[0361]
本公开提供用于将包括本文所描述的两种多肽链的多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种结合于第一目标表位的体外和体内方法，所述方法包括：(a)使第一目标表位与呈非活化形式的多特异性抗原结合蛋白复合物(双链蛋白复合物)接触，所述抗原结合蛋白复合物包括第一fab区、第二fab区、fc区和呈非裂解状态的可裂解连接子，其中当可裂解连接子呈非裂解状态时，第一fab区结合第一目标表位，并且第二fab区展现与第二目标表位的结合降低；以及(b)使第一表位结合于蛋白复合物的第一完整fab。在一个实施方式中，步骤(a)中使用的多特异性抗原结合蛋白复合物包括本文所描述的包括第一可裂解连接子的双链蛋白复合物中的任一种。在一个实施方式中，可裂解连接子可经以下裂解：基质金属蛋白酶(mmp)、mmp1、mmp2、mmp3、mmp8、mmp9、mmp11、mmp13、mmp14、mt1-mmp(膜型基质金属蛋白酶1)、去整合素和金属蛋白酶(adam)蛋白酶、adam10、adam12、adam17、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(upa)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶k或组织蛋白酶l。在一个实施方式中，第一目标表位包括第一可溶性细胞表面抗原或第一膜结合的细胞表面抗原。
[0362]
在一个实施方式中，所述方法进一步包括：使可裂解连接子裂解以产生活化的多特异性抗原结合蛋白复合物，其中第二fab区可以结合于第二目标表位。在一个实施方式中，第二目标表位包括第二可溶性细胞表面抗原或第二膜结合的细胞表面抗原。
[0363]
在一个实施方式中，所述方法进一步包括：(a)使第二目标表位与活化的多特异性抗原结合蛋白复合物接触；以及(b)使第二目标表位与活化的多特异性抗原结合蛋白复合物的第二fab区结合以形成结合于第一和第二目标表位的活化的多特异性抗原结合蛋白复合物。在一个实施方式中，在可裂解连接子裂解之后，第一fab区和第二fab区能够同时分别结合于第一和第二目标表位。
[0364]
在一个实施方式中，所述方法进一步包括：检测活化的多特异性抗原结合蛋白复合物是否结合于第一和第二目标表位。
[0365]
在一个实施方式中，第一目标表位包括由肿瘤或癌细胞表达的第一抗原(例如表面抗原)。在一个实施方式中，第二表位包括由效应t细胞表达的第二抗原(例如表面抗原)。
[0366]
在一个实施方式中，表达第一目标表位的肿瘤或癌细胞还表达使可裂解连接子裂解的一种或多种酶。在一个实施方式中，肿瘤或癌细胞表达包括以下的两种或更多种酶中的一种或组合：基质金属蛋白酶(mmp)、mmp1、mmp2、mmp3、mmp8、mmp9、mmp11、mmp13、mmp14、mt1-mmp(膜型基质金属蛋白酶1)、去整合素和金属蛋白酶(adam)蛋白酶、adam10、adam12、adam17、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(upa)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶k和/或组织蛋白酶l。
[0367]
在一个实施方式中，所述方法进一步包括：通过使由肿瘤或癌细胞表达的第一表位(例如，第一抗原)与活化的多特异性抗原结合蛋白复合物的第一完整fab结合，并且使由效应t细胞表达的第二表位(例如，第二抗原)与活化的多特异性抗原结合蛋白复合物的第二完整fab结合，形成细胞突触。
[0368]
在一个实施方式中，所述方法进一步包括：用细胞突触中的介导细胞毒性细胞杀
伤的效应t细胞杀死肿瘤或癌细胞。
[0369]
在一个实施方式中，呈非活化形式的多特异性抗原结合蛋白复合物包括彼此缔合以形成第一fab区、第二fab区、fc区和可裂解连接子的两条多肽链。在一个实施方式中，每一多肽链包括第一半fab区、第二半fab区和半fc区。在一个实施方式中，多肽链中的一者包括可裂解连接子。在一个实施方式中，第一和第二fab区串联安排。在一个实施方式中，可裂解连接子位于第一fab区与第二fab区之间(例如，第一和第二fab区以非串联方式安排)。
[0370]
在一个实施方式中，可裂解连接子可在肽裂解条件下裂解，所述肽裂解条件选自由蛋白酶、酯酶、还原性条件和氧化条件中选出的群组。
[0371]
在一个实施方式中，可裂解连接子可经选自由以下组成的群组的蛋白酶裂解：基质金属蛋白酶(mmp)、mmp1、mmp2、mmp3、mmp8、mmp9、mmp11、mmp13、mmp14、mt1-mmp(膜型基质金属蛋白酶1)、去整合素和金属蛋白酶(adam)蛋白酶、adam10、adam12、adam17、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(upa)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。
[0372]
在一个实施方式中，可裂解连接子可在存在于肿瘤微环境中的肽裂解条件下裂解。
[0373]
在一个实施方式中，存在于肿瘤微环境中的肽裂解条件包括选自由以下组成的群组的蛋白酶：基质金属蛋白酶(mmp)、mmp1、mmp2、mmp3、mmp8、mmp9、mmp11、mmp13、mmp14、mt1-mmp(膜型基质金属蛋白酶1)、去整合素和金属蛋白酶(adam)蛋白酶、adam10、adam12、adam17、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(upa)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。
[0374]
本公开提供用于将包括本文所描述的三条多肽链的多特异性抗原结合蛋白复合物中的任一种结合于第一目标表位和第二目标表位的体外和体内方法，所述方法包括：使第一和第二目标表位与多特异性抗原结合蛋白复合物(三链蛋白复合物)接触，所述复合物包括第一fab区、第二fab区和fc区，其中第一fab区结合第一目标表位并且第二fab区结合第二目标表位。在一个实施方式中，第一fab区和第二fab区能够同时分别结合于第一和第二目标表位。在一个实施方式中，第一目标表位包括第一可溶性细胞表面抗原或第一膜结合的细胞表面抗原。在一个实施方式中，第二目标表位包括第二可溶性细胞表面抗原或第二膜结合的细胞表面抗原。
[0375]
在一个实施方式中，第一目标表位包括由肿瘤或癌细胞表达的第一抗原(例如表面抗原)。在一个实施方式中，第二表位包括由肿瘤或癌细胞表达或由效应t细胞表达的第二抗原(例如表面抗原)。
[0376]
在一个实施方式中，所述方法进一步包括：通过使由肿瘤或癌细胞表达的第一表位(例如，第一抗原)与活化的多特异性抗原结合蛋白复合物的第一完整fab结合，并且使由肿瘤或癌细胞表达或由效应t细胞表达的第二表位(例如，第二抗原)与活化的多特异性抗原结合蛋白复合物的第二完整fab结合，形成细胞突触。
[0377]
在一个实施方式中，方法进一步包括：用细胞突触中的介导细胞毒性细胞杀伤的效应t细胞杀死肿瘤或癌细胞。
[0378]
在一个实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括彼此缔合的三条多肽链以形成第一fab区、第二fab区和fc区。在一个实施方式中，第一和第二fab区串联安排或以非串列方式安排。
[0379]
本公开提供治疗患有与肿瘤相关抗原的表达或过度表达相关的疾病的个体的方法，所述方法包括：向个体施用包括多特异性抗原结合蛋白复合物的治疗性组合物，所述多特异性抗原结合蛋白复合物可以结合相同目标抗原上的两个不同表位或不同目标抗原上的两个不同表位。在一个实施方式中，蛋白复合物包括：两个不同fab区、fc区和可裂解连接子。在一个实施方式中，两个不同fab区、fc区和可裂解连接子由两条多肽链形成，并且每一多肽链携带两个不同半fab区和半fc区。在一个实施方式中，一条多肽链携带单个可裂解肽连接子。在一个实施方式中，两个不同fab区、fc区和可裂解连接子由三条多肽链形成，其中三条多肽链彼此缔合以形成包括第一完整fab结构域、完整fc结构域和第二完整fab结构域的多特异性抗原结合蛋白复合物，或其中三条多肽链彼此缔合以形成包括第一完整fab结构域、第二完整fab结构域和完整fc结构域的多特异性抗原结合蛋白复合物。
[0380]
在一个实施方式中，向个体施用多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一连接子，(iii)第二半fab重链区，及(iv)第一半fc区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；和(b)第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区，(ii)第二连接子，(iii)第二半fab轻链区，及(iv)第二半fc区，其中所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区，并且其中所述第二连接子为可裂解的。
[0381]
