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技术背景
健康的免疫系统是处于平衡的免疫系统。参与适应性免疫的细胞包括B淋巴细胞和T淋巴细胞。有两种一般类型的T淋巴细胞-效应T(Teff)细胞和调节性T(Treg)细胞。Teff细胞包括CD4+T辅助细胞和CD8+胞毒性T细胞。Teff细胞在抗原攻击后的细胞介导免疫中发挥核心作用。Teff细胞和其他免疫细胞的关键调节剂是Treg细胞，其防止过度免疫反应和自身免疫(参见，例如，Romano等,Front Imm.(2019)10,art.43)。
一些Treg在胸腺中生成；它们被称为天然Treg(nTreg)或胸腺Treg(tTreg)。其他Treg在遇到抗原后或在细胞培养中在外周生成，被称为诱导性Treg(iTreg)或适应性Treg。Treg主动控制其他免疫细胞的增殖和激活，包括诱导耐受性，通过涉及特定细胞表面受体的细胞间接触和抑制性细胞因子(例如IL-10、TGF-β和IL-35)的分泌(Dominguez-Villar和Hafler,Nat Immunol.(2018)19:665-673)。耐受性失败可以导致自身免疫和慢性炎症。Treg功能缺陷或Treg数量不足，或者Teff无反应或过度激活可以导致耐受性丧失(Sadlon等,Clin Transl Imm.(2018)7:e1011,doi:10-1002/cti2.1011)。
近年来，对使用Treg治疗疾病已经有很大兴趣。已经探索了许多方法，包括过继细胞疗法，来提高Treg的数量和功能以治疗自身免疫病。Treg转移(递送经激活和扩增的Treg群)已经在患有自身免疫病(例如I型糖尿病、皮肤红斑狼疮和克罗恩病)的患者中进行了测试(Dominguez-Villar，同上)。然而，这些细胞群本质上是多克隆的，并且因此可能不如预期的那样有效。还有证据表明，仅仅增加Treg的数量可能不足以控制疾病(McGovern等,Front Imm.(2017)8,art.1517)。
因此，仍然需要可以治疗与不想要的Teff细胞增殖和激活相关的疾病的有效细胞疗法。
技术实现要素：
本公开内容提供了在基因组的FOXP3基因座中包含异源序列的基因工程化哺乳动物细胞(例如，人细胞)，其中所述异源序列包含转基因，其中所述转基因在FOXP3基因座的FOXP3启动子的转录控制下；并且当所述启动子被激活时，所述细胞表达FOXP3和来自所述基因座的转基因的产物二者。
在另一方面，本公开内容提供了一种用于制造基因工程化哺乳动物细胞(例如，人细胞)的方法，包括使哺乳动物细胞与核酸构建体接触，所述核酸构建体包含(i)异源序列和(ii)位于所述异源序列侧翼的第一同源区域(HR)和第二HR，其中所述异源序列包含转基因，所述第一HR和所述第二HR分别与哺乳动物细胞中的FOXP3基因座的第一基因组区域(GR)和第二GR同源；在允许整合FOXP3基因座的所述第一GR与所述第二GR之间的异源序列的条件下培养细胞。在一些实施方案中，整合通过锌指核酸酶或切口酶(ZFN)、转录激活因子样效应结构域核酸酶或切口酶(TALEN)、大范围核酸酶、整合酶、重组酶、转座酶或CRISPR/Cas系统促进。在一些实施方案中，所述核酸构建体是慢病毒构建体、腺病毒构建体、腺相关病毒构建体、质粒、DNA构建体或RNA构建体。
在本公开内容的一些实施方案中，所述异源序列包含(i)紧邻所述转基因上游的内部核糖体进入位点(IRES)或(ii)紧邻所述转基因上游并且在其框内的自切割肽的编码序列。自切割肽可以是例如2A肽，其中所述2A肽任选地选自P2A肽、E2A肽、F2A肽和T2A肽。
在一些实施方案中，所述异源序列被插入到一个或更多个FOXP3外显子上游的FOXP3内含子(例如，内含子4、9或10)中，其中所述异源序列包含(i)编码一个或更多个FOXP3外显子的核苷酸序列和(ii)所述核苷酸序列上游的剪接受体以允许从所述基因座表达全长FOXP3 mRNA转录物，并且所述核苷酸序列是(a)紧邻IRES上游或(b)紧邻所述自切割肽的编码序列上游并且在其框内。
在一些实施方案中，所述转基因产物是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。所述CAR或TCR可以对(i)自身抗原、(ii)任选地选自CD19和CD20的B细胞抗原或(iii)同种异体HLA I类分子具有特异性，其中所述I类分子任选地是HLA-A2。在特定的实施方案中，所述转基因产物是对同种异体HLA-A2具有特异性的CAR，并且从N-末端到C-末端包含(i)含有重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的scFV，其中VH分别包含含有SEQ ID NO:1-3的HCDR1-3，并且VL包含含有SEQ ID NO:5-7的LCDR1-3，或者VH和VL分别包含SEQ ID NO:4和10；(ii)源自CD28、CD4或4-1BB的跨膜(TM)结构域和共刺激结构域；(iii)胞内CD3ζ信号传导序列。
在另一些实施方案中，所述转基因产物是细胞因子、趋化因子、生长因子或信号传导因子；或选自VP1、VP2或VP3的AAV衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述工程化细胞是淋巴样细胞(例如，Treg细胞)、淋巴样祖细胞、间充质干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞或胚胎干细胞。在优选的实施方案中，所述工程化细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞在选自以下的基因中包含无效突变：T细胞受体α或β链基因、II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)基因、与抗原加工相关的转运蛋白(例如，TAP-1或TAP-2)、HLA I类或II类基因、次要组织相容性抗原基因和β2-微球蛋白(B2M)基因。
在一些实施方案中，所述细胞包含自杀基因，所述自杀基因任选地选自HSV-TK基因、胞嘧啶脱氨酶基因、硝基还原酶基因、细胞色素P450基因或caspase-9基因。
在另一些方面，本公开内容提供一种用于治疗需要免疫抑制的患者的方法，包括向所述患者施用本发明的工程化细胞；所述细胞在制备治疗需要免疫抑制的患者的药物中的用途；以及用于治疗需要免疫抑制的患者的工程化细胞。在一些实施方案中，所述患者患有自身免疫病。在一些实施方案中，所述患者已经接受或将接受组织移植。在优选的实施方案中，所述患者是人。
附图说明
图1A-1D是分析从健康人志愿者中分离的Treg细胞的荧光激活细胞分选(FACS)图。
图2A是描绘了将嵌合抗原受体(CAR)编码序列整合到人FOXP3基因的内含子9中的基因组编辑方法的示意图。从引入的mRNA产生的锌指核酸酶(ZFN)在内含子9的特定位点(闪电(lightning bolt))产生双链断裂。通过腺相关病毒(AAV)6载体引入的供体序列从5’到3’包含：同源区域1、剪接受体(SA)、FOXP3外显子10-12的序列、自切割肽2A的编码序列、CAR编码序列和同源区域2。该同源区域是与位于ZFN切割位点侧翼的基因组区域同源。FOXP3外显子、2A编码序列和CAR编码序列彼此在框内。
图2B是描绘了将绿色荧光蛋白(GFP)编码序列整合到人FOXP3基因的内含子9中的相似基因组编辑方法的示意图。
图2C是示出了在图2B中所示的研究中通过MiSeq下一代测序评估的等位基因组修饰的水平的条形图。插入缺失(Indel)：插入/缺失。TI：靶向整合。模拟(Mock)：用载体处理的细胞。ZFN：用靶向FOXP3内含子9的ZFN的mRNA转染的细胞。供体：用图2B中所示的供体构建体转染的细胞。ZFN+供体：用ZFN mRNA和供体构建体转染的细胞。
图2D是示出了使用图2A和2B中所示的一般方案在FOXP3基因座的不同位点修饰的T细胞中通过MiSeq下一代测序评估的等位基因组修饰水平的表。对于每个靶向位点A、B、C、D、E或F，测试了三个T细胞样品：用ZFN和供体构建体处理的T细胞(第一行)，仅用供体构建体处理的T细胞(第二行)和用GFP mRNA处理的T细胞(第三行)。
图2E是总结了图2D中所示的数据的条形图，并且表明了靶向位点A、B、C、D、E和F的位置。
图3A-3C是分析图2C中评估的相同Treg的流式细胞术图。模拟：用载体处理的细胞。ZFN：用靶向FOXP3内含子9的ZFN的mRNA转染的细胞。SA-部分FOXP3-2A-GFP：用图2B中所示的供体构建体转染的细胞。ZFN+供体：用ZFN mRNA和供体构建体转染的细胞。
图4A-4C描绘了包含对人MHC I类分子HLA-A2具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)的基于AAV的供体构建体。图4A：具有抗HLA-A2 scFv；CD28铰链、跨膜(TM)和信号传导(共刺激)结构域；和CD3ζ信号传导结构域的HLA-A2 CAR的示意图(Boardman等,Am J Transpl.(2017)17:931-43)。图4B：CAR中HLA-A2 scFv的VH和VL氨基酸序列(分别地SEQ ID NO：95、4和10，按出现顺序)。Id.图4C：AAV供体构建体的示意图，其中HLA-A2scFv的VH和VL通过[G4S]3肽接头(SEQ ID NO：90)连接。SA：剪接受体。外显子10-12：FOXP3的外显子10-12。2A：2A自切割肽。hGMCSF sig：人GM-CSF信号肽。Myc：myc标签。TM：跨膜结构域。Co-stim：共刺激结构域。信号：信号传导结构域。ITR：AAV的反向终端重复。
