使用融合蛋白进行TCR重编程的组合物和方法与流程

使用融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法
1.交叉引用
2.本技术要求2019年4月22日提交的美国临时申请号62/836,977和2019年12月4日提交的美国临时申请号62/943,679的权益，其各自通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.癌症是美国和其它地方死亡的主要原因。根据癌症的类型，通常用手术、化疗和/或放疗进行治疗。这些治疗通常失败，并且显然需要新的治疗，以单独使用或与当前的护理标准组合使用。
4.大多数患有血液恶性肿瘤或晚期实体瘤的患者不能用标准疗法治愈。此外，传统的治疗选择通常具有严重的副作用。已经进行了许多尝试来使患者的免疫系统排斥癌细胞，这种方法统称为癌症免疫疗法。
5.工程化t细胞疗法在清除实体瘤方面的成功取决于所述t细胞在免疫抑制性肿瘤微环境(tme)中起作用的能力。已经采用或正在开发克服tme的多种策略。许多方法直接修饰和工程化t细胞以表达多个共刺激结构域(例如cd40的组成型表达)、以分泌促炎细胞因子如il-12和/或阻断抑制信号的抗体(如抗pd1)(参见例如yeku&brentjens，2016)。
6.例如，通过遗传修饰以表达嵌合抗原受体(car)的肿瘤特异性t细胞的产生已获得产生强抗肿瘤作用的吸引力(jena等人，2010，blood.116：1035-1044；bonini等人，2011，biol blood marrow transplant 17(1 suppl)：515-20；restifo等人，2012，nat rev immunol 12：269-281；kohn等人，2011，mol ther 19：432-438；savoldo等人，2011，j clin invest 121：1822-1825；ertl等人，2011，cancer res 71：3175-3181)。
7.cd19特异性car t细胞(称为ctl019)的临床结果在患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)以及儿童急性成淋巴细胞性白血病(all)的患者中显示完全缓解(参见例如，kalos等人，sci transl med 3：95ra73(2011)，porter等人，nejm 365：725-733(2011)，grupp等人，nejm 368：1509-1518(2013))。另一种方法是使用为肿瘤相关肽抗原选择的t细胞受体(tcr)α和β链来遗传工程化自体t细胞。这些tcr链将形成完整的tcr复合物，并为t细胞提供具有第二确定特异性的tcr。在滑液癌患者中用表达ny-eso-1-特异性tcrα和β链的工程化自体t细胞获得了令人鼓舞的结果。最近的方法是改进基因工程化的t细胞以更广泛地对抗各种人恶性肿瘤。tcr亚单位(包括cd3ε、cd3γ和cd3δ)和tcrα和tcrβ链与细胞表面抗原特异性结合结构域的新融合蛋白已显示出超过现有方法限制的潜力。参见例如2016年5月18日提交的共同未决的国际申请号pct/us2016/033146；2017年8月2日提交的pct/us2017/045159；和2018年6月13日提交的pct/us2018/037387，其各自通过引用并入本文。
8.不幸的是，为了实现有效的蛋白质表达，这些方法中的许多已经面临在t细胞内递送药物组合物的技术限制。
9.编码蛋白质的基因的大尺寸对工程化t细胞如融合蛋白提出了技术限制和挑战。将这些大基因编码到产生t细胞所必需的活载体中是复杂的。此外，即使成功产生载体，也不总是观察到t细胞转导效率和稳定的蛋白质表达。这可能与转录、翻译和最终蛋白质分泌
相关的漫长而复杂的过程有关。据推测，这些蛋白质中的许多不是由t细胞内源性表达的事实可使其进一步复杂化。
10.例如，在将重组dna递送到细胞中之后，但在产生可影响蛋白质表达的编码蛋白质之前，可能发生多个步骤。一旦进入细胞，dna可被转运到细胞核中，在细胞核中它被转录成mrna。从dna转录的mrna然后可以进入细胞质，在那里它被翻译成蛋白质。从施用的dna到蛋白的多个加工步骤不仅在产生功能蛋白之前产生滞后时间，而且每个步骤都代表了错误和损伤细胞的机会。此外，已知难以在细胞中获得dna表达，因为dna经常进入细胞但不表达或不以合理的速率或浓度表达。当dna被引入原代细胞或修饰的细胞系时，这可能是特别的问题。


技术实现要素：

11.本文认识到需要递送生物形式以解决围绕细胞内翻译的调节和编码多肽的核酸的加工的缺陷，并因此优化来自递送形式的蛋白质表达。
12.显然需要改进基因工程化的t细胞以更广泛地对抗各种人恶性肿瘤，例如癌症。
13.以下公开内容中的组合物和方法已经被设计成通过递送包含核酸如环状rna(circrna)的组合物来解决这种需要。
14.因此，在一个方面，本文公开了分离的重组核酸分子，其包含：(a)一种或多种编码t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)的核糖核酸(rna)序列，所述tfp包含(a)tcr亚单位，所述tcr亚单位包含(i)tcr胞外结构域的至少一部分，(ii)跨膜结构域，和(iii)tcr胞内结构域，其中所述tcr亚单位的胞外、跨膜和/或胞内信号传导结构域衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ或tcrα或tcrβ或tcrδ或tcrγ；和(b)抗原结合结构域；其中所述tcr亚单位与所述抗原结合域可操作地连接；且其中当在t细胞中表达时，tfp并入tcr中；和(b)一种或多种内部核糖体进入位点(ires)；其中(a)和(b)可操作地连接以形成环状重组核酸分子。在一个实施方案中，tcr胞内结构域包含衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ的刺激结构域。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或抗体片段。在一个实施方案中，分离的重组核酸分子还包含邻近(a)的5’端和(b)的3’端的(c)核酸间隔序列，其中(c)通过线性核酸的环化形成。在一个实施方案中，间隔序列的长度为约30-100个核苷酸。在另一个实施方案中，线性核酸的环化产生环状rna分子。在另一个实施方案中，环状重组核酸分子是外源的。在另一个实施方案中，ires包含来自柯萨奇病毒b3(cvb3)或来自脑心肌炎病毒(emcv)的ires序列。在另一个实施方案中，环状重组核酸分子适于转染或转导到同种异体或自体人免疫细胞中。
15.在另一方面，提供了分离的重组核酸分子，其包含：(a)一种或多种编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的核糖核酸(rna)序列；和(b)一种或多种内部核糖体进入位点(ires)；其中(a)和(b)可操作地连接以形成环状重组核酸分子。在一个实施方案中，分离的重组核酸分子还包含邻近(a)的5’端和(b)的3’端的(c)核酸间隔序列，其中(c)通过线性核酸的环化形成。在一个实施方案中，间隔序列的长度为约30-100个核苷酸。在另一个实施方案中，分离的重组核酸分子是外源性的。在一个实施方案中，ires还包含获自柯萨奇病毒b3(cvb3)或获自脑心肌炎病毒(emcv)的ires。
16.在另一方面，提供了分离的重组核酸分子，其包含(a)一种或多种编码t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)的脱氧核糖核酸(dna)序列，所述tfp包含(a)tcr亚单位，所述tcr亚单
位包含(i)tcr胞外结构域的至少一部分，(ii)跨膜结构域，和(iii)tcr胞内结构域，所述tcr胞内结构域包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域，其中所述tcr亚单位的胞外、跨膜和/或胞内信号传导结构域衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ或tcrα或tcrβ或tcrδ或tcrγ；和(b)抗原结合结构域；其中所述tcr亚单位与所述抗原结合结构域可操作地连接；且其中当在t细胞中表达时，tfp并入tcr中；(b)一种或多种包含一种或多种内部核糖体进入位点(ires)的dna序列；和(c)一种或多种包含第一环化结构域的dna序列，所述第一环化结构域包含5
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同源序列和3
′
置换的内含子-外显子(pie)序列中的至少一个；和(d)一种或多种包含第二环化结构域的dna序列，所述第二环化结构域包含3
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同源序列和5
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pie序列中的至少一个，其中(a)和(b)可操作地连接。在一个实施方案中，tcr胞内结构域包含衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ的刺激结构域。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或抗体片段。在一个实施方案中，(a)-(d)以取向(c)-(b)-(a)-(d)可操作地连接。在另一个实施方案中，一种或多种dna序列还包含至少一个间隔序列。在一个实施方案中，间隔序列的长度为至少约30-100个核苷酸。在一个实施方案中，核酸分子是外源性的。在另一个实施方案中，核酸分子是质粒。在另一个实施方案中，核酸分子还包含对肿瘤相关抗原(taa)具有特异性的抗原结合结构域。在另一个实施方案中，ires包含来自柯萨奇病毒b3(cvb3)或来自脑心肌炎病毒(emcv)的ires序列。在一个实施方案中，分离的重组核酸分子还包含至少一个额外的5
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同源序列和一个额外的3
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同源序列。
17.在另一方面，提供了分离的重组核酸分子，其包含(a)一种或多种编码car或tcr的脱氧核糖核酸(dna)序列；和(b)一种或多种包含一种或多种内部核糖体进入位点(ires)的dna序列；和(c)一种或多种包含第一环化结构域的dna序列，所述第一环化结构域包含5
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同源序列和3
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置换的内含子-外显子(pie)序列中的至少一个；和(d)一种或多种包含第二环化结构域的dna序列，所述第二环化结构域包含3
′
同源序列和5
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pie序列中的至少一个，其中(a)和(b)可操作地连接。在一个实施方案中，(a)-(d)以取向(c)-(b)-(a)-(d)可操作地连接。在另一个实施方案中，一种或多种dna序列还包含至少一个间隔序列。在一个实施方案中，间隔序列的长度为至少约30-100个核苷酸。在另一个实施方案中，核酸分子是外源性的。在一个实施方案中，核酸分子是质粒。在一个实施方案中，核酸分子还包含编码的抗原结合结构域。在一个实施方案中，ires包含来自柯萨奇病毒b3(cvb3)或来自脑心肌炎病毒(emcv)的ires序列。在另一个实施方案中，分离的重组核酸分子还包含至少一个额外的5
′
同源序列和一个额外的3
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同源序列。在一个实施方案中，编码抗原结合结构域的序列通过编码的接头序列与编码tcr胞外结构域的序列连接。在一个实施方案中，编码的接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至4。在另一个实施方案中，编码的抗原结合结构域特异性结合肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，肿瘤相关抗原是cd19或其变体、cd20、cd22、bcma、msln、il13ra2、egfrviii、muc16、muc1、ror1、pd1、epha2或其组合。在一个实施方案中，编码的跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：tcrα链、tcrβ链、tcrδ链、tcrγ链、cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、其功能片段、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。
18.在一个实施方案中，分离的重组核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列，其中编码的共刺激结构域是选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：ox40、
cd2、cd27、cd28、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、和4-1bb(cd137)、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。在一个实施方案中，对其的至少一个但不超过20个修饰包括调节细胞信号传导的氨基酸的修饰或响应于配体与编码的tfp或car或tcr结合而磷酸化的氨基酸的修饰。在一个实施方案中，编码的tfp或car或tcr还包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)或其部分，其中所述itam或其部分来自选自由以下组成的组的蛋白质：cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、tcrζ链、fcε受体1链、fcε受体2链、fcγ受体1链、fcγ受体2a链、fcγ受体2b1链、fcγ受体2b2链、fcγ受体3a链、fcγ受体3b链、fcβ受体1链、tyrobp(dap12)、cd5、cd16a、cd16b、cd22、cd23、cd32、cd64、cd79a、cd79b、cd89、cd278、cd66d、其功能片段、以及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。在一个实施方案中，itam或其部分替换tcr胞内结构域的itam；其中tcr胞内结构域的替换的itam仅衍生自cd3ε或cd3γ，并且不同于替换它的itam或其部分。在一个实施方案中，编码的tfp分子能够与内源性tcr复合物、至少一种内源性tcr多肽或其组合在功能上相互作用。在一个实施方案中，抗原结合结构域是scfv或vhh结构域。在一个实施方案中，分离的重组核酸分子包含在细胞中。在一个实施方案中，细胞是cd8+或cd4+或cd8+cd4+人免疫细胞。在一个实施方案中，抗体或其片段结合细胞表面抗原。在一个实施方案中，抗体或其片段结合肿瘤细胞表面上的细胞表面抗原。在一个实施方案中，分离的重组核酸还包含编码tcr恒定结构域的序列，当在t细胞中表达时，该tcr恒定结构域并入功能性tcr复合物中。在另一实施方案中，tcr恒定结构域并入与在t细胞中表达时并入tfp的功能性tcr复合物相同的功能性tcr复合物。在一个实施方案中，编码tfp的序列和编码tcr恒定结构域的序列包含在同一核酸分子中。在一个实施方案中，编码tfp的序列和编码tcr恒定结构域的序列包含在不同的核酸分子中。在一个实施方案中，tcr亚单位和抗体结构域、抗原结合结构域通过编码的接头序列可操作地连接。
19.在一个实施方案中，跨膜结构域是来自cd3ε、cd3γ、cd3δ、tcrα或tcrβ或tcrγ或tcrδ的t细胞受体复合物跨膜结构域。在一个实施方案中，胞内结构域仅衍生自cd3ε、仅衍生自cd3γ、仅衍生自cd3δ、仅衍生自tcrα、仅衍生自tcrβ、仅衍生自tcrγ、或仅衍生自tcrδ。在一个实施方案中，分离的重组核酸还包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：ox40、cd2、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、和4-1bb(cd137)、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。在一个实施方案中，分离的重组核酸分子还包含编码抗原结合结构域的序列。在一个实施方案中，分离的重组核酸分子还包含编码蛋白质转导结构域或细胞穿透肽的序列。
20.在另一方面，提供了一种离体产生修饰的人免疫细胞的方法，其包括用一种或多种本文公开的分离的重组核酸分子转导或转染免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是t细胞。在另一个实施方案中，免疫细胞是选自包含以下的组的人t细胞：cd4+细胞、cd8细胞、初始t细胞、记忆干t细胞、中枢记忆t细胞、双阴性t细胞、效应记忆t细胞、效应t细胞、th1细胞、tc1细胞、th2细胞、tc2细胞、th17细胞、th22细胞、γ/δt细胞、天然杀伤(nk)细胞、天然杀伤t(nkt)细胞、b细胞、造血干细胞和多能干细胞。
21.在另一方面，提供了一种产生编码t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)的环状rna的方法，其包括以下步骤：(i)提供一种或多种载体，其包含：(a)一种或多种编码t细胞受体
(tcr)融合蛋白(tfp)的dna序列，所述tfp包含(a)tcr亚单位，所述tcr亚单位包含(1)tcr胞外结构域的至少一部分，(2)跨膜结构域，和(3)tcr胞内结构域，其中所述tcr亚单位的胞外、跨膜和/或胞内信号传导结构域衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ或tcrα或tcrβ或tcrδ或tcrγ；和(b)抗原结合结构域；其中该tcr亚单位与该抗原结合结构域可操作地连接；且其中当在t细胞中表达时，tfp并入tcr中；(b)一种或多种包含一种或多种内部核糖体进入位点(ires)的dna序列；和(c)一种或多种包含第一环化结构域的dna序列，所述第一环化结构域包含5
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同源序列和3
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置换的内含子-外显子(pie)序列中的至少一个；和(d)一种或多种包含第二环化结构域的dna序列，所述第二环化结构域包含3
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同源序列和5
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pie序列中的至少一个，其中(a)和(b)可操作地连接；(ii)转录一种或多种载体以产生一种或多种线性rna；和(iii)通过使用化学方法、酶方法或核酶方法使线性rna自剪接，从而产生环状rna。在一个实施方案中，tcr胞内结构域包含衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ的刺激结构域。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或抗体片段。在一个实施方案中，载体是dna载体。在另一个实施方案中，环状rna在体外或离体产生。在另一个实施方案中，环状rna还包含至少一个间隔序列。在一个实施方案中，间隔序列的长度为约30-100个核苷酸。在另一个实施方案中，载体是质粒。在一个实施方案中，环状rna通过体外转录产生。在一个实施方案中，载体被整合到宿主细胞的基因组中。在一个实施方案中，ires包含来自柯萨奇病毒b3(cvb3)或来自脑心肌炎病毒(emcv)的ires序列。在一个实施方案中，载体还包含至少一个额外的5
′
同源序列和一个额外的3
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同源序列。在一些实施方案中，载体并入靶细胞的基因组中。在一些实施方案中，将载体作为递送媒介物(例如纳米颗粒、脂质体、核内体等)的有效负载施用于受试者。
22.在另一方面，提供了一种产生编码car或tcr的环状rna的方法，其包括以下步骤：(i)提供一种或多种载体，其包含：(a)一种或多种编码car的dna序列或(b)一种或多种包含一种或多种内部核糖体进入位点(ires)的dna序列；和(c)一种或多种包含第一环化结构域的dna序列，所述第一环化结构域包含5
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同源序列和3
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置换的内含子-外显子(pie)序列中的至少一个；和(d)一种或多种包含第二环化结构域的dna序列，所述第二环化结构域包含3
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同源序列和5
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pie序列中的至少一个，其中(a)和(b)可操作地连接；(ii)转录一种或多种载体以产生一种或多种线性rna；和(iii)通过使用化学方法、酶方法或核酶方法使线性rna自剪接，从而产生环状rna。在一个实施方案中，环状rna还包含至少一个间隔序列。在一个实施方案中，间隔序列的长度为约30-100个核苷酸。在一个实施方案中，载体是质粒。在另一个实施方案中，环状rna通过体外转录产生。在一个实施方案中，编码的抗原结合结构域对肿瘤相关抗原具有特异性。在另一个实施方案中，ires包含来自柯萨奇病毒b3(cvb3)或来自脑心肌炎病毒(emcv)的ires序列。在一个实施方案中，载体还包含至少一个额外的5
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同源序列和一个额外的3
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同源序列。
23.在另一方面，提供了一种在受试者中产生含有编码t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)的环状rna的修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供一种或多种环状rna载体，其包含：(a)一种或多种编码t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)的序列，所述tfp包含(a)tcr亚单位，所述tcr亚单位包含(i)tcr胞外结构域的至少一部分；跨膜结构域；(ii)包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域的tcr胞内结构域，其中所述tcr亚单位的胞外、跨膜和/或胞内信号传导结构域衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ或tcrα或tcrβ或tcrδ或tcr
γ；和(iii)抗原结合域；其中该tcr亚单位与该抗原结合结构域可操作地连接；且其中当在t细胞中表达时，tfp并入tcr中；(b)一种或多种包含一种或多种内部核糖体进入位点(ires)的dna序列；和(c)一种或多种包含第一环化结构域的dna序列，所述第一环化结构域包含5
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同源序列和3
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置换的内含子-外显子(pie)序列中的至少一个；和(d)一种或多种包含第二环化结构域的dna序列，所述第二环化结构域包含3
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同源序列和5
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pie序列中的至少一个，其中(a)和(b)可操作地连接；和(2)以有效修饰靶免疫细胞群的量向受试者施用一种或多种环状rna载体。在一个实施方案中，tcr胞内结构域包含衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ的刺激结构域。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述靶免疫细胞群包含选自包含以下的组的人t细胞：cd4+细胞、cd8细胞、初始t细胞、记忆干t细胞、中枢记忆t细胞、双阴性t细胞、效应记忆t细胞、效应t细胞、th1细胞、tc1细胞、th2细胞、tc2细胞、th17细胞、th22细胞、γ/δt细胞、天然杀伤(nk)细胞、天然杀伤t(nkt)细胞、b细胞、造血干细胞和多能干细胞。在一个实施方案中，一种或多种环状rna载体还包含至少一种包含t细胞受体基序的结合结构域的细胞靶向配体。在一个实施方案中，一种或多种环状rna载体还包含选自基本上由以下组成的组的递送媒介物：大分子复合物、纳米胶囊、纳米颗粒、外来体、外来体-脂质缀合物、微球、珠、水包油乳液、脂质-纳米颗粒缀合物、胶束、混合胶束和脂质体。在一个实施方案中，递送媒介物还包含至少一种包含t细胞受体基序的结合结构域的细胞靶向配体。在另一个实施方案中，细胞靶向配体选自包含以下的组：t-细胞α链、t-细胞β链、t-细胞γ链、t-细胞δ链、ccr7、cd1a、cd1b、cd1c、cdld、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd11b、cd11c、cd16、cd19、cd20、cd21、cd22、cd25、cd28、cd34、cd35、cd39、cd40、cd45ra、cd45ro、cd46、cd52、cd56、cd62l、cd68、cd80、cd86、cd95、cd101、cd117、cd127、cd133、cd137(4-1bb)、cd148、cd163、f4/80、il-4rα、sca-1、ctla-4、gitr、garp、lap、粒酶b、lfa-1、转铁蛋白受体及其组合。
24.在另一方面，提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用在用于将分离的重组核酸分子递送至受试者的制剂中的根据权利要求1或权利要求0的编码t细胞受体融合蛋白(tfp)的分离的重组核酸分子，并且其中所述分离的重组核酸分子在体内进入靶细胞。在一个实施方案中，分离的重组核酸分子是环状rna分子。在另一个实施方案中，重组核酸以5
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至3
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的顺序包含：i)包含3
′
剪接位点的外源内含子的3
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部分，ii)编码rna外显子的核酸序列，和iii)包含5
′
剪接位点的外源内含子的5
′
部分，其中通过重组核酸的转录产生的rna的剪接导致受试者中环状rna的产生。在一个实施方案中，其中环状rna由dna载体编码。在一个实施方案中，环状rna与靶向部分缀合。在另一个实施方案中，环状rna包含蛋白质转导结构域或细胞穿透肽。在另一个实施方案中，制剂包含纳米颗粒。在一个实施方案中，纳米颗粒是外来体、脂质体或外来体-脂质体杂合体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含至少一种靶向部分。在另一个实施方案中，靶向部分是结合配体或鼠抗体或人或人源化抗体或其片段。在另一个实施方案中，靶向部分特异性结合cd3、cd4或cd8。在一个实施方案中，靶细胞是人免疫细胞。在另一个实施方案中，靶细胞是选自包含以下的组的人t细胞：cd4+细胞、cd8细胞、初始t细胞、记忆干t细胞、中枢记忆t细胞、双阴性t细胞、效应记忆t细胞、效应t细胞、th1细胞、tc1细胞、th2细胞、tc2细胞、th17细胞、th22细胞、γ/δt细胞、天然杀伤(nk)细胞、天然杀伤t(nkt)细胞、造血干细胞和多能干细胞。
25.在另一方面，提供了一种药物制剂，其包含：(a)人免疫细胞，其含有足以治疗受试
者中的癌症的量的环状rna，其中所述环状rna编码t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)，所述tfp包含(a)tcr亚单位，所述tcr亚单位包含(i)tcr胞外结构域的至少一部分；跨膜结构域；(ii)tcr胞内结构域，其包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域，其中所述tcr亚单位的胞外、跨膜和/或胞内信号传导结构域衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ或tcrα或tcrβ或tcrδ或tcrγ；和(iii)抗原结合结构域；其中该tcr亚单位与该抗原结合结构域可操作地连接；且其中当在t细胞中表达时，tfp并入tcr中；和(b)药学上可接受的载体。在一个实施方案中，tcr胞内结构域包含衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ的刺激结构域。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或抗体片段。
26.在另一方面，提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物制剂，所述药物制剂包含含有环状rna的人免疫细胞，其中所述环状rna编码t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)，所述tfp包含(a)tcr亚单位，所述tcr亚单位包含(i)tcr胞外结构域的至少一部分；跨膜结构域；(ii)tcr胞内结构域，其包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域，其中所述tcr亚单位的胞外、跨膜和/或胞内信号传导结构域衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ或tcrα或tcrβ或tcrδ或tcrγ；和(iii)抗原结合结构域；其中该tcr亚单位与该抗原结合结构域可操作地连接；且其中当在t细胞中表达时，tfp并入tcr中；和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述方法包括所述制剂的单次施用。在一个实施方案中，tcr胞内结构域包含衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ的刺激结构域。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述方法包括所述制剂的多于一次施用。在一个实施方案中，细胞是同种异体t细胞。在另一个实施方案中，细胞是自体t细胞。
27.在另一方面，提供了一种药物制剂，其包含：包含环状rna的药物制剂，其中所述环状rna编码t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)，所述tfp包含(a)tcr亚单位，所述tcr亚单位包含(i)tcr胞外结构域的至少一部分；跨膜结构域；(ii)tcr胞内结构域，其包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域，其中所述tcr亚单位的胞外、跨膜和/或胞内信号传导结构域衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ或tcrα或tcrβ或tcrδ或tcrγ；和(iii)抗原结合结构域；其中该tcr亚单位与该抗原结合结构域可操作地连接；且其中当在t细胞中表达时，tfp并入tcr中；和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，环状rna与靶向部分缀合。在另一个实施方案中，环状rna包含以下的一种或多种：蛋白质转导结构域、细胞穿透肽或内涵体溶解肽。在一个实施方案中，tcr胞内结构域包含衍生自cd3ε或cd3γ或cd3δ的刺激结构域。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或抗体片段。在一个实施方案中，制剂包含纳米颗粒。在另一个实施方案中，纳米颗粒是外来体、脂质体或外来体-脂质体杂合体。在一个实施方案中，纳米颗粒包含至少一种靶向部分。在另一个实施方案中，靶向部分是结合配体或鼠抗体或人或人源化抗体或其片段。在一个实施方案中，靶向部分特异性结合cd3、cd4或cd8。
28.通过引用并入
29.本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文中，其程度如同明确且个别地指示每个单独的出版物、专利或专利申请以引用的方式并入一般。
附图说明
30.本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下阐述示例性实施方
案的详细描述和附图，将更好地理解本发明的特征和优点，在所述示例性实施方案中利用了本发明的原理，在附图中：