在一个实施方式中，向个体施用多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一半fc区，(iii)第一连接子，及(iv)第二半fab重链区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；和(b)第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区，(ii)第二半fc区，(iii)第二连接子，及(iv)第二半fab轻链区，其中所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区，并且其中所述第二连接子为可裂解的。
[0382]
在一个实施方式中，向个体施用多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一连接子，(iii)第二半fab重链区，及(iv)第一半fc区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；(b)第二多肽链，其包括有包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区的第一半fab轻链区；和(c)第三多肽链，其包括(i)第二半fab轻链区，及(ii)第二半fc区，其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区。
[0383]
在一个实施方式中，向个体施用多特异性抗原结合蛋白复合物，所述抗原结合蛋白复合物包括：(a)第一多肽链，其包括(i)第一半fab重链区，(ii)第一半fc区，(iii)第一连接子，及(iv)第二半fab重链区，其中所述第一半fab重链区包括来自第一fab重链的第一
可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab重链区包括来自第二fab重链的第二可变区和第二恒定区；(b)第二多肽链，其包括(i)第一半fab轻链区及(ii)第二半fc区；和(c)第三多肽链，其包括第二半fab轻链区，其中所述第一半fab轻链区包括来自第一fab轻链的第一可变区和第一恒定区，并且其中所述第二半fab轻链区包括来自第二fab轻链的第二可变区和第二恒定区。
[0384]
本公开提供一种基于体外裂解的方法以检测蛋白酶活性和特异性，用于检测、诊断、监测和/或分级癌症或肿瘤。肿瘤或癌症肿块可以从个体提取并且与本文所描述的一种或多种不同的双链多特异性抗原结合蛋白复合物接触，所述复合物各自具有蛋白酶裂解特征已知的不同可裂解连接子(例如第二连接子)。肿瘤或癌症肿块产生一种或多种蛋白酶并且在适合于蛋白酶的条件下与不同的双链多特异性抗原结合蛋白复合物接触以使双链蛋白复合物上的可裂解连接子裂解。由连接子裂解产生的产物可以使用任何适合的方法检测。因此，可以识别由肿瘤或癌症肿块产生的一种或多种类型的蛋白酶。在一个实施方式中，可裂解连接子可用选自以下的两种或更多种蛋白酶中的任何一种或任何组合裂解：基质金属蛋白酶(mmp)、mmp1、mmp2、mmp3、mmp8、mmp9、mmp11、mmp13、mmp14、mt1-mmp(膜型基质金属蛋白酶1)、adam蛋白酶、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(upa)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。
[0385]
本公开提供一种用于检测由来自个体的肿瘤产生的蛋白酶是否存在的方法，所述方法包括：(a)接触(i)获自个体的肿瘤与(ii)包括两个不同fab区、fc区和可裂解连接子的多特异性抗原结合蛋白复合物(例如本文所描述的双链蛋白复合物中的任一种)，其中肿瘤样品产生蛋白酶，其中可裂解连接子的氨基酸序列可为或可不为用于通过由肿瘤样品产生的蛋白酶进行裂解的基质，并且其中接触在适合于蛋白酶裂解可裂解连接子的条件下进行以在蛋白酶裂解可裂解连接子时产生裂解产物；以及(b)检测裂解产物，由此诊断个体的癌症。在一个实施方式中，所述方法进一步包括：(c)通过检测裂解产物并且使裂解产物与可裂解连接子的氨基酸序列相关来识别由来自个体的肿瘤产生的蛋白酶的类型。在一个实施方式中，通过识别由个体中的肿瘤产生的蛋白酶类型，可以诊断个体中的癌症。在一个实施方式中，裂解产物可以通过凝胶电泳、蛋白质印迹分析、免疫学、免疫组织化学、比色法、分光光度法、质量分光光度法、液相色谱或通过其任何组合检测。在一个实施方式中，肿瘤或癌症肿块可获自前列腺癌、乳癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、皮肤癌、结直肠癌、肛门癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、平滑肌瘤癌、脑癌、神经胶质瘤癌、胶质母细胞瘤癌、食道癌、肝癌、肾癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、外阴癌、喉癌、阴道癌、骨癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉癌、下喉癌、唾液腺癌、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌和睾丸癌。在一个实施方式中，个体是人、非人灵长类动物、猿猴、猿、鼠(例如小鼠和大鼠)、牛、猪、马、犬、猫、山羊、狼、蛙或鱼。在一个实施方式中，基于体外裂解的方法可以用于检测、诊断、监测和/或分级个体的癌症。
[0386]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中第一或第二轻链可变区包括来自κ(kappa)或λ(lambda)链的氨基酸序列。
[0387]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中第一或第二重链可变区包括来自μ(mu)、γ(gamma)、α(alpha)、δ(delta)或ε(epsilon)链的氨基酸序列。
[0388]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中可变重链区和恒定重链区直接接合在一起而无任何避免引入免疫原性位点的介入连接子序列。
[0389]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中可变轻链区和恒定轻链区直接接合在一起而无任何避免引入免疫原性位点的介入连接子序列。
[0390]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中第一fab区可以结合第一目标表位，所述第一目标表位选自由以下组成的群组：细胞表面蛋白、细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和酶。在一个实施方式中，第一目标表位包括癌症或肿瘤细胞上的疾病相关抗原。
[0391]
在一个实施方式中，第一fab区可以结合第一目标表位并且展现10-5
m或更小、或10-6
m或更小、或10-7
m或更小、或10-8
m或更小、或10-9
m或更小、或10-10
m或更小的解离常数kd。
[0392]
在一个实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括第一fab区或第一和第二fab区，其可以结合选自由以下组成的群组的第一目标表位：b7-h3(cd276)、b7-h4、bcma、btla、ccr2、cd19、cd20、cd27、cd30、cd32b、cd33、cd38、cd40l、cd47、cd123、cd137、cea、ckit、c-met、cxcr3、cxcr5、ctla4、dll4、egfr、epcam、erbb3、erbb2、gpa33、her1、her2、her3、her4、icos、igf1r、il1α、il4、il6r、il13、il17a/f、jag1、kir、kras、lag3、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5ac、muc5b、muc7、oprf、opri、ox40、p-钙粘素、pd-1、pd-l1、psma、stat3、tim3、tnfa、vegfr2和wisp1。
[0393]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中第二fab区能够结合选自由以下组成的群组的第二目标表位：t细胞(例如效应t细胞)、nk细胞、单核细胞、嗜中性白细胞或巨噬细胞上的细胞表面抗原。在一个实施方式中，第二目标表位包括癌症或肿瘤细胞上的疾病相关抗原。
[0394]
在一个实施方式中，第二fab区能够结合第二目标表位并且展现10-5
m或更小、或10-6
m或更小、或10-7
m或更小、或10-8
m或更小、或10-9
m或更小、或10-10
m或更小的解离常数kd。
[0395]
在一个实施方式中，第二fab区在第二连接子裂解后结合第二表位。
[0396]
在一个实施方式中，第二目标表位包括：cd3、tcrα、tcrβ、cd28或ctla4(例如表达于t细胞上)；或pd-l1(也称为b7-h1；例如表达于巨噬细胞和树突状细胞上)；或cd16(也称为fcγriii；例如表达于nk细胞上)；或cd64(也称为fcγri；例如表达于巨噬细胞、嗜中性白细胞或单核细胞上)。