图5A-5C是分析用相同ZFN和/或图4B和4C中所示的供体构建体编辑的Treg的流式细胞术图。
图6A-6C是分析用相同ZFN和/或图4B和4C中所示的相同供体构建体编辑的CD8+效应T细胞(Teff)的流式细胞术图。
图7A和7B是分析图5A-5C的Treg细胞中FOXP3+细胞的分数的流式细胞术图。图7A：未经编辑的细胞(仅用AAV供体构建体处理的细胞)。图7B：经编辑的细胞(用ZFN和AAV供体构建体处理的细胞)。“同种型”：与抗-FOXP3抗体(从未免疫动物中分离的IgG抗体混合物)具有相同同种型的对照抗体。
图8示出了人FOXP3基因的注释图。将位于每个ZFN切割位点侧翼的同源臂(HA)并入每个相应的AAV供体中以促进同源定向修复。内含子1(CNS1&TSDR)、内含子2(CNS2)和核心启动子区域内的调节位点也被注释。
发明详述
本公开内容提供了在内源性基因组FOXP3基因座中包含异源序列(例如，转基因)的基因工程化调节性T(Treg)细胞，其中该异源序列可以在FOXP3转录调控元件(例如FOXP3启动子)的控制下转录成RNA。高FOXP3表达水平是Treg细胞的特定表型。结果，该异源序列与FOXP3基因一起在Treg细胞中被主动转录，并且该异源序列仅在细胞保持其Treg、FOXP3+表型时表达。本公开内容还提供了用于制造和使用基因工程化Treg细胞的方法。
调节性T细胞保持免疫稳态并且赋予免疫耐受性。工程化Treg细胞可以是自体或同种异体的，可以用于基于细胞的疗法来治疗需要诱导免疫耐受性或恢复免疫稳态的患者，例如接受器官移植或同种异体细胞疗法的患者和患有自身免疫病的患者。目前的Treg细胞具有增强的免疫调节活性，包括改善的组织特异性(例如，通过在靶向组织中表达对抗原具有特异性的编入的受体)和/或增强的免疫抑制功能(例如，通过分泌编入的免疫调节分子)。Treg通过受体介导的细胞间接触和免疫抑制细胞因子(例如，IL-10、TGF-β和IL-35)的分泌，在局部和/或全身主动控制T效应细胞的增殖和激活。
由于移植的Treg可以增殖和自我更新，故本发明的细胞疗法可以实现对移植物的长期耐受和保护。参见，例如，Dawson等,JCI Insight.(2019)4(6):e123672，其全部内容通过引用并入本文。
Treg细胞还具有安全特征，即异源序列仅在Treg细胞保持其Treg表型时表达。一旦细胞失去FOXP3基因表达，异源序列不再被转录。
I.用于FOXP3基因组编辑的细胞
本公开内容的工程化细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞、来自农场动物(例如，牛、猪或马)的细胞和来自宠物(例如，猫或狗)的细胞。所述的基因组编辑可以在Treg细胞上进行，或者可以在不是Treg细胞但在基因组编辑后分化为Treg细胞的细胞上进行。Treg表型部分取决于主转录因子叉头盒P3(FOXP3)的表达，该FOXP3调控免疫抑制功能所必需的基因网络的表达。
如本文所用，术语“调节性T细胞”、“调节性T淋巴细胞”和Treg是指调节免疫系统、保持对自身抗原的耐受性并且通常抑制或下调T效应细胞的诱导和增殖的T细胞亚群。Treg通常由CD4+CD25+CD127loFOXP3+的表型标记。在一些实施方案中，Treg也是CD45RA+、CD62Lhi和/或GITR+。在特定的实施方案中，Treg由CD4+CD25+CD127loCD62L+或CD4+CD45RA+CD25hiCD127lo标记。如本文所用，Treg包括(i)在胸腺中发生的“天然”Treg；(ii)通过在胸腺外发生的分化过程(例如，在组织或次级淋巴器官中，或在于限定培养条件下的实验室环境中)产生的诱导性、适应性或外周Treg；(iii)已经使用重组DNA技术创造的Treg，包括基因组编辑和基因疗法。
1.用于基因组编辑的Treg细胞的分离
对其进行基因组编辑的Treg细胞可以从多种来源分离，包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织或脾组织。例如，可以使用众所周知的技术通过从受试者中收集的血液单位分离Treg，例如FicollTM分离、红细胞裂解和单核细胞耗竭后的通过PERCOLLTM梯度离心、逆流离心淘析、白细胞除去术和随后的基于细胞表面标志物的磁性或流式细胞术分离。
从分离的白细胞中进一步富集Treg细胞可以通过阳性和/或阴性选择与针对独特表面标志物的抗体组合使用技术(例如流式细胞术细胞分选和/或涉及缀合珠的磁性免疫粘附)来实现。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常可以包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。为了富集或阳性选择Treg，可以使用CD4、CD25、CD45RA、CD62L、GITR和/或CD127的抗体。
在示例性和非限制性的协议中，Treg细胞可以如下获得(参见Dawson等,JCI Insight.(2019)4(6):e123672)。通过RosetteSepTM(STEMCELL Technologies，15062)从人供体中分离CD4+T细胞，并且在使用AstriosTM(Beckman Coulter)或FACSAriaTMII(BD Biosciences)对活CD4+CD25hiCD127lo Treg或CD4+CD127loCD25hiCD45RA+Treg进行分选之前富集CD25+细胞(Miltenyi Biotec,130-092-983)。可以在具有1000U/ml IL-2(Proleukin)的ImmunoCultTM-XF T细胞扩增培养基(STEMCELL Technologies，10981)中用L细胞和抗-CD3单克隆抗体(例如，OKT3、UBC AbLab；100ng/ml)刺激分选的Treg，如MacDonald等,J Clin Invest.(2016)126(4):1413-24)中所述的。一天或更多天后，Treg细胞可以进行如下所述的基因组编辑。对于表型分析，可以用可固定的活力染料(FVD,Thermo Fisher Scientific,65-0865-14；BioLegend,423102)对细胞进行染色，并且对于表面标志物，在固定和透化之前，使用eBioscience FOXP3/转录因子染色缓冲液组(Thermo Fisher Scientific，00-5523-00)并且对细胞内蛋白质进行染色。在CytoFLEX(Beckman Coulter)上读取样品。
Treg也可以在体外源自T效应细胞，例如通过暴露于IL-10或TGF-β。
2.用于基因组编辑的非Treg细胞的分离
源细胞，即对其进行基因组编辑的细胞，也可以是多能干细胞(PSC)。PSC是能够在机体中产生任何细胞类型的细胞，包括例如胚胎干细胞(ESC)、通过体细胞核移植衍生的PSC和诱导PSC(iPSC)。关于将iPSC分化为T细胞，参见，例如Iriguchi和Kaneko Cancer Sci.(2019)110(1):16–22。如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指从早期胚胎中获得的多能干细胞；在一些实施方案中，该术语是指从先前建立的胚胎干细胞系中获得的ESC，并且不包括通过最近破坏人胚胎获得的干细胞。
在另一些实施方案中，用于基因组编辑的源细胞是多能细胞，例如造血干细胞(HSC，例如从骨髓或脐带血液中分离的那些)、造血祖细胞(例如，淋巴祖细胞)或间充质干细胞(MSC)。多能细胞能够发育成多于一种细胞类型，但是比多潜能细胞的细胞类型潜能更有限。多能细胞可以源自已建立的细胞系或从人骨髓或脐带中分离。作为示例，可以在G-CSF诱导的动员、普乐沙福诱导的动员或其组合之后从患者或健康供体中分离HSC。为了从血液或骨髓中分离HSC，血液或骨髓中的细胞可以被结合不需要的细胞的抗体筛选，例如CD4和CD8(T细胞)、CD45(B细胞)、GR-1(粒细胞)和Iad(分化的抗原呈递细胞)的抗体(参见，例如Inaba(1992)J Exp Med.176:1693-1702)。然后可以通过CD34的抗体阳性选择HSC。
在又另一些实施方案中，用于基因组编辑的源细胞是在基因组编辑后分化为Treg细胞的非Treg淋巴细胞。关于如何将T效应细胞分化为Treg细胞，参见上文。
经编辑的非Treg细胞可以在植入患者之前分化为Treg细胞，如上所述的。可替代地，可以在植入患者后诱导经编辑的非Treg细胞分化为Treg细胞。
3.另外的基因组编辑
可以在FOXP3基因组编辑之前或之后将本发明的工程化细胞进一步基因工程化，以使细胞更有效、更适用于更大的患者群体和/或更安全。