31.图1是使用编码tfp的circrna体内转导t细胞导致tfp表达的示意图。如图所示，circrna由包含编码tfp的序列上游的ires序列的前体产生。然后与tfp连接的ires在任一端侧接内部同源序列，随后是置换的内含子-外显子序列，随后是外部同源序列，向远端移动。然后该构建体能够自剪接，产生circrna。circrna可以比mrna持续和保持更长功能。circrna可以编码数千碱基(kb)的编码序列(cds)。该示意图改编自wesselhoeft等人，nat.commun.，9：26-29.，2018。
32.图2是能够形成本文所述的gfp circrna的由seq id no：146编码的前体rna的线性形式和三维结构的示意图。
33.图3是显示用于产生具有cvb3和emcv ires的gfp circrna的rna前体和circrna的体外转录反应的产物的琼脂糖凝胶的图像。
34.图4是流式细胞术数据的图示，其显示用表达gfp和gfp剪接突变体的gfp circrna(seq id no：147)转导的jurkat细胞的比例。在该实施例中，通过电穿孔将circrna递送至jurkat细胞。
35.图5是能够形成本文所述的抗cd19-tfp circrna的由seq id no：148编码的前体rna的线性形式和三维结构的示意图。
36.图6是显示用于产生实施例11中产生的抗cd19-tfp circrna的rna前体和circrna的体外转录反应的产物的琼脂糖凝胶的图像。本实施例显示了cvb3抗cd19tfp circrna环化。
37.图7是流式细胞术数据的图示，其显示用表达抗cd19-tfp的抗cd19-tfp circrna转导的jurkat细胞的比例。
38.图8是能够形成本文所述的抗msln-tfp circrna的由seq id no：149编码的前体rna的线性形式和三维结构的示意图。
39.图9是显示实施例12中产生的抗msln-tfp circrna的琼脂糖凝胶图像。此实施例显示cvb3抗msln tfp circrna环化。
40.图10是流式细胞术数据的图示，其显示用表达抗msln-tfp的抗msln-tfp circrna转导的jurkat细胞的比例。通过电穿孔将circrna递送至jurkat细胞。
41.图11是流式细胞术数据的图示，其显示用表达抗msln-tfp的抗msln-tfp circrna转导的活化t细胞的比例。通过电穿孔将circrna递送至活化t细胞。
42.图12是比较用抗msln-tfp circrna转导的细胞与慢病毒抗msln-tfp或未转导对照相比观察到的％效应细胞杀伤的细胞毒性测定的图示，其显示用表达抗msln-tfp的抗msln-tfp circrna转导的活化t细胞的比例。
43.图13是检测用gfp circrna、所示taa(x).tfp circrna电穿孔的细胞或非电穿孔对照表面上的cd3ε和gfp或vhh的流式细胞术数据的图示。
44.图14是比较用gfp circrna或taa(x).tfp circrna电穿孔的t细胞与用慢病毒taa(x).tfp转导的t细胞或未转导对照相比所观察到的％效应细胞裂解的细胞毒性测定的图示。对于每个转导的/电穿孔的构建体和未转导的对照，从左到右显示的是效应物：靶细胞比率为9∶1、3∶1和1∶1的％效应细胞裂解。
45.图15是显示用于产生具有0％、10％和100％m6a的抗msln-tfp circrna的rna前体和circrna的体外转录反应产物的琼脂糖凝胶图像。
46.图16是显示用具有0％、10％或100％m6a的circrna电穿孔的细胞或对照中的抗msln-tfp表达和mfi的一系列图。
具体实施方案
47.本文提供了用于治疗受试者例如患有癌症的受试者的重组核酸。在某些方面，重组核酸包含环状rna序列。在某些方面，重组核酸包含编码环状rna序列的dna。在一些实施方案中，重组核酸序列编码嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)或t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)，其中tfp包含(a)tcr亚单位，所述tcr亚单位包含(i)tcr胞外结构域的至少一部分，(ii)跨膜结构域，和(iii)cd3ε、cd3γ、cd3δ、tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ的tcr胞内结构域；和(b)抗原结合结构域；其中该tcr亚单位与该抗原结合结构域可操作地连接；其中当在t细胞中表达时，tfp功能性地并入tcr中。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含刺激结构域，例如来自cd3ε、cd3γ或cd3δ。
48.某些术语
49.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
50.术语“一(a和an)”是指一个或多于一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。例如，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。
51.如本文所用，“约”可意指正或负小于1％或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％或大于30％，这取决于情况和本领域技术人员已知或可知。
52.如本说明书所用，“受试者”或“个体”可包括但不限于哺乳动物，诸如人或非人哺乳动物，例如驯养的、农业的或野生的动物、以及鸟类和水生动物。“患者”是患有或处于发展疾病、障碍或病症的风险或另外需要本文提供的组合物和方法的受试者。
53.如本文所用，“治疗”是指在治疗或改善疾病或病症中成功的任何指征。治疗可包括例如降低、延迟或减轻疾病或病症的一种或多种症状的严重程度，或其可包括降低患者经历疾病、缺陷、障碍或不良病症等的症状的频率。如本文所用，“治疗或预防”有时在本文中用于指导致疾病或病症的一定水平的治疗或改善并且预期针对该目的的结果范围的方法，包括但不限于完全预防病症。
54.如本文所用，“预防”是指预防患者的疾病或病症，例如肿瘤形成。例如，如果处于发展肿瘤或其它形式的癌症的风险中的个体用本公开的方法治疗并且随后不发展肿瘤或其它形式的癌症，则该疾病已经在该个体中至少在一段时间内被预防。
55.如本文所用，“治疗有效量”是组合物或其活性组分的量，该量足以对施用该组合物的个体提供有益效果或以其它方式减少有害的非有益事件。本文中的“治疗有效剂量”是指对施用产生一种或多种所需或期望的(例如有益的)效果的剂量，这种施用在给定的时间段内发生一次或多次。确切剂量将取决于治疗目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术确定(参见，例如lieberman，pharmaceutical dosage forms(第1-3卷，1992)；lloyd，the art，science and technology of pharmaceutical compounding(1999)；以及pickar，
dosage calculations(1999))
56.如本文所用，“t细胞受体(tcr)融合蛋白”或“tfp”包括衍生自包含tcr的各种多肽的重组多肽，其通常能够i)结合靶细胞上的表面抗原和ii)通常当共同位于t细胞中或表面上时，与完整tcr复合物的其它多肽组分相互作用。
57.术语“刺激”是指通过刺激结构域或刺激分子(例如tcr/cd3复合物)与其同源配体的结合，从而介导信号转导事件，例如但不限于经由tcr/cd3复合物的信号转导来诱导的初级应答。刺激可以介导某些分子的改变的表达，和/或细胞骨架结构的重组等。
58.术语“刺激分子”或“刺激结构域”是指由t细胞表达的分子或其部分，其提供初级胞质信号传导序列，所述初级胞质信号传导序列以刺激方式调节tcr复合物对t细胞信号传导途径的至少一些方面的初级激活。一方面，初级信号由例如tcr/cd3复合物与负载肽的mhc分子的结合所引发，且其导致t细胞反应的介导，包括但不限于增殖、激活、分化等。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或“itam”。含有在本公开中特别有用的初级胞质信号传导序列的itam的实例包括但不限于衍生自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd278(也称为“icos”)和cd66d的那些。
59.术语“抗原呈递细胞”或“apc”是指在其表面上展示与主要组织相容性复合物(mhc)复合的外源抗原的免疫系统细胞，例如辅助细胞(例如b细胞、树突细胞等)。t细胞可利用其t细胞受体(tcr)识别这些复合物。apc加工抗原并将其呈递给t细胞。
[0060]“主要组织相容性复合物(mhc)分子通常作为肽：mhc复合物的一部分与tcr结合。mhc分子可以是mhc i类或ii类分子。复合物可以在抗原呈递细胞，如树突细胞或b细胞，或任何其它细胞，包括癌细胞的表面上，或者它可以通过例如包被到珠子或平板上而被固定。
[0061]
本文所用的术语“胞内信号传导结构域”是指分子的胞内部分。胞内信号传导结构域产生促进含有tfp的细胞(例如修饰的t-t细胞)的免疫效应子功能的信号。例如在修饰的t-t细胞中的免疫效应子功能的实例包括细胞溶解活性和t辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括衍生自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些。
[0062]
初级胞内信号传导结构域可以包含itam(“基于免疫受体酪氨酸的激活基序”)。含有初级胞质信号传导序列的itam的实例包括但不限于衍生自cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d dap10和dap12的那些。
[0063]
术语“共刺激分子”是指t细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导t细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其可用于有效的免疫反应。共刺激分子包括但不限于mhc i类分子、btla和toll配体受体、以及ox40、cd2、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)和4-1bb(cd137)。共刺激胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的胞内部分。共刺激分子可以在以下蛋白质家族中表示：tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(slam蛋白)和激活nk细胞受体。此类分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、gitr、cd30、cd40、icos、baffr、hvem、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、
cd2、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3和与cd83特异性结合的配体等。胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子或其功能片段的整个胞内部分或整个天然胞内信号传导结构域。术语“4-1bb”是指具有以genbank登录号aaa62478.2提供的氨基酸序列的tnfr超家族的成员，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基；“4-1bb共刺激结构域”定义为genbank登录号aaa62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基。
[0064]
本文所用的术语“抗体”是指衍生自免疫球蛋白分子的蛋白或多肽序列，其特异性结合抗原。抗体可以是多克隆或单克隆来源的完整免疫球蛋白，或其片段，并且可以衍生自天然或重组来源。
[0065]
术语“抗体片段”是指抗体或其重组变体的至少一部分，其含有抗原结合结构域，即完整抗体的抗原决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶标(例如抗原及其确定的表位)的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab’、f(ab’)2和fv片段、单链(sc)fv(“scfv”)抗体片段、线性抗体、单结构域抗体例如sdab(v
l
或vh)、骆驼科动物v
hh
结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0066]
术语“scfv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单个多肽链，并且其中scfv保留其来源的完整抗体的特异性。
[0067]
关于抗体的“重链可变区”或“v
h”是指重链的片段，其含有插入在称为框架区的侧翼区段之间的三个cdr，这些框架区通常比cdr更高度保守并形成支架以支持cdr。骆驼科动物“vhh”结构域是包含单个可变抗体结构域的重链。
[0068]
除非另有说明，否则如本文所用，scfv可具有任一顺序的v
l
和vh可变区，例如，相对于多肽的n端和c端，scfv可包含v
l-接头-vh或可包含v
h-接头-v
l
。
[0069]
本公开的tfp组合物的包含抗体或其抗体片段的部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdab)、来源于鼠、人源化或人抗体的单链抗体(scfv)(harlow等人，1999，in：using antibodies：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，n.y.；harlow等人，1989，in：antibodies：a laboratory manual，cold spring harbor，n.y.；houston等人，1988，proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883；bird等人，1988，science 242：423-426)。在一方面，本公开的tfp组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一方面，tfp包括含有scfv或sdab的抗体片段。
[0070]
术语“重组抗体”是指使用重组dna技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语也应解释为指通过合成编码抗体的dna分子产生的抗体，该dna分子表达抗体蛋白，或指定抗体的氨基酸序列，其中该dna或氨基酸序列是使用本领域可获得的和熟知的重组dna或氨基酸序列技术获得的。
[0071]
术语“抗原”或“ag”是指能够被抗体特异性结合或以其它方式激发免疫反应的分子。该免疫反应可涉及抗体产生、或特异性免疫活性细胞的激活或两者。
[0072]
本领域技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽都可用作抗原。此外，抗原可衍生自重组或基因组dna。本领域技术人员将理解，包含编码引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna因此编码如本文所用的术语“抗原”。此
外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本公开包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫反应的多肽。此外，本领域技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生，或者可以来源于生物样品，或者可以是除多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其它生物组分的流体。
[0073]
本文所用的术语“cd19”是指分化簇19蛋白，其是可在b细胞白血病前体细胞、其它恶性b细胞和正常b细胞谱系的大多数细胞上检测到的抗原决定簇。
[0074]
如本文所用，术语“bcma”是指b细胞成熟抗原，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员17(tnfrsf17)，且分化簇269蛋白(cd269)是人中由tnfrsf17基因编码的蛋白。tnfrsf17是tnf受体超家族的细胞表面受体，其识别b细胞激活因子(baff)(参见例如laabi等人，embo 11(11)：3897-904(1992)。该受体在成熟b淋巴细胞中表达，并且对于b细胞发育和自身免疫反应可能是重要的。
[0075]
如本文所用，术语“cd16”(也称为fcγriii)是指在天然杀伤细胞、中性粒细胞多形核白细胞、单核细胞和巨噬细胞的表面上发现的分化分子簇。cd16已被鉴定为参与信号转导的fc受体fcγriiia(cd16a)和fcγriiib(cd16b)。cd16是参与抗体依赖性细胞毒性(adcc)的免疫球蛋白超家族(igsf)的分子。
[0076]
本文所用的“nkg2d”是指属于c型凝集素样受体的cd94/nkg2家族的跨膜蛋白。在人中，nkg2d由nk细胞、γδt细胞和cd8+αβt细胞表达。nkg2d识别来自mic和raet1/ulbp家族的诱导自身蛋白，其出现在应激的、恶性转化的和感染的细胞的表面上。
[0077]
间皮素(msln)是指通常存在于胸膜、腹膜和心包内衬的间皮细胞上的肿瘤分化抗原。间皮素在几种人肿瘤中过度表达，包括间皮瘤以及卵巢癌和胰腺腺癌。
[0078]
酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体ror1，也称为神经营养性酪氨酸激酶受体相关1(ntrkr1)是受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ror)家族的成员。它在癌症转移中起作用。
[0079]
术语“muc16”，也称为“粘蛋白16，细胞表面相关的”或“卵巢癌相关的肿瘤标记物ca125”是在其氨基末端含有胞外结构域，大串联重复结构域和具有短胞质结构域的跨膜结构域的膜栓系粘蛋白。该基因的产物已被用作不同癌症的标记物，其较高的表达水平与较差的结果相关。
[0080]
术语“cd22”，也称为唾液酸结合ig样凝集素2、siglec-2、t细胞表面抗原leu-14和b细胞受体cd22，是介导b细胞/b细胞相互作用的蛋白质，并且被认为参与b细胞在淋巴组织中的定位，并且与包括难治性血液癌症和毛细胞白血病的疾病有关。适用于本文公开的方法的完全人抗cd22单克隆抗体(“m971”)描述于例如xiao等人.，mabs.2009年5月-6月；1(3)：297-303中。
[0081]“cd79α”和“cd79β”基因编码构成b淋巴细胞抗原受体的蛋白质，该b淋巴细胞抗原受体是包括抗原特异性组分表面免疫球蛋白(ig)的多聚体复合物。表面ig与b细胞抗原受体的表达和功能所必需的两种其它蛋白ig-α和ig-β(分别由cd79α及其旁系同源物cd79β编码)非共价结合。该复合物的功能破坏可导致例如人b细胞慢性淋巴细胞白血病。
[0082]
b细胞激活因子或“baff”是属于肿瘤坏死因子(tnf)配体家族的细胞因子。该细胞因子是受体tnfrsf13b/taci、tnfrsf17/bcma和tnfrsf13c/baff-r的配体。该细胞因子在b
细胞谱系细胞中表达，并作为有效的b细胞激活剂。它还显示在b细胞的增殖和分化中起重要作用。
[0083]
术语“抗肿瘤效应”是指可通过各种方式表现的生物效应，包括但不限于例如肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数目的减少、转移瘤数目的减少、预期寿命的增加、肿瘤细胞增殖的减少、肿瘤细胞存活的减少或与癌症病症相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤效应”还可以通过本公开的肽、多核苷酸、细胞和抗体在首要位置预防肿瘤发生的能力来表明。
[0084]
术语“自体的”是指源自同一个体的任何材料，随后将其再引入该个体。
[0085]
术语“同种异体的(allogeneic)”或“同种异体的(allogenic)”是指源自与引入该材料的个体相同物种的不同动物或不同患者的任何材料。当一个或多个基因座上的基因不相同时，认为两个或多个个体彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种个体的同种异体材料可能在遗传上与抗原相互作用足够不同。
[0086]
术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
[0087]
术语“癌症”是指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部分。本文描述了各种癌症的实例，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
[0088]
术语“编码”是指多核苷酸(例如基因、cdna或mrna)中的特定核苷酸序列的固有性质，以用作在生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板，所述模板具有确定的核苷酸序列(例如rrna、trna和mrna)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物性质。因此，如果对应于基因的mrna的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因、cdna或rna编码该蛋白质。其核苷酸序列与mrna序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cdna转录模板的非编码链均可称为编码该基因或cdna的蛋白质或其它产物。
[0089]
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列还可以包括内含子，其程度使得编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可以含有一个或多个内含子。
[0090]
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文所述的化合物、制剂、材料或组合物有效实现特定生物或治疗结果的量。
[0091]
术语“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
[0092]
术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。
[0093]
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0094]
术语“功能破坏”是指对特定(例如，靶)核酸(例如，由其编码的蛋白质的基因、rna转录物)的物理或生物化学变化，其阻止其在细胞中的正常表达和/或行为。在一个实施方案中，功能破坏是指通过基因编辑方法修饰基因。在一个实施方案中，功能破坏阻止靶基因(例如内源基因)的表达。
[0095]
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应该
解释为还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
[0096]
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
[0097]
术语“慢病毒”指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的dna中，因此它们是基因递送载体的最有效的方法之一。hiv、siv和fiv都是慢病毒的实例。
[0098]
术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括milone等人，mol.ther.17(8)：1453-1464(2009)提供的自失活的慢病毒载体。可用于临床的慢病毒载体的其它实例包括但不限于例如来自oxford biomedica的lentivector
tm
基因递送技术、来自lentigen的lentimax
tm
载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可用的，并且是本领域技术人员已知的。
[0099]
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子(如两个dna分子或两个rna分子)之间，或两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当两个分子中的亚单位位置被相同的单体亚单位占据时；例如，如果两个dna分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置的数目的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，聚合物10个亚单位长度中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则两个序列是90％同源的。
[0100]
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如fv、fab、fab’、f(ab’)2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体及其抗体片段大部分是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体互补决定区(cdr)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的cdr的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不存在于受体抗体中也不存在于导入的cdr或框架序列中的残基。这些修饰可以进一步细化和优化抗体或抗体片段性能。一般而言，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的cdr区对应于非人免疫球蛋白的cdr区，所有或大部分的fr区是人免疫球蛋白序列的fr区。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白。更多细节参见jones等人，nature，321：522-525，1986；reichmann等人，nature，332：323-329，1988；presta，curr.op.struct.biol.，2：593-596，1992。
[0101]“人”或“完全人”是指免疫球蛋白，例如抗体或抗体片段，其中整个分子是人源的或由与人形式的抗体或免疫球蛋白相同的氨基酸序列组成。
[0102]
术语“分离的”是指从天然状态改变或除去。例如，天然存在于活动物中的核酸或
肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞。
[0103]
在本公开的上下文中，使用通常出现的核酸碱基的以下缩写。“a”指腺苷，“c”指胞嘧啶，“g”指鸟苷，“t”指胸苷，“u”指尿苷。
[0104]
术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特性的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸替换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术将修饰引入本公开的抗体或抗体片段中，例如定点诱变和pcr介导的诱变。保守氨基酸替换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本公开的tfp内的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且改变的tfp可使用本文所述的功能测定来测试。
[0105]
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。可操作地连接的dna序列可以是彼此相邻的，并且，例如，当需要连接两个蛋白质编码区时，它们在同一读码框中。
[0106]
术语免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
[0107]
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其聚合物。除非特别限制，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合性质，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)、等位基因、直向同源物、snp和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子替换可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换的序列来实现(batzer等人，nucleic acid res.19：5081(1991)；ohtsuka等人，j.biol.chem.260：2605-2608(1985)；以及rossolini等人，mol.cell.probes 8：91-98(1994))。
[0108]
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽可以包含至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链，其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚体，以及长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，其中存在许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
[0109]
术语“启动子”是指被细胞的转录机制或引入的合成机制识别的dna序列，其可用于启动多核苷酸序列的特异性转录。
[0110]
术语“启动子/调控序列”指用于表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，而在其它情况下，该序列还可以包括增强子序列和用于表达基因产物的其它调控元件。例如，启动子/调控序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
[0111]
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，引起基因产物在细胞的大多数或所有生理条件下在细胞中产生的核苷酸序列。
[0112]
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当细胞中存在对应于启动子的诱导物时才引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
[0113]
术语“组织特异性”启动子是指当与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
[0114]
在scfv的上下文中使用的术语“接头”和“柔性多肽接头”是指由单独或组合使用的氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，以将可变重链和可变轻链区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽接头是gly/ser接头并且包含氨基酸序列(gly-gly-gly-ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(gly4ser)4或(gly4ser)3。在另一个实施方案中，接头包括(gly2ser)、(glyser)或(gly3ser)的多个重复。wo2012/138475(通过引用并入本文)中描述的接头也包括在本公开的范围内。在一些情况下，接头序列包含长接头(ll)序列。在一些情况下，长接头序列包含(g4s)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(sl)序列。在一些情况下，短接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至3。
[0115]
如本文所用，5
′
帽(也称为rna帽、rna 7-甲基鸟苷帽或rna m7g帽)是在转录开始后不久添加到真核信使rna的“前”或5
′
端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。5
′
帽由连接至第一个转录的核苷酸的末端基团组成。其存在对于核糖体识别和保护免受rna酶是关键的。加帽与转录偶联，并且以共转录方式发生，使得相互影响。转录开始后不久，正合成的mrna的5
′
端被与rna聚合酶相关的帽合成复合物结合。该酶复合物催化用于mrna加帽的化学反应。合成作为多步生物化学反应进行。可以修饰加帽部分以调节mrna的功能，例如其稳定性或翻译效率。
[0116]
如本文所用，“体外转录的rna”是指已在体外合成的rna，优选mrna。通常，体外转录的rna由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的rna的模板。
[0117]
