产生生物表面活性剂的重组微生物的制作方法

1.本文公开了涉及应用微生物制备生物表面活性剂的技术。


背景技术：

2.脂肪酶是切断构成植物油脂等油脂类的甘油三酯的酯键、分解为脂肪酸和甘油的酶。很多生物拥有脂肪酶，脂肪酶不仅用于生物体内的反应，而且用于很多工业用途。
3.生物表面活性剂是微生物生产的天然表面活性剂，生物降解性高，环境负荷低，具有多种有益的生理功能。因此，如果用于食品工业、化妆品工业、药物工业、化学工业、环境工业领域等，在实现环境友好型社会方面是有意义的。
4.生物表面活性剂分类为糖脂质系、酰基肽系、磷脂质系、脂肪酸系和高分子系五种。在它们之中，糖脂质系的表面活性剂的研究最多。作为这样的糖脂质系的生物表面活性剂，已知赤藓糖醇与甘露糖糖苷键连接的甘露糖赤藓糖醇(下文中，也称为me)中、进一步脂肪酸酯键连接的甘露糖赤藓糖醇脂(下文中，也称为mel)，以及鼠李糖脂、黑粉菌酸、海藻糖脂和槐糖脂。
5.关于mel，以植物油脂等油脂类为原料制备的实例有很多报告。例如，在非专利文献1以及2中，报告了应用念珠菌物种(candida sp.)b-7株在5天中从5质量％的大豆油可以生产35g/l(生产速度：0.3g/l/h，原料收率：70质量％)的mel。在非专利文献3以及4中，报告了应用南极念珠菌(candida antarctica)t-34株在8天中从8质量％的大豆油可以生产38g/l(生产速度：0.2g/l/h，原料收率：48质量％)的mel。
6.在非专利文献5中，报告了应用南极念珠菌t-34株，通过以6天间隔3次的逐次加载，24天后，从25质量％的花生油可以生产110g/l(生产速度：0.2g/l/h，原料收率：44质量％)的mel。在非专利文献6中，报告了应用念珠菌物种(candida sp.)sy-16株，从10质量％的植物油脂，通过分批培养法，在200小时中可以生产50g/l(生产速度：0.25g/l/h，原料收率：50质量％)的mel，同时，通过补料分批培养法，从20质量％的植物油，在200小时中可以生产120g/l(生产速度：0.6g/l/h，原料收率：50质量％)的mel。
7.mel中存在结合的脂肪酸残基以及乙酰基的位置以及数目等不同的各种结构。图1中显示以r1～r5示出氢原子、乙酰基、以及碳原子数3～18的脂肪酸残基的mel的结构式。r1和r2是脂肪酸残基、且r3和r4是乙酰基的结构物定义为mel-a，r3是氢原子、r4是乙酰基的结构物定义为mel-b，r3是乙酰基、r4是氢原子的结构物定义为mel-c，r3和r4是氢原子的结构物定义为mel-d。取决于与甘露糖结合的赤藓糖醇的羟甲基来自1位碳或4位碳，得到的me的结构如图2(a)、(b)所示而不同。前述南极念珠菌t-34株以图2(a)所示4-o-β-d-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇(4-o-β-d-mannopyranosyl-erythritol)为糖骨架生成化合物。得到的4-o-β-d-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇脂(4-o-β-d-mannopyranosyl-erythritol lipid)也称为4-o-β-mel。
8.多种微生物生成上述4-o-β-mel，与之相对，筑波拟酵母(pseudozyma tsukubaensis)以橄榄油为原料，以图2(b)所示1-o-β-d-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇为糖骨架
生成1-o-β-d-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇脂-b(下文中，也称为1-o-β-mel-b)。1-o-β-mel-b与4-o-β-mel-b相比具有水合性提高、囊泡形成能力也高的特征，是作为护肤剂等有希望的生物材料。据报告，筑波拟酵母1e5株在7天中从20质量％的橄榄油可以生产70g/l(生产速度：0.4g/l/h，原料收率：35质量％)的1-o-β-mel-b(参考非专利文献7)，作为化妆品材料出售。
9.现有技术文献
10.专利文献
11.专利文献1：wo2017/208791
12.非专利文献
13.非专利文献1：t.nakahara，h.kawasaki，t.sugisawa，y.takamori和t.tabuchi：j.ferment.technol.，61，19(1983)
14.非专利文献2：h.kawasaki，t.nakahara，m.oogaki和t.tabuchi：j.ferment.technol.，61，143(1983)