在一些实施方案中，本发明的经FOXP3编辑的细胞可以是患者的同种异体细胞。在这种情况下，可以将细胞基因工程化以减少宿主对这些细胞的排斥(排斥)和/或这些细胞对宿主的潜在攻击(移植物抗宿主疾病)。作为示例，细胞可以被工程化以具有以下一种或更多种的无效基因型：(i)T细胞受体(TCRα链或β链)；(ii)多态性主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类分子(例如，HLA-A、HLA-B或HLA-C；HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、或HLA-DR；或β2-微球蛋白(B2M))；(iii)与抗原加工相关的转运蛋白(例如，TAP-1或TAP-2)；(iv)II类MHC反式激活剂(CIITA)；(v)次要组织相容性抗原(MiHA；例如，HA-1/A2、HA-2、HA-3、HA-8、HB-1H或HB-1Y)；(vi)其任何组合。同种异体工程化细胞还可以表达不变的HLA或CD47，以保护工程化Treg细胞免受宿主排斥。这些进一步的遗传修饰可以通过本领域已知的基因编辑技术和本文所述的那些技术进行。
经进一步编辑的同种异体细胞特别有用，因为它们可以用于多个患者而没有相容性问题。因此，同种异体细胞可以被称为“通用的”并且可以“现成”使用。“通用的”细胞的使用大大提高了效率并且降低了采用细胞疗法的成本。
在一些实施方案中，本发明的经FOXP3编辑的工程化细胞被工程化以包含安全开关，例如自杀基因，如以下进一步讨论的。
4.Treg表型的保持
可塑性是几乎所有类型的免疫细胞固有的特性。看起来，在炎症和环境条件下Treg细胞能够转变(“慢慢变化”)为Teff细胞(Sadlon等,Clin Transl Imm.(2018)7(2):e1011)。为了在工程化Treg细胞中保持Treg表型和/或增加FOXP3和转基因的表达，可以在含有雷帕霉素和/或高浓度IL-2的组织培养基中培养细胞。参见，例如，MacDonald等,Clin Exp Immunol.(2019)doi:10.1111/cei.13297。
II.用于插入FOXP3基因座的转基因
本公开内容的工程化细胞包含整合在它们的内源性FOXP3基因座中的一个或两个中的异源序列。本文中术语“异源”是指将序列插入基因组中该序列不天然出现的位点。异源序列可以包含转基因并且可以包含来自基因组的另外序列，例如FOXP3序列(参见，例如，图2A和2B)。整合到FOXP3基因座中的转基因与FOXP3共表达，但是当细胞失去其Treg、FOXP3+表型时不再表达。转基因可以编码蛋白质，该蛋白质增强Treg细胞的治疗功效或提供单独的治疗益处。以下是可以由本公开内容的工程化Treg细胞表达的转基因的非限制性实例。
1.可溶性多肽
可用于本文的转基因的实例是编码细胞因子(例如，IL-10)、趋化因子(例如，CCR7)、生长因子(例如，用于治疗多发性硬化症的髓鞘再生因子)和信号传导因子(例如，双调蛋白)的那些。
2.抗原结合受体
可用于本文的转基因的另一些实例是编码目标T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)使得工程化Treg对目标抗原具有特异性的那些。
CAR是一种设计用于将表达它的T细胞靶向所需抗原的融合蛋白。在其最基本的形式中，CAR包含胞外抗原结合结构域和一系列定制的胞内TCR共刺激/信号传导结构域。一旦CAR与其抗原结合，它就激活表达它的细胞，像天然TCR一样。抗原特异性工程化Treg能够通过归巢到靶向组织(例如，移植物或自身免疫炎症部位)来增强免疫抑制。它们可以与对同种异体抗原(在移植的情况下)或自身抗原(在自身免疫病的情况下)具有特异性的Teff细胞相互作用。CAR的优势在于，与天然TCR不同，它们无需与其他共刺激分子相互作用或参与MHC I类或II类分子即可与抗原结合，从而在更广泛的环境中提供功能。
在某些情况下，Treg可以功能性地转换为效应器样T细胞(Sadlon，同上)。由于工程化CAR或TCR Treg的抗原特异性克隆性，功能性转换为效应器样状态可能引起意外的细胞毒性，导致恶化的病理。本发明的工程化Treg避免了该潜在问题，因为CAR或TCR仅在T细胞保持其Treg(FOXP3+)表型时表达。
A.CAR的抗原结合结构域
CAR的抗原结合结构域可以包含抗体片段，例如scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域或骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施方案中，CAR对多态性同种异体MHC分子具有特异性，例如通过实体器官移植中的细胞或通过基于细胞的疗法(例如，骨髓移植、癌症CAR T疗法、或基于细胞的再生疗法)中的细胞表达的MHC分子。如此靶向的MHC分子包括但不限于HLA-A、HLA-B或HLA-C；HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ或HLA-DR。作为示例，CAR靶向I类分子HLA-A2。HLA-A2是移植中常见的错配组织相容性抗原。HLA-A错配与移植后不良结果相关。表达对MHC I类分子具有特异性的CAR的工程化Treg是有利的，因为MHC I类分子在所有组织中广泛表达，因此无论移植的组织类型，Treg可用于器官移植。针对HLA-A2的CAR提供了另外的优势，HLA-A2由相当大比例的人群表达，因此在许多供体器官上表达。有证据表明，Treg细胞中HLA-A2 CAR的表达可以增强Treg细胞预防移植排斥的功效(参见，例如，Boardman，同上；MacDonald等,J Clin Invest.(2016)126(4):1413-24；和Dawson，同上)。
在一些实施方案中，CAR对自身抗原具有特异性，即在机体的特定组织的自身免疫炎症部位普遍或独特表达的内源性抗原。表达此种CAR的Treg可以归巢到发炎组织，并且通过引起局部免疫抑制发挥组织特异性活性。自身抗原的实例是水通道蛋白水通道(例如，水通道蛋白4水通道)、副肿瘤抗原Ma2、双载蛋白、电压门控钾通道、N-甲基-d-天冬氨酸受体(NMDAR)、a-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体(AMPAR)、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、抗-N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR1亚基)、Rh血型抗原、桥粒素1或3(Dsgl/3)、BP180、BP230、乙酰胆碱烟碱型突触后受体、促甲状腺激素受体、血小板整合素、糖蛋白IIb/IIIa、钙蛋白酶抑制素、瓜氨酸蛋白、α-β-晶状体球蛋白、胃壁细胞内因子、磷脂酶A2受体1(PLA2R1)和含凝血酶致敏蛋白1型结构域的7A(THSD7A)。自身抗原的另外实例是多发性硬化症相关抗原(例如，髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂蛋白(PLP)、少突胶质细胞髓鞘寡蛋白(OMGP)、髓鞘细胞相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP/Claudin 11)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、髓鞘相关神经突生长抑制剂NOGO A、糖蛋白Po、外周髓鞘蛋白22(PMP22)、2’3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNPase)及其片段)；关节相关抗原(例如，经瓜氨酸取代的环状和线性聚丝蛋白肽、II型胶原蛋白肽、人软骨糖蛋白39肽、角蛋白、波形蛋白、纤维蛋白原和I、III、IV和V型胶原蛋白肽)；和眼相关抗原(例如，视网膜抑制蛋白、S-抑制蛋白、光感受器间视黄醇结合蛋白、β-晶状体蛋白B1、视网膜蛋白、脉络膜蛋白及其片段)。
在一些实施方案中，由Treg细胞靶向的自身抗原是IL23-R(用于治疗例如克罗恩病、炎症性肠病或类风湿性关节炎)、MOG(用于治疗多发性硬化症)或MBP(用于治疗多发性硬化症)。
在一些实施方案中，编辑到FOXP3基因座中的TCR或CAR可以靶向其他目标抗原(例如，B细胞标志物CD19和CD20)。另外，不是使用两个单独的CAR构建体，CAR转基因本身可以编码能够识别例如CD19和CD20的双特异性CAR(Zah等,Cancer Immunol Res.(2016)4(6):498-508)。
B.CAR共刺激和刺激/激活结构域
CAR可以包含来自一种或更多种免疫细胞表面分子的一种或更多种跨膜和胞内共刺激和激活结构域。共刺激信号传导结构域可以是T细胞上共刺激分子的跨膜和/或细胞内部分。T细胞上的共刺激分子与抗原呈递细胞上的配体结合，和TCR与抗原呈递细胞上的抗原结合合作，并且允许抗原结合的T细胞的激活(例如，细胞因子的增殖和分泌)。共刺激分子可以代表以下蛋白质家族：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活NK细胞受体。用于构建CAR的共刺激结构域是众所周知的，包括但不限于CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD28、CD137(4-1BB)、TNFR2和诱导型T细胞共刺激剂(ICOS)的跨膜和/或细胞内序列。还参见，例如，Chen和Flies,Nat Rev Immunol.(2013)13(4):227-42。