[0397]
在一个实施方式中，多特异性抗原结合蛋白复合物包括第二fab区，其可以结合选自由以下组成的群组的第二目标表位：cd3、cd8、cd10、cd16a、cd19、cd20、cd21、cd22、cd33、cd79b、has(人血清白蛋白)、il13、il17、il17a和vegf。
[0398]
在一个实施方式中，第二完整fab包括能够结合cd3的抗原结合结构域并且抗原结合结构域衍生自选自由以下组成的群组的已知抗cd3抗体：莫罗单抗(muromonab)-cd3(okt3)、奥昔珠单抗(otelixizumab)(trx4)、替利珠单抗(teplizumab)(mga031)、维西珠单抗(visilizumab)(nuvion)、sp34或i2c、tr-66或x35-3、vit3、bma030(bw264/56)、clb-t3/3、cris7、yth12.5、fl 11-409、clb-t3.4.2、tr-66、wt32、spv-t3b、11d8、xiii-141、xiii-46、xiii-87、12f6、t3/rw2-8c8、t3/rw2-4b6、okt3d、m-t301、smc2、f101.01、ucht-1和wt-31.e。
[0399]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括能够结合一
对目标表位的第一fab区和第二fab区，所述目标表位选自由以下组成的群组：cd38和cd3、bcma和cd3、efgr和pd-l1、以及cd20和cd47。所属领域的技术人员将了解，许多其它组合是可能的。
[0400]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中fc区包括直接接合在一起而无任何介入氨基酸或肽连接子序列的ch2和ch3序列。
[0401]
在一个实施方式中，fc区展现效应功能，包含补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或抗体依赖性吞噬作用(adp)，并且fc区中的突变可以增加或降低这些功能中的任一者或任何组合。在一个实施方式中，fc区包括降低效应功能的lala-pg突变(l234a、l235a、p329g)。
[0402]
在一个实施方式中，fc区介导蛋白复合物的血清半衰期，并且fc区中的突变可增加或降低蛋白复合物的血清半衰期。
[0403]
在一个实施方式中，fc区影响蛋白复合物的热稳定性，并且fc区中的突变可增加或降低蛋白复合物的热稳定性。
[0404]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其包括促进在组装的蛋白复合物中形成异二聚体的任何半fab区和/或任何半fc区中的一个或多个氨基酸突变，其中突变引起引入杵入臼结构(ridgeway 1996《蛋白质工程(protein engineering)》9(7):617-621)、引入额外链间二硫化物键结(carter 2011《免疫方法杂志(journal of immunological methods)》248:7-15)和/或引入新盐桥键。
[0405]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中fc区或第一或第二fab区包含在一链上产生突起(例如杵)以及在另一链上产生插口(例如臼)使得突起和插口彼此缔合的多肽链中的任一种中的突变。在一个实施方式中，突起和插口促进多肽链之间的缔合，例如促进异二聚化。在一个实施方式中，通过用较大氨基酸取代小氨基酸以产生突起(例如，在第一或第二半fc区中)来使多肽链中的一个突变。在一个实施方式中，通过用较小氨基酸取代较大氨基酸以产生插口(例如，在第二或第一半fc区中)来使另一多肽链突变。在一个实施方式中，fc区杵入臼突变包括在任何一个fc位置或两个或更多个fc位置的任何组合处的取代突变，所述fc位置选自由以下组成的群组：t366、l368、t394、f405、y407和k409(编号是基于kabat系统)。在一个实施方式中，fc区杵入臼突变包括以下突变中的任何一个或两个或更多个的任何组合：t366y、t366w、t366s、l368a、t394s、t394w、f405a、f405w、y407a、y407v、y407t(基于kabat系统的编号)。
[0406]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中任何第一半fab重链区和第一半fab轻链区能够彼此缔合以形成至少一个共价键(例如链间二硫化物键结)。半fab重链区和/或半fab轻链区中的任一个可经突变以新增形成至少一个二硫键(例如参见图1-16中的“s-s”)或去除现有二硫键(例如参见图1-16中的“x-x”)的能力。
[0407]
在一个实施方式中，第一半fab重链区和第一半fab轻链区包含氨基酸修饰(例如氨基酸取代；例如丝氨酸经半胱氨酸取代或酪氨酸经半胱氨酸取代)以用于在第一半fab重链区和第一fab轻链区彼此缔合时形成额外二硫键。
[0408]
在一个实施方式中，第二半fab重链区和第二半fab轻链区包含氨基酸修饰(例如氨基酸取代；例如丝氨酸经半胱氨酸取代或酪氨酸经半胱氨酸取代)以用于在第一半fab重链区和第一fab轻链区彼此缔合时形成额外二硫键。
[0409]
在一个实施方式中，第一半fab重链区和第一半fab轻链区包含氨基酸修饰(例如氨基酸取代)，其在第二半fab重链区和第二fab轻链区彼此缔合时去除形成共价键的能力。
[0410]
在一个实施方式中，第二半fab重链区和第二半fab轻链区包含氨基酸修饰(例如氨基酸取代)，其在第二半fab重链区和第二fab轻链区彼此缔合时去除形成二硫键的能力。
[0411]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中任何第一半fc区和第二半fc区能够彼此缔合以形成至少一个共价键(例如二硫键)。半fc区中的任一个可经突变以新增形成额外二硫键或去除现有二硫键的能力。
[0412]
在一个实施方式中，第一半fc区和第二半fc区包含氨基酸修饰(例如氨基酸取代；例如丝氨酸经半胱氨酸取代或酪氨酸经半胱氨酸取代)以用于在第一半fc区和第二半fc区彼此缔合时形成额外共价键。
[0413]
在一个实施方式中，第一半fc区和第二半fc区包含氨基酸修饰(例如氨基酸取代)，其在第一半fc区和第二半fc区彼此缔合时去除形成共价键的能力。
[0414]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中fc区或第一或第二fab区包含产生新链间盐桥键的任一条多肽链中的突变。在一个实施方式中，第一、第二或第三多肽链中的任何位置处的苏氨酸残基被谷氨酸置换，并且成对多肽链中的对应位置处的天冬酰胺被赖氨酸置换，从而产生链间盐桥键。
[0415]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中铰链区包括有包括来自igg1、igg2、igg3或igg4免疫球蛋白分子的上部、核心或下部铰链序列的两个或更多个区的任何一个或任何组合。在一个实施方式中，铰链区包括igg1上铰链序列epkscdktht(seq id no:170)。在一个实施方式中，铰链区包括igg1核心铰链序列cpxc，其中x为p、r或s(seq id no:171)。在一个实施方式中，铰链区包括下铰链/ch2序列papellggp(seq id no:172)。在一个实施方式中，铰链接合于具有氨基酸序列svflfppkpkdt(seq id no:173)的fc区(ch2)。在一个实施方式中，铰链区包含上铰链、核心铰链和下铰链的氨基酸序列并且包括epkscdkthtcppcpap ellggp(seq id no:174)。在一个实施方式中，铰链区包括可形成至少一个、两个、三个或更多个链间二硫键的一个、两个、三个或更多个半胱氨酸。
[0416]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中第一连接子包括肽连接子，所述肽连接子允许缔合/组装第一和第二多肽链以形成能够结合相同目标抗原上或不同目标抗原上的两个或更多个不同表位的多特异性抗原结合蛋白复合物。第一连接子长度可为1-50个氨基酸，其任选地可包含至少一个氨基酸类似物。在一个实施方式中，第一连接子主要包括两种或更多种以下氨基酸的任何组合：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和/或苏氨酸。在一个实施方式中，第一连接子包括甘氨酸-丙氨酸或丙氨酸-丝氨酸或其它柔性连接子序列的至少一种和至多四种聚合物。在一个实施方式中，第一连接子包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：(sg)n(seq id no:157)、(sgg)n(seq id no:158)、(sggg)n(seq id no:159)、(ssg)n(seq id no:160)、(gs)n(seq id no:161)、(ggg)n(seq id no:162)、(gsggs)n(seq id no:163)、(gsg)n(seq id no:164)、(ggggs)n(seq id no:165)、(gggs)n(seq id no:166)、(ggggsgs)n(seq id no:167)、(ggggsggs)n(seq id no:168)和(ggs)n(seq id no:169)，其中n为1-6的整数。在一个实施方式中，第一连接子包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：akttpkleegefsear、akttpkleegefsearv、akttpklgg、sakttpklgg、akttpkleegefsearv、sakttp、sakttpklgg、radaap、radaaptvs、radaaaaggpgs、