15.非专利文献3：d.kitamoto，s.akiba，c.hioki and t.tabuchi：agric.biol.chem.，54，31(1990)
16.非专利文献4：d.kitamoto，k.haneishi，t.nakahara and t.tabuchi：agric.biol.chem.，54，37(1990)
17.非专利文献5：d.kitamoto，k.fijishiro，h.yanagishita，t.nakane and t.nakahara：biotechnol.lett.，14，305(1992)
18.非专利文献6：金，伊炳大，桂树彻，谷吉树：平成10年日本生物工学会大会要旨，p195
19.非专利文献7：t.morita，m.takashima，t.fukuoka，m.konishi，t.imura，d.kitamoto：appl.microbiol.biotechnol.，88，679(2010)


技术实现要素：

20.发明所要解决的问题
21.为了在食品工业、药物工业、以及化学工业等中广泛普及mel，期望提高mel的生产效率，降低生产成本。作为这样的提高mel的生产效率的手段，专利文献1中公开了用脂肪酶基因转化产生生物表面活性剂的微生物。提供这一手段的进一步改良手段是一个问题。
22.用于解决问题的手段
23.为了解决这一问题而反复深入研究，结果发现，通过用特定的启动子控制脂肪酶基因，显著提高生物表面活性剂的生产效率。基于这些发现进一步反复研究和探讨，结果提供下述代表的发明。
24.第1项
25.产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物，其用具有在e5pgap启动子或e5ptef启动子控制下编码脂肪酶的基因的表达载体转化。
26.第2项
27.第1项中记载的产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物，其中，产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物是拟酵母属微生物。
28.第3项
29.第1项或第2项中记载的产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物，其中，编码脂肪酶的基因来自拟酵母属微生物。
30.第4项
31.第1～3项的任一中记载的产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物，其中，产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物是筑波拟酵母。
32.第5项
33.表达载体，其具有在e5pgap启动子或e5ptef启动子控制下编码脂肪酶的基因。
34.第6项
35.第5项中记载的表达载体，其中，编码脂肪酶的基因来自拟酵母属微生物。
36.第7项
37.第5或6项中记载的表达载体，其为用于转化产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物的表达载体。
38.第8项
39.制备第1项中记载的产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物的方法，其包括用第5～7项的任一中记载的表达载体转化产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物。
40.第9项
41.制备产生甘露糖赤藓糖醇脂的方法，其应用第1～4项的任一中记载的产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物。
42.第10项
43.制备产生甘露糖赤藓糖醇脂的方法，其包括在含有植物油脂的培养基中培养第1～4项的任一中记载的产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物。
44.发明效果
45.能够高效制备生物表面活性剂。
附图说明
46.[图1]显示mel的结构。
[0047]
[图2]显示4-o-β-d-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇(a)以及1-o-β-d-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇(b)的结构。
[0048]
[图3]显示表达载体puc
t
_neo：：palipa的结构。
[0049]