CAR的激活结构域可以源自CD3-ζ或CD3-ε。CD3-ζ链可以具有作为GenBank Acc.No.BAG36664.1提供的蛋白质序列，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。CD3-ζ激活或刺激结构域包括来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能衍生物，它们足以在功能上传递T细胞激活所需的初始信号。在一个实施方案中，ζ的细胞质结构域包含GenBank Acc.No.BAG36664.1的52至164位残基或来自非人物种的等效残基。
3.其他转基因
插入FOXP3基因座中的转基因可以编码其他目标蛋白质。例如，转基因可以编码使患者适应其他疗法(例如基因疗法)的蛋白质。作为示例，在遗传疾病(例如血友病)的基因疗法中重复施用重组AAV可能引发患者的抗-AAV免疫反应，从长远来看，使疗法效果降低。因此，可能需要向接受AAV基因疗法的患者引入工程化Treg，该工程化Treg表达针对AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2和/或VP3)的抗原特异性受体(例如，CAR或TCR)，以诱导患者对这些蛋白质的免疫耐受性。
表位标签的编码序列可以被包含作为转基因的部分以允许监测基因编辑。表位标签包括例如FLAG的一个或更多个拷贝、His标签、myc标签、Tap标签、HA标签、低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)和/或其作为标签的抗体结合结构域、或任何其他可易于检测的氨基酸序列。
4.表面表达的信号序列
在一些实施方案中，转基因包含信号或前导肽的编码序列以促进转基因的表面表达。例如，信号序列可以是源自人GM-CSF或CD8信号序列的信号序列。
III.携带转基因的构建体
用于将异源序列靶向整合到特定基因组位点中的任何基因编辑方法可用于将本文所述的异源序列引入FOXP3基因座中。为了使转基因在FOXP3转录调控元件(例如，FOXP3启动子)下共表达，尽管异源序列整合到FOXP3基因组基因座中，携带转基因的异源序列可以包含允许完整FOXP3转录物不受干扰地转录的元件。
在一些实施方案中，异源序列被整合到FOXP3内含子中，即至少一个FOXP3外显子的上游。在此类实施方案中，异源序列可以从5’到3’包含剪接受体(SA)序列、异源序列靶位点下游的外显子、自切割肽的编码序列和转基因。一旦整合，SA允许表达编码完整(即全长)FOXP3多肽、自切割肽和转基因产物的RNA转录物。由于中间肽序列的自切割性质，该RNA转录物的翻译产生两种独立的多肽产物——完整的FOXP3多肽和转基因产物。SA序列的实例是FOXP3外显子的那些和本领域已知的其他SA序列。自切割肽的实例是2A肽，它是病毒衍生的肽，典型长度为18-22个氨基酸。2A肽包括T2A、P2A、E2A和F2A。例如，P2A是19个氨基酸的肽；切割后，P2A的几个氨基酸残基留在上游基因上，并且脯氨酸留在第二基因的开头。
在另一些实施方案中，代替自切割肽的编码序列，异源序列可以在FOXP3外显子的编码序列与转基因之间携带内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列类似地允许表达两种独立的多肽产物——完整的FOXP3多肽和转基因产物。
在另一些实施方案中，异源序列在FOXP3基因座的外显子12中的终止密码子之前被整合到更下游。在那些实施方案中，异源序列可以在转基因的5’携带自切割肽的编码序列(如上所述)，而无需携带任何FOXP3外显子的序列。自切割肽允许与转基因产物平行表达FOXP3多肽。
在又另一些实施方案中，异源序列被整合到FOXP3外显子中。在那些实施方案中，异源序列携带整合位点下游的FOXP3外显子序列的编码序列，包括被破坏的外显子的剩余下游序列，使得仍然可以从工程化基因组基因座生成FOXP3转录物。同样在那些实施方案中，异源序列可能不需要包含SA，而FOXP3序列和转基因序列可以由如上所述的自切割肽或IRES的编码序列分开。
另外的元件可以包含在异源序列中。例如，为了允许转录终止，转基因可包括聚腺苷酸化(polyA)位点，例如SV40 polyA位点。异源序列还可包含RNA稳定元件，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
在一些实施方案中，异源序列还可以包含不变HLA或CD47的编码序列，以促进工程化Treg细胞(尤其是具有I类HLA敲除或敲低的那些)对宿主的自然杀伤和其他参与抗移植排斥的免疫细胞的耐受性。HLA或CD47编码序列可以通过自切割肽的编码序列与异源序列中的初级转基因连接，使得FOXP3基因座可以共表达FOXP3、转基因产物和不变HLA或CD47。
为了提高转基因位点特异性整合的精确度，携带异源序列的构建体可以在其一端或两端包含与靶基因组位点同源的同源区域。在一些实施方案中，异源序列在5’和3’端区域都携带与靶向基因组位点(例如FOXP3基因的内含子4、内含子9或内含子10内的位点)同源的序列。参见，例如图2A、2B和8。异源序列上的同源区域的长度可以为例如50-1,000个碱基对。异源序列中的同源区域可以但不必与靶向基因组序列相同。例如，异源序列中的同源区域可以与靶向基因组序列(例如，被异源序列中的同源区域替换的序列)80％或更多(例如，85％或更多、90％或更多、95％或更多、99％或更多)同源或相同。在另外的实施方案中，构建体在线性化时在一端包含同源区域1，在其另一端包含同源区域2，其中同源区域1和2分别与位于基因组的整合位点侧翼的基因组区域1和基因组区域2同源。
FOXP3基因座的基因组结构示于图2A和8。人FOXP3基因的基因序列和外显子/内含子边界可以在Genbank ID 50943中找到。整合的靶向位点可以在内含子(例如，内含子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)中，在FOXP3基因的最后外显子下游的区域，在外显子(例如，外显子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)中，或在内含子与其相邻外显子之间的连接处。
携带异源序列的构建体可以通过任何已知技术引入靶细胞，例如化学方法(例如，磷酸钙转染和脂质转染)、非化学方法(例如，电穿孔和细胞挤压)、基于粒子的方法(例如，磁转染)和病毒转导(例如，通过使用病毒载体，例如牛痘载体、腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体和杂交病毒载体)。在一些实施方案中，构建体是AAV病毒载体并且通过其基因组包含构建体的重组AAV病毒粒子引入靶人细胞，包括在两端具有AAV反向末端重复(ITR)序列以允许在产生系统(例如昆虫细胞/杆状病毒产生系统或哺乳动物细胞产生系统)中产生AAV病粒子。参见，例如，图4。AAV可以是任何血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV8.2、AAV9或AAVrh10，可以是假型，例如AAV2/8、AAV2/5或AAV2/6。
异源序列可以通过任何位点特异性基因敲入技术整合到FOXP3基因组基因座中。此类技术包括但不限于同源重组；基于锌指核酸酶或切口酶(本文统称为“ZFN”)、转录激活因子样效应核酸酶或切口酶(本文统称为“TALEN”)、成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR，例如使用Cas9或cpf1的那些)、大范围核酸酶、整合酶、重组酶和转座酶(transpose)的基因编辑技术。如以下工作实施例中所示，对于位点特异性基因编辑，编辑核酸酶通常在靶向基因组序列中产生DNA断裂(例如，单链或双链DNA断裂)，使得与靶向基因组序列具有同源性的供体多核苷酸(例如，本文所述的构建体)用作DNA断裂修复的模板，导致将供体多核苷酸引入基因组位点中。
基因编辑技术是本领域众所周知的。关于CRISPR基因编辑技术，参见，例如美国专利8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,865,406、8,871,445、8,889,356、8,895,308、8,906,616、8,932,814、8,945,839、8,993,233、8,999,641、9,790,490、10,000,772、10,113,167和10,113,167。关于用于ZFN技术及其在编辑T细胞和干细胞中的应用，参见，例如美国专利8,735,153、8,771,985、8,772,008、8,772,453、8,921,112、8,936,936、8,945,868、8,956,828、9,234,187、9,234,188、9,238,803、9,394,545、9,428,756、9,567,609、9,597,357、9,616,090、9,717,759、9,757,420、9,765,360、9,834,787、9,957,526、10,072,062、10,081,661、10,117,899、10,155,011和10,260,062。上述专利的公开内容通过引用整体并入本文。