radaaaa(g4s)4、sakttp、sakttpklgg、sakttpkleegefsearv、adaap、adaaptvsifpp、tvaap、tvaapsvfifpp、qpkaap、qpkaapsvtlfpp、akttpp、akttppsvtplap、akttap、akttapsvyplap、astkgp、astkgpsvfplap、genkveyapalmals、gpakeltplkeakvs和gheaaavmqvqypas(分别为seq id no:156-184)。
[0417]
在一个实施方式中，第二连接子包括与上文所描述的第一连接子中的任一者至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％一致的氨基酸序列。
[0418]
在一个实施方式中，第一连接子序列可衍生自任何同种型的重链，包含(例如)cγ1、cγ2、cγ3、cγ4、cα1、cα2、cδ、cε和cμ。在一个实施方式中，第一连接子序列可衍生自免疫球蛋白样多肽，包含tcr、fcr和kir。在一个实施方式中，第一连接子序列可衍生自免疫球蛋白铰链区。
[0419]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其中第二连接子包括肽连接子，所述肽连接子允许缔合/组装第一和第二多肽链以形成能够结合相同目标抗原上或不同目标抗原上的两个或更多个不同表位的多特异性抗原结合蛋白复合物。第二连接子长度可为1-50个氨基酸，其任选地可包含至少一个氨基酸类似物。
[0420]
在一个实施方式中，第二连接子为完整的(例如未裂解)。在一个实施方式中，完整的第二连接子不会显著增加或降低第一fab区结合其目标表位的能力。在一个实施方式中，完整的第二连接子降低/限制第二fab区结合其目标表位的能力。在一个实施方式中，完整的第二连接子不会显著增加或降低第一fab区结合其目标表位的能力，并且降低/限制第二fab区结合其目标表位的能力。在一个实施方式中，与其中第二连接子裂解的多特异性抗原结合蛋白复合物相比，当第二连接子为完整的时，第二fab区展现与第二表位的结合降低。在一个实施方式中，完整的第二连接子使得多特异性抗原结合蛋白复合物处于非活化状态。在一个实施方式中，在第二连接子裂解后，多特异性抗原结合蛋白复合物变为活化的蛋白复合物并且第二fab区可以结合其目标表位。假定当蛋白复合物中的第二连接子裂解时，多特异性蛋白复合物经历构象变化，使得第二fab区呈现可结合其目标表位的构象。因此，包括裂解的第二连接子的多特异性抗原结合蛋白复合物变为活化的蛋白质前药。
[0421]
在一个实施方式中，第二连接子包含在裂解条件下可裂解的氨基酸序列，所述裂解条件包含蛋白酶、酯酶、还原性条件或氧化条件。在一个实施方式中，第二连接子可通过存在于肿瘤微环境中的蛋白酶裂解或可通过存在于肿瘤微环境中的还原性或氧化条件裂解(rakashanda等人,2012biotechnology and molecular biology review 7(4):90-101)。在一个实施方式中，裂解条件包括一种蛋白酶或两种或更多种蛋白酶的任何组合，包含丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶、血清蛋白酶、基质金属蛋白酶(mmp)、mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、mmp11、mmp13、mmp14、mt1-mmp(膜型基质金属蛋白酶1)、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(upa)、肠激酶、前列腺特异性抗原(psa，hk3)、介白素转化酶、凝血酶、fap(fap-a)、二肽基肽酶、穿膜肽酶(meprin)、颗粒酶(例如颗粒酶b)、二肽基肽酶iv(dppiv/cd26)、去整合素和金属蛋白酶(例如adam蛋白酶)、adam10、adam12、adam17、第二型穿膜丝氨酸蛋白酶(hepsin)、组织蛋白酶、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶k、组织蛋白酶l、激肽释放酶(kallikrein)、hkl、hk10、hk15、纤溶酶、胶原蛋白酶、iv型胶原蛋白酶、基质溶素、溶酶体酶、xa因子、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、
弹性蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶、奇异果蛋白酶(actinidain)、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、胱天蛋白酶、胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-10、胱天蛋白酶-11、胱天蛋白酶至12、胱天蛋白酶-13、胱天蛋白酶-14、单纯疱疹病毒蛋白酶、hiv蛋白酶、cmv蛋白酶、mirl-cp、木瓜蛋白酶、hiv-1蛋白酶、hsv蛋白酶、cmv蛋白酶、凝乳酶、肾素、胃蛋白酶、间质蛋白酶(例如间质蛋白酶2、人类st14或tmprss6)、豆荚蛋白(legumain)、疟原虫天冬氨酸蛋白酶(plasmepsin)、猪笼草蛋白酶(nepenthesin)、金属外肽酶(metalloexopeptidase)和/或金属内肽酶(metalloendopeptidase)。
[0422]
在一个实施方式中，第二连接子包括与可用基质金属蛋白酶裂解的肽至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％一致的氨基酸序列，例如以下氨基酸序列：ggsgsgsggssgggsggggs(dp连接子)、tsgsggsggsv(eg或eh连接子)、tsgsggsplgmggsgsv(ei或eu连接子)、tsgsggsplgvggsgsv(ej或ev连接子)、tsgsggspaalggsgsv(ek或ew连接子)、tsgsggspaglggsgsv(el或ex连接子)、tsgsggsplgmvgv(em或ey连接子)、tsgsggsplgvvgv(en或ez连接子)、tsgsggspaalvgv(eo或fa连接子)、tsgsggspaglvgv(ep或fb连接子)、tsgsggsplgmvlv(eq或fc连接子)、tsgsggsplgvvlv(er或fd连接子)、tsgsggspaalvlv(es或fe连接子)或tsgsggspaglvlv(st或ff连接子)(分别为seq id no:11-24，或分别为seq id no:43-56)。
[0423]
在一个实施方式中，第二连接子包括由mmp9识别和裂解的氨基酸序列leata。在一个实施方式中，第二连接子包括由mmp9识别和裂解的氨基酸序列pr(s/t)(l/i)(s/t)。在一个实施方式中，第二连接子包括氨基酸序列sgsggsplgmggsgsvd、sgsggspaglggscsvd或sgsggspaglvgvd(分别为seq id no:185-187)。在一个实施方式中，第二连接子包括由mmp11识别和裂解的氨基酸序列ggaanlvrgg(seq id no:188)。
[0424]
本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其结合来自人类的表位或抗原。本公开提供本文所描述的任何多特异性抗原结合蛋白复合物，其结合来自人类的表位或抗原并且可以与来自非人类动物(如小鼠、大鼠、山羊、兔、仓鼠和/或猴(例如食蟹猕猴、恒河或猕猴))中的任一种或其任何组合的表位或抗原(例如同源抗原)结合(例如，交叉反应)。
[0425]
实例
[0426]
以下实例意图为说明性的且可用于进一步理解本公开的实施方式，且不应以任何方式被解释为限制本发明传授内容的范围。
[0427]
实例1：biacore结合分析：
[0428]
流动相目标抗原与表面结合的双特异性抗体之间的结合。
[0429]
使用表面等离子体共振(spr)分析，使用biacore t200表面等离子体共振(ge healthcare)，在约25℃下测量单个抗原的三链或双链双特异性抗体之间的动力学相互作用。
[0430]
将三链和双链双特异性抗体对于其相应抗原作为唯一结合事件的结合动力学与其亲本单克隆抗体的结合动力学进行比较。根据制造商建议，双特异性抗体在cm5生物传感器芯片(ge healthcare)上经由胺偶联抗fc抗体固定到生物传感器表面。将一系列浓度在0至约10倍kd范围内的单个抗原作为分析物施加到生物传感器表面持续2分钟用于缔合阶
段，接着施加5分钟的缓冲流用于解离阶段。
[0431]
将经设计以结合pd-l1和egfr、以结合流动相egfr或pd-l1抗原作为唯一结合事件的固定化双特异性抗体的结合动力学与亲本抗egfr或抗pd-l1单克隆抗体的结合动力学进行比较。
[0432]
图17a显示与流动相egfr抗原结合的表面结合的三链非串联双特异性抗体(图4中所示的结构，kv4.33)的传感图。图17b显示与流动相egfr抗原结合的表面结合的三链串联双特异性抗体(图2中所示的结构，kv5.1)的传感图。图17c显示与流动相egfr抗原结合的表面结合的对照抗egfr抗体(参见图43)的传感图。图17d显示与流动相egfr抗原结合的表面结合的亲本抗egfr单克隆抗体(2dga1)的传感图。亲本单克隆抗egfr抗体描述于美国专利第9,944,707号中作为抗体克隆2dga1。
[0433]
图18a显示与流动相pd-l1抗原结合的表面结合的三链非串联双特异性抗体(图4中所示的结构，kv4.33)的传感图。图18b显示与流动相pd-l1抗原结合的表面结合的三链串联双特异性抗体(图2中所示的结构，kv5.1)的传感图。图18c显示与流动相pd-l1抗原结合的表面结合的亲本抗pd-l1单克隆抗体(sh1e2)的传感图。亲本单克隆抗pd-l1抗体描述于美国专利第9,175,082号中作为抗体克隆sh1e2，并且抗体克隆h6b1l也描述于美国专利第9,175,082号中。
[0434]
将经设计以结合cd38和cd3、以结合流动相cd38抗原作为唯一结合事件的固定化双特异性抗体的结合动力学与亲本抗cd38单克隆抗体的结合动力学进行比较。
[0435]
图19a显示与流动相cd38抗原结合的表面结合的三链非串联双特异性抗体(图4中所示的结构，kv4.33)的传感图。图19b显示与流动相cd38抗原结合的表面结合的三链串联双特异性抗体(图2中所示的结构，kv5.1)的传感图。图19c显示与流动相cd38抗原结合的表面结合的亲本抗cd38单克隆抗体(3h10m1)的传感图。图19d显示与流动相cd38抗原结合的表面结合的双链串联双特异性抗体(完整、非裂解)(图2中所示的结构，kv6.1)的传感图。图19e显示与流动相cd38抗原结合的表面结合的双链非串联双特异性抗体(完整、非裂解)(图3中所示的结构，kv6.2)的传感图。亲本单克隆抗cd38抗体描述于2019年3月29日提交的美国临时申请案第62/825,983号以及2020年3月27日提交的pct申请案第pct/us2020/025181号中(例如抗体克隆3h10m1)。
[0436]
将经设计以结合bcma和cd3、以结合流动相bcma抗原作为唯一结合事件的固定化双特异性抗体的结合动力学与亲本抗bcma单克隆抗体的结合动力学进行比较。
[0437]
图20a显示与流动相bcma抗原结合的表面结合的三链非串联双特异性抗体(图4中所示的结构，kv4.33)的传感图。图20b显示与流动相bcma抗原结合的表面结合的亲本抗bcma单克隆抗体(2c5)的传感图。亲本单克隆抗bcma抗体描述于2019年2月27日提交的美国临时申请案第62/811,431号以及2020年2月25日提交的国际申请案第pct/us2020/19763号中(例如抗体克隆2c5)。
[0438]
对于实例1、2和3中描述的所有biacore分析，egfr目标抗原获自sino biological(目录号10001-h08h，ncbi寄存号np 005219，met 1-ser 645，参见图39)、pd-l1目标抗原获自sino biological(目录号10081-h08h，ncbi寄存号np054862.1，met 1-thr 239，参见图40)，cd38目标抗原获自sino biological(目录号10818-h08h，ncbi寄存号np001766.2，val 43-ile 300，参见图41)，并且bmca目标抗原获自acro biosystems(目录号bca-h522g，ncbi
寄存号q02223-1，met 1-ala 54，参见图42)。
[0439]
将使用1:1结合模型的标准评估应用于上文所描述的所有动力学系列。缔合和解离常数(k-on和k-off)、亲和力(kd)、最大反应(rmax)以及拟合统计数据(chi^2)呈现在表8中，表8呈现在实例部分结尾处。
[0440]
实例2：biacore结合分析：
[0441]
流动相双特异性抗体与表面结合的目标抗原之间的结合。
[0442]
目标抗原(egfr或pd-l1)经由胺偶联到cm5传感器芯片(ge healthcare)上的参考和测试流动单元表面上而固定到生物传感器表面。仅在2分钟缔合阶段和5分钟解离阶段的情况下，将一系列浓度的三链双特异性抗体施用于测试流动细胞。
[0443]
将固定化egfr或pd-l1抗原与经设计以结合pd-l1和egfr作为唯一结合事件的流动相双特异性抗体的结合动力学与亲本抗egfr或抗pd-l1单克隆抗体的结合动力学进行比较。
[0444]
图21a显示与三链非串联双特异性抗体(图4中所示的结构，kv4.33)结合的表面结合的egfr抗原的传感图。图21b显示与三链串联双特异性抗体(图2中所示的结构，kv5.1)结合的表面结合的egfr抗原的传感图。图21c显示与三链非串联双特异性抗体(图4中所示的结构，kv4.33)结合的表面结合的pd-l1抗原的传感图。图21d显示与三链串联双特异性抗体(图2中所示的结构，kv5.1)结合的表面结合的pd-l1抗原的传感图。
[0445]
将使用1:1结合模型的标准评估应用于上文所描述的所有动力学系列。缔合和解离常数(k-on和k-off)、亲和力(kd)、最大反应(rmax)以及拟合统计数据(chi^2)呈现在表8中，表8呈现在实例部分结尾处。
[0446]
实例3：biacore结合分析：
[0447]
双特异性抗体与两种目标抗原的结合。
[0448]
使用biacore系统的夹层方法(sandwich method)用于同时测定三链双特异性抗体与两种不同目标抗原的结合动力学。通过胺偶联到cm5传感器芯片表面上而固定目标抗原-1(egfr或pd-l1)。接着，通过在每个循环中应用相同量的双特异性抗体，之后应用一系列浓度的目标抗原-2(pd-l1或egfr)作为分析物，将三链双特异性抗体固定于参考和测试流。
[0449]
图22a显示在流动相中在不同浓度下结合于三链串联双特异性抗体(图2中所示的结构，kv5.1)且结合pd-l1抗原-2的表面结合的egfr抗原-1的传感图。矩形突出显示在减去参考流动单元反应之后经受动力学分析的传感图时间段。图22b显示来自图22a的矩形区域的减去参考的传感图。
[0450]
图23a显示在流动相中在不同浓度下结合于三链串联双特异性抗体(图2中所示的结构，kv5.1)且结合egfr抗原-2的表面结合的pd-l1抗原-1的传感图。矩形突出显示在减去参考流动单元反应之后经受动力学分析的传感图时间段。图23b显示来自图22a的矩形区域的减去参考的传感图。
[0451]
将使用1:1结合模型的标准评估应用于上文所描述的所有动力学系列。缔合和解离常数(k-on和k-off)、亲和力(kd)、最大反应(rmax)以及拟合统计数据(chi^2)呈现在表8中，表8呈现在实例部分结尾处。
[0452]
实例4：可裂解连接子：
[0453]
用于双特异性抗体的可裂解连接子的设计和分析。
[0454]
各种连接子序列的裂解效率通过将其包含在双链串联和非串联双特异性抗体(例如，cd38/cd3)上来设计并且加以测试。连接子序列和代码注释在下表1中列出。
[0455]
表1：
[0456][0457]
一系列mmp2/9可裂解连接子经设计以包含甘氨酸/丝氨酸掺合物的柔性5-氨基酸连接子中1或2个单元的组合。还设计了不可裂解连接子。各种双链串联(kv6.1)和非串联(kv6.2)双特异性抗体经构造以包含这些可裂解或不可裂解连接子中的一者以用于瞬时cho细胞表达。收集来自cho细胞培养物的上清液，并且通过采用单步重力蛋白质a纯化来处理上清液中的双特异性抗体。
[0458]
通过使蛋白质a纯化的双特异性抗体中的每一者在类似于制造商所建议、具有一些修改的条件下经受可商购的mmp2或mmp9酶来评估连接子裂解效率。kv6.1双特异性抗体在37℃下用2.7nm mmp9(calbiochem)在ph6.8的50mm乙酸钠、50mm tris-hcl和10mm cacl2中消化1hr。kv6.2双特异性抗体在37℃下用22nm mmp9(calbiochem)或3u mmp2(creative biolab)在50mm乙酸钠、50mm tris-hcl、10mm cacl2、0.05％bsa和0.05％聚山梨醇酯20(ph6.8)中消化至多2hr。
[0459]
使蛋白酶消化的kv6.1和kv6.2双特异性抗体在还原条件下经受sds-page和后续抗人类fc蛋白质印迹分析，以识别与完整的hc-fc融合体和lc-fc融合链相比具有观察到的较小分子量的fc融合链的存在。蛋白酶消化的kv6.1和kv6.2双特异性抗体的标记合并的抗人类fc蛋白质印迹呈现于图24a-e中。
[0460]
用mmp9消化的串联(kv6.1)双特异性抗体的抗人类fc蛋白质印迹(还原条件)(图24a)在1小时蛋白酶处理之后揭示含有连接子ei、el或ep的双特异性抗体中的lc-fc融合链的可检测裂解。箭头表示裂解产物。
[0461]
用mmp9(图24b和图24c)或mmp2(图24d和图24e)消化的非串联(kv6.2)双特异性抗体的抗人类fc蛋白质印迹(还原条件)揭示在用mmp9消化1小时之后，在含有连接子eu、ev、ex或ey(图24b)的双特异性抗体中的lc-fc融合链的可检测裂解，揭示在用mmp9消化2小时之后，在含有连接子fa或fb(图24c)的双特异性抗体中的可检测裂解。含有eu、ev、ew、ex、fa、fb或fd连接子的非串联双特异性抗体(kv6.2)的裂解可在mmp2处理1小时情况下检测(图24d)。含有eu、ev、ew、ex、fa、fb或fd连接子的非串联双特异性抗体(kv6.2)的裂解可在
mmp2处理1小时(图24d)和至多2小时(图24e)情况下检测。箭头表示裂解产物。
[0462]
结果指示两种相关mmp蛋白酶的裂解效率存在差异。结果还指示具有串联(kv6.1)和非串联(kv6.2)设计的双特异性抗体形式影响连接子裂解效率，因为相同连接子在串联(kv6.1)和非串联(kv6.2)形式中展现不同裂解效率。
[0463]
实例5：细胞结合分析：
[0464]
双特异性抗体与表达cd3的t细胞的结合。
[0465]
使用intellicyt ique筛选流式细胞仪测量初级人类t细胞上的cd3抗原与各种三链或双链双特异性抗体的结合。所测试的双特异性抗体包含：结合cd38和cd3或结合bcma和cd3的三链非串联双特异性抗体(kv4.33)；结合cd38和cd3的三链串联双特异性抗体(kv5.1)；结合cd38和cd3的双链非串联双特异性抗体(kv6.2)；以及结合cd38和cd3的双链串联双特异性抗体(kv6.1)。对于含有抗cd38抗原结合结构域的双特异性抗体的分析，在分析之前，对新分离的人类t细胞进行负选择以用于cd38-阴性亚群。对于结合bcma/cd3的三链非串联双特异性抗体(kv4.33)的分析，使用保持于atc(活性t细胞)培养基中持续小于一周的新分离的人类t细胞。对于两种类型的分析，具有大于90％存活率的t细胞用facs缓冲液(含有2％胎牛血清(fbs)的基于dpbs的缓冲液)洗涤一次，并且接着在相同缓冲液中调节到1e+6/ml的细胞密度。使用大约25,000个细胞产生每一数据点。
[0466]
对于双特异性抗体或对照mab与t细胞上的cd3结合的每一剂量依赖性曲线，在facs缓冲液中制备每一双特异性抗体或对照mab的一系列1:3稀释液(至多十二次)。将相等体积的每种双特异性抗体稀释液和t细胞混合于96孔板的孔中。特定双特异性抗体或对照mab的浓度范围基于其针对cd3的所估计的ec50(得到半最大结合的浓度)来选择。在将每一浓度系列的双特异性抗体或对照mab与其相应t细胞一起培育一小时之后，混合物用facs缓冲液洗涤且在离心后去除上清液。以制造商建议的效价将作为二级抗体的抗人类fc-apc结合物添加到每种双特异性抗体或对照mab/细胞混合物中并且培育大约15-20分钟。洗涤双特异性抗体或对照mab/细胞混合物并且如上文所描述去除上清液。将最终双特异性/细胞混合物再悬浮于25ul facs缓冲液中，且在流式细胞仪上经受facs分析，其中分析10ul的每一悬浮液。
[0467]
通过绘制每个浓度系列下相应双特异性抗体或对照mab/细胞混合物中检测到的单峰(singlet)细胞的荧光高度的几何平均值来产生每种双特异性抗体或对照mab结合于cd3 t细胞的剂量依赖性结合曲线。在使用4参数线性回归(4pl)模型将曲线拟合到剂量依赖性曲线之后，测定每一双特异性或对照mab针对t细胞上的cd3的ec50。完整的含有抗cd3的双特异性抗体针对t细胞上的cd3的结合曲线呈现于图25a、b和c中。对照抗体和含抗cd3的双特异性抗体针对t细胞上的cd3的ec50分别在表2和表3a和表3b中列出(参见下文)。
[0468]
表2：
[0469][0470][0471]
表3a：
[0472][0473]
表3b：
[0474][0475]
实例6：细胞结合分析：
[0476]
表达cd3的t细胞与具有裂解连接子的双特异性抗体的结合。
[0477]
分析表达cd3的t细胞与具有mmp2/9可裂解连接子的双特异性抗体的结合。将结合cd38和cd3并且具有双链串联(kv6.1)和双链非串联(kv6.2)结构的双特异性抗体分析为未裂解或裂解形式。
[0478]
可商购的mmp9酶用于在16℃下在50mm乙酸钠、50mm tris-hcl、10mm cacl2、0.05％bsa和0.05％聚山梨醇酯20(ph6.8)中以1:200ab:酶质量比消化双特异性抗体过夜。每一消化混合物通过蛋白质a亲和分批结合和重力洗脱用50mm乙酸纯化，之后用相等体积的0.2m乙酸钠ph5.5进行单步滴定以在125mm乙酸钠ph5.0下达到最终缓冲液条件。在非还原以及还原条件下，使mmp9消化的cd38/cd3双特异性抗体的ph滴定蛋白质a洗脱份经受sds-page以用于连接子裂解验证。在通过完整和消化双特异性抗体的比较性还原sds-page来确认可裂解连接子完全裂解之后，所滴定的蛋白质a洗脱份通过uv280吸收来定量蛋白质浓度并且经制备用于t细胞结合分析。在以上实例5中描述了浓度系列和表达cd3的cd38-阴性人类t细胞的制备以及分析设置和分析。
[0479]
结合cd38/cd3的对照不可裂解抗体包含链串联(kv6.1)和非串联(kv6.2)分子，所述分子携带在第二多肽上替换可裂解连接子的不可裂解gs连接子。
[0480]
结合cd38/cd3的对照三链抗体包含串联(kv5.1)和非串联(kv4.33)分子。
[0481]
在连接子裂解之前和之后，双特异性抗体与可裂解连接子的cd3结合曲线呈现于图26a和26b中。
[0482]
图26a中的结果显示携带mmp2/9-可裂解连接子的双链串联双特异性抗体(kv6.1)的mmp9蛋白酶裂解恢复与表达cd3的cd38-阴性t细胞的结合，指示连接子裂解增加了这些双特异性抗体中第二fab区的互补位的可获取性。携带mmp2/9-可裂解连接子的双链串联双特异性抗体(kv6.1)的裂解与三链串联双特异性抗体(kv5.1)相比对cd3抗原具有相当的亲和力(例如，在10倍差异内)。具有串联结构的对照不可裂解双特异性抗体(kv6.1)展现出极大减少的与cd3的结合超过100倍的差异。实线是对应数据集的剂量依赖性4参数逻辑回归(4pl)拟合曲线。
[0483]
图26b中的结果显示携带mmp2/9可裂解连接子的双链非串联双特异性抗体(kv6.2)的mmp9蛋白酶裂解增加与表达cd3的cd38-阴性t细胞的结合。携带mmp2/9-可裂解连接子的双链非串联双特异性抗体(kv6.2)的裂解与三链非串联双特异性抗体(kv4.33)相比对cd3抗原具有在100倍差异内的亲和力。具有非串联结构的对照不可裂解双特异性抗体
(kv6.2)展现出极大减少的与cd3的结合超过1000倍的差异。实线是对应数据集的剂量依赖性4参数逻辑回归(4pl)拟合曲线。
[0484]
在各种双特异性抗体的连接子裂解之前和之后，在t细胞上结合cd3的相应ec50值在以下表4和5中列出。
[0485]
表4：
[0486][0487]
表5：
[0488][0489][0490]
实例7：细胞因子释放分析：
[0491]
由cd38/cd3双特异性抗体诱导的细胞因子释放。
[0492]
多重msd(meso scale diagnostics)方法用于分析cd38/cd3双特异性抗体的细胞因子释放能力。未刺激的人类t细胞和rpmi8226细胞在重定向t细胞细胞毒性分析中与各种浓度的cd38/cd3双特异性抗体或对照抗体混合。在针对每一重定向t细胞细胞毒性条件同时分析的t细胞细胞毒性中测试三种细胞因子，包含ifnγ、il-2和tnfα。制造商建议的分析程序用于在以下样品处置实践下进行分析。
[0493]
将先前冷冻的上清液在室温下解冻，并且通过反转和短暂离心均质化。对于用双特异性抗体或对照单克隆抗体浓度梯度处理的系列，其中观察到肿瘤目标细胞rpmi杀伤，均质化的上清液在msd板装载之前稀释50次。对于作为仅细胞的对照(即仅肿瘤目标细胞、仅t细胞或双细胞混合物)的系列，其中观察到较少细胞死亡并且预计较少细胞因子，上清液在msd板装载之前稀释10次。
[0494]
在图27a-c中呈现每一cd38/cd3双特异性抗体以及mab和仅细胞对照针对rpmi8226细胞的细胞因子释放分布。图27a-c中的实线是对应数据集的剂量依赖性4参数逻辑回归(4pl)拟合曲线。在10nm cd38/cd3双特异性抗体或5nm的每一亲本单克隆抗体存在下释放的每一细胞因子的并排比较呈现于图27d中。
[0495]
图27a-d中所示的结果指示三链串联双特异性抗体(kv5.1；图2中说明的结构)与三链非串联双特异性抗体(kv4.33；图4中说明的结构)相比，可以在更高水平下诱导ifnγ、il-2和tnfα的细胞因子释放。
[0496]
实例8：体外t细胞活化分析：
[0497]
肿瘤相关抗原依赖性体外t细胞活化。
[0498]
将新分离的未刺激的人类t细胞与cd38(+)/bcma(+)骨髓瘤细胞系mm1.r gfr/luc和cd38/cd3或bcma/cd3双特异性抗体或亲本单克隆抗体混合。以固定e/t(效应细胞/目标细胞)比混合t细胞和肿瘤细胞，所述细胞在高于或低于既定双特异性抗体的先前确定的ec50的浓度下与每一双特异性抗体反应。
[0499]
每一分析条件下，在静态培育箱中的96孔板中，在1pm、10pm或1nm的每一双特异性抗体或对照亲本mab存在下，将大约15,000个mm1.r细胞和150,000个初级人类t细胞在37℃下培育过夜。无抗原对照分析包含仅具有相应双特异性抗体或对照亲本mab中的每一者的t细胞。通过离心将来自过夜培育的细胞粒化，并用rpmi培养基+10％fbs洗涤一次，之后进行facs染色和分析。将细胞团粒再悬浮于facs缓冲液中并且根据制造商建议的分析效价和程序用抗cd25-apc和抗cd69-apc-cy7抗体(百进生技公司(biolegend,inc.))双染色。用于双色facs分析的适当补偿对照以及无ab对照也包含于分析设计中。
[0500]
在facs分析之前，将洗涤和双染色后的细胞团粒再悬浮于facs缓冲液中。通过facs仪器在bl-1(gfp)、rl-1(cd25-apc)和rl-2(cd69-apc-cy7)通道上分析每一分析条件下大约1/3的细胞(或50,000-60,000个细胞)。在fsc-a(前向散射-面积)相对于bl1-h(高度)散布图上，从mm1.r目标细胞中门控t细胞，其中bl1-h低群作为效应细胞。接着在应用适当补偿之后，将t细胞群绘制在rl-1(cd25-apc)相对于rl-2(cd69-apc-cy7)散布图上。高度表达cd25(+)和cd69(+)两者的右上象限定义为活化t细胞群。所有检测到的t细胞群中的cd25(+)/cd69(+)t细胞的百分比被计算为针对对应分析条件的活化百分比并且呈现于图28a和28b中。图28a中的结果显示cd38/cd3和bcma/cd3双特异性抗体以剂量依赖性方式介导未刺激t细胞的taa依赖性活化。图28b中的结果显示，在不存在肿瘤目标的情况下，cd38/cd3和bcma/cd3双特异性抗体在图28a中所示的数据中所测试的相同浓度范围内引发较少t细胞活化。在亲本mab条件中，t细胞活化水平不依赖于肿瘤抗原的存在(图28a和28b中所示)。通过减去在目标细胞和仅t细胞条件中观察到的活化水平来归一化每一分析条件下的活化百分比。相对于相应双特异性抗体或对照亲本mab浓度绘制归一化的活化百分比，并且呈现于图28c-g中。
[0501]
结果显示，在双特异性抗体浓度大于先前表征的taa依赖性重定向t细胞细胞毒性的ic50的25％下，对于三链非串联bcma/cd3双特异性抗体(kv4.33)(图28c)、三链非串联cd38/cd3双特异性抗体(kv4.33)(图28d)和三链串联cd38/cd3双特异性抗体(kv5.1)(图28e)，双特异性抗体介导的t细胞活化是剂量依赖性和目标特异性的。在相同测试浓度范围下，在对照亲本抗bcma mab和抗cd3 mab(图28f)或对照亲本抗cd38 mab和抗cd3 mab(图28g)的情况下未观察到此类肿瘤目标依赖性t细胞活化。*p值《0.05；**p值《0.01；***p值《0.001。
[0502]
实例9：体外t细胞细胞毒性分析：
[0503]
体外肿瘤相关抗原依赖性t细胞细胞毒性分析
[0504]
使用等量的人类t细胞和表达cd38的肿瘤细胞在固定效应细胞/目标细胞比和不同浓度的cd38/cd3双特异性抗体下进行体外肿瘤相关抗原(taa)依赖性t细胞细胞毒性分析以测定双特异性抗体的目标细胞杀伤能力，以及对表达细胞凋亡标记物的肿瘤细胞进行定量。
[0505]
将新分离的(未刺激的)人类t细胞在37℃静态培育箱中以大约2-5
×
106个细胞/
毫升保持在补充有10％fbs和10ng/ml il-7的rpmi培养基中过夜。在细胞毒性分析设置之前，通过使用补偿的三色流式细胞测量术方法分别定量总cd3(+)t细胞计数中cd8(+)和cd4(+)亚群的百分比来进行细胞毒性相对于辅助t细胞比率的分析。大约2:1的cd4(+)/cd8(+)比为使经分离的人类t细胞具备用于细胞毒性分析的资格的典型标准。
[0506]
rpmi8226细胞系(高度表达cd38的人类多发性骨髓瘤细胞系(atcc，ccl-155))的细胞通过用pmys-ires(具有gfp和萤火虫荧光素酶基因的逆转录病毒衍生的载体)转导，以及针对具有内源性gfp和荧光素酶表达的稳定细胞系以用于荧光以及发光检测进行后续选择来标记。在分析设置的当天，rpmi gfp-luc细胞和新分离的存活率》90％的t细胞各自用rpmi培养基洗涤一次，并且密度经调节以在每一分析条件下提供20:1的e/t比，其中每一数据点使用大约15,000个目标细胞。在rpmi培养基中制备cd38/cd3三链串联(kv4.33)和非串联(kv5.1)双特异性抗体的连续1:3稀释液以及双亲本mab(抗cd38和抗cd3 mab)的混合物，并且将其添加到96孔板中的rpmi/t细胞混合物中。一系列目标细胞孔和仅t细胞的孔还设置为仅二级抗原和无双特异性抗体对照。仅rpmi的孔和仅t细胞的孔也包括于设置中以评估每个细胞类型的内源性细胞凋亡基线。为了解决基于板的分析的边缘效应，仅96孔板的内侧行或列用于设置分析。边界的行和列填充有与内分析孔等体积的rpmi培养基。将分析板保持于37℃静态培育箱中过夜。
[0507]
通过离心将来自过夜培育的细胞粒化。将一百μl的分析上清液从每一分析孔中转移到新的96孔pcr管培养板中，且在稍后时间在-80℃下冷冻以用于细胞因子释放分析(参见实例7)。将细胞团粒用facs缓冲液、dpbs中的2％fbs洗涤一次，并且在上清液去除之前离心。分析板中的细胞团粒经受膜联蛋白v(annexin v)(早期细胞凋亡标记物)，随后进行检测和分析。使用百进生技公司市售的facs试剂盒，按照制造商建议的条件和程序，进行膜联蛋白v检测。
[0508]
分析板接着在具有用于gfp的bl-1通道和用于膜联蛋白v检测的rl-1通道的intellicyte ique筛选仪(赛多利斯(sartorius))仪器上进行facs分析。归因于gfp的组成性表达，在fsc-a(前向散射-面积)相对于bl1-h(高度)散布图上，rpmi gfp/fluc目标细胞可以与t细胞区分开，其中bl1-h高群为目标细胞，bl1-h低群为效应细胞。rpmi细胞在rl1-h(膜联蛋白v)相对于bl1-h散布图上进一步门控，其中rl1-h高群为膜联蛋白v高表达子集。目标细胞的杀伤％定义为在每一分析条件下膜联蛋白v高表达子集在rpmi的总细胞计数中的百分比。接着针对双特异性抗体或mab、亲本混合物或二级抗体浓度绘制rmpi的杀伤％(图29a和29b)。这些杀伤％相对于log[浓度]的标绘图的4参数非线性回归(4-pl)拟合的剂量依赖性曲线产生每一双特异性抗体或亲本mab混合物对照的ic50(参见下表6)。ic50定义为产生针对所定义实验条件的最大可观察作用的50％所需的生物药剂的浓度。cd38/cd3双特异性抗体以及亲本单克隆抗体混合物对照的4-pl拟合的剂量依赖性杀伤曲线呈现于图29a中，并且对应分子的ic50在以下表6中列出。
[0509]
表6：
[0510][0511]
双特异性抗体介导表达bcma的目标细胞的杀伤的能力以类似于上文所描述的体外方法的方式进行，所述方式具有以下修改：mm1.r用作目标细胞，使用三链非串联(kv4.33)bcma/cd3双特异性抗体，并且e/t比为10:1。类似于gfp/荧光素酶标记的rpmi-gfp/fluc转基因表达，对mm1.r细胞(atcc)进行遗传修饰以表达gfp和荧光素酶，用于使用逆转录病毒载体pmys-ires进行荧光和发光检测。bcma/cd3双特异性抗体和cd38/cd3taa对照以及亲本mab混合物对照的4-pl非线性拟合的剂量依赖性杀伤曲线呈现于图29b和29c中，以及对应分子的ic50在下表7中列出。两个独立操作伴随有不同的2亲本mab混合物对照，任一混合物对照具有抗bcma/抗cd3(c)或抗cd38/抗cd3(d)组合。
[0512]
表7：
[0513][0514]
图29a-c中的数据指示非串联双特异性抗体(kv4.33)在重定向t细胞介导的细胞毒性方面不太有效。还观察到kv4.33 cd38/cd3和kv4.33 bcma/cd3双特异性抗体中的抗原依赖性效力差异，其中后者在此作用中具有相对较低的功效。
[0515]
实例10：cd38靶向双特异性或mab介导的体外肿瘤细胞细胞毒性的供体反应特征分析：
[0516]
通过流式细胞测量术评估肿瘤细胞系的cd38表达水平。
[0517]
六个已知的cd38(+)肿瘤细胞系，亦即rpmi 8226(atcc，ccl-155)、mm.1r(atcc，crl-2975)、im-9(atcc，ccl-159)、raji(atcc，ccl-86)、daudi(atcc，ccl-213)和nci-h929(atcc，crl-9068)。rpmi 8226、mm.1r、im-9和raji细胞系通过用pmys-ires(具有gfp和萤火虫荧光素酶基因的逆转录病毒衍生的载体)转导以及针对具有内源性gfp和荧光素酶表达的稳定细胞系以用于荧光以及发光检测进行后续选择来标记。
[0518]
在cd38抗原染色的前一天，将6个细胞系中的每一者在细胞培养瓶中培养至亚汇合状态。将具有大于90％存活率的细胞滴定到1e+6/ml密度并且以50,000个细胞/孔接种于v底96孔板中。添加facs缓冲液(dpbs中的2％胎牛血清(fbs))以洗涤细胞并且在室温下在以500
×
g平缓离心3分钟之后抽吸上清液。将细胞团粒与抗cd38 apc-结合物(百进生技)在制造商建议的浓度下连同指定的未染色对照一起再悬浮于facs缓冲液中。将细胞在室温下在暗处培育20min。添加facs缓冲液以洗涤细胞并且如先前所描述在类似平缓离心之后抽吸上清液。细胞团粒在流式细胞测量术分析之前再悬浮于facs缓冲液中。
[0519]
流式细胞仪(intellicyte ique筛选仪，赛多利斯)设置有用于gfp的bl-1通道和用于cd38-apc检测的rl-1通道。cd38-apc未染色样品充当apc通道的补偿参考。接着使用关于所有事件的fsc-h(前向散射荧光高度)相对于ssc-h(侧向散射荧光高度)的散布图鉴别细胞。接着以fcs-h相对于fcs-a(面积)绘制细胞群以鉴别单峰。以荧光通道bl1-h相对于rl1-h进一步绘制单峰，并且导出每一肿瘤细胞系的rl1-h峰的几何平均值。使用graphpad prism软件将每个染色的细胞系的rl1-h峰上的几何平均值绘制为cd38表达水平的图示(图30a)。
[0520]
实例11：通过先前未刺激的人类pbmc进行的cd38/cd3双特异性或cd38 mab介导的肿瘤细胞杀伤：
[0521]
通过在固定e/t(效应细胞/目标细胞)比下，使等量的新分离的人类pbmc和每一cd38(+)肿瘤细胞系在37℃下在96孔板中经受一定浓度梯度的cd38/cd3双特异性抗体过夜，评估cd38/cd3双特异性抗体重定向初级人类t细胞以杀伤表达cd38的肿瘤细胞系的效率。为比较由cd38/cd3双特异性抗体介导的重定向t细胞细胞毒性(rtcc)与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)(nk细胞介导的cd38靶向商业mab药物darzalex依赖性肿瘤细胞杀伤现象)的效力，还同时使用相同浓度梯度的darzalex治疗类似的pbmc/cd38(+)肿瘤细胞混合物。第二天使用流式细胞测量术方法定量肿瘤细胞上的细胞凋亡标记物的存在。
[0522]
将新分离的人类pbmc在37℃静态培育箱中以2～5e+6个细胞/ml保持于补充有10％fbs和10ng/ml il-7的rpmi培养基中过夜。在细胞毒性分析设置之前，通过使用补偿式三色流式细胞测量术方法分别定量总cd3(+)t细胞计数中的cd4(+)和cd8(+)亚群的百分比来进行细胞毒性相对于辅助t细胞比率的分析。通过补偿式双色流式细胞测量术方法染色t细胞的cd3(+)和nk的cd56(+)，还对分离的pbmc中的nk细胞含量进行平行分析。cd4(+)/cd8(+)比以及以每个供体的总pbmc的百分比计的cd56(+)呈现于图30b中。
[0523]
在分析设置的当天，将新分离的pbmc以及表达gfp和表征cd38抗原水平的存活率》90％的肿瘤细胞各自用rpmi培养基洗涤一次，并且密度经调节以在每一分析中达到10:1的e/t比，除了raji细胞系使用40:1比率，其中每一数据点具有大约15,000个目标细胞。在rpmi培养基中制备kv5.1抗cd38/cd3双特异性抗体分子或抗cd38 mab darzalex的连续1:3或1:4稀释液并且将其添加到每个96孔板中的e/t细胞混合物中。一系列目标细胞孔和仅t细胞的孔还设置为仅二级抗原和无双特异性抗体对照。还包括仅肿瘤细胞的孔和仅pbmc的孔，以评估每个细胞类型的内源性细胞凋亡基线。为了解决基于板的分析的边缘效应，仅96孔板的内侧行或列用于设置分析。边界的行和列填充有与内分析孔等体积的rpmi培养基。接着将分析板保持于37℃静态培育箱中过夜。
[0524]
通过离心将来自过夜培育的细胞粒化。将细胞团粒用facs缓冲液洗涤一次，并且在上清液去除之前离心。接着使每一分析板中的细胞团粒经受膜联蛋白v(早期细胞凋亡标记物)、检测和分析。使用百进生技公司市售的facs试剂盒，按照制造商建议的条件和程序，进行膜联蛋白v检测。
[0525]
分析板接着在具有用于gfp的bl-1通道和用于膜联蛋白v检测的rl-1通道的intellicyte ique筛选仪(赛多利斯)仪器上进行facs分析。归因于gfp的组成性表达，在fsc-a(前向散射-面积)相对于bl1-h散布图上，肿瘤目标细胞可以与效应细胞区分开，其中bl1-h高群体为目标细胞，bl1-h低群为效应细胞。gfp(+)肿瘤细胞在rl1-h(膜联蛋白v)相
对于bl1-h散布图上进一步门控，其中rl1-h高群为膜联蛋白v高表达子集。目标细胞的杀伤％定义为在每一分析条件下膜联蛋白v高表达子集在gfp高肿瘤细胞群的总细胞计数中的百分比。每一分析孔的杀伤％相对于kv5.1 cd38/cd3双特异性抗体或抗cd38 mab darzalex浓度梯度绘制。
[0526]
在graphpad prism中，5参数非线性回归(5-pl)拟合的剂量依赖性反应模型用于拟合这些杀伤％相对于log[浓度]的标绘图(图38c)。来自多个供体的pmbc相对于六种cd38(+)肿瘤细胞中的每一者进行了一式两份地描绘。用来自血库的至少6个随机健康供体的pbmc对每个肿瘤细胞系进行筛选，各自通过抗cd38/cd3双特异性抗体进行rtcc或通过抗cd38 mab darzalex进行adcc。每个供体在双特异性抗体或mab梯度中的肿瘤杀伤反应百分比与仅针对双特异性抗体或mab分子编码的线型一起绘制，而不区分个体供体。在图38c中，来自每个测试供体的细胞毒性t细胞或nk细胞对每个cd38(+)肿瘤细胞系的剂量依赖性杀伤绘制在同一组图中。在所有组图中，串联3链kv5.1 cd38/cd3双特异性抗体反应由灰色曲线(实线)表示并且darzalex的反应由虚线表示。图30c中示出的数据指示，kv5.1 cd38/cd3双特异性抗体在诱导由细胞毒性t细胞介导的cd38(+)肿瘤目标细胞死亡方面相较于darzalex通过nk细胞所进行，展现出更大效能。
[0527]
实例12：小鼠模型中的体内肿瘤杀伤
[0528]
将在cd38(+)多发性骨髓瘤(mm)或其它cd38(+)实体肿瘤异种移植小鼠模型中测试cd38/cd3串联(kv5.1)和非串联(kv4.33)双特异性抗体的肿瘤破坏活性。八周龄的雌性nsg小鼠将用于研究。来自atcc的cd38(+)mm或其它实体肿瘤细胞系将用荧光素酶和gfp基因的多顺反子表达盒进行病毒转染。从cd38(+)肿瘤细胞系转染子中选择使用稳定多顺反子荧光素酶和gfp表达的单一细胞克隆。将cd38(+)肿瘤-fluc细胞悬浮于pbs或其它适当的制剂缓冲液中，并且在双特异性抗体治疗前数周或数天，经静脉注射到每只nsg小鼠的尾静脉中，进行肿瘤摄取和异种移植建立，以评估针对现有肿瘤/已建立肿瘤的抗肿瘤疗效。基于来自ivis成像的生物发光，将排除具有极小或极大肿瘤负荷的动物。研究中选择的动物将随机分为不同的组。或者，在双特异性抗体治疗的同一天，可将cd38(+)肿瘤-fluc细胞悬浮液静脉注射到nsg小鼠，以评估其对侵袭性转移肿瘤的预防作用。
[0529]
在第0天，在肿瘤根除模型中，将来自单一健康供体的约1
×
10^6至1
×
10^7个先前未刺激的人类pbmc通过尾静脉注射至每个带有肿瘤的nsg中。在同一天，在肿瘤接种后，以与肿瘤根除模型中相同体积的pbs/制剂缓冲液经由对侧尾静脉或腹膜内施用pbs、对照抗cd38 mab、双特异性cd38/cd3 kv5.1或双特异性cd38/cd3 kv4.33的疗法。在预防性模型中，mm-fluc细胞悬浮液与先前未刺激的hpbmc混合并且通过一侧上的尾静脉经静脉内注射。如先前所描述，在肿瘤细胞/pbmc注射的同一天，双特异性抗体和对照治疗剂类似地通过对置尾静脉或腹膜内施用。单个剂量的双特异性抗体和对照治疗剂被施用，或多个剂量每周施用一次并且可持续至多4周直至肿瘤负荷达到对个体动物进行安乐死的监管标准。
[0530]
将通过在肿瘤细胞接种后每周测量每只小鼠背侧上的总光子通量并且在治疗过程期间每周持续测量来监测小鼠中的肿瘤生长。监测可以在最终疗法后持续至多4或5周。将在150mg/kg荧光素腹膜内施用后约10至20分钟拍摄图像。所有小鼠的体重将在测量肿瘤生物发光的同时进行监测和记录。在每次治疗前以及每次治疗后的第二天，经由尾静脉收集来自每只动物的血液样品。在施用最终剂量之后，其后每周收集血液样品。血液样品将经
由流式细胞测量术分析肿瘤丰度和细胞死亡标记物，以及效应细胞生物标记物，如活化、细胞毒性、增殖、活化诱导的细胞死亡和双特异性抗体对受体的占用。从血液样品中提取的血清还针对细胞因子释放、游离双特异性抗体和潜在双特异性抗体片段进行分析。
[0531]
双特异性抗体kv5.1和kv4.33 cd38/cd3的抗肿瘤功效主要以双特异性治疗组相对于对照mab、对照双特异性或仅pbmc治疗组的生存延长程度评估。来自治疗组和对照组的鼠类血液样品的效应细胞室中的生物标记物特征，如t细胞活化、t细胞增殖、t细胞分化、t细胞死亡作为对药物诱导和活化的反应，还可以证明双特异性抗体kv5.1和kv4.33cd38/cd3在以剂量和抗原(cd38)特异性方式重定向针对cd38(+)肿瘤细胞的人类t细胞方面的有效性。
[0532]
表8(对实例1-3的附录)：
[0533]
[0534]