[图4]显示培养外源性脂肪酶导入株以及对照时，用sds-page法检测培养上清中的脂肪酶的结果。
[0050]
[图5]显示测定外源性脂肪酶导入株以及对照的菌体增殖量(a)以及脂肪酶活性(b)的结果。
[0051]
[图6]显示用hplc测定外源性脂肪酶导入株以及对照的菌体增殖量(a)以及mel的生产的结果。
[0052]
[图7]显示用薄层色谱(a)以及hplc(b)测定通过外源性脂肪酶导入株以及对照的原料油脂的消耗量的结果。
[0053]
[图8]显示来自筑波拟酵母的pgap的碱基序列。
[0054]
[图9]显示来自筑波拟酵母的ptef的碱基序列。
[0055]
[图10]显示来自筑波拟酵母的pubq的碱基序列。
[0056]
[图11]显示用hplc测定外源性脂肪酶导入株以及对照的mel生产的结果。
[0057]
[图12]显示用hplc测定外源性脂肪酶导入株以及对照的橄榄油消耗的结果。
[0058]
[图13]显示用hplc测定外源性脂肪酶导入株以及对照的脂肪酸生产的结果。
具体实施方式
[0059]
产生甘露糖基赤藓糖醇的微生物优选用在特定的启动子控制下编码某脂肪酶的基因转化。在一个实施方式中，特定的启动子优选是适合宿主的高表达启动子。在一个实施方式中，特定的启动子优选是来自拟酵母属微生物的启动子，更优选是来自筑波拟酵母的启动子。在一个实施方式中，特定的启动子优选是拟酵母属微生物的三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子(pgap)、延伸因子ef-1的启动子(ptef)、或泛素基因的启动子(pubq)。在一个实施方式中，特定的启动子优选是pgap或ptef，更优选是ptef。来自筑波拟酵母的pgap的碱基序列在图8(序列编号1)中显示。来自筑波拟酵母的ptef的碱基序列在图9(序列编号2)中显示。来自筑波拟酵母的pubq的碱基序列在图10(序列编号3)中显示。高表达启动子可以通过经rna序列分析表达频率而选择。
[0060]
在优选的一个实施方式中，特定的启动子优选具有序列编号1～3的任一的碱基序列或与其具有80％以上同一性的碱基序列。同一性优选地是85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上。这样的启动子可以通过任意方法得到。例如，可以使用基因工程方法以及化学合成法(例如，液相法以及固相法)制备。
[0061]
在其它的实施方式中，启动子也可以是由序列编号1～3的碱基序列中1或数个碱基置换、缺失、插入、添加和/或倒位(下文中有时将它们统称为“突变”)的序列组成、具有启动子活性的序列。在此，“数个”只要维持启动子活性则没有限制，例如，相当于全部序列的不足约20％的数目，优选地是相当于不足约15％的数目，进一步优选地是相当于不足约10％的数目，更加再优选地是相当于不足约5％的数目，最优选地是相当于不足约1％的数目。更具体地，例如，2～100个、优选地是2～80个、更优选地是2～60个、进一步优选地是2～40个、更进一步优选地是2～20个、再优选地是2～15个、更加再优选地是2～10个、特别优选地是2～5个。
[0062]
用于微生物的重组的脂肪酶没有特别限制，只要在微生物中表达、发挥(即起作用)脂肪酶活性，可以任意选择。因此，脂肪酶的来源可以是微生物、植物和动物的任一个。在一个实施方式中，优选的脂肪酶来自微生物。在一个实施方式中，作为脂肪酶的来源的优选的微生物是拟酵母(pseudozyma)属、黑粉菌(ustilago)属、孢堆黑粉菌(sporisorium)属、瘤黑粉菌(melanopsichium)属、莫氏黑粉菌(moesziomyces)属和克氏担孢酵母(kurtzmanomyces)属。优选的拟酵母属微生物是南极拟酵母(pseudozyma antarctica)(南极莫氏黑粉菌(moesziomyces antarcticus))、蚜虫拟酵母(pseudozyma aphidis)(蚜虫莫氏黑粉菌(moesziomyces aphidis))、湖北拟酵母(pseudozyma hubeiensis)、以及筑波拟酵母(pseudozyma tsukubaensis)。优选的黑粉菌属微生物是大麦坚黑粉菌(ustilago hordei)以及玉米黑粉菌(ustilago maydis)。优选的孢堆黑粉菌属微生物是玉米孢堆黑粉菌(sporisorium reilianum)以及甘蔗孢堆黑粉菌(sporisorium scitamineum)。优选的瘤黑粉菌属微生物是宾地瘤黑粉菌(melanopsichium pennsylvanicum)。优选的克氏担孢酵