在基因编辑技术中，可以通过改变复合物的DNA结合特异性来定制基因编辑复合物以靶向特定基因组位点。例如，在CRISPR技术中，指导RNA序列可以设计成结合特定基因组区域；并且在ZFN技术中，ZFN的锌指蛋白结构域可以设计成具有对特定基因组区域具有特异性的锌指，使得ZFN的核酸酶或切口酶结构域可以以位点特异性方式切割基因组DNA。参见工作实施例中的进一步描述。根据所需的基因组靶位点，可以相应地设计基因编辑复合物。关于人FOXP3基因的序列和结构，参见，例如GenBank ID 50943。
基因编辑复合物的组分可以通过众所周知的方法，与转基因构建体同时或按顺序，递送到靶细胞中，例如电穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、脂质纳米颗粒、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA或mRNA以及人工病毒粒子。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声孔效应也可用于递送核酸。在特定的实施方案中，基因编辑复合物的一种或更多种组分，包括核酸酶或切口酶，作为mRNA递送到待编辑的细胞中。
IV.工程化细胞中的安全开关
在细胞疗法中，可能期望，移植的细胞在它们的基因组中包含“安全开关”，使得当不再需要它们存在于患者中时可以停止细胞的增殖。安全开关可以是例如自杀基因，其在向患者施用药物化合物后被激活或失活，使得细胞进入细胞凋亡。自杀基因可以编码在人中未发现的在人体细胞中将无害物质转化为有毒代谢物的酶(例如，细菌或病毒酶)。自杀基因的实例包括但不限于胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、细胞内抗体、端粒酶、半胱天冬酶和DNA酶的基因。参见，例如Zarogoulidis等,J Genet Syndr Gene Ther.(2013)doi:10.4172/2157-7412.1000139。在一些实施方案中，自杀基因可以是来自单纯疱疹病毒(HSV)的胸苷激酶(TK)基因。可以通过向患者施用更昔洛韦、缬更昔洛韦、法昔洛韦等开启HSV-TK基因以杀伤细胞。
安全开关还可以是“开启”或“加速器”开关；编码小干扰RNA、shRNA或干扰对细胞存活至关重要的细胞蛋白质表达的反义链(antisense)的基因。
安全开关可以利用任何合适的哺乳动物和其他必要的转录调控序列。可以使用本文所述的基因编辑技术或本领域已知的其他技术通过随机整合或位点特异性整合将安全开关引入细胞中。可能需要将安全开关整合到基因组安全港中，使得保持工程化细胞的遗传稳定性和临床安全性。安全港的实例是AAVS1基因座；ROSA26基因座；CLYBL基因座；白蛋白的基因位点，CCR5和CXCR4；以及工程化细胞中内源基因被敲除的基因座(例如，T细胞受体α或β链基因座、HLA基因座、CIITA基因座或β2-微球蛋白基因座)。
V.工程化Treg细胞的使用
本公开内容的基因工程化Treg细胞可用于细胞疗法以治疗需要诱导免疫耐受性或恢复免疫稳态的患者(例如，人患者)。术语“治疗(“treating”和“treatment”)”是指治疗病症的一种或更多种症状的缓解或消除、症状的发生或复发的预防、组织损伤的逆转或补救、和/或疾病进展的减缓。
本文中的患者可以是患有不期望的炎性病症(例如自身免疫病)或具有患有不期望的炎性病症(例如自身免疫病)的风险的患者。自身免疫病的实例是爱迪生病、AIDS、强直性脊柱炎、抗肾小球基底膜疾病、自身免疫性肝炎、皮炎、古德帕斯丘综合征、肉芽肿性血管炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜(HSP)、幼年关节炎、幼年肌炎、川崎病、炎性肠疾病(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、多肌炎、肺泡蛋白沉积、多发性硬化症、重症肌无力、视神经脊髓炎、PANDAS、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、干燥综合征、系统性硬皮病、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、血小板减少性紫癜(TTP)、I型糖尿病、葡萄膜炎、血管炎、白癫风和Vogt-小柳-原田病。
在一些实施方案中，Treg被基因工程化以从FOXP3基因座表达靶向与自身免疫疾病相关的自身抗原的CAR，例如髓鞘脂少突胶质细胞糖蛋白(多发性硬化症)、髓鞘脂蛋白零(自身免疫性周围神经病变)、HIV env或gag蛋白(AIDS)、髓鞘脂碱性蛋白(多发性硬化症)、CD37(系统性红斑狼疮)、CD20(B细胞介导的自身免疫病)和IL-23R(炎性肠疾病，例如克罗恩病或溃疡性结肠炎)。
本文中的患者可以是需要同种异体移植的患者，例如同种异体组织或实体器官移植或同种异体细胞疗法。本公开内容的Treg，例如表达靶向一种或更多种同种异体MHC I类或II类分子的CAR的那些，可以被引入患者中，其中Treg归巢于移植物并且抑制由宿主免疫系统引起的同种异体移植物排斥和/或移植物抗宿主排斥。需要组织或器官移植或同种异体细胞疗法的患者包括需要例如肾移植、心脏移植、肝移植、胰腺移植、肠移植、静脉移植、骨髓移植和皮肤移植的那些；需要再生细胞疗法的那些；需要基因疗法(基于AAV的基因治疗)的那些；以及需要癌症CAR T疗法的那些。
如果需要，接受本文中的工程化Treg的患者(其包括接受在体内分化为Treg的工程化多能或专能细胞的患者)在引入细胞移植物之前用温和的清髓性程序或用剧烈的清髓性调理方案治疗。
本公开内容的FOXP3工程化细胞可以在包含细胞和药学上可接受的载体的药物组合物中提供。例如，药物组合物包含无菌水、生理盐水或中性缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)、盐类、抗生素、等渗剂和其他赋形剂(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇；蛋白质(例如，人血清白蛋白)；氨基酸(例如，甘氨酸和精氨酸)；抗氧化剂(例如，谷胱甘肽)；螯合剂(例如，EDTA)；和防腐剂)。药物组合物可以另外地包含支持Treg表型和生长的因子(例如，IL-2和雷帕霉素或其衍生物)、抗炎细胞因子(例如，IL-10、TGF-β和IL-35)和其他用于细胞疗法的细胞(例如，用于癌症疗法的CAR T效应细胞或用于再生疗法的细胞)。为了储存和运输，细胞可以任选地冷冻保存。在使用之前，细胞可以解冻并在药学上可接受的载体中稀释。
本公开内容的药物组合物通过全身施用(例如，通过静脉注射或输注)或局部注射或输注到目标组织(例如，通过肝动脉输注和注射到大脑、心脏或肌肉)以治疗有效量施用到患者。术语“治疗有效量”是指当施用到患者时足以实现治疗的药物组合物的量或细胞的数量。
在一些实施方案中，药物组合物的单个剂量单位包含多于104个细胞(例如，约105至约106个细胞、约106至约1010、约106至107、约106至108、约107至108、约107至109、或约108至109个细胞)。在某些实施方案中，组合物的单个剂量单位包含约106、约107、约108、约109、或约1010个或更多个细胞。可以每两天一次、每三天一次、每四天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或以在患者中建立足够数量的工程化Treg细胞所需的其他频率向患者施用药物组合物。
还提供了包含如本文所述的任何锌指核酸酶或其他核酸酶和多核苷酸的药物组合物。
除非本文另有定义，否则与本公开内容结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。示例性的方法和材料在下面描述，尽管与本文描述的那些相似或等效的方法和材料也可用于本公开内容的实践或测试中。在冲突的情况下，本说明书，包括定义，将控制。通常，与本文所述的心脏病学、医学、药物和药物化学以及细胞生物学结合使用的术语和技术是本领域众所周知的和常用的。酶促反应和纯化技术按照制造商的说明书进行，如本领域中通常完成的或如本文所述的。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数形式，并且复数术语应包括单数形式。贯穿本说明书和实施方案，词语“有/具有(have)”和“包含/包括(comprise)”或变型例如“有/具有(has)”、“有/具有(having)”、“包含/包括(comprises)”或“包含/包括(comprising)”理解为暗示包含所述的整数或整数组，但是不排除任何其他整数或整数组。本文中提及的所有出版物和其他参考文献通过引用整体并入。尽管本文中引用了许多文件，但是该引用不构成承认这些文件中的任一个构成本领域公知常识的一部分。如本文所用，应用于一个或更多个目标值的术语“大约”或“约”是指与所述的参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或从上下文中明显看出，否则该术语是指在任一方向(大于或小于)上落入所述参考值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的值范围。