如本文所用，“poly(a)”是通过聚腺苷酸化连接到mrna的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施方案中，polya为50-5000，优选大于64，更优选大于100，最优选大于300或400。poly(a)序列可被化学修饰或酶修饰以调节mrna功能，如定位、稳定性或翻译效率。
[0118]
如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酸部分或其修饰变体与信使rna分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使rna(mrna)分子在3
′
端被聚腺苷酸化。3
′
poly(a)尾是通过酶聚腺苷酸聚合酶的作用添加到前mrna的腺嘌呤核苷酸的长序列(通常数百个)。在高等
真核生物中，将poly(a)尾添加到含有特定序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。poly(a)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mrna不被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mrna从细胞核输出和翻译也是重要的。聚腺苷酸化在dna转录成rna后立即在细胞核中发生，但也可在细胞质中稍后发生。转录终止后，通过与rna聚合酶相关的核酸内切酶复合物的作用切割mrna链。切割位点的特征通常在于在切割位点附近存在碱基序列aauaaa。在mrna被切割后，将腺苷残基添加到切割位点的游离3
′
末端。
[0119]
如本文所用，“瞬时”是指未整合的转基因在数小时、数天或数周内的表达，其中表达的时间段小于如果整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的基因表达的时间段。
[0120]
术语“信号转导途径”是指在信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分中起作用的多种信号转导分子之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并跨细胞膜传输信号的分子和分子复合物。
[0121]
术语“受试者”旨在包括其中可引发免疫反应的活生物体(例如哺乳动物、人)。
[0122]
术语“基本上纯化的”细胞是指基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其它细胞类型分离的细胞，所述其它细胞类型在其天然存在状态下通常与其结合。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质细胞群。在其它情况下，该术语仅指已经与它们在其天然状态下天然结合的细胞分离的细胞。在一些方面，细胞在体外培养。在其它方面，细胞不在体外培养。
[0123]
本文所用的术语“治疗”是指治疗。通过疾病状态的减少、抑制、缓解或根除获得治疗效果。
[0124]
本文所用的术语“预防”是指疾病或疾病状态的预防或保护性治疗。
[0125]
在本公开的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性障碍抗原”或“与过度增殖性障碍相关的抗原”是指特定过度增殖性障碍共有的抗原。在某些方面，本公开的过度增殖性障碍抗原来源于癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、nhl、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
[0126]
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其后代。
[0127]
术语“特异性结合”是指抗体、抗体片段或特异性配体，其识别并结合样品中存在的同源结合配偶体(例如cd19)，但其不一定且基本上识别或结合样品中的其它分子。
[0128]
如本文所用，术语“大范围核酸酶”是指以大于12个碱基对的识别序列结合双链dna的核酸内切酶。优选地，本公开的大范围核酸酶的识别序列是22个碱基对。大范围核酸酶可以是衍生自i-crel的核酸内切酶，并且可以指相对于天然i-crel在例如dna结合特异性、dna切割活性、dna结合亲和力或二聚化特性方面已被修饰的i-crel的工程化变体。用于产生i-crel的此类修饰变体的方法是本领域已知的(例如，wo2007/047859)。本文所用的大范围核酸酶以异源二聚体或“单链大范围核酸酶”与双链dna结合，其中使用肽接头将一对dna结合结构域连接到单个多肽中。术语“归巢核酸内切酶”与术语“大范围核酸酶”同义。当在细胞中，特别是在人t细胞中表达时，本公开的大范围核酸酶是基本上无毒的，这样使得
当使用文中描述的方法测量时，细胞可以被转染并且维持在37℃而没有观察到对细胞活力的有害影响或大范围核酸酶切割活性的显著降低。
[0129]
如本文所用，术语“单链大范围核酸酶”是指包含通过接头连接的一对核酸酶亚单位的多肽。单链大范围核酸酶具有以下结构：n端亚单位-接头-c端亚单位。两个大范围核酸酶亚单位通常在氨基酸序列上是不相同的，并且将识别不相同的dna序列。因此，单链大范围核酸酶通常切割假回文或非回文识别序列。单链大范围核酸酶可以被称为“单链异二聚体”或“单链异二聚体大范围核酸酶”，尽管事实上它不是二聚体。为清楚起见，除非另有说明，否则术语“大范围核酸酶”可指二聚体或单链大范围核酸酶。
[0130]
如本文所用，术语“talen”是指包含dna结合结构域的核酸内切酶，所述dna结合结构域包含与foki核酸酶结构域的任何部分融合的16-22个tal结构域重复。
[0131]
如本文所用，术语“紧凑型talen”是指包含具有16-22个tal结构域重复的dna结合结构域的核酸内切酶，所述重复以任何取向与i-tevl归巢核酸内切酶的核酸酶结构域的任何催化活性部分融合。
[0132]
如本文所用，术语“crispr”是指基于半胱天冬酶的核酸内切酶，其包含半胱天冬酶，例如cas9，和指导rna，所述指导rna通过与基因组dna中的识别位点杂交来指导半胱天冬酶的dna切割。
[0133]
如本文所用，术语“megatal”是指单链核酸酶，其包含具有工程化的序列特异性归巢核酸内切酶的转录激活物样效应物(tale)dna结合结构域。
[0134]
范围：贯穿本公开，本公开的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不灵活限制。因此，范围的描述应被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应被认为具有具体公开的子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个实例，诸如95-99％同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的某物，并且包括诸如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性的子范围。这不管范围的宽度如何都适用。
[0135]
描述
[0136]
在一些实施方案中，本文公开了包含编码tfp、car、tcr或其组合的序列的重组核酸。在更优选的实施方案中，本文提供了包含编码tfp、car、tcr或其组合的序列的circrna。根据一个方面，本文提供了包含编码tfp、car、tcr或其组合的序列的转移载体。
[0137]
本文提供了使用包含t细胞受体(tcr)融合蛋白的修饰的人免疫细胞治疗疾病如癌症的物质组合物和使用方法。如本文所用，“t细胞受体(tcr)融合蛋白”或“tfp”包括衍生自包含tcr的各种多肽的重组多肽，其通常能够i)结合靶细胞上的表面抗原和ii)通常当共同位于t细胞中或表面上时，与完整tcr复合物的其它多肽组分相互作用。如本文所提供的，与嵌合抗原受体相比，tfp提供了显著的益处。术语“嵌合抗原受体”或“car”是指包含scfv形式的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文也称为“胞内信号传导结构域”)的重组多肽，该胞质信号传导结构域包含衍生自如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域。通常，car的中心胞内信号传导结构域衍生自通常发现与tcr复合物结合的cd3ζ链。cd3ζ信号传导结构域可以与衍生自至少一种共刺激分子如4-1bb(即cd137)、
cd27和/或cd28的一个或多个功能性信号传导结构域融合。
[0138]
t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)
[0139]
本公开涵盖编码tfp的重组核酸构建体，其中tfp包含结合结构域，例如抗原结合结构域，例如包含特异性结合肿瘤相关抗原(taa)(例如人taa)的抗体片段或配体结合结构域，其中结合结构域的序列与编码tcr亚单位或其部分的核酸序列邻接且在同一读码框中。
[0140]
在一个方面，本公开的tfp包含另外称为抗原结合结构域的靶特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的靶抗原的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记物的靶抗原。因此，可作为本公开的tfp中的抗原结合结构域的靶抗原的细胞表面标记物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染；自身免疫性疾病；和癌症疾病(例如，恶性疾病)相关的那些。
[0141]
在一个方面，tfp介导的t细胞反应可通过将抗原结合结构域工程化到特异性结合所需抗原的tfp中而针对感兴趣的抗原。
[0142]
在一个方面，包含抗原结合结构域的tfp部分包含靶向肿瘤相关抗原(例如人肿瘤相关抗原)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，taa是cd19、cd20、cd22、bcma、msln、il13ra2、egfrviii、mucl6、ror1、her2、baff、baff受体、pd-l1、cd79b或psma。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或其片段。在一个方面，包含抗原结合结构域的tfp部分包含配体结合结构域如nkg2d或cd16。抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体，如骆驼科动物来源的纳米抗体的重链可变结构域(vh)、轻链可变结构域(v
l
)和可变结构域(v
hh
)，以及本领域已知的用作抗原结合结构域的替代支架，如重组纤连蛋白结构域、anticalin、darpin等。同样，特异性识别和结合靶抗原的天然或合成配体可用作tfp的抗原结合结构域。在一些情况下，抗原结合结构域源自tfp将最终用于其中的相同物种是有益的。例如，用于人时，tfp的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基可能是有益的。
[0143]
因此，在一方面，抗原结合结构域包括人源化或人抗体或抗体片段、或鼠抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人源化或人抗taa结合结构域包含具有本文所述的人源化或人抗taa结合结构域的一个或多个(例如所有三个)轻链互补决定区1(lc cdr1)、轻链互补决定区2(lc cdr2)和轻链互补决定区3(lc cdr3)和/或本文所述的人源化或人抗taa结合结构域的一个或多个(例如所有三个)重链互补决定区1(hc cdr1)、重链互补决定区2(hc cdr2)和重链互补决定区3(hc cdr3)的scfv，例如包含一个或多个(例如所有三个)lc cdr和一个或多个(例如所有三个)hc cdr的人源化或人抗taa结合结构域。在一个实施方案中，人源化或人抗taa结合结构域包含本文所述的人源化或人抗taa结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(hc cdr1)、重链互补决定区2(hc cdr2)和重链互补决定区3(hc cdr3)，例如，人源化或人抗taa结合结构域具有两个可变重链区，各自包含本文所述的hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3。在一个实施方案中，人源化或人抗taa结合结构域包含本文所述的人源化或人轻链可变区和/或本文所述的人源化或人重链可变区。在一个实施方案中，人源化或人抗taa结合结构域包含本文所述的人源化重链可变区，例如至少两个本文所述的人源化或人重链可变区。在一个实施方案中，抗taa结合结构域是包含本文提供的氨基酸序列的轻链和重链的scfv。在一个实施方案中，抗taa结合结构域(例如scfv)包含：
轻链可变区，其包含具有本文提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，替换)但不超过30、20或10个修饰(例如，替换)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有本文提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，替换)但不超过30、20或10个修饰(例如，替换)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化或人抗taa结合结构域是scfv，并且包含本文所述的氨基酸序列的轻链可变区经由接头(例如本文所述的接头)连接至包含本文所述的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，人源化抗taa结合结构域包括(gly
4-ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选3或4。scfv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以下取向中的任一个：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。在一些情况下，接头序列包含长接头(ll)序列。在一些情况下，长接头序列包含(g4s)n，其中n＝2至10，例如2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(sl)序列。在一些情况下，短接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至3。
[0144]
在一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与人中天然产生的抗体或其片段的相似性。在一个方面，抗原结合结构域是人源化的。
[0145]
人源化抗体可以使用本领域已知的多种技术产生，包括但不限于cdr-移植(参见例如欧洲专利号ep 239,400；国际公布号wo 9i/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101、和5,585,089，其各自通过引用整体并入本文)、镶面或表面重修(参见例如欧洲专利号ep 592,106和ep 519,596；padlan，1991，molecular immunology，28(4/5)：489-498；studnicka等人，1994，protein engineering，7(6)：805-814；和roguska等人，1994，pnas，91：969-973，其各自通过引用整体并入本文)、链改组(参见例如美国专利号5,565,332，其通过引用整体并入本文)、以及以下公开的技术：例如美国专利申请公开号us2005/0042664、美国专利申请公开号us2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号wo 9317105、tan等人，j.immunol.，169：1119-25(2002)、caldas等人，protein eng.，13(5)：353-60(2000)、morea等人，methods，20(3)：267-79(2000)、baca等人，j.biol.chem.，272(16)：10678-84(1997)、roguska等人，protein eng.，9(10)：895-904(1996)、couto等人，cancer res.，55(23supp)：5973s-5977s(1995)、couto等人，cancer res.，55(8)：1717-22(1995)、sandhu j s，gene，150(2)：409-10(1994)和pedersen等人，j.mol.biol.，235(3)：959-73(1994)，其各自通过引用整体并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自cdr供体抗体的相应残基替换，以改变例如改善抗原结合。这些框架替换通过本领域熟知的方法鉴定，例如通过对cdr和框架残基的相互作用进行建模以鉴定对于抗原结合重要的框架残基和通过序列比较以鉴定特定位置处的不寻常的框架残基(参见例如，queen等人，美国专利号5,585,089；和riechmann等人，1988，nature，332：323，其通过引用整体并入本文)。
[0146]
人源化抗体或抗体片段具有一个或多个来自非人来源的剩余氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。如本文提供的，人源化抗体或抗体片段包含一个或多个来自非人免疫球蛋白分子的cdr和框架区，其中构成框架的氨基酸残基完全或大部分来源于人种系。用于抗体或抗体片段的人源化的多种技术是本领域熟知的，并且基本上可以按照winter和同事的方法进行(jones等人，nature，321：522-525(1986)；riechmann等人，nature，332：323-327(1988)；verhoeyen等人，science，
239：1534-1536(1988))，通过用啮齿动物cdr或cdr序列替换人抗体的相应序列，即cdr移植(ep 239,400；pct公开号wo 91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其内容通过引用整体并入本文)。在这种人源化抗体和抗体片段中，基本上少于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列替换。人源化抗体通常是人抗体，其中一些cdr残基和可能的一些框架(fr)残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基替换。抗体和抗体片段的人源化也可以通过镶面或表面重修(ep 592,106；ep 519,596；padlan，1991，molecular immunology，28(4/5)：489-498；studnicka等人，protein engineering，7(6)：805-814(1994)；和roguska等人，pnas，91：969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)来实现，这些内容通过引用整体并入本文。
[0147]
选择用于制备人源化抗体的人可变区(轻和重)是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。最接近啮齿动物的人序列随后被接受为人源化抗体的人框架(fr)(sims等人，j.immunol.，151：2296(1993)；chothia等人，j.mol.biol.，196：901(1987)，其内容通过引用整体并入本文)。另一种方法使用衍生自轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体(参见，例如，nicholson等人mol.immun.34(16-17)：1157-1165(1997)；carter等人，proc.natl.acad.sci.usa，89：4285(1992)；presta等人，j.immunol.，151：2623(1993)，其内容通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，重链可变区的框架区，例如所有四个框架区衍生自vh4-4-59种系序列。在一个实施方案中，框架区可包含例如相应鼠序列的氨基酸的1、2、3、4或5个修饰，例如替换。在一个实施方案中，轻链可变区的框架区，例如所有四个框架区衍生自vk3-1.25种系序列。在一个实施方案中，框架区可包含例如相应鼠序列的氨基酸的1、2、3、4或5个修饰，例如替换。
[0148]
在一些方面，本公开的tfp组合物的包含抗体片段的部分是人源化的，保留了对靶抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。根据本公开的一个方面，人源化抗体和抗体片段通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的并且是本领域技术人员所熟悉的。可以使用计算机程序来说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。这样，可以从受体和输入序列中选择并组合fr残基，从而实现所需的抗体或抗体片段特征，例如对靶抗原的亲和力增加。通常，cdr残基直接和最基本地参与影响抗原结合。
[0149]
人源化抗体或抗体片段可以保留与原始抗体类似的抗原特异性，例如，在本公开中，结合人cd20、cd22、bcma、msln、il13ra2、epha2、ny-eso-1、psma、baff、egfrviii、muc16、muc1、ror1或cd19的能力。在一些实施方案中，人源化抗体或抗体片段可具有改善的结合人cd19、cd20、cd22、bcma、msln、il13ra2、epha2、ny-eso-1、psma、baff、egfrviii、muc16、muc1或ror1的亲和力和/或特异性。
[0150]
在一方面，抗taa结合结构域的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或性质。例如，在一方面，本公开的tfp组合物的包含抗原结合结构域的部分特异性结合选自包含以下的组的肿瘤相关抗原：人cd19、人bcma、人msln、人cd20、人cd22、人ror1、人baff、人muc16、人epha2、人ny-eso-1、人psma、人il13ra2和人egfrviii。在一方面，抗原结合结构域
对人cd19具有相同或相似的结合特异性，如nicholson等人mol.immun.34(16-17)：1157-1165(1997)中所述。在一方面，本公开涉及包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域，其中所述抗体结合结构域特异性结合taa蛋白或其片段，其中所述抗体或抗体片段包含含有本文提供的氨基酸序列的可变轻链和/或可变重链。在某些方面，scfv与前导序列相邻并在同一读码框中。
[0151]
在一方面，抗taa结合结构域是片段，例如单链可变片段(scfv)。在一方面，抗taa结合结构域是fv、fab、(fab’)2或双功能(例如双特异性)杂交抗体(例如lanzavecchia等人，eur.j.immunol.17，105(1987))。在一方面，本公开的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合taa蛋白。在一方面，抗taa结合结构域是单结构域(sdab)抗体或其片段。在另一方面，抗taa结合结构域是vhh。
[0152]
本文还提供了用于获得对靶抗原(例如，肿瘤相关抗原(taa)诸如cd19、bcma、msln、或本文别处描述的用于融合部分结合结构域的靶标的任何靶抗原)特异性的抗体抗原结合结构域的方法，所述方法包括通过在本文列出的vh结构域的氨基酸序列中添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸来提供vh结构域，所述vh结构域是vh结构域的氨基酸序列变体，任选地将由此提供的vh结构域与一个或多个v
l
结构域组合，以及测试vh结构域或一个或多个vh/v
l
组合以鉴定对感兴趣的靶抗原具有特异性并且任选地具有一种或多种期望特性的特异性结合成员或抗体抗原结合结构域。
[0153]
在一些情况下，vh结构域和scfv可根据本领域已知的方法制备(参见例如bird等人，(1988)science 242：423-426和huston等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883)。scfv分子可以通过使用柔性多肽接头将vh和v
l
区连接在一起而产生。scfv分子包含具有优化长度和/或氨基酸组成的接头(例如ser-gly接头)。接头长度可极大地影响scfv的可变区如何折叠和相互作用。事实上，如果使用短多肽接头(例如5-10个氨基酸)，则阻止了链内折叠。链间折叠可使两个可变区在一起以形成功能性表位结合位点。在一些情况下，接头序列包含长接头(ll)序列。在一些情况下，长接头序列包含(g4s)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(sl)序列。在一些情况下，短接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至3。接头取向和大小的实例参见例如hollinger等人1993proc natl acad.sci.u.s.a.90：6444-6448、美国专利申请公开号20050100543和20050175606、美国专利号7,695,936以及pct公开号wo2006/020258和wo2007/024715，其各自通过引用并入本文。
[0154]
scfv可在其v
l
和vh区之间包含约10、11、12、13、14、15或大于15个残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，接头序列包含甘氨酸和丝氨酸重复组，例如(gly4ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。在一个实施方案中，接头可以是(gly4ser)4或(gly4ser)3。接头长度的变化可以保持或增强活性，在活性研究中产生优异的功效。在一些情况下，接头序列包含长接头(ll)序列。在一些情况下，长接头序列包含(g4s)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(sl)序列。在一些情况下，短接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至3。
[0155]
稳定性和突变
[0156]
可参考常规对照scfv分子或全长抗体的生物物理特性(例如热稳定性)评估抗taa结合结构域(例如，scfv分子(例如可溶性scfv))的稳定性。在一个实施方案中，在所描述的
测定中，人源化或人scfv的热稳定性比亲本scfv高约约0.1、约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10摄氏度、约11摄氏度、约12摄氏度、约13摄氏度、约14摄氏度或约15摄氏度。
[0157]
抗taa结合结构域的改善的热稳定性随后赋予给整个cd19-tfp构建体，导致抗taa tfp构建体的改善的治疗特性。与常规抗体相比，抗taa结合结构域(例如scfv)的热稳定性可提高至少约2℃或3℃。在一个实施方案中，与常规抗体相比，抗taa结合结构域，例如scfv的热稳定性提高1℃。在另一个实施方案中，与常规抗体相比，抗taa结合结构域，例如scfv或sdab的热稳定性提高2℃。在另一个实施方案中，与常规抗体相比，scfv的热稳定性提高4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃。例如，可以在本文公开的scfv分子与衍生scfv vh和v
l
的抗体的scfv分子或fab片段之间进行比较。热稳定性可以使用本领域已知的方法测量。例如，在一个实施方案中，可以测量tm。在下面更详细地描述了测量tm的方法和测定蛋白质稳定性的其它方法。
[0158]
scfv中的突变(通过可溶性scfv的人源化或直接诱变产生)改变scfv的稳定性并改善scfv和抗taa tfp构建体的整体稳定性。使用诸如tm、温度变性和温度聚集的测量将人源化scfv的稳定性与鼠scfv进行比较。在一个实施方案中，抗taa结合结构域，例如scfv，包含源自人源化过程的至少一个突变，使得突变的scfv赋予抗taa tfp构建体改善的稳定性。在另一个实施方案中，抗taa结合结构域，例如scfv包含源自人源化过程的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个突变，使得突变的scfv赋予taa-tfp构建体改善的稳定性。
[0159]
在一方面，tfp的抗原结合结构域包含与本文所述的抗原结合结构域氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且抗原结合结构域保留本文所述的抗taa抗体片段的所需功能特性。在一个具体方面，本公开的tfp组合物包含抗体片段。在另一方面，抗体片段包含scfv。在另一实施方案中，抗体包含vh结构域。
[0160]
在多个方面，通过修饰一个或两个可变区(例如vh和/或v
l
)内，例如一个或多个cdr区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个氨基酸来工程化tfp的抗原结合结构域。在一个具体方面，本公开的tfp组合物包含抗体片段。在另一方面，抗体片段包含scfv。
[0161]
本领域普通技术人员将理解，可以进一步修饰本公开的抗体或抗体片段，使得它们改变氨基酸序列(例如，来自野生型)，但不改变期望的活性。例如，可以对蛋白质进行导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸替换的额外核苷酸替换。例如，分子中的非必需氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。在另一个实施方案中，氨基酸串可以被在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的结构上相似的串替换，例如，可以进行保守替换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。
[0162]
具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链((例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链((例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链((例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
[0163]
在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中的百分比同一性是指相同的两个或多个序列。当使用以下序列比较算法中的一种或通过人工比对和目视检查测量在比较窗口或
指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时，如果两个序列具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(例如，在特定区域上60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或当未指定时，在整个序列上)，则两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
[0164]
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下进行：例如通过smith和waterman，(1970)adv.appl.math.2：482c的局部同源性算法、通过needleman和wunsch，(1970)j.mol.biol.48：443的同源性比对算法、通过pearson和lipman，(1988)proc.nat’l.acad.sci.usa 85：2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta，genetics computer group，575science dr.，madison，wis.)、或通过人工比对和视觉检查(参见例如brent等人，(2003)current protocols in molecular biology)。适于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是blast和blast 2.0算法，其分别描述于altschul等人，(1977)nuc.acids res.25：3389-3402；和altschul等人，(1990)j.mol.biol.215：403-410中。用于进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。
[0165]
在一方面，本公开考虑了产生功能等同分子的起始抗体或片段(例如scfv)氨基酸序列的修饰。例如，包含在tfp中的抗taa结合结构域例如scfv的vh或v
l
可以被修饰以保留抗cd19结合结构域(例如scfv)的起始vh或v
l
框架区的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。本公开考虑了整个tfp构建体的修饰，例如在tfp构建体的各种结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以产生功能等同分子。可以修饰tfp构建体以保留起始tfp构建体的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
[0166]
胞外结构域
[0167]
胞外结构域可以源自天然或重组来源。当来源是天然来源时，结构域可以源自任何蛋白质，但特别是膜结合或跨膜蛋白。在一方面，胞外结构域能够与跨膜结构域结合。在本公开中特别使用的胞外结构域可以至少包括例如t细胞受体的α、β、γ或δ链、或cd3ε、cd3γ或cd3δ的胞外区域，或在替代的实施方案中，cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。
[0168]
跨膜结构域
[0169]
通常，tfp序列包含由单个基因组序列编码的胞外结构域和跨膜结构域。在替代的实施方案中，tfp可以被设计成包含与tfp的胞外结构域异源的跨膜结构域。跨膜结构域可
以包括与跨膜区相邻的一个或多个额外的氨基酸，例如，与跨膜来源的蛋白质的胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，胞外区域的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸)和/或与跨膜蛋白质来源的蛋白质的胞内区域相关的一个或多个额外的氨基酸(例如，胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸)。在一些情况下，跨膜结构域可以包括胞外区域的至少30、35、40、45、50、55、60或更多个氨基酸。在一些情况下，跨膜结构域可以包括胞内区域的至少30、35、40、45、50、55、60或更多个氨基酸。在一方面，跨膜结构域是与使用的tfp的其它结构域中的一个相关的跨膜结构域。在一些情况下，可通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。在一方面，跨膜结构域能够与tfp-t细胞表面上的另一tfp同二聚化。在不同的方面，可以修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列，以使与相同tfp中存在的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
[0170]
跨膜结构域可以源自天然或重组来源。当来源是天然来源时，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一方面，无论何时tfp与靶标结合，跨膜结构域都能够向胞内结构域发信号。在本公开中特别使用的胞外结构域可以至少包括例如t细胞受体的α、β、γ或δ链、cd28、cd3ε、cd3δ、cd3γ、cd3ξ、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154的跨膜区。
[0171]
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白的铰链)连接到tfp的胞外区，例如tfp的抗原结合结构域。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人免疫球蛋白(ig)铰链，例如igg4铰链或cd8a铰链。
[0172]
接头
[0173]
任选地，长度为2-10个氨基酸的短的寡肽或多肽接头可形成跨膜结构域和tfp的胞质区之间的连接。在一些情况下，接头的长度可以是至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。例如，在一方面，接头包含氨基酸序列ggggsggggs(seq id no：3)。在一些实施方案中，接头由核苷酸序列ggtggcggaggttctggaggtggaggttcc(seq id no：4)编码。
[0174]
胞质结构域
[0175]
tfp的胞质结构域可以包括胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域来自cd3γ、cd3δ、cd3ε、tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ。在一些实施方案中，如果tfp含有cd3γ、δ或ε多肽，则胞内结构域包含信号传导结构域；tcrα、tcrβ、tcrγ和tcrδ亚单位通常具有短的(例如长度为1-19个氨基酸)胞内结构域，并且通常缺乏信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责激活其中已引入tfp的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。尽管tcrα、tcrβ、tcrγ和tcrδ的胞内结构域不具有信号传导结构域，但它们能够募集具有本文所述的初级胞内信号传导结构域(例如cd3ζ)的蛋白质，所述初级胞内信号传导结构域用作胞内信号传导结构域。术语“效应子功能”是指细胞的特定功能。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质部分。虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要
其转导效应子功能信号，就可使用这种截短部分代替完整链。因此，术语胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
[0176]
用于本公开的tfp的胞内信号传导结构域的实例包括t细胞受体(tcr)的胞质序列和能够协同作用以在抗原受体接合后起始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
[0177]
已知通过单独tcr产生的信号可能不足以完全激活初始t细胞，并且可以使用次级和/或共刺激信号。因此，初始t细胞激活可以被认为由两种不同类型的胞质信号传导序列介导：通过tcr起始抗原依赖性初级激活的那些(初级胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质结构域，例如共刺激结构域)。
[0178]
初级信号传导结构域以刺激方式或抑制方式调节tcr复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级胞内信号传导结构域可含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的信号传导基序。
[0179]
含有在本公开中特别使用的初级胞内信号传导结构域的itam的实例包括cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。在一个实施方案中，本公开的tfp包含胞内信号传导结构域，例如cd3-ε的初级信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含修饰的itam结构域，例如与天然itam结构域相比具有改变的(例如增加的或降低的)活性的突变的itam结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含修饰的含itam的初级胞内信号传导结构域，例如优化的和/或截短的含itam的初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个itam基序。
[0180]
tfp的胞内信号传导结构域可以包含cd3信号传导结构域，例如cd3ε、cd3δ、cd3γ或cd3ζ，其本身或其可以与在本公开的tfp的上下文中有用的任何其它期望的胞内信号传导结构域组合。例如，tfp的胞内信号传导结构域可以包含cd3ε链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指包含共刺激分子的胞内结构域的tfp的一部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其可导致淋巴细胞对抗原的有效反应。这类分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性结合的配体等。例如，cd27共刺激已被证明在体外增强人tfp-t细胞的扩增、效应子功能和存活，并在体内增强人t细胞持久性和抗肿瘤活性(song等人blood.2012；119(3)：696-706)。
[0181]
本公开的tfp的胞质部分内的胞内信号传导序列可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，长度为例如2至10个氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的短寡肽或多肽接头可形成胞内信号传导序列之间的连接。
[0182]
在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸可用作合适的接头。
[0183]
在一方面，编码tfp或car或tcr的载体或环状rna在体外细胞中表达。另一方面，tfp或car或tcr在体内被递送至细胞。另一方面，tfp或car或tcr被离体递送至细胞。
[0184]
在一方面，本文所述的tfp表达细胞可还包含第二tfp，例如包含不同抗原结合结构域的第二tfp，例如针对相同靶标(相同taa)或不同靶标(例如cd123)。在一个实施方案中，当tfp表达细胞包含两种或多种不同的tfp时，不同tfp的抗原结合结构域可以使得抗原
结合结构域彼此不相互作用。例如，表达第一和第二tfp的细胞可以具有第一tfp的抗原结合结构域，例如作为片段，例如scfv，其不与第二tfp的抗原结合结构域形成结合，例如第二tfp的抗原结合结构域是v
hh
。
[0185]
在另一方面，本文所述的tfp表达细胞可以进一步表达另一种剂，例如增强修饰的人免疫细胞活性的剂。例如，在一个实施方案中，剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子(例如pd1)可降低修饰的人免疫细胞产生免疫效应反应的能力。抑制性分子的实例包括pd1、pd-l1、ctla4、tim3、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfrβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包含与向细胞提供正信号的第二多肽(例如本文所述的胞内信号传导结构域)结合的第一多肽(例如抑制性分子)。在一个实施方案中，剂包含第一多肽，例如抑制性分子如pd1、lag3、ctla4、cd160、btla、lair1、tim3、2b4和tigit的第一多肽，或任何这些的片段(例如任何这些的胞外结构域的至少一部分)，和第二多肽，所述第二多肽是本文所述的胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域(例如4-1bb、cd27或cd28，例如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的cd3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，剂包含pd1的第一多肽或其片段(例如，pd1的胞外结构域的至少一部分)，和本文所述的胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，本文所述的cd28信号传导结构域和/或本文所述的cd3ζ信号传导结构域)。pd1是cd28受体家族的抑制性成员，该家族还包括cd28、ctla-4、icos和btla。pd-1在激活的b细胞、t细胞和骨髓细胞上表达(agata等人1996int.immunol 8：765-75)。pd1的两种配体pd-l1和pd-l2已显示出在与pd1结合后下调t细胞激活(freeman等人2000 j exp med 192：1027-34；latchman等人2001 nat immunol 2：261-8；carter等人2002eur j immunol 32：634-43)。pd-l1在人癌症中含量丰富(dong等人2003 j mol med 81：281-7；blank等人2005 cancer immunol.immunother 54：307-314；konishi等人2004 clin cancer res 10：5094)。免疫抑制可通过抑制pd1与pd-l1的局部相互作用而逆转。
[0186]
在一个实施方案中，剂包含抑制性分子的胞外结构域(ecd)，例如，程序性死亡1(pd1)可与跨膜结构域和任选的胞内信号传导结构域如41bb和cd3ζ(本文也称为pd1 tfp)融合。在一个实施方案中，当与本文所述的抗taa tfp组合使用时，pd1 tfp改善t细胞的持久性。在一个实施方案中，tfp是包含pd1的胞外结构域的pd1 tfp。或者，提供含有特异性结合程序性死亡配体1(pd-l1)或程序性死亡配体2(pd-l2)的抗体或抗体片段如scfv的tfp。
[0187]
在另一方面，本公开提供了表达tfp的t细胞群，例如tfp-t细胞。在一些实施方案中，表达tfp的t细胞群包含表达不同tfp的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，tfp-t细胞群可包括表达具有本文所述抗taa结合结构域的tfp的第一细胞，和表达具有不同抗taa结合结构域的tfp的第二细胞，例如与第一细胞表达的tfp中的抗taa结合结构域不同的本文所述的抗taa结合结构域。作为另一个实例，表达tfp的细胞群可包括表达包含例如本文所述的抗taa结合结构域的tfp的第一细胞，和表达包含针对除cd19或bcma以外的靶标(例如另一肿瘤相关抗原)的抗原结合结构域的tfp的第二细胞。
[0188]
在另一方面，本公开提供了细胞群，其中该群体中的至少一个细胞表达具有本文所述的抗taa结构域的tfp，并且第二细胞表达另一种剂，例如增强修饰的人免疫细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如可以降低修饰的人免疫细胞产生免疫效应反应的能力。抑制性分子的实例包括
pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfrβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包含与向细胞提供正信号的第二多肽(例如本文所述的胞内信号传导结构域)结合的第一多肽(例如抑制性分子)。
[0189]
环状rna(circrna)
[0190]
本文公开了用于产生编码tfp、car、tcr或其组合的体外或体内转录的rna的方法。在优选的实施方案中，rna是circrna。在一些实施方案中，circrna是外源的。在其它实施方案中，circrna是内源的。在其它实施方案中，具有内部核糖体进入位点(ires)的circrna可以在体外或离体翻译。
[0191]
环状rna(circrna)是一类具有连续结构的单链rna，其具有增强的稳定性并且缺乏与各种细胞蛋白相互作用所必需的末端基序。circrna是3-5’共价闭合的rna环，并且circrna不显示帽或poly(a)尾。circrna缺乏核酸外切酶介导的降解所必需的游离末端，使得它们对多种rna转换机制具有抗性，并且与它们的线性mrna对应物相比，赋予它们延长的寿命。出于这个原因，环化可以使通常具有短半衰期的mrna稳定，因此可以提高mrna在各种应用中的总体效力。此外，当转染到细胞(例如t细胞)中时，circrna相对于其它形式的rna(例如shrna或双链rna)可具有降低的免疫原性。circrna由剪接过程产生，并且环化使用主要在注释的外显子边界处的常规剪接位点发生(starke等人，2015；szabo等人，2015)。对于环化，剪接位点反向使用：下游剪接供体“反向剪接”到上游剪接受体(综述参见jeck和sharpless，2014；barrett和salzman，2016；szabo和salzman，2016；holdt等人，2018)。
[0192]
为了产生随后可以转移到细胞中的circrna，可以对具有自催化剪接内含子的circrna的体外产生进行编程(图1)。产生circrna的方法可以包括用特别设计的引物体外转录(ivt)前体线性rna模板。迄今为止已经报道了用于rna环化的三种一般策略：使用溴化氰或类似缩合剂的化学方法，使用rna或dna连接酶的酶促方法和使用自剪接内含子的核酶方法。在优选的实施方案中，通过径流转录合成前体rna，然后在镁离子和gtp存在下加热以促进环化。如此产生的rna可有效转染不同种类的细胞。一方面，模板包括tfp、car和tcr或其组合的序列。
[0193]
噬菌体t4胸苷酸合酶(td)基因的第i组内含子被充分表征成环状，而外显子线性剪接在一起(chandry和bel-fort，1987；ford和ares，1994；perriman和ares，1998)。当td内含子顺序排列在任何外显子序列的侧翼时，外显子通过两个自催化酯交换反应环化(ford和ares，1994；puttaraju和been，1995)。在优选的实施方案中，噬菌体t4胸苷酸合酶(td)基因的第i组内含子用于产生外源circrna。
[0194]
在一些示例性实施方案中，使用利用排列的第i组催化内含子的核酶方法。该方法可能更适用于长rna环化，并且可能仅需要添加gtp和mg2+作为辅因子。这种排列的内含子-外显子(pie)剪接策略由侧接半内含子序列的融合部分外显子组成。在体外，这些构建体经历第i组催化内含子的双酯交换反应特征，但是因为外显子融合，所以它们被切除为共价5
′
和3
′
连接的环。
[0195]
在一方面，本文公开了一种序列，其包含全长脑心肌炎病毒(例如emcv)ires、编码tfp、car、tcr或其组合的基因、对应于外显子片段(e1和e2)的两个短区、以及在t4噬菌体的胸苷酸合酶(td)基因中的排列的第i组催化内含子或鱼腥藻的前体trna基因中的排列的第i组催化内含子的3
′
和5
′
内含子之间的pie构建体。在一个更优选的实施方案中，所述序列
还包含位于前体rna的5
′
和3
′
末端的互补
′
同源臂
′
，目的是使5
′
和3
′
剪接位点彼此接近。为了确保主要剪接产物是环状的，剪接反应可以用rna酶r处理。
[0196]
在一方面，抗taa tfp由circrna编码。一方面，将编码抗taa tfp的circrna引入t细胞以产生tfp-t细胞。在一个实施方案中，体外转录的rna tfp可作为瞬时转染的形式引入细胞。
[0197]
在一些方面，使用聚合酶链式反应(pcr)产生的模板通过体外转录产生线性前体rna。使用合适的引物和缓冲液以及rna聚合酶和修饰或未修饰的核苷酸，可以通过pcr将来自任何来源的目的dna直接转化为模板用于体外rna合成。dna的来源可以是例如基因组dna、质粒dna、噬菌体dna、cdna、消化的dna、合成的dna序列或任何其它合适的dna来源。用于体外转录的期望模板是本公开的tfp。在一个实施方案中，用于pcr的dna含有开放阅读框。dna可以来自生物体基因组的天然存在的dna序列。在一个实施方案中，核酸可以包括5
′
和/或3
′
非翻译区(utr)中的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一个实施方案中，用于pcr的dna是人核酸序列。在另一个实施方案中，用于pcr的dna是包括5
′
和3
′
utr的人核酸序列。或者，dna可以是在天然存在的生物体中通常不表达的人工dna序列。示例性的人工dna序列是含有连接在一起形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因部分的序列。连接在一起的dna部分可以来自单个生物体或来自多个生物体。
[0198]
在一些示例性实施方案中，pcr用于生成用于转染用的线性前体rna的体外转录的模板。进行pcr的方法是本领域熟知的。用于pcr的引物被设计成具有与用作pcr模板的dna区域基本上互补的区域。本文所用的“基本上互补”是指引物序列中大部分或全部碱基是互补的，或一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于pcr的退火条件下与预期的dna靶退火或杂交。引物可以被设计成与dna模板的任何部分基本上互补。例如，引物可以被设计成扩增通常在细胞中转录的核酸部分(开放阅读框)，包括5
′
和3
′
utr。引物也可以被设计成扩增编码特定目的结构域的核酸部分。在一个实施方案中，引物被设计成扩增人cdna的编码区，包括5
′
和3
′
utr的全部或部分。用于pcr的引物可通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是含有与待扩增dna序列上游的dna模板上的核苷酸基本互补的核苷酸区域的引物。“上游”在本文中用于指待扩增的dna序列相对于编码链的5
′
位置。“反向引物”是含有与待扩增dna序列下游的双链dna模板基本互补的核苷酸区域的引物。“下游”在本文中用于指待扩增dna序列相对于编码链的3
′
位置。
[0199]
可用于pcr的任何dna聚合酶可用于本文公开的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
[0200]
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。rna优选具有5
′
和3
′
utr。在一个实施方案中，5
′
utr的长度为1-3000个核苷酸。添加到编码区的5
′
和3
′
utr序列的长度可通过不同方法改变，包括但不限于设计与utr的不同区域退火的pcr引物。使用此方法，本领域普通技术人员可修饰5
′
和3
′
utr长度以在转染转录的rna后实现最佳rna稳定性或/和翻译效率。
[0201]5′
和3
′
utr可以是目的核酸的天然存在的内源5
′
和3
′
utr。或者，可以通过将utr序列掺入正向和反向引物中或通过模板的任何其它修饰来添加对目的核酸而言不是内源的utr序列。使用对目的核酸而言非内源的utr序列可用于修饰rna的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3
′
utr序列中富含au的元件可以降低mrna的稳定性，而蛋白结合基序可以增加
mrna和circrna的稳定性。因此，可以基于本领域熟知的utr的性质选择或设计3
′
utr以增加转录的rna的稳定性。
[0202]
在一个实施方案中，5
′
utr可含有内源核酸的kozak序列。或者，当通过如上所述的pcr添加对目的核酸而言不是内源的5
′
utr时，可通过添加5
′
utr序列重新设计共有kozak序列。kozak序列可以提高一些rna转录物的翻译效率，但可能不是所有rna都能有效翻译所需的。本领域已知的许多mrna可以包含kozak序列。在其它实施方案中，5
′
utr可以是其rna基因组在细胞中是稳定的rna病毒的5
′
utr。在其它实施方案中，可在3
′
或5
′
utr中使用各种核苷酸类似物以阻止mrna的核酸外切酶降解。
[0203]
为了能够在不需要基因克隆的情况下从dna模板合成线性前体rna，应将转录启动子连接到待转录序列上游的dna模板上。当将作为rna聚合酶启动子的序列添加到正向引物的5
′
端时，rna聚合酶启动子被并入到待转录的开放阅读框上游的pcr产物中。在一个优选的实施方案中，启动子是t7聚合酶启动子，如本文别处所述。其它有用的启动子包括但不限于t3和sp6 rna聚合酶启动子。t7、t3和sp6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
[0204]
在一些实施方案中，rna在5
′
末端具有帽和3
′
poly(a)尾，其决定细胞中核糖体结合、翻译起始和mrna稳定性。在环状dna模板例如质粒dna上，rna聚合酶产生不适于在真核细胞中表达的长串联体产物。在3
′
utr末端线性化的质粒dna的转录产生正常大小的mrna，其在真核转染中无效，即使其在转录后被聚腺苷酸化。
[0205]
在线性dna模板上，噬菌体t7 rna聚合酶可以将转录物的3
′
端延伸超过模板的最后一个碱基(schenborn和mierendorf，nuc acids res.，13：6223-36(1985)；nacheva和berzal-herranz，eur.j.biochem.，270：1485-65(2003))。
[0206]
将polya/t片段整合到dna模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒dna中的polya/t序列可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒dna模板经常被缺失和其它畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费力和耗时，而且通常不可靠。这就是为什么非常需要在不克隆的情况下构建具有polya/t3
′
片段的dna模板的方法的原因。
[0207]
转录dna模板的polya/t片段可以在pcr过程中通过使用含有polyt尾的反向引物产生，例如100t尾(大小可以是50-5000t)，或者在pcr之后通过任何其它方法产生，包括但不限于dna连接或体外重组。poly(a)尾也为rna提供稳定性并减少它们的降解。通常，poly(a)尾的长度与转录的rna的稳定性正相关。在一个实施方案中，poly(a)尾是100-5000个腺苷。
[0208]
rna的poly(a)尾可以在体外转录后使用poly(a)聚合酶如大肠杆菌polya聚合酶(e-pap)进一步延伸。在一个实施方案中，将poly(a)尾的长度从100个核苷酸增加到300-400个核苷酸导致rna翻译效率增加约两倍。另外，不同化学基团与3
′
端的连接可增加mrna稳定性。这种连接可以含有修饰的/人工的核苷酸、适体和其它化合物。例如，可使用poly(a)聚合酶将atp类似物掺入poly(a)尾。atp类似物可进一步增加rna的稳定性。
[0209]5′
帽还可以为rna分子提供稳定性。在一些实施方案中，通过本文公开的方法产生的rna包括5
′
帽。使用本领域已知和本文所述的技术提供5
′
帽(cougot，等人，trends in biochem.sci.，29：436-444(2001)；stepinski，等人，rna，7：1468-95(2001)；elango，等人，biochim.biophys.res.commun.，330：958-966(2005))。
[0210]
通过本文公开的方法产生的rna(例如circrna)还可以含有内部核糖体进入位点
(ires)序列。ires序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，其起始不依赖帽的核糖体与mrna的结合并促进翻译的起始。可以包括适合于细胞电穿孔的任何溶质，其可以含有促进细胞渗透性和生存力的因子，例如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
[0211]
可使用多种不同方法中的任一种将rna引入靶细胞中，例如可商购的方法，包括但不限于电穿孔(amaxa-ii(amaxa biosystems，cologne，germany))、ecm 830(btx)(harvard instruments，boston，mass.)、氖转染系统(thermofisher)、细胞挤压(sqz biotechnologies)或geneii(biorad，denver，colo.)、(eppendorf，hamburg germany)、使用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染、或生物射弹粒子递送系统如“基因枪”(参见例如nishikawa，等人hum gene ther.，12(8)：861-70(2001)。
[0212]
基于排列的内含子-外显子(pie)剪接策略的pie选择
[0213]
circrna通常由长于平均的外显子形成，并且通常在它们相关的前体mrna中侧接长于平均的内含子(jeck等人，2013；salzman等人，2012)；这种内含子富含被认为在人许多circrna的生物发生中起作用的互补alu元件(jeck等人，2013)。因此，排列的内含子-外显子(pie)剪接策略由侧接半内含子序列的融合的部分外显子组成[wesselhoeft等人，nat.commun.，9：26-29.，2018]。可以基于其侧翼内含子的序列组成预测circrna。
[0214]
噬菌体t4胸苷酸合酶(td)基因的第i组内含子被充分表征成环状，而外显子线性剪接在一起(chandry和bel-fort，1987；ford和ares，1994；perriman和ares，1998)。当td内含子顺序在任何外显子序列侧翼排列(50个一半位于30位，反之亦然)时，外显子通过两个自催化酯交换反应环化(ford和ares，1994；puttaraju和been，1995)。在优选的实施方案中，在所公开的circrna的设计中使用自剪接内含子[wesselhoeft等人，nat.commun.，9：26-29.，2018]。在更优选的实施方案中，第i组内含子用于设计公开的circrna以促进自剪接和环化。
[0215]
ires
[0216]
帽非依赖性翻译是真核生物中翻译起始的替代方式，其取决于诱导内部起始的特定元件例如内部核糖体进入位点(ires)的存在。ires序列首先在病毒rna中报道，并且当在rna内部时结合真核核糖体(chen和sarnow，1995；perriman和ares，1998)。原则上，ires驱动的翻译的关键特征是其5
′
端非依赖性，而不是帽非依赖性。
[0217]
与线性mrna不同，circrna严重依赖于折叠的rna结构，包括排列的第i组内含子和ires，用于剪接和翻译。例如，靠近ires的二级结构，包括在直接跟随ires的编码区内，具有破坏ires折叠和翻译起始的潜力，影响环化效率。因此，应根据pie的选择来选择和测试不同种类的ires序列。
[0218]
在一些实施方案中，ires序列选自包含病毒序列如ampv、csfv、cvb3、emcv、ev71、hav、hrv2、htlv和pv(脊髓灰质炎病毒)的组。在优选的实施方案中，ires序列选自柯萨奇病毒b3(cvb3)。在其它优选的实施方案中，ires序列选自脑心肌炎病毒(emcv)。
[0219]
提高环化效率的同源臂
[0220]
′
同源臂
′
是位于前体线性rna的5
′
和3
′
末端的互补序列，目的是使5
′
和3
′
剪接位点彼此接近。没有同源臂，预测在前体rna的末端之间不会发生碱基配对。已经报道同源臂
的添加导致增加的剪接效率以及环化效率[wesselhoeft等人，nat.commun.，9：26-29.，2018]。rnafold webserver(由维也纳大学提供的位点)预测单链rna或dna序列的二级结构。前体rna二级结构的预测为设计同源臂提供信息。在一些实施方案中，rnafold用于测试同源臂序列的序列变体。在一些实施方案中，序列长度在20至150个核苷酸的范围内选择。在一些实施方案中，在前体线性rna的5
′
和3
′
端存在多于一个同源臂序列。
[0221]
在一方面，本文公开了前体线性rna序列，其含有全长脑心肌炎病毒(例如emcv)ires、编码tfp、car、tcr或其组合的基因、对应于外显子片段(e1和e2)的两个短区、以及在t4噬菌体的胸苷酸合酶(td)基因中的排列的第i组催化内含子或鱼腥藻的前体trna基因中的排列的第i组催化内含子的3
′
和5
′
内含子之间的pie构建体。在更优选的实施方案中，所述序列还包含位于前体rna的5
′
和3
′
端的互补
′
同源臂
′
，目的是使5
′
和3
′
剪接位点彼此接近。另一方面，从所述线性rna序列自剪接得到的circrna包含两个外显子片段(e1和e2)之间的区域，该区域包含ires、编码tfp、car、tcr或其组合的基因、间隔序列(任选的)和同源臂(任选的)。
[0222]
间隔序列
[0223]
为了进一步提高由自剪接前体rna产生circrna的效率，可以进行进一步优化[wesselhoeft等人，nat.commun.，9：26-29.，2018]。ires内的序列可能干扰剪接核酶的折叠，无论是在3
′
剪接位点的近端还是因为3
′
pie剪接位点接近ires而通过长距离接触在5
′
剪接位点的远端，并且因为两个序列都是高度结构化的。已预测间隔序列的添加允许以增加的剪接效率进行剪接[wesselhoeft等人，nat.commun.，9：26-29.，2018]。
[0224]
在一些实施方案中，rnafold用于测试间隔序列的序列变体。在一些实施方案中，序列长度选择为在20-150个核苷酸的范围内。
[0225]
编码tfp的重组核酸
[0226]
在一些实施方案中，本文公开了包含编码t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)的序列的重组核酸，所述tfp包含(i)tcr亚单位，所述tcr亚单位包含(1)tcr胞外结构域的至少一部分，(2)跨膜结构域，和(3)来自cd3ε、cd3γ、cd3δ、tcrα、tcrβ、tcrδ或tcrγ的胞内信号传导结构域的胞内结构域；和(ii)抗原结合结构域；其中所述tcr亚单位与所述抗原结合域可操作地连接；且其中当在t细胞中表达时，tfp功能上并入tcr复合物中。在一些实施方案中，胞内结构域包含刺激结构域，例如来自cd3ε、cd3γ或cd3δ。在一些实施方案中，重组核酸还包含编码tcr恒定结构域的序列。在一些实施方案中，tcr恒定结构域是tcrα恒定结构域、tcrβ恒定结构域或tcrα恒定结构域和tcrβ恒定结构域。在一些实施方案中，tcr恒定结构域是tcrγ恒定结构域、tcrδ恒定结构域或tcrγ恒定结构域和tcrδ恒定结构域。
[0227]
在一些情况下，当在t细胞中表达时，tcr恒定结构域并入功能性tcr复合物中。在一些情况下，tcr恒定结构域并入与在t细胞中表达时并入tfp的功能性tcr复合物相同的功能性tcr复合物中。在一些情况下，编码tfp的序列和编码tcr恒定结构域的序列包含在同一核酸分子中。在一些情况下，编码tfp的序列和编码tcr恒定结构域的序列包含在不同的核酸分子中。
[0228]
在一些情况下，tcr亚单位和抗体结构域、抗原结构域或结合配体或其片段通过接头序列可操作地连接。在一些情况下，接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至4。
[0229]
在一些情况下，跨膜结构域是来自cd3ε、cd3γ、cd3δ、tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ的
tcr跨膜结构域。在一些情况下，胞内结构域仅衍生自cd3ε、仅衍生自cd3γ、仅衍生自cd3δ、仅衍生自tcrα、仅衍生自tcrβ、仅衍生自tcrγ或仅衍生自tcrδ。
[0230]
在一些情况下，tcr亚单位包含(i)tcr胞外结构域的至少一部分，(ii)tcr跨膜结构域，和(iii)tcr胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个来自相同的tcr亚单位。
[0231]
在一些情况下，tcr胞外结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分：tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、其功能片段和其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
[0232]
在一些情况下，tcr亚单位包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、其功能片段和其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
[0233]
在一些情况下，tcr亚单位包含cd3ε、cd3γ、cd3δ、tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ的tcr胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含选自cd3ε、cd3γ或cd3δ的胞内信号传导结构域或具有对其的至少一个修饰的氨基酸序列的蛋白质的刺激结构域。
[0234]
在一些情况下，tcr亚单位包含胞内结构域，其包含选自4-1bb的功能性信号传导结构域和/或cd3ζ的功能性信号传导结构域或具有对其的至少一个修饰的氨基酸序列的蛋白质的刺激结构域。
[0235]
在一些情况下，重组核酸还包含编码共刺激结构域的序列。在一些情况下，共刺激结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：ox40、cd2、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、和4-1bb(cd137)、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。
[0236]
在一些情况下，tcr亚单位包含tcr亚单位的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)，其包含选自由以下组成的组的蛋白质的itam或其部分：cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、fcε受体1链、fcε受体2链、fcγ受体1链、fcγ受体2a链、fcγ受体2b1链、fcγ受体2b2链、fcγ受体3a链、fcγ受体3b链、fcβ受体1链、tyrobp(dap12)、cd5、cd16a、cd16b、cd22、cd23、cd32、cd64、cd79a、cd79b、cd89、cd278、cd66d、其功能片段、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。在一些情况下，itam替代cd3γ、cd3δ或cd3ε的itam。在一些情况下，itam选自由cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位和cd3δtcr亚单位组成的组，并替代选自由cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位和cd3δtcr亚单位组成的组的不同itam。
[0237]
在一些情况下，tfp、tcrα恒定结构域、tcrβ恒定结构域及其任何组合能够与内源性tcr复合物和/或至少一种内源性tcr肽在功能上相互作用。在一些情况下，(a)tcr恒定结构域是tcrα恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含tcrβ、cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位；(b)tcr恒定结构域为tcrβ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含tcrα、cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位；或(c)tcr恒定结构域是tcrα恒定结构域和tcrβ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位。
[0238]
在一些情况下，tfp、tcrγ恒定结构域、tcrδ恒定结构域及其任何组合能够与内源
性tcr复合物和/或至少一种内源性tcr多肽在功能上相互作用。在一些情况下，(a)tcr恒定结构域是tcrγ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含tcrδ、cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位；(b)tcr恒定结构域为tcrδ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含tcrγ、cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位；或(c)tcr恒定结构域是tcrγ恒定结构域和tcrδ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位。
[0239]
在一些情况下，对其的至少一个但不超过20个修饰包括介导细胞信号传导的氨基酸的修饰或响应于配体与tfp结合而磷酸化的氨基酸的修饰。
[0240]
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是鼠、骆驼、羊驼、人或人源化的。在一些情况下，抗体片段是scfv、单结构域抗体结构域、vhh、vh结构域或vl结构域。在一些情况下，包含抗原结合结构域的抗体选自由以下组成的组：抗cd19结合结构域、抗b细胞成熟抗原(bcma)结合结构域、抗间皮素(msln)结合结构域、抗cd22结合结构域、抗pd-1结合结构域、抗baff或baff受体结合结构域和抗ror-1结合结构域。
[0241]
在一些情况下，核酸选自由dna和rna组成的组。在一些情况下，核酸是mrna。在一些情况下，重组核酸包含核酸类似物，其中核酸类似物不在重组核酸的编码序列中。在一些情况下，核酸类似物选自由以下组成的组：2
′‑
o-甲基、2
′‑
o-甲氧基乙基(2
′‑
o-moe)、2
′‑
o-氨基丙基、2
′‑
脱氧、t-脱氧-2
′‑
氟、2
′‑
o-氨基丙基(2
′‑
o-ap)、2
′‑
o-二甲基氨基乙基(2
′‑
o-dmaoe)、2
′‑
o-二甲基氨基丙基(2
′‑
o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2
′‑
o-dmaeoe)、2
′‑
o-n-甲基乙酰胺基(2
′‑
o-nma)修饰、锁核酸(lna)、乙烯核酸(ena)、肽核酸(pna)、1
′
，5
′‑
脱水己糖醇核酸(hna)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2
′‑
氟n3-p5
′‑
亚磷酰胺。
[0242]
在一些实施方案中，核酸是rna。在一些实施方案中，rna不包含m6a。在一些实施方案中，rna包含小于20％、小于19％、小于18％、小于17％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的m6a。
[0243]
在一些情况下，重组核酸还包含前导序列。在一些情况下，重组核酸还包含启动子序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码poly(a)尾的序列。在一些情况下，重组核酸还包含3
′
utr序列。在一些情况下，核酸是分离的核酸或非天然存在的核酸。在一些情况下，核酸是体外转录的核酸。
[0244]
在一些情况下，重组核酸还包含编码tcrα跨膜结构域的序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码tcrβ跨膜结构域的序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码tcrα跨膜结构域的序列和编码tcrβ跨膜结构域的序列。
[0245]
在一些实施方案中，本文公开了包含编码t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)的序列的重组核酸，所述tfp包含(i)tcr亚单位，所述tcr亚单位包含(1)tcr胞外结构域的至少一部分，(2)跨膜结构域，和(3)胞内结构域；和(ii)能够结合抗体或其片段的结合配体或其片段；其中所述tcr亚单位与所述结合配体或其片段可操作地连接，且其中当在t细胞中表达时，tfp功能上并入tcr复合物中。在一些实施方案中，重组核酸还包含编码tcr恒定结构域的序列。在一些实施方案中，tcr恒定结构域是tcrα恒定结构域、tcrβ恒定结构域或tcrα恒
定结构域和tcrβ恒定结构域。在一些实施方案中，tcr恒定结构域是tcrγ恒定结构域、tcrδ恒定结构域或tcrγ恒定结构域和tcrδ恒定结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含tcrα或tcrβ的胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含来自cd3ε、cd3γ或cd3δ的胞内信号传导结构域的刺激结构域。在一些情况下，结合配体能够结合抗体的fc结构域。在一些情况下，结合配体能够选择性地结合igg1抗体。在一些情况下，结合配体能够特异性结合igg1抗体。在一些情况下，抗体或其片段结合细胞表面抗原。在一些情况下，抗体或其片段结合肿瘤细胞表面上的细胞表面抗原。在一些情况下，结合配体包含单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体。在一些情况下，结合配体不包含抗体或其片段。在一些情况下，结合配体包含cd16多肽或其片段。在一些情况下，结合配体包含cd16结合多肽。在一些情况下，结合配体是人或人源化的。在一些情况下，重组核酸还包含编码能够被结合配体结合的抗体或其片段的核酸序列。在一些情况下，抗体或其片段能够从细胞分泌。
[0246]
在一些情况下，当在t细胞中表达时，tcr恒定结构域并入功能性tcr复合物中。在一些情况下，tcr恒定结构域并入与在t细胞中表达时并入tfp的功能性tcr复合物相同的功能性tcr复合物中。在一些情况下，编码tfp的序列和编码tcr恒定结构域的序列包含在同一核酸分子中。在一些情况下，编码tfp的序列和编码tcr恒定结构域的序列包含在不同的核酸分子中。
[0247]
在一些情况下，tcr亚单位和结合配体或其片段通过接头序列可操作地连接。在一些情况下，接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至4。
[0248]
在一些情况下，跨膜结构域是来自cd3ε、cd3γ、cd3δ、tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ的tcr跨膜结构域。在一些情况下，胞内结构域仅衍生自cd3ε、仅衍生自cd3γ、仅衍生自cd3δ、仅衍生自tcrα、仅衍生自tcrβ、仅衍生自tcrγ或仅衍生自tcrδ。
[0249]
在一些情况下，tcr亚单位包含(i)tcr胞外结构域的至少一部分，(ii)tcr跨膜结构域，和(iii)tcr胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个来自相同的tcr亚单位。
[0250]
在一些情况下，tcr胞外结构域包含选自由以下组成的组蛋白质的胞外结构域或其部分：tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、其功能片段和其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
[0251]
在一些情况下，tcr亚单位包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、其功能片段和其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
[0252]
在一些情况下，tcr亚单位包含tcr胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ的胞内结构域，或具有对其的至少一个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，tcr胞内结构域包含选自cd3ε、cd3γ或cd3δ的胞内信号传导结构域或具有对其的至少一个修饰的氨基酸序列的蛋白质的刺激结构域。
[0253]
在一些情况下，tcr亚单位包含胞内结构域，其包含选自4-1bb的功能性信号传导结构域和/或cd3ζ的功能性信号传导结构域或具有对其的至少一个修饰的氨基酸序列的蛋白质的刺激结构域。
[0254]
在一些情况下，重组核酸还包含编码共刺激结构域的序列。在一些情况下，共刺激结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：ox40、cd2、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、和4-1bb(cd137)、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。
[0255]
在一些情况下，tcr亚单位包含tcr亚单位的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)，其包含选自由以下组成的组的蛋白质的itam或其部分：cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、fcε受体1链、fcε受体2链、fcγ受体1链、fcγ受体2a链、fcγ受体2b1链、fcγ受体2b2链、fcγ受体3a链、fcγ受体3b链、fcβ受体1链、tyrobp(dap12)、cd5、cd16a、cd16b、cd22、cd23、cd32、cd64、cd79a、cd79b、cd89、cd278、cd66d、其功能片段、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。在一些情况下，itam替代cd3γ、cd3δ或cd3ε的itam。在一些情况下，itam选自由cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位和cd3δtcr亚单位组成的组，并替代选自由cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位和cd3δtcr亚单位组成的组的不同itam。
[0256]
在一些情况下，tfp、tcrα恒定结构域、tcrβ恒定结构域及其任何组合能够与内源性tcr复合物和/或至少一种内源性tcr肽在功能上相互作用。在一些情况下，(a)tcr恒定结构域是tcrα恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含tcrβ、cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位；(b)tcr恒定结构域为tcrβ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含tcrα、cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位；或(c)tcr恒定结构域是tcrα恒定结构域和tcrβ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位。
[0257]
在一些情况下，tfp、tcrγ恒定结构域、tcrδ恒定结构域及其任何组合能够与内源性tcr复合物和/或至少一种内源性tcr多肽在功能上相互作用。在一些情况下，(a)tcr恒定结构域是tcrγ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含tcrδ、cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位；(b)tcr恒定结构域为tcrδ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含tcrγ、cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位；或(c)tcr恒定结构域是tcrγ恒定结构域和tcrδ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位。
[0258]
在一些情况下，对其的至少一个但不超过20个修饰包括介导细胞信号传导的氨基酸的修饰或响应于配体与tfp结合而磷酸化的氨基酸的修饰。
[0259]
在一些情况下，核酸选自由dna和rna组成的组。在一些情况下，核酸是mrna。在一些情况下，重组核酸包含核酸类似物，其中核酸类似物不在重组核酸的编码序列中。在一些情况下，核酸类似物选自由以下组成的组：2
′‑
o-甲基、2
′‑
o-甲氧基乙基(2
′‑
o-moe)、2
′‑
o-氨基丙基、2
′‑
脱氧、t-脱氧-2
′‑
氟、2
′‑
o-氨基丙基(2
′‑
o-ap)、2
′‑
o-二甲基氨基乙基(2
′‑
o-dmaoe)、2
′‑
o-二甲基氨基丙基(2
′‑
o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2
′‑
o-dmaeoe)、2
′‑
o-n-甲基乙酰胺基(2
′‑
o-nma)修饰、锁核酸(lna)、乙烯核酸(ena)、肽核酸(pna)、1
′
，5
′‑
脱水己糖醇核酸(hna)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2
′‑
氟n3-p5
′‑
亚磷酰胺。
[0260]
在一些情况下，重组核酸还包含前导序列。在一些情况下，重组核酸还包含启动子序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码poly(a)尾的序列。在一些情况下，重组核酸还包
含3
′
utr序列。在一些情况下，核酸是分离的核酸或非天然存在的核酸。在一些情况下，核酸是体外转录的核酸。
[0261]
在一些情况下，重组核酸还包含编码tcrα跨膜结构域的序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码tcrβ跨膜结构域的序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码tcrα跨膜结构域的序列和编码tcrβ跨膜结构域的序列。或者，重组核酸包含编码tcrγ或tcrδ结构域例如跨膜结构域的序列。
[0262]
在一些实施方案中，本文公开了包含编码t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)的序列的重组核酸，所述tfp包含(i)tcr亚单位，所述tcr亚单位包含(1)tcr胞外结构域的至少一部分，(2)跨膜结构域，和(3)胞内结构域；和(ii)抗原结构域，其包含与细胞表面上表达的受体或多肽结合的配体或其片段；其中所述tcr亚单位与所述抗原结构域可操作地连接，且其中当在t细胞中表达时，tfp功能上并入tcr复合物中。在一些实施方案中，重组核酸还包含编码tcr恒定结构域的序列。在一些实施方案中，tcr恒定结构域是tcrα恒定结构域、tcrβ恒定结构域或tcrα恒定结构域和tcrβ恒定结构域。在一些实施方案中，tcr恒定结构域是tcrγ恒定结构域、tcrδ恒定结构域或tcrγ恒定结构域和tcrδ恒定结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含来自tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ的胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含来自cd3δ、cd3ε或cd3γ的胞内信号传导结构域的刺激结构域。在一些情况下，抗原结构域包含配体。在一些情况下，配体与细胞受体结合。在一些情况下，配体与细胞表面上表达的多肽结合。在一些情况下，在细胞表面上表达的受体或多肽包括应激反应受体或多肽。在一些情况下，在细胞表面上表达的受体或多肽是mhc i相关糖蛋白。在一些情况下，mhc i类相关糖蛋白选自由mica、micb、raet1e、raet1g、ulbp1、ulbp2、ulbp3、ulbp4及其组合组成的组。在一些情况下，抗原结构域包含单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体。在一些情况下，抗原结构域包含配体或其片段的单体或二聚体。在一些情况下，配体或其片段是单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体。在一些情况下，配体或其片段是单体或二聚体。在一些情况下，抗原结构域不包含抗体或其片段。在一些情况下，抗原结构域不包含可变区。在一些情况下，抗原结构域不包含cdr。在一些情况下，配体或其片段是天然杀伤组2d(nkg2d)配体或其片段。
[0263]
在一些情况下，当在t细胞中表达时，tcr恒定结构域并入功能性tcr复合物中。在一些情况下，tcr恒定结构域并入与在t细胞中表达时并入tfp的功能性tcr复合物相同的功能性tcr复合物中。在一些情况下，编码tfp的序列和编码tcr恒定结构域的序列包含在同一核酸分子中。在一些情况下，编码tfp的序列和编码tcr恒定结构域的序列包含在不同的核酸分子中。
[0264]
在一些情况下，tcr亚单位和抗原结构域通过接头序列可操作地连接。在一些情况下，接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至4。
[0265]
在一些情况下，跨膜结构域是来自cd3ε、cd3γ、cd3δ、tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ的tcr跨膜结构域。在一些情况下，胞内结构域仅衍生自cd3ε、仅衍生自cd3γ、仅衍生自cd3δ、仅衍生自tcrα、仅衍生自tcrβ、仅衍生自tcrγ或仅衍生自tcrδ。
[0266]
在一些情况下，tcr亚单位包含(i)tcr胞外结构域的至少一部分，(ii)tcr跨膜结构域，和(iii)tcr胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个来自相同的tcr亚单位。
[0267]
在一些情况下，tcr胞外结构域包含选自由以下组成的组蛋白质的胞外结构域或其部分：tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、其功能片段和其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
[0268]
在一些情况下，tcr亚单位包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、其功能片段和其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
[0269]
在一些情况下，tcr亚单位包含tcr胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ的胞内结构域，或具有对其的至少一个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，tcr胞内结构域包含选自cd3ε、cd3γ或cd3δ的胞内信号传导结构域或具有对其的至少一个修饰的氨基酸序列的蛋白质的刺激结构域。
[0270]
在一些情况下，tcr亚单位包含胞内结构域，其包含选自4-1bb的功能性信号传导结构域和/或cd3ζ的功能性信号传导结构域或具有对其的至少一个修饰的氨基酸序列的蛋白质的刺激结构域。
[0271]
在一些情况下，重组核酸还包含编码共刺激结构域的序列。在一些情况下，共刺激结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：ox40、cd2、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、和4-1bb(cd137)、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。
[0272]
在一些情况下，tcr亚单位包含tcr亚单位的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)，其包含选自由以下组成的组的蛋白质的itam或其部分：cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、tcrζ链、fcε受体1链、fcε受体2链、fcγ受体1链、fcγ受体2a链、fcγ受体2b1链、fcγ受体2b2链、fcγ受体3a链、fcγ受体3b链、fcβ受体1链、tyrobp(dap12)、cd5、cd16a、cd16b、cd22、cd23、cd32、cd64、cd79a、cd79b、cd89、cd278、cd66d、其功能片段、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。在一些情况下，itam替代cd3γ、cd3δ或cd3ε的itam。在一些情况下，itam选自由cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位和cd3δtcr亚单位组成的组，并替代选自由cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位和cd3δtcr亚单位组成的组的不同itam。
[0273]
在一些情况下，tfp、tcrα恒定结构域、tcrβ恒定结构域及其任何组合能够与内源性tcr复合物和/或至少一种内源性tcr肽在功能上相互作用。在一些情况下，(a)tcr恒定结构域是tcrα恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含tcrβ、cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位；(b)tcr恒定结构域为tcrβ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含tcrα、cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位；或(c)tcr恒定结构域是tcrα恒定结构域和tcrβ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位。
[0274]
在一些情况下，tfp、tcrγ恒定结构域、tcrδ恒定结构域及其任何组合能够与内源性tcr复合物和/或至少一种内源性tcr多肽在功能上相互作用。在一些情况下，(a)tcr恒定结构域是tcrγ恒定结构域，且tfp功能上整合到tcr复合物中，所述tcr复合物包含tcrδ、cd3ε、cd3γ、cd3δ或其组合的内源亚单位；(b)tcr恒定结构域为tcrδ恒定结构域，且tfp功
脱氧-2
′‑
氟、2
′‑
o-氨基丙基(2
′‑
o-ap)、2
′‑
o-二甲基氨基乙基(2
′‑
o-dmaoe)、2
′‑
o-二甲基氨基丙基(2
′‑
o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2
′‑
o-dmaeoe)、2
′‑
o-n-甲基乙酰胺基(2
′‑
o-nma)修饰、锁核酸(lna)、乙烯核酸(ena)、肽核酸(pna)、1
′
，5
′‑
脱水己糖醇核酸(hna)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2
′‑
氟n3-p5
′‑
亚磷酰胺。
[0278]
在一些情况下，重组核酸还包含前导序列。在一些情况下，重组核酸还包含启动子序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码poly(a)尾的序列。在一些情况下，重组核酸还包含3
′
utr序列。在一些情况下，核酸是分离的核酸或非天然存在的核酸。在一些情况下，核酸是体外转录的核酸。
[0279]
在一些情况下，重组核酸还包含编码tcrα跨膜结构域的序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码tcrβ跨膜结构域的序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码tcrα跨膜结构域的序列和编码tcrβ跨膜结构域的序列。
[0280]
在一些实施方案中，本文还公开了包含本文公开的重组核酸的载体。在一些情况下，载体选自由dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体(aav)、劳斯肉瘤病毒(rsv)载体或逆转录病毒载体组成的组。在一些情况下，载体是aav6载体。在一些情况下，载体还包含启动子。在一些情况下，载体是体外转录的载体。根据另一方面，本文提供了包含编码本文提供的任何重组核酸的tfp或car或tcr分子的核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体选自由dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体组成的组。在一些实施方案中，载体还包含启动子。在一些实施方案中，载体是体外转录的载体。在一些实施方案中，载体中的核酸序列还包含编码poly(a)尾的序列。
[0281]
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达基因的细胞筛选文库，通过从已知包含基因的载体衍生该基因，或通过使用标准技术从含有基因的细胞和组织直接分离。或者，目的基因可以合成产生，而不是克隆。
[0282]
本公开还提供了其中插入了本公开的核酸的载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体比源自癌逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。
[0283]
在另一个实施方案中，包含编码本公开的所需tfp或tcr或car的核酸的载体是腺病毒载体(a5/35)。在另一个实施方案中，编码tfp的核酸的表达可以使用转座子如睡美人、crisper、cas9和锌指核酸酶来实现。见下文june等人2009 nature reviews immunology 9.10：704-716，通过引用并入本文。
[0284]
根据另一方面，本文提供了包含本文提供的权利要求中任一项的重组核酸或本文提供的任一载体的载体的细胞。在一些实施方案中，细胞是人免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是t细胞前体，例如淋巴母细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是cd8
+
或cd4
+
t细胞、cd8+cd4+ t细胞、nk细胞或nkt细胞。根据另一方面，本文提供了制备细胞的方法，其包括用本文提供的重组核酸或本文提供的载体转导人免疫细胞。本文还提供了在患有疾病的哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向该哺乳动物施用有效量的包含本文提供的载体的细胞。本文还提供了在患有疾病的哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向该哺乳动物施用有效量的包含编码本文提供的tfp和circrna的核酸分子的细胞。本文还提供了在患有疾病的哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向该哺乳动物施用有效量的包含
具有本文提供的circrna结合位点的核酸分子的细胞。
[0285]
本文还提供了在患有疾病的哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向该哺乳动物施用有效量的递送媒介物如脂质体或纳米颗粒。在一些实施方案中，递送媒介物包含编码tfp、tcr或car的分离的重组核酸的有效负载。在一些实施方案中，分离的重组核酸是环状rna。在一些实施方案中，环状rna包含靶向部分。
[0286]
本公开的表达构建体还可以使用标准基因递送方案用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，通过引用整体并入本文)。在另一个实施方案中，本公开提供了基因疗法载体。
[0287]
可以将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
[0288]
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的并且描述于例如sambrook等人，2012，molecular cloning：a laboratory manual，第1-4卷，cold spring harbor press，ny，以及其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择标记物(例如wo 01/96584；wo 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0289]
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
[0290]
另外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加到相隔50bp。取决于启动子，单个元件似乎可以协同或独立地起作用以激活转录。
[0291]
能够在哺乳动物t细胞中表达tfp转基因的启动子的实例是ef1a启动子。天然ef1a启动子驱动负责将氨酰基trna酶促递送至核糖体的延伸因子1复合物的α亚单位的表达。ef1a启动子已广泛用于哺乳动物表达质粒中，并且已显示有效驱动从克隆到慢病毒载体中的转基因表达tfp(参见例如milone等人，mol.ther.17(8)：1453-1464(2009))。启动子的另一个实例是立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。此启动子序列是能够驱动与其可操作连接的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本公开不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本公开的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要这种表达时，该开关能够开启与其可操作连
接的多核苷酸序列的表达，或当不需要表达时，关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素调节的启动子。
[0292]
为了评估tfp或car或tcr多肽或其部分的表达，待引入细胞或递送媒介物中的表达载体还可含有选择标记基因或报告基因或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择标记物可以携带在核酸的单独片段上并用于共转染方法。选择标记物和报告基因都可以侧接合适的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
[0293]
报告基因用于鉴定潜在转染细胞和评价调节序列的功能性。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，并且编码其表达通过一些容易检测的性质如酶活性证明的多肽。在将核酸引入受体细胞后的合适时间测定报导基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，ui-tei等人，2000 febs letters 479：79-82)。合适的表达系统是众所周知的，并可以使用已知技术制备或商购获得。通常，显示报导基因表达最高水平的具有最小5
′
侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可以与报导基因连接并用于评价剂调节启动子驱动的转录的能力。
[0294]
用于体内/离体递送核酸的转移载体和方法
[0295]
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。在优选的实施方案中，所提及的分离的核酸是circrna。术语“转移载体”包括非病毒、病毒、质粒和非质粒载体。
[0296]
向细胞中引入和表达基因的方法是本领域已知的。可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物方法将表达载体转移到宿主细胞中。
[0297]
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如sambrook等人，2012，molecular cloning：a laboratory manual，第1-4卷，cold spring harbor press，ny)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。在一些实施方案中，所述多核苷酸是核酸。在优选的实施方案中，所述多核苷酸是circrna。
[0298]
将目的多核苷酸宿主引入细胞的生物方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物如人细胞的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等(参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
[0299]
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、纳米颗粒、脂质-纳米颗粒缀合物、微球、珠、基于肽的聚合复合物和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、脂质纳米颗粒和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。现有技术的核酸靶向递送的其它方法是可用的，例如用靶向纳米颗粒或其它合适的亚微米尺寸递送系统递送多核苷酸。
[0300]
在一些实施方案中，合适的脂质体或脂质-纳米颗粒缀合物包含一种或多种阳离子脂质，例如ckk-e12。在一些实施方案中，所述多核苷酸是核酸。在优选的实施方案中，所述多核苷酸是circrna。在一些实施方案中，circrna被包封在所述胶体分散系统内。在其它
实施方案中，circrna附着在所述胶体分散系统附近。
[0301]
在优选的实施方案中，转移载体是脂质体。在其它优选的实施方案中，转移载体选自脂质纳米颗粒或脂质-纳米颗粒缀合物的组。在一些实施方案中，编码蛋白质的circrna被包封在脂质体内，其中所述脂质体包含阳离子脂质。在优选的实施方案中，编码tfp、car、tcr的circrna被包封在脂质体内，其中所述脂质体包含阳离子脂质。
[0302]
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在优选的实施方案中，所述核酸是circrna。在另一方面，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、通过与脂质体和寡核苷酸结合的连接分子连接到脂质体上、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合、或以其它方式与脂质结合。脂质、脂质/dna或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可能以双层结构、胶束或“折叠”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的一类化合物。
[0303]
适用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“dmpc”)可以从sigma，st.louis，mo.获得；磷酸二鲸蜡酯(“dcp”)可从k&k laboratories(plainview，n.y.)获得；胆固醇(“choi”)可从calbiochem-behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“dmpg”)和其它脂质可从avanti polar lipids，inc.(birmingham，ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以储存在约-20℃。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是包括通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质载体的通用术语。脂质体可表征为具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(ghosh等人，1991 glycobiology 5：505-10)。然而，也包括在溶液中具有与正常泡状结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。
[0304]
在一些实施方案中，合适的脂质体或脂质-纳米颗粒缀合物包含一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和/或一种或多种peg修饰的脂质。在一些实施方案中，一种或多种非阳离子脂质选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(dope-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、16-o-单甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(sope)或其混合物。
[0305]
在一些实施方案中，合适的脂质体或脂质-纳米颗粒缀合物包含选自ckk-e12、dope、胆固醇、dmg-peg-2k的脂质。在其它实施方案中，编码蛋白质的circrna被包封在所述
脂质体或脂质-纳米颗粒缀合物中。在一些实施方案中，合适的脂质体或脂质-纳米颗粒缀合物包含选自ckk-e12、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、胆固醇和1，2-二肉豆蔻酰基-sm-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基-(聚z二醇)-2000](铵盐)(c14-peg 2000)的脂质。在优选的实施方案中，circrna与所述合适的脂质体或脂质-纳米颗粒缀合物结合。在更优选的实施方案中，将circrna并入所述合适的脂质体或脂质-纳米颗粒缀合物中。在其它优选的实施方案中，将编码tfp、car、tcr的circrna并入所述合适的脂质体或脂质-纳米颗粒缀合物中。
[0306]
在一些情况下，非病毒转移载体选自基于脂质的递送系统，包括(if)2.0试剂、lipofectamine
tm messengermax
tm
(thermofisher scientific)、(koken)、(koken)、2000或lipofectamine 3000。
[0307]
不管用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本公开的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中存在circrna，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，诸如southern和northern印迹、rt-pcr和pcr；“生物化学”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(elisa和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定来鉴定落入本公开范围内的剂。
[0308]
本公开进一步提供了包含tfp、car、tcr编码核酸分子的载体。在优选的实施方案中，所述核酸分子是circrna。在一方面，可以直接将载体转导到细胞，例如t细胞中。在一方面，载体能够在哺乳动物t细胞中表达tfp构建体。在一方面，哺乳动物t细胞是人t细胞。
[0309]
选择的细胞靶向配体
[0310]
所公开的转移载体的所选细胞靶向配体选择性地结合异质细胞群内的感兴趣的免疫细胞。在优选的实施方案中，所述靶向配体与转移载体结合。在其它优选的实施方案中，靶向配体遍布转移载体的表面。在更优选的实施方案中，靶向配体与包含编码tfp、car或tcr的circrna的转移载体结合。在其它更优选的实施方案中，靶向配体遍布包含编码tfp、car或tcr的circrna的转移载体的表面。
[0311]
在特定的实施方案中，感兴趣的免疫细胞是淋巴细胞。淋巴细胞包括t细胞、b细胞、天然杀伤(nk)细胞、单核细胞/巨噬细胞和hsc。在更优选的实施方案中，淋巴细胞是t细胞。
[0312]“选择性递送”是指核酸由一种或多种选择的淋巴细胞群递送和表达。在特定的实施方案中，选择性递送仅针对选择的淋巴细胞群。在特定的实施方案中，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的施用的核酸由选择的淋巴细胞群递送和/或表达。在特定的实施方案中，选择性递送确保非淋巴细胞不表达递送的核酸。例如，当靶向剂是t细胞受体(tcr)基因时，确保选择性，因为只有t细胞具有用于tcr表达的ζ链。选择性递送还可以基于未选择的细胞没有摄取核酸或基于核酸序列中存在特定启动子。例如，瞬时表达的核酸可以包括t细胞特异性cd3-δ启动子。可以实现选择性递送的额外启动子包括：鼠干细胞病毒启动子或t细胞或hsc的远端lck启动子；hsc的cd45启动子、wasp启动子或ifn-β启动子；b细胞的b29启动子；或单核细胞/巨噬细胞的cd14启动子或cd11b启动子。
[0313]
在一些实施方案中，选择的细胞靶向配体可以包括在淋巴细胞上发现的基序的结
合结构域。选择的细胞靶向配体还可以包括允许选择性摄取到淋巴细胞中的任何选择性结合机制。在特定实施方案中，选择的细胞靶向配体包括t细胞受体基序；t细胞α链；t细胞β链；t细胞γ链；t细胞δ链；ccr7；cd1a；cd1b；cd1c；cd1d；cd3；cd4；cd5；cd7；cd8；cd11b；cd11c；cd16；cd19；cd20；cd21；cd22；cd25；cd28；cd34；cd35；cd39；cd40；cd45ra；cd45ro；cd46；cd52；cd56；cd62l；cd68；cd80；cd86；cd95；cd101；cd117；cd127；cd133；cd137(4-1bb)；cd148；cd163；f4/80；il-4rα；sca-1；ctla-4；gitr；garp；lap；粒酶b；lfa-1；转铁蛋白受体和其组合的结合结构域。
[0314]
在特定的实施方案中，结合结构域可以包括细胞标记物配体、受体配体、抗体、肽、肽适体、核酸、核酸适体、镜像适配体或其组合。在选择的细胞靶向配体的上下文中，结合结构域包括与另一种物质结合以形成能够介导胞吞作用的复合物的任何物质。
[0315]“抗体”是结合结构域的一个实例，并且包括完整抗体或抗体的结合片段，例如fv、vhh、fab、fab
′
、f(ab
′
)2、fc和单链fv片段(scfv)或特异性结合淋巴细胞表达的基序的免疫球蛋白的任何生物学有效片段。抗体或抗原结合片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、小体和线性抗体的全部或一部分。
[0316]
与非人抗体相比，来自人来源的抗体或人源化抗体在人中具有降低的免疫原性或没有免疫原性，并且具有较少数目的非免疫原性表位。抗体及其片段通常被选择为在人受试者中具有降低的水平或无抗原性。
[0317]
特异性结合由淋巴细胞表达的基序的抗体可以使用获得单克隆抗体的方法、噬菌体展示的方法、产生人或人源化抗体的方法、或使用工程化以产生抗体的转基因动物或植物的方法来制备，如本领域普通技术人员已知的(参见例如美国专利号6,291,161和6,291,158)。可使用部分或完全合成抗体的噬菌体展示文库，并可筛选可结合淋巴细胞基序的抗体或其片段。例如，可以通过筛选fab噬菌体文库中特异性结合目的靶标的fab片段来鉴定结合结构域(参见hoet等人，nat.biotechnol.23：344，2005)。人抗体的噬菌体展示文库也是可用的。另外，在方便的系统(例如，小鼠、humabtcmouse
tm
、km-美洲驼、鸡、大鼠、仓鼠、兔子等)中使用感兴趣的靶标作为免疫原的用于杂交瘤开发的传统策略可用于开发结合结构域。在特定的实施方案中，抗体特异性地结合由选择的淋巴细胞表达的基序，并且不与非特异性组分或不相关的靶标交叉反应。一旦鉴定，可以分离和/或确定编码抗体的氨基酸序列或核酸序列。
[0318]
在特定实施方案中，选择的细胞靶向配体的结合结构域包括t细胞受体基序抗体；t细胞α链抗体；t细胞β链抗体；t细胞γ链抗体；t细胞δ链抗体；ccr7抗体；cd1a抗体；cd1b抗体；cd1c抗体；cd1d抗体；cd3抗体；cd4抗体；cd5抗体；cd7抗体；cd8抗体；cd11b抗体；cd11c抗体；cd16抗体；cd19抗体；cd20抗体；cd21抗体；cd22抗体；cd25抗体；cd28抗体；cd34抗体；cd35抗体；cd39抗体；cd40抗体；cd45ra抗体；cd45ro抗体；cd46抗体；cd52抗体；cd56抗体；cd62l抗体；cd68抗体；cd80抗体；cd86抗体；cd95抗体；cd101抗体；cd117抗体；cd127抗体；cd133抗体；cd137(4-1bb)抗体；cd148抗体；cd163抗体；f4/80抗体；il-4rα抗体；sca-1抗体；ctla-4抗体；gitr抗体；garp抗体；lap抗体；粒酶b抗体；lfa-1抗体；或转铁蛋白受体抗体。这些结合结构域也可以由上述抗体的scfv片段组成。
[0319]
肽适体包括在两端与蛋白质支架连接的肽环(其对靶蛋白具有特异性)。这种双重结构限制将肽适体的结合亲和力大大提高到与抗体相当的水平。可变环长度通常为8至20
个氨基酸(例如，8至12个氨基酸)，并且支架可以是稳定、可溶、小且无毒的任何蛋白质(例如，硫氧还蛋白-a、stefin a三重突变体、绿色荧光蛋白、eglin c和细胞转录因子sp1)。可以使用不同的系统进行肽适体选择，例如酵母双杂交系统(例如gal4酵母双杂交系统)或lexa相互作用捕获系统。
[0320]
核酸适体是单链核酸(dna或rna)配体，其通过折叠成特定的球状结构而起作用，所述球状结构决定以高亲和力和特异性与靶蛋白或其它分子结合，如osborne等人，curr.opin.chem.biol.1：5-9，1997；以及cerchia等人，febs letters 528：12-16，2002所述。在特定实施方案中，适体很小(15kda；或15-80个核苷酸或20-50个核苷酸)。适体通常通过称为selex(通过指数富集的配体系统进化；参见例如tuerk等人，science，249：505-510，1990；green等人，methods enzymology.75-86，1991；以及gold等人，annu.rev.biochem.，64：763-797，1995)的程序从由1014-1015个随机寡核苷酸序列组成的文库中分离。产生适体的其它方法描述于例如美国专利号6,344,318；6,331,398；6,110,900；5,817,785；5,756,291；5,696,249；5,670,637；5,637,461；5,595,877；5,527,894；5,496,938；5,475,096和5,270,16中。镜像适配体类似于核酸适体，除了至少一个β-核糖单元被β-d-脱氧核糖或选自例如β-d-核糖、α-d-核糖、β-l-核糖的修饰的糖单元代替。
[0321]
也可以使用可以促进淋巴细胞内化和/或转染淋巴细胞的其它剂，如聚(乙烯亚胺)/dna(pei/dna)内体溶解肽(elp)复合物。
[0322]
修饰的人免疫细胞
[0323]
在一些实施方案中，本文公开了包含本文公开的重组核酸或本文公开的载体的修饰的人免疫细胞；其中所述修饰的人免疫细胞包含内源性tcr的功能破坏。在一些实施方案中，本文还公开了包含编码本文公开的核酸的tfp的序列或由本文公开的核酸的序列编码的tfp的修饰的人免疫细胞，其中所述修饰的人免疫细胞包含内源性tcr的功能破坏。在一些实施方案中，本文还公开了包含编码本文公开的tfp的序列或由本文公开的核酸序列编码的tfp的修饰的同种异体t细胞。
[0324]
在一些情况下，免疫细胞还包含编码tcr恒定结构域的异源序列，其中所述tcr恒定结构域是tcrα恒定结构域、tcrβ恒定结构域或tcrα恒定结构域和tcrβ恒定结构域。在一些情况下，功能破坏的内源性tcr是内源性tcrα链、内源性tcrβ链、或内源性tcrα链和内源性tcrβ链。在某些情况下，与未修饰的对照免疫细胞相比，功能破坏的内源性tcr与mhc-肽复合物的结合降低。在某些情况下，功能破坏是编码内源性tcr的基因的破坏。在某些情况下，编码内源性tcr的基因的破坏是从免疫细胞的基因组中除去编码内源性tcr的基因的序列。在一些情况下，免疫细胞是人t细胞。在一些情况下，t细胞是cd8+、cd4+ t细胞、cd8+cd4+ t细胞、nkt细胞或nk细胞。在一些情况下，t细胞是同种异体t细胞。在一些情况下，修饰的人免疫细胞还包含编码抑制分子的核酸，所述抑制分子包含第一多肽，所述第一多肽包含抑制分子的至少一部分，与其结合的第二多肽，所述第二多肽包含来自胞内信号传导结构域的正信号。在一些情况下，抑制分子包含含有pd1的至少一部分的第一多肽和含有共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。
[0325]
t细胞来源
[0326]
在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得t细胞来源。术语“受试者”旨在包括其中可引发免疫反应的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转
基因物种。t细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本公开的某些方面，可以使用本领域可获得的任何数量的t细胞系。在本公开的某些方面，t细胞可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术从收集自受试者的血液单位获得，例如ficoll
tm
分离。在一个优选的方面，通过单采术获得来自个体循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一方面，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于随后的处理步骤。在本公开的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。在替代方面中，洗涤溶液不含钙，并且可以不含镁，或者可以不含许多(如果不是全部的话)二价阳离子。在不存在钙的情况下的初始激活步骤可导致放大的激活。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如通过使用半自动化“流通”离心机(例如，2991细胞处理器、baxteroncologycytomate、或cell5)，根据制造商的说明书。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无ca、无mg的pbs、plasmalyte a或其它含或不含缓冲液的盐水溶液。或者，可以除去单采术样品中不需要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
[0327]
在一方面，通过裂解红细胞并去除单核细胞，例如通过梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中离t细胞。t细胞的特定亚群，例如cd3+、cd28+、cd4+、cd8+、cd45ra+和cd45ro+t细胞，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，在一个方面，通过与抗-cd3/抗-cd28(例如，3
×
28)缀合的珠如m-450 cd3/cd28 t孵育足以阳性选择期望的t细胞的时间段来分离t细胞。在一个方面，该时间段为约30分钟。在另一方面，该时间段为30分钟至36小时或更长时间以及其间的所有整数值。在另一方面，该时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在另一个优选的方面，该时间段为10至24小时。在一方面，孵育时间为24小时。在与其它细胞类型相比存在很少t细胞的任何情况下，例如从肿瘤组织或从免疫受损个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(til)时，可以使用更长的孵育时间来分离t细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高cd8+ t细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长t细胞与cd3/cd28珠结合的时间和/或通过增加或降低珠与t细胞的比率(如本文中进一步描述的)，可以优先选择t细胞亚群的培养开始时或在过程中的其它时间点或针对其优先选择t细胞亚群。另外，通过增加或降低珠或其它表面上抗cd3和/或抗cd28抗体的比率，可以优先选择t细胞亚群的培养开始时或其它所需时间点或针对其优先选择t细胞亚群。本领域技术人员将认识到，在本公开的上下文中也可以使用多轮选择。在某些方面，可能希望执行选择过程并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以经受进一轮的选择。
[0328]
通过负选择富集t细胞群可以用针对负选择细胞特有的表面标记物的抗体的组合来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过负选择富集cd4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。在某些方面，可能需要富集或正选择通常表达cd4+、cd25+、cd62lhi、gitr+和foxp3+的调节性t细胞。或者，在某些方面，通过抗c25缀合珠或其它类似的选择方法去除t调节细胞。
[0329]
在一个实施方案中，可以选择表达ifn-γtnf-α、il-17a、il-2、il-3、il-4、gm-csf、il-10、il-13、粒酶b和穿孔素中的一种或多种或其它合适分子(例如其它细胞因子)的t细胞群。筛选细胞表达的方法可以例如通过pct公开号：wo 2013/126712中描述的方法。
[0330]
为了通过正或负选择分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒如珠)的浓度。在某些方面，可能需要显著地减少珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一方面，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一方面，使用大于1亿个细胞/ml。在另一方面，使用10、15、20、25、30、35、40、45或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一方面，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在其它方面，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可提高细胞产量、细胞激活和细胞扩增。此外，高细胞浓度的使用允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如cd28阴性t细胞，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病血液、肿瘤组织等)。这样的细胞群可具有治疗价值并且是期望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱cd28表达的cd8+ t细胞。
[0331]
在相关方面，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释t细胞和表面(例如，颗粒如珠)的混合物，使颗粒和细胞之间的相互作用最小化。这会选择表达大量所需抗原的细胞与颗粒结合。例如，cd4+ t细胞表达更高水平的cd28，并且在稀释浓度下比cd8+t细胞更有效地被捕获。在一方面，所用细胞的浓度为5
×
106/ml。在其它方面，所使用的浓度可以为约1
×
105/ml至1
×
106/ml，以及其间的任何整数值。在其它方面，细胞可以在旋转器上以不同的速度在2-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
[0332]
用于刺激的t细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过除去细胞群中的粒细胞和在一定程度上除去单核细胞而提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在本文中是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％dmso和8％人血清白蛋白的pbs，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso的培养基，或31.25％plasmalyte-a、31.25％葡萄糖5％、0.45％nacl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso或含有例如hespan和plasmalyte a的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1/分钟的速率冷冻至-80℃并且储存在液氮储罐的气相中。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃或在液氮中立即不受控冷冻。在某些方面，冷冻保存的细胞如本文所述解冻和洗涤，并在使用本公开的方法激活之前在室温静置1小时。
[0333]
在本公开的上下文中还考虑了在可能需要如本文所述的扩增的细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采术产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增的细胞来源，并且分离和冷冻期望的细胞，例如t细胞，随后用于t细胞疗法中，用于将受益于t细胞疗法的任何数量的疾病或病症，例如本文所述的那些。在一方面，血液样品或单采术取自一般健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采术取自处于发展成疾病的风险中但尚未发展成疾病的一般健康受试者，并且分离并冷冻感兴趣的细胞以备后用。在某些方面，可以扩增、冷冻t细胞，并以备后用。在某些方面，在诊断本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在另一方面，在任何数量的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采术中分离细胞，所述相关治疗模式包括但不限于用剂诸如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化学疗法、辐射、免疫抑制剂诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和霉酚酸
酯、抗体或其它免疫消融剂诸如阿仑单抗、抗cd3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、罗米地辛和辐射进行治疗。
[0334]
在本公开的另一方面，t细胞在治疗后直接从患者获得，该治疗使受试者具有功能性t细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗后，特别是用损害免疫系统的药物治疗后，在患者正常从治疗中恢复的期间治疗后不久，获得的t细胞的质量对于它们离体扩增的能力可以是最佳的或改善的。同样地，在使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可以处于用于增强植入和体内扩增的优选状态。因此，在本公开的上下文中预期在该恢复阶段期间收集血细胞，包括t细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。此外，在某些方面，动员(例如，用gm-csf动员)和调节方案可用于在受试者中产生其中有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增的条件，尤其是在治疗后的限定时间窗期间。示例性细胞类型包括t细胞、b细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
[0335]
t细胞的激活和扩增
[0336]
通常可以使用以下中描述的方法激活和扩增t细胞：例如美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和7,572,631。
[0337]
通常，本公开的t细胞可通过与附着有刺激cd3/tcr复合物相关信号的剂和刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。特别地，可以如本文所述刺激t细胞群，例如通过与抗cd3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗cd2抗体接触，或通过与蛋白激酶c激动剂(例如苔藓抑素)连同钙离子载体接触。为了共刺激t细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，t细胞群可以在适于刺激t细胞增殖的条件下与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。为了刺激cd4+ t细胞或cd8+ t细胞的增殖，使用抗cd3抗体和抗cd28抗体。抗cd28抗体的实例包括9.3、b-t3、xr-cd28(diaclone，besancon，france)，可以使用本领域公知的其它方法(berg等人，transplant proc.30(8)：3975-3977，1998；haanen等人，j.exp.med.190(9)：13191328，1999；garland等人，j.immunol.meth.227(1-2)：53-63，1999)。
[0338]
已经暴露于不同刺激时间的t细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采术的外周血单核细胞产物的辅助t细胞群(th、cd4+)大于细胞毒性或抑制性t细胞群(tc、cd8+)。通过刺激cd3和cd28受体的t细胞离体扩增产生t细胞群，在约8-9天之前，该t细胞群主要由th细胞组成，而在约8-9天后，该t细胞群包含越来越多的tc细胞群。因此，根据治疗目的，向受试者输注主要包含th细胞的t细胞群可能是有利的。类似地，如果分离了tc细胞的抗原特异性亚群，则更大程度地扩增该亚群可能是有益的。
[0339]
此外，除cd4和cd8标记物外，其它表型标记物在细胞扩增过程中显著变化，但大部分可再现。因此，这种再现性使得能够为特定目的定制激活的t细胞产物。
[0340]
一旦构建了抗cd19、抗bcma、抗cd22、抗pd1、抗muc16、抗il13r2a2、抗epha2、抗egfrviii、抗ror1、抗pd-1、或抗baff tfp、car或tcr，就可以使用各种测定来评价分子的活性，例如但不限于在抗原刺激后扩增t细胞的能力、在没有再刺激的情况下维持t细胞扩增的能力、以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。评价抗taa tfp、car或tcr的作用的测定在下面进一步详细描述。
[0341]
原代t细胞中tfp表达的蛋白质印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在(参见例如milone等人，molecular therapy 17(8)：1453-1464(2009))。简言之，表达tfp的t细胞(cd4
+
和cd8
+
t细胞的1∶1混合物)在体外扩增超过10天，随后在还原条件下进行裂解和sds-page。使用针对tcr链的抗体通过蛋白质印迹检测tfp。相同的t细胞亚群在非还原条件下用于sds-page分析，以允许评价共价二聚体的形成。
[0342]
抗原刺激后tfp
+
t细胞或car+ t细胞或tcr+ t细胞的体外扩增可通过流式细胞术测量。例如，用αcd3/αcd28和apc刺激cd4
+
和cd8
+ t细胞的混合物，然后用在待分析启动子控制下表达gfp的慢病毒载体转导。示例性的启动子包括cmv ie基因、ef-1α、泛素c或磷酸甘油激酶(pgk)启动子。在培养的第6天，通过流式细胞术在cd4+和/或cd8+ t细胞亚群中评估gfp荧光(参见例如milone等人，molecular therapy 17(8)：1453-1464(2009))。或者，在第0天用αcd3/αcd28包被的磁珠刺激cd4+和cd8+ t细胞的混合物，并在第1天使用表达tfp连同egfp的双顺反子慢病毒载体，使用2a核糖体跳跃序列用tfp转导。洗涤后，在抗cd3和抗cd28抗体(k562-bbl-3/28)存在下，用cd19+k562细胞(k562-cd19)、野生型k562细胞(k562野生型)或表达hcd32和4-1bbl的k562细胞再刺激培养物。每隔一天以100iu/ml向培养物中加入外源il-2。使用基于珠的计数通过流式细胞术计数gfp+ t细胞(参见例如milone等人，molecular therapy 17(8)：1453-1464(2009))。
[0343]
还可以测量在没有再刺激的情况下持续的car+、tcr+或tfp+t细胞扩增(参见例如milone等人，molecular therapy 17(8)：1453-1464(2009))。简言之，在第0天用αcd3/αcd28包被的磁珠刺激，并在第1天用指定的tfp转导后，在培养的第8天使用coulter multisizer iii颗粒计数器测量平均t细胞体积(fl)。
[0344]
动物模型也可用于测量tfp-t活性。例如，可以使用使用人cd19-特异性tfp+t细胞治疗免疫缺陷小鼠中的原代人前b all的异种移植模型(参见例如milone等人，molecular therapy 17(8)：1453-1464(2009))。非常概括地，在建立all后，将小鼠随机分到治疗组。将不同数量的工程化t细胞以1∶1的比率共注射到携带b-all的nod/scid/γ-/-小鼠中。在t细胞注射后的不同时间评估小鼠脾dna中每个载体的拷贝数。每周评估动物的白血病。在注射αcd19-ζtfp+ t细胞或模拟转导的t细胞的小鼠中测量外周血cd19+b-all母细胞计数。使用对数秩检验比较各组的存活曲线。此外，还可以分析nod/scid/γ-/-小鼠中注射t细胞后4周的绝对外周血cd4+和cd8+ t细胞计数。用白血病细胞注射小鼠，3周后注射通过编码与egfp连接的tfp的双顺反子慢病毒载体工程化以表达tfp的t细胞。通过在注射前与模拟转导细胞混合将t细胞标准化为45-50％输入gfp+t细胞，并通过流式细胞术证实。每周评估动物的白血病。使用对数秩检验比较tfp+ t细胞群的存活曲线。
[0345]
可评估剂量依赖性tfp治疗反应(参见例如milone等人，molecular therapy 17(8)：1453-1464(2009))。例如，在第21天用tfp t细胞、等量的模拟转导的t细胞或无t细胞注射的小鼠中建立白血病后35-70天获得外周血。将每组小鼠随机放血以测定外周血cd19+all母细胞计数，然后在第35和49天处死。在第57和70天评价剩余动物。
[0346]
细胞增殖和细胞因子产生的评估先前已描述于例如milone等人，molecular therapy 17(8)：1453-1464(2009)中。在一个非限制性实例中，例如在微量滴定板中，通过将洗涤的t细胞与表达cd19(k19)或cd32和cd137(kt32-bbl)的k562细胞混合，以得到最终t细胞∶k562的比率为2∶1来对tfp介导的增殖进行评估。k562细胞在使用前用γ射线照射。将
抗cd3(克隆okt3)和抗cd28(克隆9.3)单克隆抗体加入到含有kt32-bbl细胞的培养物中，以作为刺激t细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持体外长期cd8+ t细胞扩增。如制造商所述，使用countbright
tm
荧光珠(invitrogen)和流式细胞术计数培养物中的t细胞。使用用egfp-2a连接的tfp表达慢病毒载体工程化的t细胞，通过gfp表达鉴定tfp+ t细胞。对于不表达gfp的tfp+ t细胞，用生物素化重组cd19蛋白和次级抗生物素蛋白-pe缀合物检测tfp+ t细胞。t细胞上的cd4+和cd8+表达也用特异性单克隆抗体(bd biosciences)同时检测。根据制造商的说明书，使用人th1/th2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(bd biosciences)对再刺激后24小时收集的上清液进行细胞因子测量。使用facscalibur
tm
流式细胞仪(bd biosciences)评估荧光，并根据制造商的说明书分析数据。
[0347]
通过标准
51
cr释放测定评估细胞毒性(参见例如milone等人，molecular therapy 17(8)：1453-1464(2009))。将靶细胞(k562细胞系和原代pro-b-all细胞)用
51
cr(作为nacro4，new england nuclear)在37℃下在频繁搅动下装载2小时，在完全rpmi中洗涤两次并铺板于微量滴定板中。效应t细胞与靶细胞在完全rpmi的孔中以效应细胞：靶细胞(e∶t)的不同比率混合。还制备仅含有培养基(自发释放，sr)或1％triton-x 100去污剂溶液(总释放，tr)的其它孔。在37℃下孵育4小时后，收获来自每个孔的上清液。然后使用γ粒子计数器(packard instrument co.，waltham，mass.)测量释放的
51
cr。每种条件进行至少三次，使用以下公式计算裂解百分比：％裂解＝(er-sr)/(tr-sr)，其中er代表每种实验条件下释放的平均
51
cr。
[0348]
成像技术可用于评价携带肿瘤的动物模型中tfp的特异性运输和增殖。此类测定已描述于例如barrett等人，human gene therapy 22：1575-1586(2011)中。nod/scid/γc-/-(nsg)小鼠用nalm-6细胞(crl-3273
tm
)iv注射，7天后用tfp构建体电穿孔后4小时注射t细胞。用慢病毒构建体稳定转染t细胞以表达萤火虫荧光素酶，并对小鼠进行生物发光成像。或者，可如下测量nalm-6异种移植模型中单次注射tfp+ t细胞的治疗功效和特异性：用转导以稳定表达萤火虫荧光素酶的nalm-6注射nsg小鼠，接着7天后用cd19tfp 7电穿孔的t细胞的单次尾静脉注射。在注射后的不同时间点对动物进行成像。例如，可以产生第5天(治疗前2天)和第8天(tfp+pbl后24小时)代表性小鼠中萤火虫荧光素酶阳性白血病的光子密度热图。
[0349]
其它测定，包括本文实施例部分所述的那些以及本领域已知的那些也可用于评价本文公开的抗cd19、抗bcma、抗il13ra2、muc16、epha2 egfrviii、抗cd22、抗ror1、抗pd1或抗baff tfp构建体。
[0350]
药物组合物
[0351]
在一些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含：(a)本公开的修饰的免疫细胞；和(b)药学上可接受的载体。此类组合物可包含缓冲剂如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一方面，本公开的组合物被配制用于静脉内施用。
[0352]
本公开的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的量和频率将由诸如患者状况和患者疾病的类型和严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可由临床试验决定。
[0353]
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含例如没有可检测水平的污染物，例如选自由以下组成的组：内毒素、支原体、具有复制能力的慢病毒(rcl)、p24、vsv-g核酸、hiv gag、残留的抗cd3/抗cd28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基成分、载体包装细胞或质粒成分、细菌和真菌。在一个实施方案中，细菌是选自由以下组成的组的至少一种：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌a组。
[0354]
当指示“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本公开的组合物的精确量可由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度和状况的个体差异来确定。通常可以说，包含本文所述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，在一些情况下105至106个细胞/kg体重，包括那些范围内的所有整数值的剂量施用。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如rosenberg等人，new eng.j.of med.319：1676，1988)。
[0355]
在某些方面，可能需要向受试者施用激活的t细胞，然后随后再抽取血液(或进行单采术)，根据本公开从其激活t细胞，并用这些激活和扩增的t细胞再输注患者。该过程可以每几周进行多次。在某些方面，可以从10cc至400cc的血液抽取中激活t细胞。在某些方面，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取中激活t细胞。
[0356]
主题组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输液、植入或移植。本文所述的组合物可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。在一方面，通过皮内或皮下注射向患者施用本公开的t细胞组合物。在一方面，本公开的t细胞组合物通过静脉内注射施用。t细胞组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
[0357]
在特定的示例性方面，受试者可以经历白细胞单采术，其中离体收集、富集或去除白细胞以选择和/或分离感兴趣的细胞，例如t细胞。这些t细胞分离物可通过本领域已知的方法扩增和处理，使得可引入本公开的一种或多种tfp构建体，从而产生本公开的修饰的t-t细胞。有此需要的受试者随后可以用高剂量化疗进行标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植后或与移植同时，受试者接受本公开的扩增的修饰的人免疫细胞的输注。在另一方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
[0358]
施用于患者的上述治疗的剂量将随待治疗的病症的精确性质和治疗的接受者而变化。用于人施用的剂量的缩放可以根据本领域接受的实践进行。例如，对于成人患者，阿仑单抗的剂量通常在1至约100mg的范围内，通常每天施用，持续1至30天。优选的日剂量为1至10mg/天，尽管在一些情况下可使用高达40mg/天的较大剂量(美国专利号6,120,766中描述)。
[0359]
在一个实施方案中，例如使用体外转录将tfp引入t细胞中，并且受试者(例如人)接受本公开的tfp t细胞的初始施用，以及本公开的tfp t细胞的一次或多次后续施用，其中所述一次或多次后续施用在上次施用后不到15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。在一个实施方案中，每周向受试者(例如人)施用多于一次本公开的tfp t细胞施用，例如每周施用2、3或4次本公开的tfp t细胞施用。在一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)每周接受多于一次的tfp t细胞施用(例如，每周2、3或4次施用)(在本文中也称
为循环)，随后一周不施用tfp t细胞，然后向受试者施用一次或多次另外的tfp t细胞施用(例如，每周多于一次的tfp t细胞施用)。在另一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)接受多于一个循环的tfp t细胞，并且每个循环之间的时间少于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，tfp t细胞每隔一天施用，每周施用3次。在一个实施方案中，施用本公开的tfp t细胞至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
[0360]
在一方面，抗taa tfp t细胞或car t细胞或tcr t细胞使用慢病毒载体如慢病毒产生。产生的tfp-t细胞将具有稳定的tfp表达。在另一方面，t抗taa tfp t细胞或car t细胞或tcr t细胞
[0361]
在一方面，tfp t细胞在转导后4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天瞬时表达tfp载体。tfp的瞬时表达可受到rna tfp载体递送的影响。一方面，通过电穿孔将tfp rna转导到t细胞中。
[0362]
在用瞬时表达tfp的t细胞(特别是用携带鼠scfv的tfp t细胞)治疗的患者中可能出现的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。
[0363]
不受这种理论的束缚，据信这种过敏反应可能是由患者产生体液抗tfp反应，即具有抗ige同种型的抗tfp抗体引起的。认为当暴露于抗原中断10-14天时，患者的抗体产生细胞经历从igg同种型(不引起过敏反应)到ige同种型的类别转换。
[0364]
如果患者在瞬时tfp治疗(例如通过rna转导产生的那些)过程中处于产生抗tfp抗体反应的高风险中，则tfp t细胞输注中断的持续时间不应超过10至14天。
[0365]
治疗方法
[0366]
在一些实施方案中，本文公开了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文公开的药物组合物和制剂。在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含(a)根据本文公开的方法产生的修饰的人免疫细胞；和(b)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含(a)含有有效负载的递送装置(例如脂质体)，所述有效负载包含本文公开的环状rna分子或载体中的一种；和(b)药学上可接受的载体。
[0367]
在一些情况下，修饰的人免疫细胞是同种异体t细胞。在一些实施方案中，修饰的人免疫细胞是自体t细胞。在一些实施方案中，修饰的人免疫细胞是成淋巴细胞。在一些情况下，与施用有效量的未修饰的对照t细胞的受试者相比，受试者中释放更少的细胞因子。在一些情况下，与施用有效量的包含本文公开的重组核酸或本文公开的载体的修饰的人免疫细胞的受试者相比，受试者中释放更少的细胞因子。
[0368]
在一些情况下，方法包括将药物制剂与增加药物制剂功效的剂组合施用。在一些情况下，方法包括将药物制剂与改善与药物组合物相关的一种或多种副作用的剂组合施用。
[0369]
在一些情况下，癌症是实体癌、淋巴瘤或白血病。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：急性成淋巴细胞性白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、未知原发性来源的癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、导管
癌、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、粘连成神经细胞瘤、纤维组织细胞瘤、尤因肉瘤、眼癌、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠基质瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、小叶原位癌、肺癌、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈隐匿性原发性癌、涉及nut基因的中线癌、口腔癌、多发性内分泌腺瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌样瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓瘤、胃癌、t细胞淋巴瘤、畸胎瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和肾母细胞瘤。
[0370]
不希望受任何特定理论的束缚，由修饰的人免疫细胞引起的抗肿瘤免疫反应可以是主动或被动免疫反应，或者可以是由于直接与间接免疫反应。
[0371]
在一方面，本公开的修饰的人免疫细胞可以是用于哺乳动物的离体免疫和/或体内治疗的疫苗类型。在一方面，哺乳动物是人。
[0372]
关于离体免疫，在将细胞施用给哺乳动物之前，在体外发生以下至少一种：i)细胞的扩增，ii)将编码tfp或tcr或car和tcrα、β、γ和/或δ恒定结构域的核酸引入细胞，或iii)细胞的冷冻保存。
[0373]
离体程序是本领域熟知的，并在下面更充分地讨论。简言之，从哺乳动物(例如人)分离细胞并用本文公开的载体遗传修饰(即，体外转导或转染)。可以将修饰的人免疫细胞施用给哺乳动物接受者以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，并且修饰的细胞对于接受者可以是自体的。或者，细胞对于接受者可以是同种异体的、同基因的或异种的。
[0374]
在通过引用并入本文的美国专利号5,199,942中描述了用于离体扩增造血干细胞和祖细胞的程序可应用于本公开的细胞。其它合适的方法是本领域已知的；因此，本公开不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简单地说，离体培养和扩增t细胞包括：(1)从哺乳动物外周血收获物或骨髓外植体收集cd34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增所述细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子外，其它因子如flt3-l、il-1、il-3和c-kit配体可用于培养和扩增细胞。
[0375]
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本公开还提供了用于体内免疫以在患者中引发针对抗原的免疫反应的组合物和方法。
[0376]
通常，如本文所述激活和扩增的细胞可用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。
[0377]
本公开的修饰的人免疫细胞可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其它组分如il-2或其它细胞因子或细胞组合施用。
[0378]
联合疗法
[0379]
本文所述的修饰的人免疫细胞或靶向的环状rna或靶向的或非靶向的递送载体(例如，脂质体)可以与其它已知的剂和疗法组合使用。如本文所用，“组合”施用意指在受试
者罹患病症的过程期间向受试者递送两种(或更多种)不同治疗，例如在受试者已被诊断患有病症之后且在病症已被治愈或消除或治疗因其它原因而停止之前递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当第二种治疗的递送开始时，一种治疗的递送仍在发生，从而在施用方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并发递送”。在其它实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方案中，治疗由于组合施用而更有效。例如，与在没有第一种治疗的情况下施用第二种治疗或在第一种治疗的情况下观察到类似情况相比，第二种治疗更有效，例如用较少的第二种治疗观察到等效效果，或第二种治疗更大程度地减轻症状。在一些实施方案中，递送使得症状或与病症相关的其它参数的减少大于在不存在另一种的情况下递送一种治疗时所观察到的。两种治疗的效果可以是部分叠加、完全叠加或大于叠加。递送可以使得当递送第二种治疗时，递送的第一种治疗的效果仍然是可检测的。
[0380]
在一些实施方案中，“至少一种另外的治疗剂”包括修饰的人免疫细胞。还提供了表达多个tfp的t细胞，所述tfp结合相同或不同的靶抗原，或相同靶抗原上的相同或不同表位。还提供了t细胞群，其中第一t细胞子集表达第一tfp和tcrα和/或β恒定结构域，第二t细胞子集表达第二tfp和tcrα和/或β恒定结构域。还提供了t细胞群，其中第一t细胞子集表达第一tfp和tcrγ和/或δ恒定结构域，第二t细胞子集表达第二tfp和tcrγ和/或δ恒定结构域。
[0381]
本文所述的修饰的人免疫细胞和至少一种另外的治疗剂可以同时、在相同或分开的组合物中施用或依序施用。对于依序施用，可以首先施用本文所述的修饰的人免疫细胞，然后可以施用另外的剂，或可以颠倒施用顺序。
[0382]
在其它方面，本文所述的修饰的人免疫细胞可用于与以下组合治疗方案中：手术、化学疗法、辐射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和fk506、抗体或其它免疫消融剂如阿仑单抗、抗cd3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、罗米地辛、细胞因子和辐射、肽疫苗，例如izumoto等人2008j neurosurg 108：963-971中所述的。
[0383]
在一个实施方案中，可以向受试者施用降低或改善与施用修饰的人免疫细胞相关的副作用的剂。与施用修饰的人免疫细胞相关的副作用包括但不限于细胞因子释放综合征(crs)和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(hlh)，也称为巨噬细胞激活综合征(mas)。crs的症状包括高烧、恶心、短暂性低血压、缺氧等。因此，本文公开的方法可以包括向受试者施用本文所述的修饰的人免疫细胞，并进一步施用剂以控制由用修饰的人免疫细胞治疗引起的可溶性因子水平升高。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是ifn-γ、tnfα、il-2和il-6中的一种或多种。因此，用于治疗这种副作用所施用的剂可以是中和这些可溶性因子中的一种或多种的剂。此类剂包括但不限于类固醇、tnfα抑制剂和il-6抑制剂。tnfα抑制剂的实例是依他西普。il-6抑制剂的实例是托珠单抗。
[0384]
在一个实施方案中，可以向受试者施用增强修饰的人免疫细胞活性的剂。例如，在一个实施方案中，剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如程序性死亡1(pd1)可降低修饰的人免疫细胞引发免疫效应反应的能力。抑制性分子的实例包括pd1、pd-l1、ctla4、tim3、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfrβ。抑制性分子的抑制，例如通过在dna、rna或蛋白质水平上的抑制，可以优化修饰的人免疫细胞的性能。
在实施方案中，抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsrna，例如sirna或shrna，可用于抑制tfp表达细胞中抑制性分子的表达。在一个实施方案中，抑制剂是shrna。在一个实施方案中，抑制性分子在修饰的人免疫细胞内被抑制。在这些实施方案中，抑制抑制性分子表达的dsrna分子与编码tfp的组分例如所有组分的核酸连接。在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以是例如与抑制性分子结合的抗体或抗体片段。例如，剂可以是结合pd1、pd-l1、pd-l2或ctla4的抗体或抗体片段(例如，伊匹单抗(也称为mdx-010和mdx-101，并作为销售)；bristol-myers squibb；替西木单抗(购自pfizer的igg2单克隆抗体，以前称为ticilimumab、cp-675，206))。在一个实施方案中，剂是结合tim3的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，剂是结合lag3的抗体或抗体片段。
[0385]
在一些实施方案中，增强修饰的人免疫细胞的活性的剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，第二结构域是与正信号相关的多肽，例如包含如本文所述的胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与正信号相关的多肽可以包括cd28、cd27、icos的共刺激结构域，例如cd28、cd27和/或icos的胞内信号传导结构域、和/或初级信号传导结构域，例如cd3ζ的初级信号传导结构域，例如，如本文所述。在一个实施方案中，融合蛋白由表达tfp的相同细胞表达。在另一个实施方案中，融合蛋白由细胞表达，例如不表达抗taa tfp的t细胞。
[0386]
实施例
[0387]
参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。除非另有说明，否则提供这些实施例仅用于说明的目的，并不旨在限制。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。在没有进一步描述的情况下，据信本领域普通技术人员可以使用前述描述和以下说明性实施例制备和利用本发明的化合物并实施要求保护的方法。以下工作实施例具体指出了本发明的各个方面，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
[0388]
实施例1：编码蛋白质的环状rna(circrna)的设计
[0389]
此实验经选择表达的靶蛋白是gfp。功能性gfp从环状rna的翻译是通过在排列的内含子-外显子(pie)剪接策略中使用核酶实现的。为了产生编码gfp的circrna，在来自噬菌体t4的胸苷酸合酶(td)基因中i组催化内含子下游和上游的e2和e1外显子的两个短片段之间放置内部核糖体进入位点(ires)，随后是gfp编码序列。或者，可使用鱼腥藻前体trna基因中i组催化内含子下游和上游的e2和e1外显子，因为鱼腥藻前体trna基因中i组催化内含子的剪接效率比噬菌体t4 td基因更有效。[puttaraju，m.&been，m.nucleic acids res.20，5357-5364(1992)]。最后，将i组催化性内含子的3
′
半部分克隆到e2的上游，而将i组催化性内含子的5
′
半部分置于e1的下游。设计3
′
pie剪接位点和ires之间的间隔物。将长度为33-35个核苷酸的互补
′
同源臂
′
置于前体rna的5
′
和3
′
端，目的是使5
′
和3
′
剪接位点彼此接近，以在循环过程中用于提高剪接效率。
[0390]
实施例2：编码tfp的circrna的设计
[0391]
功能性tfp从环状rna(circrna)的翻译可以通过使用核酶以排列的内含子-外显子(pie)剪接策略来实现。为了产生编码tfp的circrna，在来自噬菌体t4的胸苷酸合酶(td)基因中i组催化内含子下游和上游的e2和e1外显子的两个短片段之间放置内部核糖体进入位点(ires)，随后是tfp编码序列(cds)。或者，可使用鱼腥藻前体trna基因中i组催化内含
子下游和上游的e2和e1外显子，因为鱼腥藻前体trna基因中i组催化内含子的剪接效率比噬菌体t4 td基因更有效。[puttaraju，m.&been，m.nucleic acids res.20，5357-5364(1992)]。最后，将i组催化性内含子的5
′
半部分克隆到e2的上游，而将i组催化性内含子的3
′
半部分置于e1的下游。设计3
′
pie剪接位点和ires之间的间隔物。将长度为33-35个核苷酸的互补外部同源臂置于前体rna的5
′
和3
′
端，目的是使5
′
和3
′
剪接位点彼此接近，以在循环过程中用于提高剪接效率[wesselhoeft等人，nat.commun.，9：26-29.，2018]。在一些实施方案中，在tfp编码序列之外添加蛋白质结合基序以增加circrna的半衰期。在一个实施方案中，蛋白结合基序是具有约20个核苷酸的polya接头。
[0392]
实施例3：编码car、tcr的circrna的设计
[0393]
功能性car、tcr从环状rna(circrna)的翻译可以通过使用核酶以排列的内含子-外显子(pie)剪接策略来实现。为了产生编码car、tcr的circrna，在来自噬菌体t4的胸苷酸合酶(td)基因中i组催化内含子下游和上游的e2和e1外显子的两个短片段之间放置内部核糖体进入位点(ires)，随后是car、tcr编码序列(cds)。或者，可使用鱼腥藻前体trna基因中i组催化内含子下游和上游的e2和e1外显子，因为鱼腥藻前体trna基因中i组催化内含子的剪接效率比噬菌体t4 td基因更有效。[puttaraju，m.&been，m.nucleic acids res.20，5357-5364(1992)]。最后，将i组催化性内含子的5
′
半部分克隆到e2的上游，而将i组催化性内含子的3
′
半部分置于e1的下游。设计3
′
pie剪接位点和ires之间的间隔物。将长度为33-35个核苷酸的互补
′
同源臂
′
置于前体rna的5
′
和3
′
端，目的是使5
′
和3
′
剪接位点彼此接近，以在循环过程中用于提高剪接效率。此外，可以在tfp编码序列之外添加蛋白质结合基序以增加circrna的半衰期，例如具有a＞20个核苷酸的polya接头[wesselhoeft等人，nat.commun.，2018]。
[0394]
表1：用于设计编码有效负载的环状rna的序列
[0395]
[0396]
[0397][0398]
表2：用于产生编码有效负载的环状rna的序列
[0399]
[0400]
[0401]
[0402]
[0403]
[0404]
[0405]
[0406]
[0407]
[0408]
[0409][0410]
实施例4：自剪接线性前体rna的产生
[0411]
tfp编码基因座，鱼腥藻催化内含子和(柯萨奇病毒b3(cvb3)或脑心肌炎病毒(emcv))ires序列通过使用integrated dnatechnologies化学合成。随后使用hifi dna assembly试剂盒(new england biolabs)通过gibson将序列克隆到含有t7 rna聚合酶启动子的线性化质粒载体中。使用定点诱变试剂盒(new england biolabs)引入间隔区、同源臂和其它变体。使用t7高产率rna合
成试剂盒(new england biolabs)通过体外转录从线性化质粒dna模板或pcr产物合成线性前体rna。
[0412]
实施例5：编码tfp的circrna的产生和纯化
[0413]
在体外转录后，用dna酶i(new england biolabs)处理线性前体rna 20分钟。然后使用megaclear转录净化试剂盒(ambion)柱纯化rna样品。然后在镁离子和gtp的存在下加热线性前体rna以促进环化，基本上如先前关于较短rna的环化所述[ford，e.&ares，m.proc.natl acad.sci.91，3117-3121(1994)]：将rna加热至70c，持续5分钟，然后立即置于冰上，持续3分钟，然后加入gtp至终浓度2mm，以及含有镁的缓冲液(50mm tris-hcl、10mm mgcl2、1mm dtt、ph 7.5；new england biolabs)。然后将rna加热至55c，持续40分钟，然后进行柱纯化。
[0414]
使用rna酶r检测rna的环度：为了富集circrna，将20μg rna在水中稀释(88μl终体积)，然后在70℃加热2分钟，并在冰上冷却2分钟。加入20u rna酶r和10μl酶r缓冲液(epicenter)，使反应在37c孵育40min；在反应中途加入另外的10u rna酶r。使用rna净化试剂盒(new england biolabs)对rna酶r消化的rna进行柱纯化。
[0415]
在预制的1.5％tbe琼脂糖凝胶或预制的2％e-gel ex琼脂糖凝胶(invitrogen)上分离rna；使用ssrna阶梯(neb，thermofisher scientific)作为标准。使用蓝光透射使条带可视化。对于凝胶提取，从凝胶切下对应于circrna的条带，然后使用zymoclean
tm
凝胶rna提取试剂盒(zymogen)进行提取。
[0416]
circrna制剂的纯度是使circrna的蛋白质产生最大化和避免先天细胞免疫反应所必需的另一因素[kariko，k.，muramatsu，h.，ludwig，j.&weissman，d.nucleic acids res.39，e142-e142(2011)]。因此，应用高效液相色谱(hplc)、快速蛋白液相色谱(fplc)或尺寸排阻色谱作为另一种柱纯化方法。对于hplc，将30μg rna在65℃加热3min，然后置于冰上3min。使rna在agilent 1100系列hplc(agilent)上通过粒径为5μm、孔径为的4.6
×
300mm大小排阻柱(sepax technologies；部件号：215980p-4630)。在无rna酶的te缓冲液(10mm tris，1mm edta，ph：6)中以0.3ml/分钟的流速运行rna。通过260nm处的uv吸光度检测rna，但在没有uv检测的情况下收集。所得rna级分用5m乙酸铵沉淀，再悬浮于水中，然后在一些情况下用rna酶r处理，如上所述。
[0417]
使用配备有50ml超环和三个串联连接的5ml hitrap deae-琼脂糖ff柱(ge healthcare)的akta prime fplc系统，从粗转录反应中纯化rna。在室温下用三个柱体积的缓冲液a(50mm磷酸钠[ph6.5]，150mm氯化钠和0.2mm edta)平衡deae柱。缓冲液b含有具有2m氯化钠的相同组分。两种缓冲液都可以大量制备，无菌过滤，并储存在4℃(缓冲液a)或室温(缓冲液b)以避免氯化钠沉淀。将终止的转录反应(10-40ml)加载到50ml超环中并使用以下梯度进行弱阴离子交换层析，同时在无菌15ml塑料管中收集10ml级分：0-70ml(0％b，1ml/min)将样品加载到deae柱上，70-100ml(0％-10％b，2ml/min)从柱上洗掉剩余的rntp，100-380ml(10％-30％b，2ml/min)分离小的流产转录物，所需的rna产物和质粒dna模板，380-410ml(30％-100％b，4ml/min)、410-455ml(100％b，4ml/min)、和455-485ml(100％-0％b，4ml/min)清洗并平衡柱用于下一次纯化。对于低于1ml的小规模转录，用缓冲液a将反应混合物稀释至2ml以确保完全加载到超环，并使用单个1ml hitrap deae-琼脂糖ff柱和
相同的梯度曲线进行层析，其中缓冲液体积减少至1/15，收集2ml级分。含有所需rna的级分用5m乙酸铵沉淀，重悬于水中，然后在一些实施方案中用rna酶r处理，如上所述。
[0418]
对于sec，akta纯系统在unicorn 7.0软件包的控制下连接到fr-9级分收集。通过0.5ml样品环将环状rna注射到superdex 200增加柱(24ml)。用在depc处理的水中制备的pbs(nacl0.138m；kcl-0.0027m)ph＝7.2平衡该柱。以0.2ml/min进行色谱，收集0.5或0.25ml级分。所有实验均在4℃下进行。
[0419]
实施例6：通过电穿孔用编码tfp的circrna转染jurkat细胞
[0420]
j将jurkat细胞以0.2
×
106个细胞/ml维持在补充有10％胎牛血清(fbs)和300mg/l l-谷氨酰胺的rpmi 1640培养基中直至电穿孔。将1-2μg circrna与5
×
105个t细胞混合，并根据转染系统(thermofisher)的制造商方案进行电穿孔。电穿孔设定为1600v，10ms，3个脉冲。脉冲后，立即将细胞转移至温热培养基中并在37℃下孵育3-7天。
[0421]
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的(参见例如，sambrook等人，2012，molecular cloning：a laboratory manual，第1-4卷，cold spring harbor press，ny)。将多核苷酸引入宿主细胞的一种方法是磷酸钙转染。
[0422]
实施例7：用编码tfp的circrna转导的t细胞的制备
[0423]
pbmc分离
[0424]
从全血或血沉棕黄层制备外周血单核细胞(pbmc)。将全血收集在10ml肝素真空采血管中并立即处理或在4℃下储存过夜。在50ml锥形离心管(pbs，ph7.4，不含ca
2+
/mg
2+
)中将约10ml抗凝全血与无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液混合，总体积为20ml。然后将20ml这种血液/pbs混合物轻轻覆盖在15mlplus(ge healthcare，17-1440-03)的表面上，然后在室温下在不施加制动的情况下以400g离心30-40分钟。
[0425]
血沉棕黄层购自research blood components(boston，ma)。通过加入15ml(ge health care)制备管(greiner bio-one)并以1000g离心1分钟。将血沉棕黄层在pbs(ph7.4，不合ca
2+
或mg
2+
)中以1∶3稀释。将稀释的血沉棕黄层转移到leucosep管中并在不施加制动的情况下以1000g离心15分钟。小心地除去在稀释血浆/ficoll界面处看到的含有pbmc的细胞层，以使ficoll的污染最小化。然后通过在室温下以200g离心10分钟用40ml pbs洗涤pbmc三次来除去残留的ficoll、血小板和血浆蛋白。然后用血细胞计数器计数细胞。将洗涤的pbmc用car t培养基(aimt培养基(aim(bsa)(life technologies)，含有5％ab血清和1.25μg/ml两性霉素b(gemini bioproducts，woodland，ca)，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)洗涤一次。或者，将洗涤的pbmc转移到保温小瓶中并在-80℃下冷冻24小时，然后储存在液氮中备用。
[0426]
t细胞激活
[0427]
从全血或血沉棕黄层制备的pbmc在转染前用抗人cd28和cd3抗体缀合的磁珠刺激24小时。将新鲜分离的pbmc在不合huil-2的car t培养基(aim v-albumax(bsa)(life technologies)，含有5％ab血清和1.25μg/ml两性霉素b(gemini bioproducts)、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中洗涤一次，然后以1x106个细胞/ml的终浓度再悬浮于含有300iu/ml人il-2(来自1000x原液；invitrogen)的car t培养基中。如果pbmc先前已被冷冻，
则将其解冻并在10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素存在下，以1x107个细胞/ml再悬浮于9ml预温(37℃)cdmem培养基(life technologies)中，浓度为1x106个细胞/ml，然后在cart培养基中洗涤一次，以1x106个细胞/ml再悬浮于car t培养基中，并添加il-2，如上所述。
[0428]
在激活之前，用1ml无菌1xpbs(ph7.4)洗涤抗人cd28和cd3抗体缀合的磁珠(可获自例如invitrogen，life technologies)三次，使用磁架从溶液中分离珠，然后在含有300iu/ml人il-2在car t培养基中重悬浮至4x107珠/ml的终浓度。然后通过将25μl(1
×
106珠)的珠转移到1ml pbmc中，将pbmc和珠以1∶1的珠与细胞比混合。然后将所需数量的等分试样分配到12孔低附着或未处理的细胞培养板的单个孔中，并在转染前在37℃下用5％co2孵育24小时。
[0429]
t细胞转染和扩增
[0430]
激活pbmc后，将细胞在37℃，5％co2下孵育48小时。然后，根据制造商的说明书，使用messengermax
tm
(invitrogen)或2000(invitrogen，11668-019)将40-100ng rna酶r处理的剪接反应或纯化的编码tfp的circrna反向转染到96孔板的每孔中10,000个细胞/100μl。所用的试剂盒是基于脂质纳米颗粒的技术。对于其中在多个时间点评估蛋白质表达的实验，在每个时间点完全除去并更换培养基。基于中试实验选择样本量，以确定测定差异并最小化试剂消耗，同时允许区分条件之间的有意义的差异。
[0431]
然后使细胞在持续存在300iu/ml人il-2的情况下生长6-14天(总孵育时间取决于car-t细胞的最终数量)。每2-3天分析细胞浓度，此时加入培养基以将细胞悬浮液维持在1
×
106细胞/ml。
[0432]
在一些情况下，通过电穿孔转染激活的pbmc。在一个实施方案中，在存在300iu/ml重组人il-2(r&d systems)(可以使用其它刺激试剂，如milyeni pharmaceuticals的t细胞试剂)下，用(thermofisher)以1∶1的比率刺激人pbmc 3天。在电穿孔之前除去珠子。洗涤细胞并以2.5
×
107细胞/ml的浓度重悬于opti-mem培养基(thermofisher)中。将200μl细胞悬浮液(5
×
106个细胞)转移到2mm间隙electroporation cuvettes plus
tm
(harvard apparatus btx)中并在冰上预冷。将10μg编码tpf的circrn加入到细胞悬浮液中。然后使用ecm830电方波穿孔器(harvard apparatus btx)将circrna/细胞混合物在200v下电穿孔20毫秒。电穿孔后立即将细胞转移到新鲜细胞培养基(aim v(bsa)无血清培养基+5％人ab血清+300iu/ml il-2)中并在37℃下孵育。
[0433]
在一些情况下，使用与实施例6中类似的方案通过电穿孔转染t细胞。将1-2μg circrna与5x105t细胞混合并根据neon转染系统(thermofisher)的制造商方案进行电穿孔。电穿孔设定为1600v，10ms，3个脉冲。脉冲后，立即将细胞转移至温热培养基中并在37℃下孵育。
[0434]
实施例8：转染的jurkat和t细胞的蛋白表达分析
[0435]
翻译反应的蛋白质印迹分析
[0436]
t细胞和jurkat细胞中tfp表达的蛋白质印迹分析用于检测单体和二聚体的存在(参见例如，milone等人，molecular therapy 17(8)：1453-1464(2009))。简言之，将表达
tfp的t细胞或jurkat细胞在体外扩增6-14天，然后裂解并在还原条件下进行sds-page。通过使用针对tcr链的抗体(例如抗tcrα、抗tcrβ、抗cd3ε、抗cd3γ、抗cd3δ或抗cd3ζ)来检测tfp。相同的t细胞子集在非还原条件下用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳((sds-page)分析，以允许评价共价二聚体的形成。
[0437]
流式细胞术
[0438]
在用circrna转染t细胞和jurkat细胞后，通过流式细胞术证实tfp的表达，例如包含对间皮素、cd19、bcma、pd1、ror1、cd22、il13ra2等具有特异性的结合蛋白的tfp，或双特异性tfp表达。使用抗cd3 apc(克隆，ucht1.bd biosciences目录号340440，批号6005787)、抗cd4-pacific blue(克隆rpat4，biolegend，目录号300521，批号b231611)、抗cd8-apccy7(克隆sk1，bd biosciences，目录号557834，批号，6082865)、间皮素抗原(acro bioscience，目录号904x-7289f1-e7，批号904x-3aos1-4n)、cd69-af 700(克隆fn50，目录号560739，批号7051802)、zenon r-藻红蛋白人igg标记试剂盒(thermofischer scientific，目录号z25408，批号1863290)和同种型对照、apc小鼠igg1、k同种型对照(克隆x40，bd biosciences，目录号340442)、pacific blue同种型对照(克隆mopc-21，bd biosciences，目录号558120)、apccy7 igg1同种型对照(bd biosciences，目录号557873)、af700igg1同种型对照(克隆27-35，bd biosciences，目录号560543)、人nkg2d/cd314-apc(r&d systems，批号lco061321)及其各自的同种型对照(bd biosciences)对t细胞染色。使用bd-lsriix20(bd biosciences)进行流式细胞术，使用facs diva软件获取数据并用(treestar，inc.ashland，or)进行分析。
[0439]
实施例9：msth-tfp的细胞毒性
[0440]
基于荧光素酶的细胞毒性测定(“luc-cyto”测定)通过间接测量共培养后残余活靶细胞中的荧光素酶酶活性来评估表达抗msth-tfp的t细胞的细胞毒性。
[0441]
表达萤火虫荧光素酶(luc)的肿瘤细胞的产生
[0442]
luc-cyto测定中使用的靶细胞是nalm6-luc(cd19阳性)和k562-luc(cd19阴性通过稳定转导nalm6(dsmz目录号acc 128)和k562(目录号ccl-243
tm
而产生)细胞以表达萤火虫荧光素酶。利用(thermofisher)合成编码萤火虫荧光素酶的dna，并将其插入单启动子慢病毒载体pcdh527a-1(system biosciences)的多克隆位点。根据制造商的说明书包装慢病毒。然后用慢病毒转导肿瘤细胞24小时，然后用嘌呤霉素(5μg/ml)选择。nalm6-luc和k562-luc细胞的成功产生通过用bright-glo
tm
荧光素酶测定系统(promega)测量细胞中的荧光素酶活性来证实。
[0443]
评估t细胞的细胞毒性的luc-cyto测定
[0444]
通过将t细胞与肿瘤细胞以不同的效应物(t细胞)与靶标(肿瘤细胞)(e∶t)比率混合来建立luc-cyto测定。将靶细胞(nalm6-luc或k562-luc)以10,000个细胞/孔铺板在具有补充有10％热灭活(hi)fbs的rpmi-1640培养基的96孔板中。将tfp t细胞以每孔10000、3333或1111个细胞加入到肿瘤细胞中，以达到1∶1或1∶3或1∶9的e∶t比率。将细胞混合物在37c和5％co2下孵育24小时。使用bright-glo
tm
荧光素酶测定系统(promega)测量荧光素酶活性，其测量t细胞和肿瘤细胞共培养物中残留活靶细胞的活性。
[0445]
实施例10：表达gfp的circrna的产生和转导
[0446]
根据实施例1所述的方法设计用于产生具有seq id no：146序列的表达gfp的circrna的前体rna的序列。如图2和图3所示，将cbv3或emcv ires接着gfp置于鱼腥藻前体trna基因中i组催化内含子下游和上游的e2和e1外显子的两个短片段之间。i组催化内含子的3
′
半部分位于e2的上游，而i组催化内含子的5
′
半部分位于e1的下游。在3
′
pie剪接位点和ires之间也引入间隔物。长度为33-35个核苷酸的互补外部同源臂也位于5
′
和3
′
端。具有cbv3ires的前体rna的序列是seq id no：146。图2也显示了由该前体rna形成的三维结构。
[0447]
首先根据实施例4中描述的方法将前体rna的序列克隆到dna质粒中。然后将质粒线性化，然后从dna模板体外转录rna前体。
[0448]
然后根据实施例5中描述的方法从线性前体rna产生circrna。然后将产物在琼脂糖凝胶上电泳。如图3所示，具有emcv和cbv3ires的前体rna都形成circrna环化产物，可见为一条更缓慢迁移的条带。
[0449]
然后将circrna转染到jurkat细胞中以评价表达gfp蛋白的细胞的比例。根据实施例6中描述的方法通过电穿孔转染jurkat细胞。细胞未转导，用gfp circrna转导，或用剪接位点突变的gfp前体转导，所述剪接位点突变的gfp前体缺失跨越i组催化内含子的3
′
半部分和e2的剪接位点的40个核苷酸区域以及跨越e1和内含子的5
′
半部分的剪接位点的30个核苷酸区域。该突变的gfp前体由具有seq id no：147序列的前体rna产生。根据实施例8中所述的方法，在转染后24小时通过流式细胞术测量转染细胞中的蛋白质表达。如图4所示，未转导的(nt)细胞不表达gfp，而用gfp circrna转导的细胞表达gfp至少15天。用突变的gfp circrna转导的细胞表gfp少于10天。
[0450]
实施例11：表达抗cd19-tfp的circrna的产生和转导
[0451]
根据实施例2所述的方法设计用于产生具有seq id no：148序列的表达抗cd19-tfp的circrna的前体rna的序列。如图5所示，将cbv3 ires接着抗cd19-tfp置于鱼腥藻前体trna基因中i组催化内含子下游和上游的e2和e1外显子的两个短片段之间。i组催化内含子的3
′
半部分位于e2的上游，而i组催化内含子的5
′
半部分位于e1的下游。在3
′
pie剪接位点和ires之间也引入间隔物。长度为33-35个核苷酸的互补外部同源臂也位于5
′
和3
′
端。图5也显示了由前体rna形成的三维结构。
[0452]
首先根据实施例4中描述的方法将前体rna的序列克隆到dna质粒中。然后将质粒线性化，然后从dna模板体外转录rna前体。
[0453]
然后根据实施例5中描述的方法从线性前体rna产生circrna。在ivt反应和环化后，在琼脂糖凝胶上可见rna。如图6所示，前体rna形成circrna环化产物，可见为一条更缓慢迁移的条带。
[0454]
然后将circrna转染到jurkat细胞中以评价表达抗cd19-tfp蛋白的细胞的比例。根据实施例6中描述的方法通过电穿孔转染jurkat细胞。细胞未转导或用抗cd19-tfp circrna转导。根据实施例8中所述的方法，在转染后24小时通过流式细胞术测量转染细胞中的蛋白质表达。如图7中所示，未转导的细胞不表达抗cd19-tfp，而用抗cd19-tfp circrna转导的细胞表达抗cd19-tfp至少5天。
[0455]
实施例12：表达抗msln-tfp的circrna的产生和转导
[0456]
根据实施例2所述的方法设计用于产生具有seq id no：149序列的表达抗msln-tfp的circrna的前体rna的序列。如图8所示，将cbv3 ires接着抗msln-tfp置于鱼腥藻前体
trna基因中i组催化内含子下游和上游的e2和e1外显子的两个短片段之间。i组催化内含子的3
′
半部分位于e2的上游，而i组催化内含子的5
′
半部分位于e1的下游。在3
′
pie剪接位点和ires之间也引入间隔物。长度为33-35个核苷酸的互补外部同源臂也位于5
′
和3
′
端。图8也显示了由前体rna形成的三维结构。
[0457]
首先根据实施例4中描述的方法将前体rna的序列克隆到dna质粒中。然后将质粒线性化，然后从dna模板体外转录rna前体。
[0458]
然后根据实施例5中描述的方法从线性前体rna产生circrna。在ivt反应和环化后，在琼脂糖凝胶上可见rna。如图9所示，前体rna形成circrna环化产物，可见为一条更缓慢迁移的条带。此外，该环化产物比线性前体对rna酶r的处理具有更高的抗性。
[0459]
然后将circrna转染到jurkat细胞和激活的t细胞中以评价表达抗msln-tfp蛋白的细胞的比例。根据实施例6所述的方法通过电穿孔转染jurkat细胞，根据实施例7所述的方法通过电穿孔转染t细胞。细胞未转导或用抗msln-tfp circrna转导。根据实施例8中所述的方法，在转染后24小时通过流式细胞术测量转染细胞中的蛋白质表达。如图10所示，在jurkat细胞中，未转导的细胞不表达抗msln-tfp，而用抗msln-tfp circrna转导的细胞表达抗msln-tfp至少7天。如图11中所示，在激活的t细胞中，未转导的细胞不表达抗msln-tfp，而用抗msln-tfp circrna转导的细胞表达抗msln-tfp至少5天。
[0460]
根据实施例9中描述的方法测量表达抗msln-tfp的t细胞的细胞毒性。使用的靶细胞是过表达msln的k562-luc细胞，t细胞用抗msln-tfp circrna或抗msln-tfp慢病毒载体转导。如图12所示，用抗msln-tfp circrna转导的细胞相对于用抗msln-tfp慢病毒载体转导的细胞表现出增加的细胞毒性，特别是以3∶1的t∶e比率。
[0461]
实施例13：表达taa(x)-tfp的circrna的产生和转导
[0462]
用于产生表达靶向肿瘤细胞表面上发现的第三抗原(文中鉴定为taa(x)，对于肿瘤相关抗原x)的tfp的circrna的前体rna的序列根据实施例2中所述的方法进行设计。使用具有靶向taa(x)的四个不同结合结构域的tfp(taa(x)-tfp1-4)。将cbv3 ires接着taa(x)-tfp序列置于鱼腥藻前体trna基因中i组催化内含子下游和上游的e2和e1外显子的两个短片段之间。i组催化内含子的3
′
半部分位于e2的上游，而i组催化内含子的5
′
半部分位于e1的下游。在3
′
pie剪接位点和ires之间也引入间隔物。长度为33-35个核苷酸的互补外部同源臂也位于5
′
和3
′
端。
[0463]
首先根据实施例4中描述的方法将前体rna的序列克隆到dna质粒中。然后将质粒线性化，然后从dna模板体外转录rna前体。
[0464]
然后根据实施例5中描述的方法从线性前体rna产生circrna。
[0465]
然后将circrna转染到来自三个供体的t细胞中以评价表达taa(x)-tfp蛋白的细胞的比例。根据实施例7所述的方法通过电穿孔转染t细胞。细胞未转导或用taa(x)-tfp circrna电穿孔。根据实施例8中描述的方法，在转染后24小时通过流式细胞术测量电穿孔细胞中的蛋白质表达。如图13所示，未转导的细胞不表达taa(x)-tfp，而在转染后24小时在转导的细胞中检测到taa(x)-tfp表达。
[0466]
根据实施例9中描述的方法测量表达taa(x)-tfp的t细胞的细胞毒性。使用的靶细胞是对照k562-luc细胞或tfp靶向抗原的luc细胞，t细胞用taa(x)-tfp circrna电穿孔或用taa(x)-tfp慢病毒载体转导。如图14所示，与用抗msln-tfp慢病毒载体转导的细胞相比，
用taa(x)-tfp circrna转导的细胞表现出相似的细胞毒性。
[0467]
实施例14：circrna中包含m6a的影响
[0468]
先前已经报道，circrna中的n6-甲基腺苷(m6a)降低免疫原性(chen等人，molecular cell 2019)。为了研究m6a对用circrna产生的tfp t细胞的作用，如先前所述，通过ivt，使用0％、10％或100％m6a产生cvb3-mh1e的前体线性rna，并将ivt产物环化。如图15所示，ivt和环化产物在琼脂糖凝胶上可见。在环化步骤后，含有10％或100％m6a的构建体残留可见的线性产物，而缺乏m6a的构建体没有，表明m6a抑制环化。
[0469]
然后如实施例7所述，将circrna构建体电穿孔到t细胞中。在7天内通过流式细胞术测量细胞表面表达。如图16所示，相对于缺乏m6a的构建体，含有m6a的构建体具有降低比例的tfp阳性细胞和mfi(平均荧光强度)。
[0470]
实施例15：circrna在t细胞中的免疫原性
[0471]
在电穿孔后通过经由rt-pcr测量ifn-β1、rantes、rig-1和mda5的表达来测量t细胞(表3)和thp-1细胞(表4)中的细胞免疫反应。将表达水平标准化为管家基因rpl13a的表达。细胞未转导、模拟电穿孔、或用(1)gfp circrna、(2)剪接位点突变的gfp前体、(3)线性gfp rna、(4)trilink gfp rna、(5)mh1e(msln)circrna、(6)具有10％m6a的mh1e(msln)circrna、(7)剪接位点突变的mh1e前体、(8)线性mh1e rna、(9)0.1ug/ml或1ug/ml的3p-发夹rna、或(10)1ug/ml的poly i：c电穿孔。shrna是rig-i配体，poly i：c是mda5配体。虽然ds rna(poly i：c)和发夹rna在两种细胞类型中诱导强烈的免疫反应，但是线性gfp rna、gfp circrna和具有10％m6a的circrna在thp-1中而非t细胞中诱导显著的免疫反应。
[0472]
表3：用指定的rna电穿孔t细胞后24小时诱导ifn-β1、rantes、rig-i和mda-5转录物
[0473][0474]
表4：用指定的rna电穿孔thp-1细胞后24小时诱导ifn-β1、rantes、rig-i和mda-5转录物
[0475]
[0476][0477]
实施例16：用circrna电穿孔的t细胞向实体瘤异种移植小鼠模型的递送
[0478]
在免疫受损小鼠模型中测试用编码tfp的circrna转染的t细胞的效力，所述小鼠模型带有来源于表达人bcma的all、cll或nhl人细胞系的皮下实体瘤。响应于t细胞治疗的肿瘤收缩可以通过肿瘤大小的卡尺测量或通过跟踪由表达gfp的肿瘤细胞发射的gfp荧光信号的强度来评估。
[0479]
原代人实体瘤细胞可以在免疫受损小鼠中生长，而不必在体外培养它们。示例性实体癌细胞包括实体瘤细胞系，如在癌症基因组图谱(tcga)和/或广泛癌细胞系百科全书(ccle，参见barretina等人，nature 483：603(2012))中提供的。示例性实体癌细胞包括分离自间皮瘤、肾细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、子宫内膜癌或胃癌的原发性肿瘤细胞。在一些实施方案中，待治疗的癌症选自由以下组成的组：间皮瘤、乳头状浆液性卵巢腺癌、透明细胞卵巢癌、混合性米勒氏卵巢癌、子宫内膜样粘液性卵巢癌、胰腺腺癌、导管胰腺腺癌、子宫浆液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、结直肠腺癌和乳腺腺癌。
[0480]
免疫受损小鼠用于测试用编码tfp的circrna电穿孔的t细胞在人肿瘤异种移植模型中的功效(参见例如morton等人，nat.procol.2：247(2007))。皮下植入或注射1
×
10
6-1
×
107个原代细胞(胶原酶处理的大量肿瘤在ec基质材料中的悬浮液)或肿瘤碎片(在ec基质材料中的原代肿瘤碎片)后，使肿瘤生长至200-500mm3，然后开始治疗。
[0481]
nod/scid(nsg)小鼠模型用于进行体内效力研究。雌性nod/scid/il-2rγ-/-(nsg-jax)小鼠，在研究开始前至少6周龄，获自杰克逊实验室(库存号005557)并在实验使用前适应3天。将用于接种的表达人bcma的细胞系保持在对数期培养物中，然后收获并用台盼蓝计数以确定活细胞计数。在肿瘤攻击当天，将细胞以300g离心5分钟并以0.5-1x106细胞/100μl再悬浮于预热的无菌pbs中。将3x106个rpmi-8226-luc细胞皮下注射(s.c.)到nsg小鼠中。肿瘤接种后19天，以15
×
106个细胞/小鼠静脉内施用用编码tfp的circrna转染的t细胞。每组有7只动物。在研究的第3、7、14、21、28和35天进行生物发光成像。每周两天通过卡尺测量来测量肿瘤体积。每天记录动物的详细临床观察结果，直至安乐死。每周对所有动物进行体重测量直至死亡或安乐死。在过继转移测试品和对照品35天后，对所有动物实施安乐死。研究期间出现濒死的任何动物均由研究负责人在与兽医协商后自行安乐死。
[0482]
实施例17：编码tfp的circrna向实体瘤异种移植小鼠模型的递送
[0483]
理想的circrna体内递送系统预期保持其有效负载对抗存在于肿瘤微环境中的大量核酸内切酶，避免免疫检测，防止与蛋白质或非靶细胞的非特异性相互作用，允许靶向递送至感兴趣的组织并且促进细胞进入功效。递送策略包括全身注射到脉管系统、皮下注射或贮库、或局部施用。
[0484]
如前所述，使用注射泵，通过在微流体装置中以1∶3的体积比混合乙醇和水相来制备脂质纳米颗粒(lnp)。简言之，通过以35∶16：46.5∶2.5的摩尔比溶解可电离类脂ckk-e12、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、胆固醇和1，2-二肉豆蔻酰基-sm-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基-(聚乙二醇)-2000](铵盐)(c14-peg 2000)的混合物来制备乙醇相。在含有circrna的10mm柠檬酸盐缓冲液(ph3)中制备水相。将lnp在slide-a-lyzer g2透析盒20,000mwco(thermo fisher)中在室温下用pbs透析2小时。根据制造商的方案，使用quant-it
tm
测定(thermo fisher)分析包封在lnp纳米颗粒中的circrna的浓度。通过比较在不存在和存在1％(v/v)triton x-100的情况下的测量来计算circrna包封到lnp中的效率。使用zetasizer nano zs(malvem instruments，worcestershire，uk)通过动态光散射(dls)分析纳米粒径、多分散性(pdi)和z电位。
[0485]
将总体积50ml的1.5至150皮摩尔的lnp-circrna在10分钟内静脉内注射到实施例9中描述的anod/scid(nsg)小鼠模型中[wu等人plos one.10(3).(2015)]。在注射后第3、7、14、21、28和35天进行生物发光成像。注射后每周两天通过卡尺测量来测量肿瘤体积。
[0486]
实施例18：用于将编码tfp的circrna递送至实体瘤异种移植小鼠模型的lpn制剂
[0487]
lpn通过标准乙醇注射方法形成(ponsa，m.；foradada，m.；estelrich，j.“liposomes obtained by the ethanol injection method”int.j.pharm.1993，95，51-56)。对于各种脂质组分，制备50mg/ml乙醇储备溶液并储存在-20℃下。
[0488]
在表5中列出的脂质纳米颗粒制剂的制备中，将每种指定的脂质组分加入到乙醇溶液中以实现预定的最终浓度和摩尔比，并换算成3ml最终体积的乙醇。单独地，从1mg/ml储备液制备分离的circrna的水性缓冲溶液(10mm柠檬酸盐/150mm nacl，ph4.5)。将脂质溶液快速注射到circrna水溶液中并振荡以在20％乙醇中产生最终悬浮液。将所得纳米颗粒悬浮液过滤并用1
×
pbs(ph7.4)透析，浓缩并储存在2-8℃之间。通过在存在和不存在0.1％
triton-x 100的情况下进行ribogreen测定来计算circrna的包封。使用malvern zetasizer仪器分别在1xpbs和1mm kcl溶液中测定粒径(动态光散射(dls))和ζ电位。
[0489]
将总体积50ml的1.5至150皮摩尔的lnp-circrna在10分钟内静脉内注射到实施例17中描述的anod/scid(nsg)小鼠模型中[wu等人plos one.10(3).(2015)]。在注射后第3、7、14、21、28和35天进行生物发光成像。注射后每周两天通过卡尺测量来测量肿瘤体积。
[0490]
表5：实施例18中的脂质纳米颗粒制剂。
[0491]
制剂成分脂质摩尔比最终circrna浓度ckk-e1240∶30∶25∶51.8mg/mldope40∶30∶25∶51.8mg/ml胆固醇40∶30∶25∶51.8mg/mldmg-peg-2k40∶30∶25∶51.8mg/ml
[0492]
附录a：序列总结
[0493]
[0494]
[0495]
[0496]
[0497]
[0498]
[0499]
[0500]
[0501]
[0502]
[0503]
[0504]
[0505]
[0506]
[0507]
[0508]
[0509]
[0510]
[0511]
[0512]
[0513]
[0514]
[0515]
[0516]
[0517]
[0518]
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[0520]
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[0525]
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