laboratory press，new york)等公知的方法导入。此外，也可以通过紫外线照射等其它的方法得到变体。变体中还包括基于具有脂肪酶的微生物的个体差异、物种或属的差异的情况等天然发生的变体(例如，单核苷酸多态性)。在一个实施方式中，突变优选存在于不影响fgdh的活性部位或底物结合部位的部位。
[0069]
编码序列编号5的氨基酸序列的碱基序列在序列编号14中显示。编码序列编号6的氨基酸序列的碱基序列在序列编号15中显示。编码序列编号7的氨基酸序列的碱基序列在序列编号16中显示。编码序列编号8的氨基酸序列的碱基序列在序列编号17中显示。编码序列编号9的氨基酸序列的碱基序列在序列编号18中显示。编码序列编号10的氨基酸序列的碱基序列在序列编号19中显示。编码序列编号11的氨基酸序列的碱基序列在序列编号20中显示。编码序列编号12的氨基酸序列的碱基序列在序列编号21中显示。编码序列编号13的氨基酸序列的碱基序列在序列编号22中显示。
[0070]
表达载体具有在如上所述的特定启动子控制下编码某脂肪酶的基因即可，其构成是任意的。例如，表达载体也可以具有多个在特定启动子控制下编码脂肪酶的基因。此情况下，编码脂肪酶的多个基因彼此可以同种，也可以异种。表达载体也可以包含多个由在特定启动子控制下编码某脂肪酶的基因组成的盒。此情况下，表达载体中包含的编码脂肪酶的多个基因彼此可以同种，也可以异种。此外，各盒中包含的特定启动子也彼此可以同种，也可以异种。
[0071]
产生甘露糖赤藓糖醇脂的微生物优选用具有在上述启动子下编码上述脂肪酶的基因的表达载体转化。转化的宿主微生物只要是具有生产甘露糖赤藓糖醇脂的能力的微生物(生产mel的微生物)则没有特别限制，可以任意选择使用。作为具有生产甘露糖赤藓糖醇脂的能力的微生物，列举例如，属于拟酵母属的微生物。在一个实施方式中，优选的具有生产甘露糖赤藓糖醇脂的能力的微生物是属于筑波拟酵母、南极拟酵母、pseudozyma rugulosa、蚜虫拟酵母、pseudozyma parantarctica、湖北拟酵母的微生物。作为tsukubaensis种中包含的优选mel生产株，列举nbrc1940株、km-160株、1d9株、1d10株、1d11株、1e5株、以及jcm16987株。筑波拟酵母生产的1-o-β-mel-b的水合性比4-o-β-mel-b高，在水系用途中有用。
[0072]
向宿主细胞导入编码脂肪酶的核酸的手段是任意的，没有特别限制。例如，可以将核酸整合到适合宿主的载体中，通过任何方法将其导入宿主细胞。载体是能够将与其整合的核酸分子转运到细胞内的核酸性分子(载体)。转化可以是瞬时的，也可以是稳定的转化。在一个实施方式中，优选转化是稳定的转化。
[0073]
对于载体的种类，只要可以在宿主细胞中复制和表达，其种类和结构没有特别限制。载体的种类可以相应于宿主细胞的种类适宜选择。作为载体的具体例，可以列举质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体(腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体等)等。在一个实施方式中，优选的载体是质粒载体。
[0074]
作为以拟酵母属为宿主的情况的质粒载体，可以示例例如，puxv1 atcc 77463、puxv2 atcc 77464、puxv5 atcc 77468、puxv6 atcc 77469、puxv7 atcc 77470、puxv8 atcc 77471、puxv3 atcc 77465、pu2x1 atcc 77466、pu2x2 atcc 77467、puxv1-neo、ppax1-neo、ppaa1-neo、puc_neo、以及puc
t
_neo等。在一个实施方式中，优选的载体是puxv1-neo、ppax1-neo、ppaa1-neo、puc_neo以及puc
t
_neo。
[0075]
作为表达载体，也可以使用包含选择标记物的表达载体。核酸向载体的插入、选择标记物基因的插入、启动子的插入等可以应用标准的重组dna技术(例如，参考molecular cloning，third edition，1.84，cold spring harbor laboratory press，new york)进行。
[0076]
载体向宿主细胞的导入方法是任意的，可以相应于宿主细胞以及载体的种类等适宜选择。载体的导入方法可以通过例如电穿孔、磷酸钙共沉淀法、脂质转染、显微注射以及醋酸锂法等实施。在一个实施方式中，载体向宿主细胞的导入方法优选通过限制酶处理一体化质粒载体后导入。由此，通过将导入的基因整合到基因组基因可以稳定转化。
[0077]
是否通过核酸的导入得到重组微生物可以通过任意方法确认。例如，通过确认经外源性核酸的导入赋予的脂肪酶活性的有无，可以确认得到期望的重组微生物。脂肪酶活性的确认可以用任意方法实施。
[0078]
重组微生物通过具备脂肪酶活性和甘露糖赤藓糖醇脂产生能力可以更高效产生甘露糖赤藓糖醇脂。重组微生物产生的甘露糖赤藓糖醇脂的种类没有特别限制，可以相应于目的适宜选择。在一个实施方式中，优选的mel是1-o-β-mel-b以及4-o-β-mel-b，更优选地是1-o-β-mel-b。此外，4-o-β-mel-b可以是mel-a、mel-b、mel-c以及mel-d中的任一种。
[0079]
应用重组微生物的mel的生产可以用任意方法进行。例如，可以通过用适于mel的生产的培养基培养重组微生物实施。在一个实施方式中，在应用重组微生物生产mel的情况下，优选在培养基中添加植物油脂。植物油脂的种类没有特别限制，可以相应于作为目标的mel的种类等适宜选择。例如，可以列举大豆油、橄榄油、菜籽油、红花油、芝麻油、棕榈油、葵花油、椰子油、可可油以及蓖麻油等。在一个实施方式中，优选的油脂是橄榄油。
[0080]
重组微生物的培养条件没有特别限制。例如，在重组微生物是拟酵母属的情况下，可以在ph5～8、优选地是ph6、温度20～35℃、优选地是22～28℃的条件培养3～7天。mel可以按照常规方法从培养液中回收。
[0081]
实施例
[0082]
在下文中，通过实施例对本发明更详细地说明，但本发明不限于此。
[0083]
1.材料
[0084]
·
使用菌体
[0085]
筑波拟酵母(pseudozyma tsukubaensis)1e5株(保藏编号jcm16987)
[0086]
·
mrna
[0087]
筑波拟酵母(pseudozyma tsukubaensis)1e5株
·
基因组dna
[0088]
筑波拟酵母(pseudozyma tsukubaensis)1e5株南极拟酵母(pseudozyma antarctica)t-34株(保藏编号km-34)
·
质粒
[0089]
表达载体puc
t
_neo
[0090]
·
培养基
[0091]
添加甘油的ym培养基：在去离子水1l中溶解酵母提取物3g、麦芽提取物3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、甘油50g配制。
[0092]
mel生产培养基：在去离子水1l中溶解酵母提取物5g、硝酸钠3g、磷酸二氢钾0.3g、硫酸镁
·
七水合物0.3g、甘油20g配制。
[0093]
2.rna序列分析
[0094]
2-1.菌株的培养
[0095]
将上述筑波拟酵母1e5株接种到在mel培养基中添加4％橄榄油的培养基30ml中，在25℃振荡培养2天。
[0096]
2-2.总rna的提取
[0097]
回收上述菌体培养液中包含的菌体，用液氮冷冻，用isogen(nippon gene)处理后，回收包含总rna的水层。用苯酚和氯仿处理回收的水层，提取总rna。用分光光度计确认得到的总rna的纯度和量。
[0098]
2-3.mrna的纯化
[0099]
用oligotex-dt30《super》mrna纯化试剂盒(takara)纯化提取的总rna，得到mrna。用分光光度计确认得到的mrna的纯度和量。
[0100]
2-4.rna文库的制成
[0101]
用nebnext ultra rna library prep kit for illumina(new england biolabs)、以及nebnext multiplex oligos for illumina(new england biolabs)按照试剂盒附带的手册处理提取的mrna，制成文库。
[0102]
2-5.序列分析
[0103]
将制成的文库供给应用miseq reagent kits v2(illumina)的序列分析。测序仪中使用miseq(illumina)。
[0104]
2-6.数据分析
[0105]
用bowtie2将由序列分析得到的数据映射到编码该微生物的蛋白质的基因序列。可以将约15％左右的序列分析数据分配给蛋白质基因序列。通过将该结果应用作为映射数据转换工具的bedtools、编程语言perl实施文本处理，将关于各蛋白质基因的映射数汇总，作为各个基因的表达量的原始数据。此外，由于各蛋白质基因中碱基数不同，基因越长，得到越多的映射数，因此在基因间比较时，映射数不反映表达的差异。为了消除该影响，用基因长度校正映射数，计算处理为每1kbp的映射数。分析的结果是，将gap启动子、tef启动子和ubq启动子选择为高表达启动子。
[0106]
3.应用高表达启动子构建脂肪酶表达载体
[0107]
3-1.基因组dna的提取
[0108]
回收上述筑波拟酵母1e5株以及南极拟酵母t-34株的菌体培养液中包含的菌体，用液氮冷冻，用苯酚和氯仿处理，提取基因组dna。用分光光度计确认得到的基因组dna的纯度和量。
[0109]
3-2.表达载体构建
[0110]
用以下步骤构建表达序列编号5所示基因的表达载体。序列编号5是编码南极拟酵母t-34株的脂肪酶a的碱基序列。首先，参考序列编号5，配制在起始密码子上游添加与载体相同的序列15bp的正向引物(序列编号23)、以及在终止密码子下游添加与载体相同的序列15bp的反向引物(序列编号24)。应用这些，以上述3-1.中得到的南极拟酵母t-34株的基因组dna为模板，进行基因的扩增。用in-fusion cloning kit(takara)将扩增的基因连接于在smai位点切断的表达载体puc
t
_neo(包含来自丝状菌(玉米黑粉菌)的复制起点(uars)、g418抗性基因、来自南极拟酵母t-34株的gap终止子)。然后，以南极拟酵母t-34株或筑波拟酵母1e5株的基因组dna为模板，应用在序列上游添加sali位点的正向引物(序列编号25以及26)、和在序列下游添加xbai位点的反向引物(序列编号27以及28)扩增gap启动子
(t34pgap或e5pgap，序列编号4以及1)。同样地，以筑波拟酵母1e5株的基因组dna为模板，应用在序列上游添加与载体相同的序列15bp的正向引物(序列编号29以及30)、以及在序列下游添加与载体相同的序列15bp的反向引物(序列编号31以及32)扩增tef启动子(e5ptef，序列编号2)以及ubq启动子(e5pubq，序列编号3)。用ligation high ver.2(toyobo、t34pgap以及e5pgap)或in-fusion cloning kit(takara、e5ptef以及e5pubq)将扩增的启动子连接于导入了在sali位点以及xbai位点切断的脂肪酶a的puc
t
_neo，构建在t34pgap、e5pgap、e5ptef、e5pubq的任一启动子控制下表达脂肪酶a基因的基因表达载体puc
t
_neo：：palipa。表达载体的结构示于图3。
[0111]
fwd：(脂肪酶a扩增用，序列编号23)
[0112][0113]
rvs：(脂肪酶a扩增用，序列编号24)
[0114][0115]
fwd：(t-34pgap扩增用，序列编号25)
[0116][0117]
fwd：(e5pgap扩增用，序列编号26)
[0118]
rvs：(t-34pgap扩增用，序列编号27)
[0119][0120]
rvs：(e5pgap扩增用，序列编号28)
[0121]
fwd：(e5ptef扩增用，序列编号29)
[0122][0123]
fwd：(e5pubq扩增用，序列编号30)
[0124][0125]
rvs：(e5ptef扩增用，序列编号31)
[0126][0127]
rvs：(e5pubq扩增用，序列编号32)
[0128][0129]
4.转化体的配制
[0130]
用限制酶sspi处理线性化在上述3-2.中得到的t34pgap、e5pgap、e5ptef、e5pubq中的任一启动子控制下表达脂肪酶a基因的基因表达载体puc
t
_neo：：palipa，应用其以电穿孔法转化筑波拟酵母1e5株。此外，作为对照，不含插入物的载体puc
t
_neo也同样地用限制酶sspi处理线性化，随后以电穿孔法导入筑波拟酵母1e5株。转化体的选择中使用g418。
[0131]
5.通过sds-page法检测培养上清中的脂肪酶
[0132]
将各转化体在添加甘油的ym培养基2ml中于25℃振荡培养2天，得到预培养液。随后，将预培养液1ml接种到在mel培养基中添加1％橄榄油的培养基20ml，于25℃振荡培养3天。将得到的菌体培养液离心，得到培养上清。将培养上清用any kd
tm
mini-protean(商标)tgx
tm
precast protein gels(biorad)和mini-protean(商标)tetra vertical electrophoresis cell(biorad)电泳后，用simplyblue
tm
safestain(invitrogen)染色蛋白
质，检测脂肪酶(图4)。
[0133]
图4中，分别地，nega.表示puc
t
_neo导入株(对照)，t34pgap表示puc
t
_neo：：palipa(t34pgap)导入株，e5pgap表示puc
t
_neo：：palipa(e5pgap)导入株，e5ptef表示puc
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_neo：：palipa(e5ptef)导入株，e5pubq表示puc
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_neo：：palipa(e5pubq)导入株。如图4所示，与对照或导入了使用来自南极拟酵母t-34株的t34pgap的表达载体的株相比，对于导入了使用来自筑波拟酵母1e5株的e5pgap、e5ptef、e5pubq的3种启动子的表达载体的株，来自脂肪酶a的条带检测更浓，确认培养上清中的脂肪酶的表达量提高。
[0134]
6.酶活性测定
[0135]
将各转化体在添加甘油的ym培养基2ml中于25℃振荡培养2天，得到预培养液。随后，将预培养液1ml接种到在mel培养基中添加1％橄榄油的培养基20ml，于25℃振荡培养3天。将得到的菌体培养液离心，得到培养上清。离心后回收菌体、干燥后测定重量、评价增殖时，在转化体间未观察到增殖量中显著的差异(图5(a))。
[0136]
用lipase activity assay kit(cayman chemical)测定各转化体的培养上清中的脂肪酶活性。1分钟消耗1nmol底物所需的酶量设为1单位(图5(b))。
[0137]
如图5所示，与对照或导入了使用来自南极拟酵母t-34株的t34pgap的表达载体的株相比，对于导入了使用来自筑波拟酵母1e5株的e5pgap、e5ptef、e5pubq的3种启动子的表达载体的株，确认到脂肪酶活性显著提高。尤其是导入了使用e5pgap以及e5ptef的表达载体的株，确认到活性提高至导入了使用来自南极拟酵母t-34株的t34pgap的表达载体的株的2倍以上。
[0138]
7.转化体的mel生产能力的评价
[0139]
将各转化体在添加甘油的ym培养基2ml中于25℃振荡培养2天，得到预培养液。随后，将预培养液1ml接种到在mel培养基中添加6％橄榄油的培养基20ml，于25℃振荡培养7天。培养第3天以及第5天追加6％橄榄油(添加油脂量总计18％)。在得到的菌体培养液中添加等量的乙酸乙酯，充分搅拌后，分取乙酸乙酯层。将在残留的水层中加入甲醇后离心、沉淀的菌体回收干燥后测定重量时，在转化体间未观察到增殖量中显著的差异(图6(a))。用高速液体色谱(hplc)定量乙酸乙酯层中包含的mel(图6(b))。
[0140]
如图6所示，与对照相比，对于导入了使用来自筑波拟酵母1e5株的e5pgap、e5ptef、e5pubq的3种启动子的表达载体的株，确认mel的生产量提高。尤其是导入了使用e5ptef的表达载体的株，确认到生产量提高至对照的1.8倍，导入了使用来自南极拟酵母t-34株的t34pgap的表达载体的株的1.5倍。
[0141]
8.转化体的原料油脂的消耗能力的评价
[0142]
将各转化体在添加甘油的ym培养基2ml中于25℃振荡培养2天，得到预培养液。随后，将预培养液1ml接种到在mel培养基中添加6％橄榄油的培养基20ml，于25℃振荡培养7天。培养第2天追加6％橄榄油，第3、4、5、6天追加3％橄榄油(添加油脂量总计24％)。在得到的菌体培养液中添加等量的乙酸乙酯，充分搅拌后，分取乙酸乙酯层。用薄层色谱(tlc)以及高速液体色谱(hplc)定量乙酸乙酯层中包含的残存油脂(图7(a、b))。
[0143]
如图7所示，与对照相比，对于导入了使用来自筑波拟酵母1e5株的e5ptef的表达载体的株，确认到原料油脂的消耗量提高。与对照中7天中分解168g/l的油脂相比，确认到导入了使用e5ptef的表达载体的株中7天中为224g/l，和油脂的消耗量提高到1.3倍。
[0144]
将野生型1e5株和上述4中制成的转化体(nega和e5ptef0)在添加甘油的ym培养基100ml中于25℃振荡培养1天，得到预培养液。随后，将预培养液60ml接种到在mel培养基中添加15％橄榄油的培养基6l/10l容量中，于25℃振荡培养3天。在得到的培养液中添加等量的乙酸乙酯，充分搅拌后，分取乙酸乙酯层。用高速液体色谱(hplc)定量乙酸乙酯层中包含的mel。此外，关于残存的橄榄油和脂肪酸的量的变化，也用hplc测定得到的区域面积比。
[0145]
如图11所示，导入了使用e5ptef的启动子的表达载体的株与野生株、nega株比较显示高mel生产性。如图12所示，从培养液中残存的橄榄油的比例得知，e5ptef导入株与野生株、nega比较橄榄油的分解速度非常快。此外，如图13所示，与图12的橄榄油的残存联动，e5ptef导入株中脂肪酸的生产速度快。这些结果显示，e5ptef导入株中橄榄油的分解被促进，作为mel的底物的脂肪酸快速产生，进展到mel合成。