为了更好地理解本发明，给出以下实施例。这些实施例仅用于说明的目的并且不应认为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：FOXP3特异性核酸酶的设计
构建FOXP3特异性ZFN以能够在人FOXP3基因中位点特异性地引入双链断裂。ZFN基本上如以下中所述的进行设计：Urnov等,Nature(2005)435(7042):646-651；Lombardo等,Nat Biotechnol.(2007)25(11):1298-306；美国专利公开号2008/0131962、2015/016495、2014/0120622和2014/0301990；和美国专利号8,956,828。ZFN对靶向FOXP3基因中的内含子4、9或10(图2B和2D)。示例性的ZFN对的识别螺旋的氨基酸序列示于下表1中。每个ZFN DNA结合结构域的靶向基因组序列示于下表2中。基因组中的由锌指蛋白(ZFP)识别螺旋靶向的核苷酸以大写字母表示；非靶向核苷酸以小写字母表示。还示出了用于连接FokI核酸酶结构域和ZFP DNA结合结构域的接头(参见，例如，美国专利公开号2015/0132269)。例如，结构域接头L0的氨基酸序列是DNA结合结构域-QLVKS-FokI核酸酶结构域(SEQ ID NO：7)。类似地，结构域接头N7a的氨基酸序列是FokI核酸酶结构域-SGTPHEVGVYTL-DNA结合结构域(SEQ ID NO：8)，并且N6a是FokI核酸酶结构域-SGAQGSTLDF-DNA结合结构域(SEQ ID NO：9)。此外，表达构建体可以包含WPRE序列和牛生长激素polyA序列。
表1人FOXP3锌指设计
Int.：内含子
表2人FOXP3锌指的靶序列
*SBS：Sangamo Biosciences序列。
测试了所有ZFN，并且发现它们结合到其靶位点并且发现作为核酸酶具有活性。插入缺失和靶向整合(TI)效率通过MiSeq下一代测序进行定量。靶向内含子4、9和10内每个位点的ZFN产生高总水平的基因组修饰，而内含子9(位点A)产生最高的TI效率(预期结果)(图2D和2E)。因此，这些ZFN可用于在人FOXP3基因内进行遗传修饰(例如，插入和/或缺失)，例如，在SEQ ID NO:76-89的任一种中所示的靶位点、在具有这些序列之一的12-25个核苷酸的靶位点、在这些基因序列的1-50(例如，1到10)个碱基对内的位点和/或在配对的靶位点之间。
本文使用的ZFN还可以包括ZFP和/或FokI结构域的磷酸接触残基的一个或更多个突变，例如，nR-5Qabc突变体(对ZFP骨架)和/或R416S和/或K525S突变体(FokI)，如美国专利公开号2018/0087072中所述的。还可以使用靶向上述靶位点的TALE核酸酶和CRISPR/Cas系统。当与一个或更多个调控结构域相关时，识别这些靶位点的ZFP、TALE和sRNA DNA结合结构域也被配制成活性工程化转录因子。调控结构域可以包括转录激活因子或抑制因子、重组酶、整合酶、核酸酶和切口酶。
实施例2：体外ZFN核酸酶活性
测试了表1中所述的ZFN在K562细胞中的核酸酶活性。K562细胞是从美国典型培养物保藏中心获得的，并且按照推荐在补充有10％合格胎牛血清(FBS，Cyclone)的RPMI培养基(Invitrogen)中培养。
为了测试DNA切割活性，将编码人FOXP3特异性ZFN对的mRNA转染到K562细胞(SBS75606/SBS75609(靶向内含子9)、SBS75893/SBS75895(靶向内含子10)、SBS75591/SBS75592(靶向内含子9)和SBS75714/SBS75715(靶向内含子10)中。对于mRNA生成，ZFN的开放阅读框被克隆到表达载体中，该表达载体针对产生带有5’和3’UTR的mRNA和合成polyA信号进行优化。表达载体是基于pVAX的载体，其包含T7启动子、ZFN编码序列和用于在体外转录反应后酶促添加polyA尾的polyA基序；或基于pGEM的载体，其包含T7启动子、5’UTR、ZFN编码序列、3’UTR和64bp polyA序列段(SEQ ID NO:93)；或PCR扩增子，其包含T7启动子、5’UTR、ZFN编码序列、3’UTR和60bp polyA序列段(SEQ ID NO:94)。按照制造商的说明书，使用mMessage mMachineTM T7 Ultra试剂盒(Ambion)从表达载体生成mRNA。
对于转染，将一百万个K562细胞与15μg/mL或3.75μg/mL的每种ZFN编码mRNA混合物混合。使用程序T-16在Amaxa Nucleofector TM IITM中进行转染。将经转染的细胞回收到1.4mL温热的RPMI培养基+10％FBS中。转染后三天，根据标准协议通过深度测序(MiSeq，Illumina)评估核酸酶活性。结果示于下表3中。
表3锌指核酸酶活性
*插入缺失：插入和/或缺失。
以上数据表明本文所述的ZFN核酸酶是有活性的并且在靶位点诱导切割和基因组修饰。
实施例3：调节性T细胞和效应T细胞的纯化
Treg是从40岁以下不吸烟的男性供体获得的新鲜白细胞去除术产品(Leukopak)(Stem Cell Technologies，加拿大)中分离的。在除去(delivery)的同一天，将Leukopak在补充有2％人血清白蛋白(Octapharma，美国)的缓冲液(Miltenyi，德国)中清洗一次。然后按照制造商的说明书，使用EasySepTM人CD4+CD127lowCD25+调节性T细胞分离试剂盒(Stem Cell Technologies，加拿大)处理细胞以进行Treg分离。
使用相同的分离试剂盒从Leukopak的非Treg级分中分离CD4+CD25-应答T(Tresponder)细胞。按照制造商的说明书，使用EasySepTM人CD8阳性选择试剂盒II(StemCell Technologies，加拿大)从Leukopak的一部分中分离供体匹配的CD8+ Teff。通过流式细胞术评估Treg、Tresponder和Teff的纯度。然后将细胞冷冻在CS10(BioLife Solutions，美国)中并且储存在液氮中。
在纯化和修饰后使用对以下抗原具有特异性的抗体评估Treg、Teff、Tresponder表型：CD4、CD25、CD127、CD69和FOXP3。包括可固定的活力染料以排除死亡或垂死的细胞。细胞表面染色后，使用eBioscience FOXP3/转录因子染色缓冲液组(Thermofisher，美国)进行FOXP3细胞内染色。通过CD8染色评估CD8+ Teff纯度。应答是CD4+CD25-。
图1A示出了细胞群是87.8％淋巴细胞。图1B示出了93.6％的淋巴细胞是CD4+CD25+。图1C示出了在CD4+CD25+细胞中，仅0.25％是CD127+，而图1D示出了在CD4+CD25+CD127-细胞中，90.4％是FOXP3+。该表型CD4+CD25+CD127-FOXP3+是Treg细胞的特征。高水平的CD4+CD25+CD127-FOXP3+细胞表明高度纯化的Treg细胞群。
实施例4：GFP转基因和HLA-A2 CAR在分离的Treg和CD8+Teff中的靶向整合
如实施例1中所述的，将靶向人FOXP3基因座的外显子9和10之间的内含子区域的ZFN mRNA(SBS75591/SBS75592对)工程化。编码5’剪接受体的AAV6载体、涵盖外显子10-12的部分FOXP3 cDNA、2A自切割肽的编码序列以及绿色荧光蛋白(GFP；图2B)或抗HLA-A2 CAR(Boardman等，同上；图5)的编码序列通过标准克隆技术生成。
HLA-A2 CAR构建体示于图2A和4A-C中。CAR的抗原识别结构域是scFv，其包含来自3PB2的重链可变结构域(VH)和来自DPK1的轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL通过肽接头序列[G4S]3(SEQ ID NO：90)连接。HLA-A2 CAR构建体包含编码hGMCSF表面表达信号序列、scFv、Myc标签、CD28跨膜(TM)结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导序列的序列(SEQ ID NO：91)。
使用前，将Treg解冻并且在补充有10％人AB血清(Valley Biomedical)和1000U/mL重组人IL-2(CTS Thermofisher，美国)的RPMI中培养两天。在操作之前，在CD3/CD28 DynabeadsTM(CTS Thermofisher，美国)的存在下激活Treg。将Teff解冻并且在具有100U/mL重组人IL-2的相同培养基中培养两天，并且在CD3/CD28 DynabeadsTM的存在下激活。
按照制造商的说明书通过经由MaxCyte装置的电穿孔或通过BTX830Square Wave电穿孔仪(Harvard Bioscience，美国)，将ZFN mRNA引入细胞。将AAV转基因供体构建体以1x105病毒基因组(vg)/细胞引入细胞中。
在AttuneTM NxT流式细胞仪(Thermofisher,USA)上分析所有细胞样品，并且使用FlowJo软件分析数据。通过首先使用eBioscience FOXP3/转录因子染色缓冲液组对细胞进行透化进行检测经修饰的Treg和Teff中的HLA-A2CAR。然后将细胞用与荧光团缀合的HLA-A2葡聚糖(Immudex，丹麦)染色，并且按照制造商的建议在染色的两小时内进行分析。通过流式细胞术在适当的荧光通道内检测GFP。
如图2C所示，ZFN单独诱导了>90％的总基因组修饰(插入缺失：插入/缺失)。当ZFN与AAV GFP转基因构建体共递送时，约70％的基因组修饰是GFP转基因在预期靶位点的靶向整合(TI)。图3A-C中的数据表明，在经受ZFN(图3A)或单独的AAV供体(图3B)的Treg中的模拟未经处理的细胞之间，表达GFP的细胞的分数和GFP表达水平相似，而经受ZFN以及供体的Treg(图3C)产生>60％的表达由内源性FOXP3启动子驱动的GFP的细胞。
对于HLA-A2 CAR工程化T细胞，通过流式细胞术评估结合HLA-A2右旋体的CAR+细胞的水平。在Treg研究中，HLA-A2靶向scFv结合的分数和水平显示与经受ZFN(图5A)或单独经受AAV供体(图5B)的Treg中的模拟未经处理的细胞相同。相比之下，经受ZFN和AAV供体(图5C)的Treg产生>70％的在内源性FOXP3启动子的控制下表达HLA-A2 CAR的Treg细胞。在Teff研究中，HLA-A2靶向scFv结合的分数和水平表明与在经受ZFN(图6A)或单独经受AAV供体(图6B)的Teff中的模拟未经处理的细胞相同。与Treg不同，Teff接受ZFN和AAV供体(图6C)也未显示出CAR表达。这些结果表明仅表达FOXP3(Treg)的细胞表达HLA-A1 CAR，并且表达受内源性FOXP3启动子调控，该启动子对Treg细胞有活性，但是在Teff细胞中没有活性。
图7A中的数据表明，在经HLA-A2 CAR供体转染的Treg细胞中，90.1％的细胞保留了FOXP3+ Treg表型。图7B中的数据表明，在接受ZFN和AAV供体二者的Treg中，相似高百分比的细胞(85.8％)保留了FOXP3+ Treg表型。
序列表
下表列出了本公开内容中的氨基酸和核苷酸序列以及其各自的SEQ ID NO(SEQ)。
序列表
<110> 桑格摩生物治疗股份有限公司
<120> 调节性T细胞中受控的转基因表达
<130> 025297.WO006
<140>
<141>
<150> 62/850,963
<151> 2019-05-21
<160> 95
<170> PatentIn version 3.5
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Asp Tyr Gly Met His
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Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Lys Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr
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Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly
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Met Val Ser Lys Ile Arg Thr Phe Gly Trp Val Gln Asn Pro Gly Lys
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Phe Glu Asn Leu Lys Arg Val Val Gln Val Phe Asp Arg Asn Ser Lys
20 25 30
Val His Asn Glu Val Lys Asn Ile Lys Ile Pro Thr Leu Val Lys Glu
35 40 45
Ser Lys Ile Gln Lys Glu Leu Val Ala Ile Met Asn Gln His Asp Leu
50 55 60
Ile Tyr Thr Tyr Lys Glu Leu Val Gly Thr Gly Thr Ser Ile Arg Ser
65 70 75 80
Glu Ala Pro Cys Asp Ala Ile Ile Gln Ala Thr Ile Ala Asp Gln Gly
85 90 95
Asn Lys Lys Gly Tyr Ile Asp Asn Trp Ser Ser Asp Gly Phe Leu Arg
100 105 110
Trp Ala His Ala Leu Gly Phe Ile Glu Tyr Ile Asn Lys Ser Asp Ser
115 120 125
Phe Val Ile Thr Asp Val Gly Leu Ala Tyr Ser Lys Ser Ala Asp Gly
130 135 140
Ser Ala Ile Glu Lys Glu Ile Leu Ile Glu Ala Ile Ser Ser Tyr Pro
145 150 155 160
Pro Ala Ile Arg Ile Leu Thr Leu Leu Glu Asp Gly Gln His Leu Thr
165 170 175
Lys Phe Asp Leu Gly Lys Asn Leu Gly Phe Ser Gly Glu Ser Gly Phe
180 185 190
Thr Ser Leu Pro Glu Gly Ile Leu Leu Asp Thr Leu Ala Asn Ala Met
195 200 205
Pro Lys Asp Lys Gly Glu Ile Arg Asn Asn Trp Glu Gly Ser Ser Asp
210 215 220
Lys Tyr Ala Arg Met Ile Gly Gly Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu Val
225 230 235 240
Lys Gln Gly Lys Lys Glu Phe Ile Ile Pro Thr Leu Gly Lys Pro Asp
245 250 255
Asn Lys Glu Phe Ile Ser His Ala Phe Lys Ile Thr Gly Glu Gly Leu
260 265 270
Lys Val Leu Arg Arg Ala Lys Gly Ser Thr Lys Phe Thr Arg Val Pro
275 280 285
Lys Arg Val Tyr Trp Glu Met Leu Ala Thr Asn Leu Thr Asp Lys Glu
290 295 300
Tyr Val Arg Thr Arg Arg Ala Leu Ile Leu Glu Ile Leu Ile Lys Ala
305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Ile Glu Gln Ile Gln Asp Asn Leu Lys Lys Leu Gly
325 330 335
Phe Asp Glu Val Ile Glu Thr Ile Glu Asn Asp Ile Lys Gly Leu Ile
340 345 350
Asn Thr Gly Ile Phe Ile Glu Ile Lys Gly Arg Phe Tyr Gln Leu Lys
355 360 365
Asp His Ile Leu Gln Phe Val Ile Pro Asn Arg Gly Val Thr Lys Gln
370 375 380
Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys
385 390 395 400
Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg
405 410 415
Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe
420 425 430
Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys
435 440 445
Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val
450 455 460
Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly
465 470 475 480
Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn
485 490 495
Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val
500 505 510
Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr
515 520 525
Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala
530 535 540
Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala
545 550 555 560
Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu
565 570 575
Ile Asn Phe
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
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Gln Ser Gly Ala Leu Ala Arg
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Gln Ser Ala Asn Arg Thr Lys
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Gln Ser Ser Asp Leu Ser Arg
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Arg Leu Tyr Thr Leu His Lys
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Val Ala Glu Tyr Arg Tyr Lys
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Gln Ser Gly His Leu Ala Arg
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<213> 人工序列
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<211> 7
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<213> 人工序列
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 智人
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ctcccctgac caaggaaaat cggggtgg 28
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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gctaagtaat tccaggagca cctccttt 28
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 82
agggatggga tgacttggct ttaggtca 28
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<212> DNA
<213> 智人
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ggactcaggt ggggggtcta ggggtgag 28
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 84
acggccattc gcaggtgctg acattttg 28
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<213> 智人
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caggcttctg gcagagaagc ttaaagac 28
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<213> 智人
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<213> 智人
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aaggatttgg aaggggtaaa gggccagg 28
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 89
aaggtgaagg gtcagaagtg gggtcaag 28
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 90
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 91
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Val Thr Leu Ser Asp Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Glu Lys Thr Val Ser Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu
195 200 205
Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
245 250 255
Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu
260 265 270
Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His
275 280 285
Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val
290 295 300
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
305 310 315 320
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
325 330 335
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
340 345 350
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
355 360 365
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
370 375 380
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
385 390 395 400
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
405 410 415
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
420 425 430
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
435 440 445
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
450 455 460
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
465 470 475 480
Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val
1 5
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<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaa 64
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<211> 60
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /note=\"人工序列的说明：合成寡核苷酸\"
<400> 94
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note=\"人工序列的说明：合成多肽\"
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys