可调节的表达系统的制作方法

可调节的表达系统
1.序列表
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技术领域
3.本文披露了包含用于可调节的基因表达的小基因的组合物及其系统和使用方法。


背景技术：

4.将遗传物质(例如，异源核酸)递送至靶细胞以增加所希望的基因产物表达的基因疗法方法可以支持此治疗目的。病毒已经进化到能够高效地将核酸递送到特定的细胞类型，同时避免受感染宿主的免疫监视。robbins等人,(1998)pharmacol.ther.[药物学与治疗学],80(1):35-47。这些特性使病毒作为用于基因疗法的递送媒介物或载体具有吸引力。几种类型的病毒(包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)和单纯疱疹病毒)已在实验室中进行了修饰以用于基因疗法应用。lunstrom等人,(2018)diseases[疾病],6(2):42。特别地，衍生自腺相关病毒(aav)的载体可以有效地递送遗传物质，因为(i)它们能够感染(转导)包括肌纤维和神经元的多种非分裂和分裂细胞类型；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而消除了天然宿主细胞对病毒感染的应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒从未与人类的任何病理相关；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型aav相比，复制缺陷型aav载体通常作为附加体持续存在，从而限制了插入诱变或癌基因激活的风险；以及(v)与其他载体系统相比，aav载体不触发显著的免疫应答(参见ii)，从而允许例如一种或多种治疗性异源核酸的长期表达(前提是他们的基因产物不被排斥)。wold等人,(2013)curr.gene ther.[当代基因疗法],13(6):421-33；lee等人,(2017)genes dis.[基因与疾病],4(2):43-63。
[0005]
aav为细小病毒科(parvoviridae)家族的成员。aav基因组包含线性单链dna分子，所述线性单链dna分子典型地含有约4.7千碱基(kb)和编码非结构性rep(复制)及结构性cap(衣壳)蛋白的两个主要开放阅读框。两个顺式作用反向末端重复(itr)序列与aav编码区侧接，这些反向末端重复(itr)序列的长度典型地为约145个核苷酸，并具有间杂的回文序列，这些回文序列可折叠成发夹结构，其在dna复制的起始期间充当引物。除他们在dna复制中的作用以外，已证实itr序列有助于病毒整合、自宿主基因组的拯救及病毒核酸衣壳化成为成熟病毒粒子。muzyczka等人,(1992)curr.top.micro.immunol.[微生物学和免疫学的最新课题],158:97-129。
[0006]
已经开发了许多蛋白，这些蛋白是重要的科学研究工具或用于预防或治疗疾病的药物。虽然病毒载体(如aav)转导多种细胞类型并将编码这些蛋白的异源核酸递送至多种靶组织类型的能力是期望的，但在蛋白表达时可能会发生副作用，范围从例如药物功效丧失到严重毒性。期望开发调节治疗性蛋白的表达水平的策略，例如，调节治疗性蛋白表达的
时机或位置和/或治疗性蛋白的水平以增加功效和/或减少副作用。
[0007]
因此，本披露部分提供了对使用小分子关闭或打开目的蛋白的表达来控制蛋白的表达有用的小基因核苷酸序列。本披露还提供了包含此类小基因序列的载体、重组病毒和药物组合物，并考虑它们在调节基因表达的方法中的用途。


技术实现要素：

[0008]
在第一方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括与编码目的蛋白的转基因连接的小基因，其中所述小基因包括：第一外显子；第一内含子；第二外显子；第二内含子；和第三外显子；其中所述第二外显子包括剪接调节子结合序列，并且其中，在剪接调节子存在的情况下，所述第二外显子包括在所述核酸的mrna产物中，并且在所述剪接调节子不存在的情况下，所述第二外显子不包括在所述核酸的mrna产物中。
[0009]
在实施例中，所述第三外显子包括终止密码子，所述终止密码子处于在所述剪接调节子不存在的情况下产生的核酸的mrna产物的框中，并且不处于在所述剪接调节子存在的情况下产生的核酸的mrna产物的框中。
[0010]
在实施例中，所述第二外显子包括终止密码子，所述终止密码子处于在所述剪接调节子存在的情况下产生的核酸的mrna产物的框中。
[0011]
在实施例中，所述第一外显子和所述第三外显子不包含起始密码子。在一些实施例中，所述第二外显子包含起始密码子。
[0012]
在任何上述方面和实施例的实施例中，所述核酸包括设置在所述小基因与所述转基因之间的编码蛋白酶切割位点的序列。
[0013]
在实施例中，所述蛋白酶切割位点被哺乳动物蛋白酶切割。
[0014]
在实施例中，所述哺乳动物蛋白酶是弗林蛋白酶、pcsk1、pcsk5、pcsk6、pcsk7、组织蛋白酶b、颗粒酶b、因子xa、肠激酶、普基酶(genenase)、分选酶、精确蛋白酶、凝血酶、tev蛋白酶、或弹性蛋白酶1。
[0015]
在任何上述方面和实施例的实施例中，所述蛋白酶切割位点包括具有选自由以下组成的组的切割基序的多肽：rx(k/r)r共有基序、rxxx[kr]r共有基序、rrx共有基序、rnrr(seq id no:39)、i-e-p-d-x共有基序(seq id no:35)、glu/asp-gly-arg、asp-asp-asp-asp-lys(seq id no:36)、pro-gly-ala-ala-his-tyr(seq id no:37)、lpxtg/a共有基序、leu-glu-val-phe-gln-gly-pro(seq id no:38)、leu-val-pro-arg-gly-ser(seq id no:40)、e-n-l-y-f-q-g(seq id no:41)、和[agsv]-x(seq id no:42)。在实施例中，所述切割位点被弗林蛋白酶切割。在实施例中，被弗林蛋白酶切割的所述蛋白酶切割位点是rnrr(seq id no:39)、rtkr(seq id no:43)、gtgaedprpsrkrrslgdvg(seq id no:45)、gtgaedprpsrkrr(seq id no:47)、lqwleqqvakrrtkr(seq id no:49)、gtgaedprpsrkrrslgg(seq id no:51)、gtgaedprpsrkrrslg(seq id no:53)、slnlteshnsrkkr(seq id no:55)、或ckingypkrgrkrr(seq id no:57)。在实施例中，被弗林蛋白酶切割的所述蛋白酶切割位点包括rnrr(seq id no:39)。在实施例中，编码蛋白酶切割位点的序列包括cgcaaccgccgc(seq id no:19)，例如由其组成。
[0016]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述核酸包括设置在所述小基因与所述转基因之间的编码自切割肽的序列，任选地其中所述自切割肽在目的蛋白的n-末端
的1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸内切割。在实施例中，所述自切割肽是2a肽，任选地选自t2a肽、p2a肽、e2a肽和f2a肽，例如其包括t2a肽，例如其中所述自切割肽包括egrgslltcgdveenpgp(seq id no:61)，任选地其中所述自切割肽包括(gsg)egrgslltcgdveenpgp(seq id no:59)。
[0017]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述剪接调节子结合序列位于第二外显子的3’末端。
[0018]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述剪接调节子结合序列包括aga，例如由其组成，并且所述剪接调节子是5-(1h-吡唑-4-基)-2-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)苯酚(lmi070)。
[0019]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述第二外显子包括选自以下的序列，例如由其组成：
[0020]
ccttgctatccctgtcttctgtagctattctgaaaccatcaacaaaggagcacaccattccatcagcaaaaga(seq id no:1)；
[0021]
gtaattagctgagaaggaagatctgaaggtttaacgagagagggcgagagatacaaaatatctgctaggaga(seq id no:2)；
[0022]
ggattgtttgtattcctgccaatgatttgtgagacagtctgttccccacatcctcgtcaacaga(seq id no:3)；
[0023]
ctttctgacatcttaacgaggcaatacagagagacgaattttcatcagtttgttcagggagacacatataacaaaaga(seq id no:4)；
[0024]
atccatacatacttaatgctgaaatgtgaagggctgagaaaaaagaaaaga(seq id no:5)；
[0025]
aattggaaacatcgagggaaaatgggctttttattattaaaacaaaacctcagtattatcacttagaaacctgaaattgaactccaaaagccaaaga(seq id no:6)；
[0026]
aagaatgttccttttgtgaagaatgacttaaggaagattcatgatgactgagtgtgcccgtgtggaactttaggacatagatgcactcctacaga(seq id no:7)；
[0027]
ttgtccttcactccgtactccagttggccaagcataggtcgcatgccagggtcaaggagactaagggaga(seq id no:8)；
[0028]
gacatacagacatggcagcccctagcatgtgtatcctaaga(seq id no:9)；
[0029]
acatacagacatggcagcccctagcatgtgtatcctaaga(seq id no:10)；
[0030]
agtttgcaaaggaaggaaaggagcagagacttgaatgagcagaaaatcatttcagggcctgttctctatgtccttgctatccctgtcttctgtagctattctgaaaccatcaacaaaggagcacaccattccatcagcaaaaga(seq id no:80)以及
[0031]
与(a)至(k)中的任一项具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的(a)至(k)中的任一项的片段或突变体。
[0032]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述第二外显子包括衍生自snx7的外显子的序列，任选地其中所述序列衍生自snx7的隐藏外显子。
[0033]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述第二外显子包括以下，例如由以下组成：
[0034]
agtttgcaaaggaaggaaaggagcagagacttgattgagcagaaaatcatttcagggcctgttctctattgtccttgctatcctgtcttctgtagctatctgaaaccatcaacaaaggagcacaccattccatcagcaaaaga
(seq id no:16)；
[0035]
seq id no:16的片段；或
[0036]
与seq id no:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的seq id no:16的突变序列或其片段。
[0037]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述第二外显子包括以下，例如由以下组成：
[0038]
agtttgcaaaggaaggaaaggagcagagacttgattgagcagaaaatcatttcagggcctgttctctattgtccttgctatcctgtcttctgtagctatctgaaaccatcaacaaaggagcacaccatggcatcagcaaaaga(seq id no:98)；
[0039]
seq id no:98的片段；或
[0040]
与seq id no:98具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的seq id no:98的突变序列或其片段。
[0041]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述第二外显子由3n-1个核苷酸组成，其中n是整数。
[0042]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述第一外显子包括：
[0043]
一个或多个(例如三个)gaa重复(seq id no:69)(例如，包括gaagaagaa(seq id no:69))；
[0044]
科扎克(kozak)序列(例如，包括gccacc(seq id no:70)的科扎克序列)；或
[0045]
(a)和(b)两者。
[0046]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述第一外显子包括以下，例如由以下组成：
[0047]
gaagaagaagatatcaagttagcatttacagatttggctgaggagaagaacag(seq id no:96)；
[0048]
seq id no:96的片段；或
[0049]
与seq id no:96具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的seq id no:96的突变序列或其片段。
[0050]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述第一内含子包括以下，例如由以下组成：
[0051]
gtaattagtgttgtttgatattgcttcattttaaagttatttgctcatttagcatttgatattgctttctattgattgtcctaactactcctctttcctctcccttctccatttttgaag(seq id no:97)；
[0052]
seq id no:97的片段；或
[0053]
与seq id no:97具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的seq id no:97的突变序列或其片段。
[0054]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述小基因已被修饰以：
[0055]
去除或突变除单个起始密码子例如atg起始密码子以外的所有密码子；
[0056]
去除或突变除第一外显子、第二外显子和第三外显子末端处的隐藏剪接供体和剪接受体序列以外的所有隐藏剪接供体和剪接受体序列。
[0057]
在实施例中，所述小基因具有设置在第一外显子内的单个起始密码子。在实施例中，所述小基因具有设置在第二外显子内的单个起始密码子。
[0058]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述小基因包括少于2000、少于
1900、少于1800、少于1700、少于1600、少于1500、少于1400、少于1300、少于1200、少于1100、或少于1000、少于900、少于800、少于700、少于600、少于500个核苷酸。
[0059]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述小基因包括在约2500与约500个之间的核苷酸，例如在约2000与约600个之间的核苷酸，例如在约1500与约700个之间的核苷酸，例如在约1200与约800个之间的核苷酸、在约1100与约900个之间的核苷酸、在约800与约500个之间的核苷酸、在约800与约600个之间的核苷酸。
[0060]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述小基因包括以下，例如由以下组成：seq id no:71或seq id no:94，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列，或其功能性片段。
[0061]
在一方面，本文披露了一种核酸分子，所述核酸分子包括(a)编码目的蛋白的转基因，和(b)小基因，所述小基因包括以下，例如由以下组成：seq id no:71或seq id no:94，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列，或其功能性片段。
[0062]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述核酸分子进一步包括编码弗林蛋白酶切割位点的序列(所述序列包括seq id no:19)和编码自切割肽的序列(所述序列包括seq id no:20)，任选地其中所述小基因设置在编码弗林蛋白酶切割位点的序列的5’(例如，紧接在编码弗林蛋白酶切割位点的序列的5’)，所述编码弗林蛋白酶切割位点的序列设置在编码自切割肽的序列的5’(例如，紧接在编码自切割肽的序列的5’)，并且所述编码自切割肽的序列设置在转基因的5’(例如，紧接在转基因的5’)。
[0063]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述核酸分子进一步包括与所述小基因和转基因可操作地连接的启动子，任选地其中所述启动子设置在小基因的5’。
[0064]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述启动子是jet启动子、cba启动子、pgk启动子、或突触蛋白启动子、或不包括内含子的任何启动子。
[0065]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述核酸分子进一步包括转录后调节元件。
[0066]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述转录后调节元件(pre)包括衍生自乙型肝炎的pre(hpre)、衍生自蝙蝠的pre(bpre)、衍生自地松鼠的pre(gspre)、衍生自北极松鼠的pre(aspre)、衍生自鸭的pre(dpre)、衍生自黑猩猩的pre(cpre)和衍生自长毛猴的pre(wmpre)或衍生自土拨鼠的pre(wpre)，任选地其中所述转录后调节元件设置在转基因的3’。
[0067]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述转录后调节元件包括seq id no:72、seq id no:73或seq id no:88。
[0068]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述核酸分子进一步包括多腺苷酸化信号(polya)，任选地其中所述polya设置在转基因的3’。
[0069]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述polya信号是sv40 polya、人生长激素(hgh)polya、或牛生长激素(bgh)polya、β-珠蛋白polya、α-珠蛋白polya、卵清蛋白polya、κ-轻链polya、和合成polya。
[0070]
在实施例中，包括在任何上述方面和实施例中，所述polya包括seq id no:22，例如由其组成。
[0071]
在另一方面，本文披露了一种载体，所述载体包括如前述方面和实施例中任一项所述的核酸。在实施例中，所述载体是dna载体，任选地环状载体，任选地质粒。在实施例中，所述载体是双链的或单链的，例如是双链的。
[0072]
在实施例中，所述载体是病毒载体。在实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒(aav)载体、嵌合aav载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、dna病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、或其任何突变体或衍生物。在实施例中，所述病毒载体是重组aav载体，任选地自互补aav(scaav)载体。在实施例中，所述病毒载体是重组aav载体，任选地单链aav(ssaav)载体。在实施例中，所述重组aav载体包括一个或多个反向末端重复(itr)，任选地其中所述itr是aav2 itr，任选地其中所述aav载体包括两个itr，任选地其中所述两个itr包括seq id no:12和seq id no:23。
[0073]
在实施例中，包括在任何前述方面和实施例中，所述载体例如从5’至3’包括：
[0074]
itr(任选地aav2 itr)，任选地，其中所述itr已被修饰以包括末端解析位点的缺失，任选地包括seq id no:12；
[0075]
启动子，任选地包括seq id no:13或由其组成的jet启动子；
[0076]
如方面1-28中任一项所述的核酸分子；
[0077]
polya信号，任选地包括seq id no:22或由其组成；以及
[0078]
itr，任选地aav2 itr，任选地包括seq id no:23或由其组成。
[0079]
在一方面，本文提供了一种重组病毒，所述重组病毒包括如前述方面和实施例中任一项所述的核酸或载体。在实施例中，所述重组病毒是腺相关病毒(aav)、嵌合aav、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、dna病毒、单纯疱疹病毒、杆状病毒、或其任何突变体或衍生物。在实施例中，所述病毒是aav。在实施例中，所述aav包括以下的一种或多种：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、和aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh36、aavrh37、aav-dj、aav-dj/8、aav.anc80、aav.anc80l65、aav-php.b、aav-php.b2、aav-php.b3、aav-php.a、aav-php.eb、和aav-php.s衣壳血清型、或其变体，例如来自一个以上aav血清型的衣壳的组合。在实施例中，所述aav包括aav9衣壳血清型或其任何突变体或衍生物。在实施例中，所述病毒包括aav9衣壳蛋白vp1、vp2和vp3，例如，如分别由seq id no:74、seq id no:75、和seq id no:76编码的，或分别包括seq id no:77、seq id no:78、和seq id no:79的氨基酸序列。在实施例中，所述aav包括自互补aav(scaav)载体。在实施例中，所述aav包括单链aav(ssaav)载体。
[0080]
在另一方面，本文提供了一种细胞，所述细胞包括如前述方面和实施例中任一项所述的核酸分子、载体、或重组病毒。在实施例中，所述细胞是人细胞。在实施例中，所述细胞是神经元或星形胶质细胞。
[0081]
在一方面，本文提供了一种细胞，包括如任何前述细胞方面和实施例所述的细胞，其中当所述细胞包括剪接调节子(例如lmi070)时，所述目的蛋白的表达水平高于当所述细胞不包括所述剪接调节子时所述目的蛋白的表达水平，例如高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍，任选地其中当所述细胞不包括所述剪接调节子时，所述表达水平检测不到。
[0082]
在一方面，本文提供了一种细胞，包括如任何前述细胞方面和实施例所述的细胞，其中当所述细胞不包括剪接调节子(例如lmi070)时，所述目的蛋白的表达水平高于当所述细胞包括所述剪接调节子时所述目的蛋白的表达水平，例如高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、
30、50或100倍，任选地其中当所述细胞包括所述剪接调节子时，所述表达水平检测不到。
[0083]
在一方面，本文提供了一种有条件地表达目的蛋白的方法，所述方法包括：使包括如任何前述方面和实施例所述的核酸分子、载体、或重组病毒的表达系统(例如细胞，例如如前述方面和实施例中任一项所述的细胞)与剪接调节子(例如，lmi070)接触，其中：
[0084]
在所述剪接调节子存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子不存在的情况下所述目的蛋白的表达水平增加，例如高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍；并且
[0085]
在所述剪接调节子不存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子存在的情况下所述目的蛋白的表达水平大幅降低，例如低2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍。
[0086]
在一方面，本文提供了一种有条件地表达目的蛋白的方法，所述方法包括：使包括如任何前述方面和实施例所述的核酸分子、载体、或重组病毒的表达系统(例如细胞，例如如前述方面和实施例中任一项所述的细胞)与剪接调节子(例如，lmi070)接触，其中：
[0087]
在所述剪接调节子不存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子存在的情况下所述目的蛋白的表达水平增加，例如高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍；并且
[0088]
在所述剪接调节子存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子不存在的情况下所述目的蛋白的表达水平大幅降低，例如低2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍。
[0089]
在一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如前述方面和实施例中任一项所述的核酸分子、载体、重组病毒、或细胞。
[0090]
在一方面，本文提供了一种治疗需要基因疗法的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如前述方面和实施例中任一项所述的核酸分子、载体、重组病毒、细胞或药物组合物。在实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用以下量的剪接调节子(例如，lmi070)，所述量有效引起所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子不存在的情况下所述目的蛋白的表达水平增加或降低至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍。
[0091]
在一方面，本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如前述方面和实施例中任一项所述的核酸分子、载体、重组病毒、细胞或药物组合物；以及剪接调节子。
[0092]
在一方面，本文提供了如前述方面和实施例中任一项所述的核酸分子、载体、重组病毒、细胞或药物组合物，用于在有条件地表达目的蛋白的方法中使用，所述方法包括：使包括如方面1-2和4-36中任一项所述的核酸分子、如方面37-45中任一项所述的载体、或如方面46-52中任一项所述的重组病毒的表达系统(例如细胞，例如如方面53-57中任一项所述的细胞)与剪接调节子(例如，lmi070)接触，其中：
[0093]
在所述剪接调节子存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子不存在的情况下所述目的蛋白的表达水平增加，例如高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍；并且
[0094]
在所述剪接调节子不存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子存在的情况下所述目的蛋白的表达水平大幅降低，例如低至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍。
[0095]
在一方面，本文提供了如前述方面和实施例中任一项所述的核酸分子、载体、重组病毒、细胞或药物组合物，用于在有条件地表达目的蛋白的方法中使用，所述方法包括：使包括如方面1或3-36中任一项所述的核酸分子、如方面37-45中任一项所述的载体、或如方面46-52中任一项所述的重组病毒的表达系统(例如细胞，例如如方面53-57中任一项所述的细胞)与剪接调节子(例如，lmi070)接触，其中：
[0096]
在所述剪接调节子不存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子存在的情况下所述目的蛋白的表达水平增加，例如高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍；并且
[0097]
在所述剪接调节子存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子不存在的情况下所述目的蛋白的表达水平大幅降低，例如低至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍。
[0098]
在一方面，本文提供了如前述方面和实施例中任一项所述的核酸分子、载体、重组病毒、细胞或药物组合物，用于在治疗需要基因疗法的受试者的方法中使用。
[0099]
在一方面，本文提供了如前述方面和实施例中任一项所述的核酸分子、载体、重组病毒、细胞或药物组合物，或如方面64-66中任一项所述使用的核酸、载体、重组病毒、细胞或药物组合物，其中所述转基因编码基因组编辑系统的蛋白(例如，rna指导的核酸酶如cas9蛋白、锌指核酸酶或talen)、抗体或抗体片段、或治疗性蛋白(例如，选自颗粒蛋白前体、smn、mecp2、cln2、cln3、cln4、cln5、cln6、cln7、cln8的蛋白)。
附图说明
[0100]
图1a.描述了剪接调节子介导的“打开开关”的概念。在打开开关系统中，当排除外显子b时，外显子c含有与由位于外显子a中的起始密码子启动的编码序列同框的提前停止(终止)密码子。当包括剪接调节子(如lmi070)时，转录物现在包括移码外显子b，从而恢复导致转基因表达的不间断开放阅读框。
[0101]
图1b.描述了剪接调节子介导的“关闭开关”的概念。在关闭开关系统中，将外显子a剪接至外显子c，这导致转基因表达。当存在剪接调节子如lmi070时，含有提前停止(终止)密码子的外显子b被包括，导致翻译停止。
[0102]
图2a.具有基于snx7小基因的开关的aav载体的设计。图2a示出了snx7基因座的示意图，所述snx7基因座含有：在以下染色体处的剪接调节子(lmi070)外显子靶结合位点：grch37:1:99204216:99204359:1(agtttgcaaaggaaggaaaggagcagagacttgaatgagcagaaaatcatttcagggcctgttctctatgtccttgctatccctgtcttctgtagctattctgaaaccatcaacaaaggagcacaccattccatcagcaaaaga(seq id no:80))，以及在以下染色体处的外显子8下游的内含子序列：grch37:1:99203793:99203946:1(cttccagaggagattggaaaacttgaagataaagtggaatgtgctaataatgccctgaaagcagattgggagagatggaaacaaaatatgcaaaatgatatcaagttagcatttacagatatggctgaggagaatatccattattatgaacag(seq id no:99))，和在以下染色体处的外显子9上游的21,251个核苷酸：grch37:1:99225610:99225687:1(tgccttgctacgtgggagtcattccttacatcacagaccaaccttcacttggaagaagcctctgaagataaaccttaa(seq id no:100))
[0103]
图2b.具有基于snx7小基因的开关的aav载体的设计。图2b示出了使用外显子8(称为外显子a)、270个核苷酸的内含子(ab)、包含在其3’端的剪接调节子(例如，lmi070)结合
位点的外显子(称为外显子b)、407个核苷酸的内含子片段(从21,251nt缩短；bc)、和外显子9(称为外显子c)的非天然存在的snx7小基因的构建。对所述小基因进行了另外的修饰以改善其性能，如：1)在外显子a中位置65处插入科扎克共有序列和atg密码子(gccaccatg)；2)用ttg替代小基因中的所有其他atg序列；3)用ag替代在外显子a的位置20处的ta，以制备gaagaagaa序列(seq id no:69)；4)从外显子b去除1nt，以在orf中创建移码(核苷酸的数目＝3n-1)；5)在外显子c的位置4处插入t，以在orf中创建移码，产生多个终止密码子；6)将在外显子c的位置9处的tac改为taa，以创建提前停止密码子；7)将在外显子c的位置34处的cag改为acc，以突变潜在的隐藏剪接位点；8)将在外显子c的位置60处的ctct改为tagc，以创建nhe i限制性位点；以及9)去除在外显子c的末端的taa，以创建连续的orf。
[0104]
图2c示出了包含snx7小基因打开开关的scaav载体的构建。所述scaav是通过将以下各项进行组合创建的：含有trs缺失的aav2itr、随后是jet启动子、随后是snx7小基因(参见上文，图2b)、随后是添加到外显子c末端的针对弗林蛋白酶切割位点的编码序列(rnrr(seq id no:39))、随后是针对t2a肽的编码序列、随后是转基因序列(此处是针对没有第一个atg的egfp的编码序列)、随后是sv40晚期多腺苷酸化信号、随后是aav2 itr。
[0105]
图3示出了使用基于snx7小基因的打开开关(图3a)和关闭开关(图3b)进行的gfp表达的调节，以及在剪接调节子不存在(“无lmi070”)时和剪接调节子存在(“加lmi070”)时的mrna表达产物。图分别按出现的顺序披露了seq id no:108-111。
[0106]
图4.在hek293细胞中通过snx7开关进行的gfp表达的调节。图4a示出了在不同浓度的剪接调节子(lmi070)下用psnx7-gfp(包含打开开关的载体)转染的hek293细胞中的gfp表达。图4b绘制了通过平均荧光强度作为lmi070浓度的函数而测量的gfp表达。图4c绘制了在不同浓度的剪接调节子下，含有外显子b或具有直接的外显子a至外显子c剪接的mrna转录物的定量。
[0107]
图5.在大鼠皮质神经元中通过snx7开关进行的gfp表达的调节。图5a示出了在不同浓度的剪接调节子(lmi070)下用psnx7-gfp(包含打开开关的载体)转染的原代大鼠神经元中的gfp表达水平。图5b绘制了在不同浓度的剪接调节子下，含有外显子b或具有直接的外显子a至外显子c剪接的mrna转录物在大鼠皮质神经元中的定量。
[0108]
图6.包含处于snx7打开开关控制下的人颗粒蛋白前体(prgn)转基因的aav载体。图6a示出了1)包含神经元特异性启动子(人突触蛋白启动子)并含有snx7打开开关小基因的ssaav载体的示意图。图6b示出了在剪接调节子存在或不存在的情况下，用图6a中描述的载体(syn_snx)转染的原代大鼠神经元中的hprgn表达，与来自不包含基于snx7的开关的载体(“syn”)的hprgn表达水平进行比较。图6c示出了在剪接调节子存在和不存在的情况下，包括外显子b的mrna和具有直接的外显子a至外显子c剪接的mrna的mrna表达水平。
[0109]
图7a.描绘了体内测试含有snx7开关(版本1)的aav载体的时间进程研究计划。将含有处于具有snx7开关的突触蛋白启动子控制下的hpgrn表达盒的单链aav9注射(icv)到p0新生小鼠中。4周后，小鼠接受口服施用的30mg/kg lmi070，并在施用后24小时开始的不同时间点取出小鼠。图7b.表明了在先前施用图7a描述的aav载体的小鼠中，口服施用lmi070以时间依赖性方式开启小鼠脑中的转基因表达。图表明了lmi070递送后指定的时间后的脑中hpgrn表达的tr-fret测量值。
[0110]
图8a.描绘了体内测试含有snx7开关(版本1)的aav载体的剂量-应答研究计划。将
含有处于具有snx7开关的突触蛋白启动子控制下的hpgrn表达盒的单链aav9注射(icv)到p0新生小鼠中。4周后，小鼠接受口服施用的不同剂量lmi070，并在施用后12小时开始的不同时间点取出小鼠。图8b.表明了在先前施用图8a描述的aav载体的小鼠中，经口施用lmi070以剂量依赖性方式开启小鼠脑中的转基因表达。图表明了在lmi070的指定剂量下并在lmi070递送后指定的时间后的脑中hpgrn表达的tr-fret测量值。
[0111]
图9示出了第一版的snx7小基因与经修饰的snx7小基因(版本2)的比较，所述经修饰的snx7小基因在lmi070不存在的情况下具有减小的尺寸和降低的肽表达。图分别按出现的顺序披露了seq id no:108和112-113。
[0112]
图10示出了经修饰的snx7小基因(版本2)对lmi070的应答比先前版本的snx7小基因更敏感。
具体实施方式
[0113]
通过结合附图，参考以下详细描述可以更容易地理解所披露的组合物和方法，这些附图形成本披露的一部分。
[0114]
在本文通篇，描述涉及组合物及使用这些组合物的方法。在本披露披露或声明与组合物相关的特征或实施例的情况下，这种特征或实施例同等适用于使用所述组合物的方法或所述组合物的用途。同样地，在本披露披露或声明与使用组合物的方法相关的特征或实施例的情况下，这种特征或实施例同等适用于所述组合物。当表达数值范围时，其包括使用所述范围内的任何特定值的实施例。进一步地，对范围中陈述的值的提及包括该范围内的每个值。所有范围均包括其端点并且是可组合的。当值是通过使用先行词“约”表达为近似值时，应当理解，该特定值形成了另一实施例。除非上下文另外明确地指示，否则对特定数值的提及至少包括该特定值。除非另外指示其具体使用情形，否则“或”的使用将意指“和/或”。出于任何目的，本文引用的所有参考文献均通过引用并入。在参考文献与说明书发生冲突的情况下，以说明书为准。应当理解，出于清楚的目的本文披露于单独实施例的上下文中的披露的组合物和方法的某些特征还可以按组合形式提供于单个实施例中。相反地，出于简洁的目的披露于单个实施例的上下文中的披露的组合物和方法的不同特征还可以分开地或以任何子组合形式提供。
[0115]
定义
[0116]
如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数形式，除非上下文另外明确地指示。如技术人员从本文包含的教导中显而易见的是，当在数值和范围的上下文中使用时，术语“约”或“大约”是指近似或接近所引用的值或范围的值或范围，使得实施例可以按照预期执行。在一些实施例中，约意指数值量
±
10％。
[0117]
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式。它们可以包括一种或多种核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链dna或rna，基因组dna，cdna，dna-rna杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生化修饰的、非天然的、或衍生化的核苷酸碱基的聚合物，例如锁核酸(lna)、肽核酸(pna)。
[0118]
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白或肽典型地含有至少两个氨基酸或氨基酸变体，并且对可包含蛋
白或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸或变体的任何肽或蛋白。这些术语包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、或其组合。
[0119]
术语“序列同一性”和“序列同源性”在本文中可互换使用，并且如与多核苷酸或多肽结合使用的，是指当比较或比对多肽的多核苷酸的两个序列时，相同且处于相同相对位置的碱基或氨基酸的百分比。序列同一性可以以多种不同的方式确定。例如，可以使用各种方法和计算机程序(例如，blast、t-coffee、muscle、mafft等)比对序列。参见例如altschul等人,(1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志]215:403-10。
[0120]
涉及本文讨论的核酸或蛋白的术语“分离的”是指已与在自然环境中通常存在的与其相关的一种或多种组分分开的核酸或蛋白。分开可以包括从较大的核酸(例如，从基因或染色体)或从通常与所述核酸或蛋白接触的其他蛋白或分子去除。所述术语涵盖但不要求完全分离。
[0121]
如本文所用，包含“异源核酸序列”的分离的核酸是指包含在天然背景下发现通常不与分离的核酸的一个或多个其他组分可操作地连接的部分(即，异源核酸部分)的分离的核酸。例如，所述异源核酸可以包含最初未在天然衍生出所述分离的核酸的其他组分(例如，启动子)的细胞、细菌细胞、病毒、或生物体中发现的核酸序列，或其中未发现所述分离的核酸的其他组分(例如，启动子)与所述细胞、细菌细胞、病毒、或生物体中的异源核酸天然地可操作地连接的核酸序列。在一些实施例中，所述异源核酸包括转基因。如本文所用，“转基因”是编码最初与核酸分子的一个或多个组分不相关的目的分子(例如，治疗性蛋白、报告蛋白或治疗性rna分子)的核酸序列。在一些实施例中，所述异源核酸序列编码人蛋白。在一些实施例中，所述异源核酸序列编码rna序列，例如shrna。
[0122]“编码”特定rna的dna序列或dna多核苷酸序列是能够转录为rna的dna的序列。dna多核苷酸可以编码翻译成蛋白的rna(mrna)，或者dna多核苷酸可以编码不翻译成蛋白的rna(例如，trna、rrna、或指导rna；也称为“非编码”rna或“ncrna”)。dna序列或dna多核苷酸序列也可以“编码”特定的多肽或蛋白序列，其中，例如，dna直接编码可翻译成多肽或蛋白序列的mrna。“蛋白编码序列”或编码特定蛋白或多肽的序列是当置于适当的调节序列的控制下时能够在体外或体内转录为mrna(在dna的情况下)和翻译(在mrna的情况下)成多肽的核酸序列。所述编码序列的边界可以由5’末端(n-末端)处的起始密码子和3’末端(c-末端)处的翻译终止无义密码子确定。编码序列可以包括但不限于来自原核或真核生物mrna的cdna、来自原核或真核生物dna的基因组dna序列、以及合成核酸。转录终止序列将通常位于编码序列的3’。
[0123]
如本文所用，术语“启动子”或“启动子序列”是例如通过结合rna聚合酶能够促进可操作地连接的编码或非编码序列(例如下游(3’方向)编码或非编码序列)的转录(例如，能够引起可检测水平的转录和/或增加可检测水平的转录(相对于在所述启动子不存在的情况下提供的水平))的dna调节序列。在一些实施例中，启动子序列在其3’末端以转录起始位点为界，并延伸到上游(5’方向)，以包括用最小数目的碱基或元件以启动高于背景的可检测水平的转录。在一些实施例中，启动子序列可以包括转录起始位点、以及负责结合rna聚合酶的蛋白结合结构域。除了足以启动转录的序列之外，启动子还可以包括参与调节转
录的其他调节元件的序列(例如增强子、科扎克序列和内含子)。各种启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子，可用于驱动本文披露的这些载体。本领域中已知的可在某些实施例中(例如，在本文披露的病毒载体中)使用的启动子的实例包括cmv启动子、cba启动子、smcba启动子和衍生自免疫球蛋白基因、sv40、或其他组织特异性基因(例如：rlbp1、rpe、vmd2)的启动子。此外，通过混合和匹配已知的调节元件产生功能性启动子的标准技术是本领域已知的。也可使用启动子的片段，例如那些保留至少最小数目的碱基或元件以启动高于背景的可检测水平的转录的片段。
[0124]
在一些实施例中，启动子可以是组成型活性启动子(即，在任何细胞类型和/或任何条件下组成型驱动表达的启动子)。在其他实施例中，启动子可以是特定组织背景下(例如在神经元、心肌细胞等中)的组成型活性启动子。在其他实施例中，启动子可以是诱导型启动子(即，其活性受外部刺激(例如存在特定的温度、化合物、或蛋白)控制的启动子)。在一些实施例中，启动子可以是空间限制型启动子，其驱动或不驱动活性，这取决于发现启动子的物理背景。空间限制型启动子的非限制性实例包括组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等。在一些实施例中，启动子可以是时间限制型启动子，其驱动表达，这取决于发现启动子的时间背景。例如，时间限制型启动子可以仅在胚胎发育的特定阶段或生物过程的特定阶段期间驱动表达。时间限制型启动子的非限制性实例包括小鼠中的毛囊周期启动子。
[0125]
在一些实施例中，所述启动子具有组织特异性，使得在多细胞生物体中，所述启动子仅在特定细胞的子集中驱动表达。例如，组织特异性启动子包括但不限于神经元特异性启动子、脂肪细胞特异性启动子、心肌细胞特异性启动子、平滑肌特异性启动子、光感受器特异性启动子等。神经元特异性启动子是指以下启动子：当例如外周直接施用到中枢神经系统(cns)、或递送至神经元细胞(包括体外、离体、或体内)时，与非神经元细胞中的表达相比，所述启动子优先驱动或调节神经元中可操作地连接的异源核酸(例如，编码目的蛋白或肽或shrna的异源核酸)的表达。
[0126]
在本文中可互换使用的术语“dna调节序列”、“控制元件”和“调节元件”是指提供和/或调节非编码序列(例如，短发夹rna)或编码序列(例如，pgrn)的转录和/或调节编码多肽的翻译的转录和翻译控制序列，如启动子、增强子、沉默子、多腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号等。
[0127]
术语“多腺苷酸化(polya)信号序列”和“多腺苷酸化序列”是指为转录停止和向rna转录物的3’端添加腺苷均聚链提供信号的调节元件。多腺苷酸化信号可以包括停止信号(例如，aauaaa序列或其他非经典序列)和任选地侧接的辅助元件(例如，富含gu的元件)和/或与有效切割和多腺苷酸化相关的其他元件。多腺苷酸化序列可以包括一系列通过多腺苷酸化附接到mrna的3’端的腺苷。特定的polya信号序列可以包括seq id no:22或seq id no:89的poly(a)信号。在一些实施例中，dna调节序列或控制元件是组织特异性调节序列。
[0128]
术语“转录后调节元件”(“pre”)是指当转录为mrna时，在mrna转录水平调节基因表达的一个或多个调节元件。此类转录后调节元件的实例可以包括编码m微小rna结合位点、rna结合蛋白结合位点等的序列。可与本文披露的核酸分子和载体一起使用的转录后调节元件的实例包括土拨鼠肝炎转录后调节元件(wpre)、肝炎转录后调节元件(hpre)。示例
性pre还可以包括披露为seq id no:88的pre。pre的实例还可以包括披露为seq id no:72的pre或披露为seq id no:73的pre。
[0129]
术语“内含子”是指一个或多个核酸序列，例如在开放阅读框中的那些，所述核酸序列不编码从核酸表达的多肽转录物(例如，目的蛋白)的一个或多个氨基酸。内含子序列可以从dna转录为rna(即，可存在于前mrna中)，但可以例如通过剪接在蛋白从成熟mrna表达之前被去除。
[0130]
术语“外显子”是指一个或多个核酸序列，例如，开放阅读框内的那些，所述核酸序列编码从核酸表达的转录物(例如，目的蛋白)的一个或多个氨基酸。外显子序列可以从dna转录为rna(即，可以存在于前mrna中)，但也可以存在于翻译为多肽的成熟mrna(即，rna的加工形式(例如，在剪接后))中。
[0131]
如本文所用，“体外”进行的过程是指在正常生物环境之外进行的过程，例如在试管、烧瓶、培养皿、人工培养基中进行的研究。“体内”进行的过程是指在活生物体或细胞内进行的过程，例如，在细胞培养物或小鼠中进行的研究。“离体”进行的研究是指在外部环境(例如，具有对自然条件的最小改变)中在来自生物体的组织中或对来自生物体的组织进行的研究，例如，允许在比体内实验更受控的条件下操作生物体的细胞或组织。
[0132]
如本文所用，如应用于例如核酸、多肽、细胞、或生物体的术语“天然存在”或“未修饰”，是自然界中发现的核酸、多肽、细胞、或生物体。例如，存在于生物体(如病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，无论是存在于该生物体中还是从所述生物体的一种或多种组分中分离的。
[0133]
在一些实施例中，“载体”是任何遗传元件(例如，dna、rna、或其混合物)，所述遗传元件含有能够在宿主细胞中表达的目的核酸(例如，转基因)，例如，在适用于递送至细胞、组织和/或生物体的较大核酸序列或结构中的目的核酸，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。例如，载体可以包含插入物(例如，包含编码待表达的基因的转基因或该基因的开放阅读框的异源核酸)以及一个或多个另外的元件，例如本文所述的小基因和/或适用于递送或控制所述插入物的表达的元件。例如当与适当的控制元件相关时，所述载体可以能够复制和/或表达，并且其可以能够在细胞之间转移遗传信息。在一些实施例中，载体可以是适用于在宿主细胞中表达的载体，例如aav载体。在一些实施例中，载体可以是适用于例如在细胞或生物反应器中表达和/或复制的质粒。在一些实施例中，特别地设计用于在靶细胞中表达异源核酸序列(例如，编码目的蛋白、shrna等的转基因)的载体可以称为表达载体，并且通常具有驱动所述转基因表达的启动子序列。在其他实施例中，载体(例如，转录载体)可以能够被转录但不能被翻译：他们可以在靶细胞中复制但不能表达。转录载体可以用于扩增他们的插入物。
[0134]
术语“表达载体”是指包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。单独或与宿主细胞提供的或在体外表达系统中的其他用于表达的元件组合，表达载体可以包含足够的用于表达的顺式作用元件。表达载体包括例如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
[0135]
术语“质粒”是指包含完整“复制子”的非染色体(并且通常为双链)dna序列，使得质粒在宿主细胞中复制。质粒可以是环状核酸。当将质粒放置在单细胞生物体内时，所述质
粒的dna导致该生物体的特征发生改变或转化。例如，携带四环素抗性(tcr)基因的质粒将先前对四环素敏感的细胞转化为对其具有抗性的细胞。在本文披露的病毒载体的一些实施例中有用的示例性质粒包括seq id no:92。
[0136]
如本文所用，术语“重组病毒”旨在意指包含转基因或其他异源核酸的非野生型和/或人工产生的重组病毒(例如，细小病毒、腺病毒、慢病毒或腺相关病毒等)。重组病毒可以包含包装在病毒(例如：aav)衣壳内的重组病毒基因组(例如，包含如本文所述的小基因和转基因)。重组病毒的特定类型可以是“重组腺相关病毒”或“raav”。包装在病毒衣壳中的重组病毒基因组可以是病毒载体。在一些实施例中，本文披露的重组病毒包含病毒载体(例如，包含目的小基因和转基因，例如，如本文所述)。病毒载体的实例包括但不限于腺相关病毒(aav)载体、嵌合aav载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、dna病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、或其任何突变体或衍生物。
[0137]
在另一实施例中，术语“转染”用以指细胞对外来dna的摄取，使得一旦已将外源dna引入细胞膜内侧，这些细胞就已被“转染”了。参见例如，graham等人,(1973)virology[病毒学]52:456；sambrook等人,(1989)molecular cloning,a laboratory manual[分子克隆：实验室手册],cold spring harbor laboratories[冷泉港实验室],纽约；davis等人,(1986)basic methods in molecular biology[分子生物学基本方法],elsevier[爱思唯尔公司]；chu等人,(1981)gene[基因],13:197。此类技术可用于将一个或多个外源dna部分引入适合的宿主细胞中。在一些实施例中，术语“转导”用以指细胞对外来dna的摄取，其中所述外来dna由病毒或病毒载体提供。因此，当已将外源dna引入细胞膜内侧时，细胞就已被“转导”。在一些实施例中，术语“转化”用以指细菌细胞对外来dna的摄取。
[0138]
如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外继续或延长生长和分裂的细胞群。在某些情况下，在储存或转移此类克隆群期间，核型可能发生自发或诱导的变化。因此，衍生自所指细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同，并且所指细胞系包括此类变体。
[0139]
术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，dna)区段之间的功能性关系。典型地，该术语是指转录调节序列与待转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列例如在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则启动子或增强子序列与编码序列可操作地连接。通常，与序列可操作地连接的启动子转录调节序列与该序列邻接或由短间隔子序列分开，即他们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列如增强子不需要在物理上邻接或位于极为接近这些转录调节序列增强其转录的编码序列的位置。
[0140]
如本文所用，术语“aav载体”是指衍生自或包含腺相关病毒血清型的一个或多个核酸序列的载体，包括但不限于aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8或aav-9病毒载体。aav载体可具有一个或多个aav野生型基因的整体或部分缺失，例如rep和/或cap基因，同时保留例如功能性侧接反向末端重复(“itr”)序列。在一些实施例中，aav载体可以包装在例如包含一个或多个aav衣壳蛋白的蛋白外壳或衣壳中，所述外壳或衣壳可提供用于将载体核酸递送至靶细胞的细胞核的媒介物。在一些实施例中，aav载体包含一个或多个aav itr序列(例如，aav2 itr序列)。在一些实施例中，aav载体包含一个或多个aav itr序列(例如，aav2 itr序列)，但不含有任何另外的病毒核酸序列。在一些实施例中，这些
aav载体组分(例如，itr)衍生自与raav衣壳不同的血清型病毒(例如，aav载体可包含衍生自aav2的itr，并且aav载体可包装到aav9衣壳中)。这些载体构建体的实施例提供于例如wo/2019/094253(pct/us2018/058744)中，将其通过引用以其全文并入本文。
[0141]
在一些实施例中，“scaav”是自互补的腺相关病毒(scaav)。scaav被称为“自互补”，因为scaav的载体的至少一部分(例如，编码区的至少一部分)形成分子内双链dna。在一些实施例中，所述raav是scaav。在一些实施例中，病毒载体从天然存在的腺相关病毒(aav)工程化以提供用于基因疗法的scaav。这些载体构建体的实施例以及其制备和纯化方法提供于例如wo/2019/094253(pct/us2018/058744)中，将其通过引用以其全文并入本文。
[0142]
在一些实施例中，“ssaav”是单链的腺相关病毒(ssaav)。ssaav被称为“单链的”，因为ssaav的载体的至少一部分(例如，编码区的至少一部分)是单链dna。在一些实施例中，所述raav是ssaav。在一些实施例中，病毒载体从天然存在的腺相关病毒(aav)工程化以提供用于基因疗法的ssaav。
[0143]
如本文所用，“病毒”或“病毒粒子”指示包含病毒载体(例如，单独或与一种或多种另外的组分(如一种或多种病毒衣壳)组合)的病毒颗粒。例如，aav病毒可以包含例如与aav衣壳蛋白外壳相关的线性单链aav核酸基因组。
[0144]
在一些实施例中，术语如“病毒”、“病毒粒子”、“aav病毒”、“重组aav病毒粒子”、“raav病毒粒子”、“aav载体颗粒”、“完全衣壳”及“完全颗粒”等是指感染性、复制缺陷型病毒，例如包含aav蛋白壳的那些，所述aav蛋白壳包裹例如在一侧或两侧上由aav itr侧接的病毒载体中的目的异源核苷酸序列。raav病毒粒子可以在适合的宿主细胞中产生，所述适合的宿主细胞包含单独或与编码aav辅助功能和附带功能(如cap基因)的核酸组合(例如在相同或另外的质粒上)的指定aav载体的序列(例如一个或多个质粒)。在一些实施例中，使得宿主细胞能够编码aav多肽，这些多肽用于实现将aav载体(含有目的重组核苷酸序列)包装至感染性重组病毒粒子颗粒中以用于后续基因递送。
[0145]
术语“反向末端重复”或“itr”是指可以例如在腺相关病毒(aav)和/或重组腺相关病毒载体(raav)中形成t形回文结构的一段核苷酸序列。muzyczka等人,(2001)fields virology[费氏病毒学],第29章,lippincott williams&wilkins[利平科特、威廉姆斯和威尔金斯出版社]。在重组aav载体中，这些序列在基因组包装和第二链合成中发挥功能性作用。
[0146]
术语“宿主细胞”表示包含目的外源核酸的细胞，例如，一种或多种微生物、酵母细胞、昆虫细胞、或哺乳动物细胞。例如，宿主细胞可以包含aav辅助构建体、aav载体质粒、附带功能载体、和/或其他转移dna。所述术语包括已转染的原始细胞的后代。由于自然的、偶然的或故意的突变，单个亲本细胞的后代在形态或基因组或总dna互补方面不一定与原始亲本完全相同。
[0147]
术语“aav辅助功能”是指可被表达以提供aav基因产物的aav衍生的编码序列，例如反式发挥功能以用于生产性aav复制的那些。例如，aav辅助功能可以包括两种主要的aav开放阅读框(orf)：rep和cap。已证明rep表达产物具有许多功能，其中包括：aav的dna复制起点的识别、结合和切断；dna解旋酶活性；以及来自aav(或其他异源)启动子的转录的调节。cap表达产物提供必要的包装功能。在本文中，aav辅助功能可用于以反式补充aav载体中缺失的aav功能。
[0148]
术语“aav辅助构建体”一般是指包括提供或编码以下蛋白或核酸的核苷酸序列的核酸分子，这些蛋白或核酸提供从aav载体中缺失的aav功能，例如，用于将目的核苷酸序列递送至靶细胞或组织的载体。aav辅助构建体通常用于提供aav rep和/或cap基因的瞬时表达，以补充aav复制所缺失的aav功能。典型地，辅助构建体缺乏aav itr，并且既不能复制也不能包装自己。aav辅助构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒、或病毒粒子的形式。已经披露了许多aav辅助构建体，如编码rep和cap表达产物的常用质粒paav/ad和plm29+45。参见例如，samulski等人,(1989)j.virol.[病毒学杂志],63:3822-3828；mccarty等人,(1991)j.virol.[病毒学杂志],65:2936-2945。已经披露了许多其他编码rep和/或cap表达产物的载体。参见例如，美国专利号5,139,941和6,376,237。这些载体构建体的实施例以及其制备和纯化方法提供于例如wo/2019/094253(pct/us2018/058744)中，将其通过引用以其全文并入本文。
[0149]
如本文所用，术语“小基因”是指包含多个内含子和外显子以及至少一个剪接调节子结合位点的核酸序列。在实施例中，在异源核酸序列表达期间，剪接调节子的存在或不存在调节成熟mrna中存在的外显子的数目。本文更完整地描述了小基因。
[0150]“剪接调节子”是与剪接调节子结合位点结合并调节前mrna分子(例如，本文所述核酸分子产生的前mrna分子)的剪接的分子。在实施例中，剪接调节子增加成熟mrna分子中外显子的纳入。在其他实施例中，剪接调节子减少成熟mrna分子中外显子的纳入。
[0151]“剪接调节子结合序列”是由剪接调节子识别的核酸的序列。该术语应理解为涵盖在前mrna中发现的序列以及在产生前mrna的dna中发现的序列。在示例性实施例中，剪接调节子是本文所述的化合物，例如lmi070，并且剪接调节子结合位点包括序列aga。在实施例中，剪接调节子结合位点设置在或靠近例如位于本文所述的小基因的外显子的3’端。
[0152]“前mrna”是通过(例如，本文所述的核酸分子的)dna的转录产生的、尚未进行进一步加工(如，例如剪接)的第一形式的rna。因此，前mrna可以包括内含子和外显子两者。前mrna分子经进一步加工(例如通过剪接)以形成“成熟rna”或“mrna”。
[0153]
本文披露的核酸序列、小基因、载体、和方法涉及小基因和包含所述小基因的可调节的表达系统、剪接调节子与此类小基因和表达系统组合以控制转基因表达的用途、其其他用途、及其组合，例如，(1)在剪接调节子存在的情况下驱动转基因序列的表达，并且在剪接调节子不存在的情况下减少所述转基因序列的表达(打开开关)，以及(2)在剪接调节子不存在的情况下驱动转基因序列的表达，并且在剪接调节子存在的情况下减少所述转基因序列的表达(关闭开关)的那些。例如，本文披露的核酸序列、载体、和方法可以以剪接调节子依赖性方式驱动人pgrn或其他治疗性蛋白序列的表达。
[0154]
核酸分子
[0155]
1.本文披露了包含编码目的分子(例如，目的蛋白)的转基因的核酸分子，其中所述转基因与例如如本文所述的小基因可操作地连接。
[0156]
小基因
[0157]
本文披露的核酸分子和其他方面包括小基因。本发明的示例性小基因描绘在图1a(打开开关)和图1b(关闭开关)中。本文披露了小基因，这些小基因是包含多个内含子和外显子以及至少一个剪接调节子结合位点的核酸序列。在实施例中，所述小基因与转基因可操作地连接。如本文所述的小基因与一个或多个剪接调节子结合使用，以控制(例如，打开
或关闭)来自与所述小基因相关的转基因的目的分子的表达。
[0158]
在多个方面，小基因包含：第一外显子；第一内含子；第二外显子；第二内含子；和第三外显子；其中所述第二外显子包含剪接调节子结合序列，并且其中，在剪接调节子存在的情况下，所述第二外显子包括在所述核酸的mrna产物中，并且在所述剪接调节子不存在的情况下，所述第二外显子不包括在所述核酸的mrna产物中。
[0159]
在多个方面，所述小基因的第三外显子包括终止密码子，所述终止密码子处于在所述剪接调节子不存在的情况下产生的核酸的mrna产物的框中，并且不处于在所述剪接调节子存在的情况下产生的核酸的mrna产物的框中。因此，在剪接调节子不存在的情况下，例如由于包含框内终止密码子的外显子的纳入导致翻译提前停止，编码设置在所述小基因下游的目的分子(例如，目的蛋白)的序列的翻译减少，而在所述剪接调节子存在的情况下，所述终止密码子在框外，并且所述目的分子的翻译增加。因此，此类方面在本文中被称为“打开开关”小基因，因为剪接调节子的存在打“开”了(例如，增加了)目的分子的表达。
[0160]
在其他实施例中，第二外显子包含终止密码子，该终止密码子处于在剪接调节子存在的情况下产生的核酸的mrna产物的框中。因此，在剪接调节子存在的情况下，包含终止密码子的外显子包括在转录物中，并且编码设置在小基因下游的目的分子(例如，目的蛋白)的序列的翻译减少，而在剪接调节子不存在的情况下，mrna中不存在包含终止密码子的外显子，并且目的分子的表达增加。因此，此类方面在本文中被称为“关闭开关”小基因，因为剪接调节子的存在关“闭”了(例如，减少了)目的分子的表达。
[0161]
不受理论的约束，本文认识到载体可能具有有限的编码能力(即，为了具有功能性，他们的尺寸可能受到限制)。因此，本文考虑包含少于2000个、少于1900个、少于1800个、少于1700个、少于1600个、少于1500个、少于1400个、少于1300个、少于1200个、少于1100个、少于1000个、少于900个、少于800个、少于700个、少于600个、或少于500个核苷酸的小基因。本文还考虑包含在约2500与约500个之间的核苷酸、例如在约2000与约600个之间的核苷酸、例如在约1500与约700个之间的核苷酸、例如在约1200与约800个之间的核苷酸、例如在约1100与约900个之间的核苷酸的小基因。不受理论的约束，具有这种长度的小基因可以被包含转基因的载体包括，并且所得的载体具有适当的尺寸以例如在宿主细胞中发挥功能。在实施例中，所述小基因的序列是人来源的序列或衍生自人来源的序列。在鉴定为包含剪切调节子结合序列的人来源的参考序列长于本文考虑的长度的情况下，可以如例如通过缺失内含子或外显子序列来缩短此类序列。
[0162]
在实施例中，可以进一步修饰本文所述的小基因。设计此类修饰以改善小基因的一个或多个特性。例如，可包括在小基因中的衍生自人基因组序列的序列可以被进一步修饰以突变或去除一个或多个起始密码子(例如，atg序列)；去除或突变所有不需要的潜在剪接受体或剪接供体序列；包括1个或多个，例如，2、3、4、5、或6个gaa重复(seq id no:101)(例如，包括gaagaagaa：seq id no:69)；包括科扎克序列(例如，gccacc的科扎克序列：seq id no:70)；或其任何修饰的组合。
[0163]
剪接调节子结合序列
[0164]
本发明的这些方面包括包含至少一个包含剪接调节子结合序列的外显子的小基因。在多个方面，剪接调节子结合序列设置在或靠近小基因的外显子的3’端。在多个方面，剪接调节子结合序列设置在小基因的外显子的3’端。在多个方面，剪接调节子结合位点衍
生自人基因组的序列。本文(例如在实例中)所述的方法用以鉴定剪接调节子识别的剪接调节子结合位点。下表1列出了示例性的、包含在外显子3’端的剪接调节子结合位点(例如，序列aga)的外显子的序列。此类剪接调节子结合序列被本文所述的剪接调节子如lmi070识别。图2示出了衍生自snx7的小基因的设计。
[0165]
表1.如通过rna测序(rnaseq)鉴定的lmi070的前10个外显子靶标的序列(例如，包含在外显子3’端处或附近的序列aga)。
[0166][0167][0168]
seq id no:80是位于包含seq id no:1的snx7基因座的外显子8与9之间的、包含剪接调节子结合位点的隐藏外显子的全基因组序列(144nt)。
[0169]
agtttgcaaaggaaggaaaggagcagagacttgaatgagcagaaaatcatttcagggcctgttctctatgtccttgctatccctgtcttctgtagctattctgaaaccatcaacaaaggagcacaccattccatcagcaaaaga(seq id no:80)。
[0170]
seq id no:16衍生自seq id no:80，其具有修饰以在orf中创建移码并且去除了起始密码子以避免泄漏表达。
[0171]
agtttgcaaaggaaggaaaggagcagagacttgattgagcagaaaatcatttcagggcctgttctcta
ttgtccttgctatcctgtcttctgtagctatctgaaaccatcaacaaaggagcacaccattccatcagcaaaaga(seq id no:16)。
[0172]
在实施例中，所述小基因包含衍生自seq id no:1至seq id no:10或seq id no:80中任一项的外显子序列，例如第二外显子序列。在实施例中，所述小基因的外显子(例如，第二外显子)包括seq id no:1至seq id no:10或seq id no:80中的任一项，或由其组成。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:1或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:1的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:2或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:2的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:3或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:3的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:4或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:4的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:5或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:5的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:6或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:6的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:7或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:7的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:8或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:8的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:9或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:9的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:10或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:10的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、
95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:80或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:80的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在一些实施例中，本文所述的小基因包括包含以下或由以下组成的外显子(例如，第二外显子)：seq id no:16或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或seq id no:16的片段，所述片段包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％、98％、或99％的所述序列的核苷酸。在实施例中，所述第二外显子由seq id no:16组成。
[0173]
在一些实施例中，所述第二外显子修饰至由3n-1个核苷酸组成，其中n是任何整数，使得mrna中第二外显子的纳入导致相对于不包括第二外显子的mrna的移码。
[0174]
剪接调节子
[0175]
如本文所用，术语“剪接调节子”是指能够介导可变剪接的化合物。在示例性实施例中，所述剪接调节子调节(例如，增加)mrna产物中外显子的纳入。在示例性实施例中，所述剪接调节子通过结合剪接调节子结合序列(例如序列aga，例如在被调节的外显子的3’端处的序列aga)调节(例如，增加)mrna产物中外显子的纳入。
[0176]
在本发明的多个方面，所述剪接调节子是本文所述的化合物。在第一剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(i)所述的化合物：
[0177][0178]
或其药学上可接受的盐，其中a’是被0、1、2、或3个独立地选自c
1-c4烷基的取代基取代的苯基，其中2个c
1-c4烷基基团可与他们所结合的原子组合以形成5-6元环并被0或1个选自以下的取代基取代：氧代基，肟基，和羟基，卤代c
1-c4烷基，二卤代c
1-c4烷基，三卤代c
1-c4烷基，c
1-c4烷氧基，c
1-c4烷氧基-c
3-c7环烷基，卤代c
1-c4烷氧基，二卤代c
1-c4烷氧基，三卤代c
1-c4烷氧基，羟基，氰基，卤素，氨基，单和二-c
1-c4烷基氨基，杂芳基，被羟基取代的c
1-c4烷基，被芳基取代的c
1-c4烷氧基，氨基，-c(o)nh c
1-c4烷基-杂芳基，-nhc(o)-c
1-c4烷基-杂芳基，c
1-c4烷基c(o)nh-杂芳基，c
1-c4烷基nhc(o)-杂芳基，3-7元环烷基，5-7元环烯基或含有1或2个独立地选自s、o和n的杂原子的5、6或9元杂环，其中杂芳基具有5、6或9个环原子，1、2或3个环杂原子，所述环杂原子选自n、o和s并被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代：氧代基，羟基，硝基，卤素，c
1-c4烷基，c
1-c4烯基，c
1-c4烷氧基，c
3-c7环烷基，c
1-c4烷基-oh，三卤代c
1-c4烷基，单和二c
1-c4烷基氨基，-c(o)nh2，-nh2，-no2，羟基c
1-c4烷基氨基，羟基c
1-c4烷基，4-7元杂环c
1-c4烷基，氨基c
1-c4烷基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基c
1-c4烷基；或a’是具有1-3个环氮原子的6元杂芳基，所述6元杂芳基被苯基或具有5或6个环原子、1或2个环杂原子的杂芳基取代，所述环杂原子独立地选自n、o和s并被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代：c
1-c4烷基、单-和二-c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基、氨基c
1-c4烷基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基c
1-c4烷基；或a’是具有9至10个环原子和1、2、或3个独立地选自n、o或s的环杂原子的双环杂芳基，所述双环杂芳基被0、1、或2个独立地选自
以下的取代基取代：氧代基、氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基和被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基；b是具有下式的基团：
[0179][0180]
其中m、n和p独立地选自0或1；r、r1、r2、r3和r4独立地选自由以下组成的组：氢、c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r5和r6独立地选自氢和氟；或r和r3一起组合形成具有0或1个选自n、o或s的另外的环杂原子的稠合5或6元杂环；r1和r3一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r1和r5一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r3和r4与他们所附接的碳原子一起组合形成螺环c
3-c6环烷基；x是cr
a’r
b’、nr7或键；r7是氢、或c
1-c4烷基；r
a’和r
b’独立地选自氢和c
1-c4烷基，或r
a’和r
b’一起组合形成二价c
2-c5亚烷基基团；z是cr8或n；当z是n时，x是键；r8是氢或与r6一起组合形成双键；或b是具有下式的基团：
[0181][0182]
其中y是c或o并且当y是o时，r
11
和r
12
两者都不存在；p和q独立地选自由0、1和2组成的组；r9和r
13
独立地选自氢和c
1-c4烷基；r
10
和r
14
独立地选自氢、氨基、单-和二-c
1-c4烷基氨基以及c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r
11
是氢、c
1-c4烷基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基；r
12
是氢或c
1-c4烷基；或r9和r
11
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环；或r
11
和r
12
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环。
[0183]
在第二剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第一剪接调节子方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中a’选自：
[0184]
[0185]
[0186]
[0187][0188]
在第三剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(ii)所述的化合物：
[0189][0190]
或其药学上可接受的盐，其中y是n或c-ra；ra是氢或c
1-c4烷基；rb是氢、c
1-c4烷基、c
1-c4烷氧基、羟基、氰基、卤素、三卤代c
1-c4烷基或三卤代c
1-c4烷氧基；rc和rd各自独立地是氢、c
1-c4烷基、c
1-c4烷氧基、羟基、三卤代c
1-c4烷基、三卤代c
1-c4烷氧基或杂芳基；a是具有1-3个环氮原子的6元杂芳基，所述6元杂芳基被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代：氧代基、c
1-c4烷基、单-和二-c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基、氨基c
1-c4烷基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基c
1-c4烷基；或a是具有1-3个环杂原子的5元杂芳基，所述环杂原子独立地选自n、o和s并被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代：c
1-c4烷基、羟基、单-和二-c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基、氨基c
1-c4烷基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基c
1-c4烷基；或a和rc与他们所结合的原子一起形成被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代的6元芳基：氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基和被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基；b是具有下式的基团：
[0191][0192]
其中m、n和p独立地选自0或1；r、r1、r2、r3和r4独立地选自由以下组成的组：氢、c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r5和r6独立地选自氢和氟；或r和r3一起组合形成具有0或1个选自n、o或s的另外的环杂原子的稠合5或6元杂环；r1和r3一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r1和r5一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r3和r4与他们所附接的碳原子一起组合形成螺环c
3-c6环烷基；x是cr
a’r
b’、nr7或键；r7是氢、或c
1-c4烷基；r
a’和r
b’独立地选自氢和c
1-c4烷基，或r
a’和r
b’一起组合形成二价c
2-c5亚烷基基团；z是cr8或n；当z是n时，x是键；r8是氢或与r6一起组合形成双键；或b是具有下式的基团：
[0193][0194]
其中p和q独立地选自由0、1和2组成的组；r9和r
13
独立地选自氢和c
1-c4烷基；r
10
和r
14
独立地选自氢、氨基、单-和二-c
1-c4烷基氨基以及c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r
11
是氢、c
1-c4烷基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基；r
12
是氢或c
1-c4烷基；或r9和r
11
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环；或r
11
和r
12
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具
c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r5和r6是氢；或r和r3一起组合形成具有0或1个选自n、o或s的另外的环杂原子的稠合5或6元杂环；r1和r3一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r1和r5一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r3和r4与他们所附接的碳原子一起组合形成螺环c
3-c6环烷基；x是cr
a’r
b’、o、nr7或键；r
a’和r
b’独立地选自氢和c
1-c4烷基，或r
a’和r
b’一起组合形成二价c
2-c5亚烷基基团；z是cr8或n；当z是n时，x是键；r8是氢或与r6一起组合形成双键。
[0204]
在第九剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第一至第七剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b是具有下式的基团：
[0205][0206]
其中p和q独立地选自由0、1和2组成的组；r9和r
13
独立地选自氢和c
1-c4烷基；r
10
和r
14
独立地选自氢、氨基、单-和二-c
1-c4烷基氨基以及c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r
11
是氢、c
1-c4烷基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基；r
12
是氢或c
1-c4烷基；或r9和r
11
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环；或r
11
和r
12
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环。
[0207]
在第十剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(iii)所述的化合物：
[0208][0209]
或其药学上可接受的盐，其中rb是氢或羟基；rc是氢或卤素；并且rd是卤素。
[0210]
在第十一剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(iv)所述的化合物：
[0211][0212]
或其药学上可接受的盐，其中rb是羟基、甲氧基、三氟甲基或三氟甲氧基。
[0213]
在第十二剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(v)所述的化合物：
[0214][0215]
或其药学上可接受的盐，其中rb是羟基、甲氧基、三氟甲基或三氟甲氧基；并且re是氢、羟基或甲氧基。
[0216]
在第十三剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第三至第九或第十一至第十二剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中y是n。
[0217]
在第十四剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第三至第九或第十一至第十二剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中y是ch。
[0218]
在第十五剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第一至第八或第十至第十四剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b选自：
[0219][0220]
其中z是nh或n(me)。
[0221]
在第十六剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第一至第八或第十至第十五剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b是
[0222]
在第十七剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第一至第七或第九至第十四剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b选自调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b选自
[0223]
在第十八剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第一至第七、第九至第十四或第十七剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b是
[0224]
在第十九剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(vi)所述的化合物：
[0225][0226]
或其药学上可接受的盐，其中a是具有9或10个环原子和1或2个环n原子及0或1个o原子的双环杂芳基或杂环，所述双环杂芳基或杂环被0、1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基取代：-c(o)nh2、-c(o)o-c
1-c4烷基、芳基、氧代基、氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、杂环基、杂芳基、杂环基c
1-c4烷基、c
1-c4烷基芳基、c
1-c4烷基杂环基、c
1-c4烷基杂芳基、c
1-c4烷氧基芳基、c
1-c4烷氧基杂环基、c
1-c4烷氧基杂芳基、被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基；并且b是具有下式的基团：
[0227][0228]
其中m、n和p独立地选自0或1；r、r1、r2、r3和r4独立地选自由以下组成的组：氢、c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r5和r6独立地选自氢和氟；或r和r3一起组合形成具有0或1个选自n、o或s的另外的环杂原子的稠合5或6元杂环；r1和r3一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r1和r5一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r3和r4与他们所附接的碳原子一起组合形成螺环c
3-c6环烷基；x是crarb、o、nr7或键；r7是氢、或c
1-c4烷基；ra和rb独立地选自氢和c
1-c4烷基，或ra和rb一起组合形成二价c
2-c5亚烷基基团；z是cr8或n；当z是n时，x是键；r8是氢或与r6一起组合形成双键；或b是具有下式的基团：
[0229][0230]
其中p和q独立地选自由0、1和2组成的组；r9和r
13
独立地选自氢和c
1-c4烷基；r
10
和r
14
独立地选自氢、氨基、单-和二-c
1-c4烷基氨基以及c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r
11
是氢、c
1-c4烷基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基；r
12
是氢或c
1-c4烷基；或r9和r
11
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环；或r
11
和r
12
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环。
[0231]
在第二十剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(vii)所述的化合物：
[0232][0233]
或其药学上可接受的盐，其中a是具有10个环原子和1或2个环n原子及的双环杂芳
基，所述双环杂芳基被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代：氧代基、氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、杂环基、杂芳基、杂环基c
1-c4烷基、c
1-c4烷基芳基、c
1-c4烷基杂环基、c
1-c4烷基杂芳基、c
1-c4烷氧基芳基、c
1-c4烷氧基杂环基、c
1-c4烷氧基杂芳基、被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基；并且b是具有下式的基团：
[0234][0235]
其中m、n和p独立地选自0或1；r、r1、r2、r3和r4独立地选自由以下组成的组：氢、c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r5和r6独立地选自氢和氟；或r和r3一起组合形成具有0或1个选自n、o或s的另外的环杂原子的稠合5或6元杂环；r1和r3一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r1和r5一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r3和r4与他们所附接的碳原子一起组合形成螺环c
3-c6环烷基；x是crarb、o、nr7或键；r7是氢、或c
1-c4烷基；ra和rb独立地选自氢和c
1-c4烷基，或ra和rb一起组合形成二价c
2-c5亚烷基基团；z是cr8或n；当z是n时，x是键；r8是氢或与r6一起组合形成双键；或b是具有下式的基团：
[0236][0237]
其中p和q独立地选自由0、1和2组成的组；r9和r
13
独立地选自氢和c
1-c4烷基；r
10
和r
14
独立地选自氢、氨基、单-和二-c
1-c4烷基氨基以及c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r
11
是氢、c
1-c4烷基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基；r
12
是氢或c
1-c4烷基；或r9和r
11
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环；或r
11
和r
12
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环。
[0238]
在第二十一剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第十九或第二十剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中a选自：
[0239][0240][0241]
其中u和v各自独立地是0、1、2或3；并且ra和rb各自独立地选自氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、杂环基、杂芳基、杂环基c
1-c4烷基、c
1-c4烷基芳基、c
1-c4烷基杂环基、c
1-c4烷基杂芳基、c
1-c4烷氧基芳基、c
1-c4烷氧基杂环基、c
1-c4烷氧基杂芳基、和被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基。
[0242]
在第二十二剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第十九至第二十一剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中a选自：
[0243][0244][0245]
其中u和v各自独立地是0、1、2或3；并且ra和rb各自独立地选自氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、杂环基、杂芳基、杂环基c
1-c4烷基、c
1-c4烷基芳基、c
1-c4烷基杂环基、c
1-c4烷基杂芳基、c
1-c4烷氧基芳基、c
1-c4烷氧基杂环基、c
1-c4烷氧基杂芳基、和被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基。
[0246]
在另一剪接调节子方面，本文提供了如第十九至第二十二剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中a在邻位被羟基取代。
[0247]
在第二十三剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第十九至第二十二剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中a选自：
[0248][0249]
在第二十四剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第十九至第二十三剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中a具有单个n原子。
[0250]
在第二十五剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(viii)所述的化合物：
[0251][0252]
或其药学上可接受的盐，其中rc和rd各自独立地选自氢、氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、杂环基、杂芳基、杂环基c
1-c4烷基、c
1-c4烷基芳基、c
1-c4烷基杂环基、c
1-c4烷基杂芳基、c
1-c4烷氧基芳基、c
1-c4烷氧基杂环基、c
1-c4烷氧基杂芳基、被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基。
[0253]
在第二十六剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(ix)所述的化合物：
[0254][0255]
或其药学上可接受的盐，其中rc和rd各自独立地选自氢、氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、杂环基、杂芳基、杂环基c
1-c4烷基、c
1-c4烷基芳基、c
1-c4烷基杂环基、c
1-c4烷基杂芳基、c
1-c4烷氧基芳基、c
1-c4烷氧基杂环基、c
1-c4烷氧基杂芳基、被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基。
[0256]
在第二十七剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(x)所述的化合物：
[0257][0258]
或其药学上可接受的盐，其中rc和rd各自独立地选自氢、氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、杂环基、杂芳基、杂环基c
1-c4烷基、c
1-c4烷基芳基、c
1-c4烷基杂环基、c
1-c4烷基杂芳基、c
1-c4烷氧基芳基、c
1-c4烷氧基杂环基、c
1-c4烷氧基杂芳基、被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基。
[0259]
在第二十八剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(xi)所述的化合物：
[0260][0261]
或其药学上可接受的盐，其中rc和rd各自独立地选自氢、氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、杂环基、杂芳基、杂环基c
1-c4烷基、c
1-c4烷基芳基、c
1-c4烷基杂环基、c
1-c4烷基杂芳基、c
1-c4烷氧基芳基、c
1-c4烷氧基杂环基、c
1-c4烷氧基杂芳基、被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基。
[0262]
在第二十九剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(xii)所述的化合物：
[0263][0264]
或其药学上可接受的盐，其中rc和rd各自独立地选自氢、氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、杂环基、杂芳基、杂环基c
1-c4烷基、c
1-c4烷基芳基、c
1-c4烷基杂环基、c
1-c4烷基杂芳基、c
1-c4烷氧基芳基、c
1-c4烷氧基杂环基、c
1-c4烷氧基杂芳基、被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基。
[0265]
在第三十剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(xiii)所述的化合物：
[0266][0267]
或其药学上可接受的盐，其中rc和rd各自独立地选自氢、氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、杂环基、杂芳基、杂环基c
1-c4烷基、c
1-c4烷基芳基、c
1-c4烷基杂环基、c
1-c4烷基杂芳基、c
1-c4烷氧基芳基、c
1-c4烷氧基杂环基、c
1-c4烷氧基杂芳基、被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基。
[0268]
在第三十一剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(xiv)所述的化合物：
[0269][0270]
或其药学上可接受的盐，其中rc和rd各自独立地选自氢、氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、杂环基、杂芳基、杂环基c
1-c4烷基、c
1-c4烷基芳基、c
1-c4烷基杂环基、c
1-c4烷基杂芳基、c
1-c4烷氧基芳基、c
1-c4烷氧基杂环基、c
1-c4烷氧基杂芳基、被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基。
[0271]
在第三十二剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第十九至第三十一剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b是具有下式的基团：
[0272][0273]
其中m、n和p独立地选自0或1；r、r1、r2、r3和r4独立地选自由以下组成的组：氢、c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r5和r6是氢；或r和r3一起组合形成具有0或1个选自n、o或s的另外的环杂原子的稠合5或6元杂环；r1和r3一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r1和r5一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r3和r4与他们所附接的碳原子一起组合形成螺环c
3-c6环烷基；x是crarb、o、nr7或键；ra和rb独立地选自氢和c
1-c4烷基，或ra和rb一起组合形成二价c
2-c5亚烷基基团；z是cr8或n；当z是n时，x是键；r8是氢或与r6一起组合形成双键。
[0274]
在第三十三剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第十九至第三十二剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b是具有下式的基团：
[0275][0276]
其中p和q独立地选自由0、1和2组成的组；r9和r
13
独立地选自氢和c
1-c4烷基；r
10
和r
14
独立地选自氢、氨基、单-和二-c
1-c4烷基氨基以及c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r
11
是氢、c
1-c4烷基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基；r
12
是氢或c
1-c4烷基；或r9和r
11
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环；或r
11
和r
12
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环。
[0277]
在第三十四剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第十九至第三十三剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b选自由以下组成的组：
[0278][0279]
其中x是o或n(me)或nh；并且r
17
是氢或甲基。
[0280]
在第三十五剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第十九至第三十四剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b是：
[0281][0282]
在第三十六剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第十九至第三十五剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中x是-o-。
[0283]
在第三十七剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第十九至第三十六剪接调节子方面中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中x是n(me)。
[0284]
在第三十八剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(xv)所述的化合物：
[0285][0286]
或其药学上可接受的盐，其中a是被0、1、2、或3个独立地选自c
1-c4烷基的取代基取代的2-羟基-苯基，其中2个c
1-c4烷基基团可与他们所结合的原子组合以形成5-6元环并被0或1个选自以下的取代基取代：氧代基，肟基和羟基，卤代c
1-c4烷基，二卤代c
1-c4烷基，三卤代c
1-c4烷基，c
1-c4烷氧基，c
1-c4烷氧基-c
3-c7环烷基，卤代c
1-c4烷氧基，二卤代c
1-c4烷氧基，三卤代c
1-c4烷氧基，羟基，氰基，卤素，氨基，单和二-c
1-c4烷基氨基，杂芳基，被羟基取代的c
1-c4烷基，被芳基取代的c
1-c4烷氧基，氨基，-c(o)nh c
1-c4烷基-杂芳基，-nhc(o)-c
1-c4烷基-杂芳基，c
1-c4烷基c(o)nh-杂芳基，c
1-c4烷基nhc(o)-杂芳基，3-7元环烷基，5-7元环烯基或含有1或2个独立地选自s、o和n的杂原子的5、6或9元杂环，其中杂芳基具有5、6或9个环原子，1、2或3个环杂原子，所述环杂原子选自n、o和s并被0、1、或2个独立地选自以下的取
代基取代：氧代基，羟基，硝基，卤素，c
1-c4烷基，c
1-c4烯基，c
1-c4烷氧基，c
3-c7环烷基，c
1-c4烷基-oh，三卤代c
1-c4烷基，单和二c
1-c4烷基氨基，-c(o)nh2，-nh2，-no2，羟基c
1-c4烷基氨基，羟基c
1-c4烷基，4-7元杂环c
1-c4烷基，氨基c
1-c4烷基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基c
1-c4烷基；或a是2-萘基，其在位置3任选地被羟基取代并且另外地被0、1或2个选自羟基、氰基、卤素、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
1-c5烷氧基的取代基取代，其中所述烷氧基是未取代的或被以下取代：羟基、c
1-c4烷氧基、氨基、n(h)c(o)c
1-c4烷基、n(h)c(o)2c
1-c4烷基、亚烷基4至7元杂环、4至7元杂环以及单-和二-c
1-c4烷基氨基；或a是具有1-3个环氮原子的6元杂芳基，所述6元杂芳基被苯基或具有5或6个环原子、1或2个环杂原子的杂芳基取代，所述环杂原子独立地选自n、o和s并被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代：c
1-c4烷基、单-和二-c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基、氨基c
1-c4烷基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基c
1-c4烷基；或a是具有9至10个环原子和1、2、或3个独立地选自n、o或s的环杂原子的双环杂芳基，所述双环杂芳基被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代：氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基和被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基；或a是具有12或13个环原子和1、2、或3个独立地选自n、o或s的环杂原子的三环杂芳基，所述三环杂芳基被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代：氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基、被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基、单-和二-c
1-c4烷基氨基以及杂芳基，其中所述杂芳基具有5、6或9个环原子，1、2或3个环杂原子，所述环杂原子选自n、o和s并被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代：氧代基、羟基、硝基、卤素、c
1-c4烷基、c
1-c4烯基、c
1-c4烷氧基、c
3-c7环烷基、c
1-c4烷基-oh、三卤代c
1-c4烷基、单-和二-c
1-c4烷基氨基、-c(o)nh2、-nh2、-no2、羟基c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基、4-7元杂环c
1-c4烷基、氨基c
1-c4烷基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基c
1-c4烷基；b是具有下式的基团：
[0287][0288]
其中m、n和p独立地选自0或1；r、r1、r2、r3和r4独立地选自由以下组成的组：氢、c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r5和r6独立地选自氢和氟；或r和r3一起组合形成具有0或1个选自n、o或s的另外的环杂原子的稠合5或6元杂环；r1和r3一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r1和r5一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r3和r4与他们所附接的碳原子一起组合形成螺环c
3-c6环烷基；x是crarb、o、nr7或键；r7是氢、或c
1-c4烷基；ra和rb独立地选自氢和c
1-c4烷基，或ra和rb一起组合形成二价c
2-c5亚烷基基团；z是cr8或n；当z是n时，x是键；r8是氢或与r6一起组合形成双键；或b是具有下式的基团：
[0289][0290]
其中p和q独立地选自由0、1和2组成的组；r9和r
13
独立地选自氢和c
1-c4烷基；r
10
和r14
独立地选自氢、氨基、单-和二-c
1-c4烷基氨基以及c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r
11
是氢、c
1-c4烷基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基；r
12
是氢或c
1-c4烷基；或r9和r
11
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环；或r
11
和r
12
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环。
[0291]
在第三十九剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第三十八剪接调节子方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中a是具有1-3个环氮原子的6元杂芳基，所述6元杂芳基被苯基或具有5或6个环原子、1或2个环杂原子的杂芳基取代，所述环杂原子独立地选自n、o和s并被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代：c
1-c4烷基、单-和二-c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基、氨基c
1-c4烷基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基c
1-c4烷基；或a是具有9至10个环原子和1、2、或3个独立地选自n、o或s的环杂原子的双环杂芳基，所述杂芳基被0、1、或2个独立地选自以下的取代基取代：氰基、卤素、羟基、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
2-c4炔基、c
1-c4烷氧基和被羟基取代的c
1-c4烷氧基、c
1-c4烷氧基、氨基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基。
[0292]
在第四十剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第三十八剪接调节子方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中a是被0、1、2、或3个独立地选自以下的取代基取代的2-羟基-苯基：c
1-c4烷基、卤代c
1-c4烷基c
1-c4烷氧基、羟基、氰基、卤素、氨基、单-和二-c
1-c4烷基氨基、杂芳基以及被羟基或氨基取代的c
1-c4烷基，所述杂芳基具有5或6个环原子、1或2个环杂原子，所述环杂原子选自n、o和s并被0、1或2个独立地选自以下的取代基取代：c
1-c4烷基、单-和二-c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基氨基、羟基c
1-c4烷基、4-7元杂环c
1-c4烷基、氨基c
1-c4烷基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基c
1-c4烷基。
[0293]
在第四十一剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第三十八剪接调节子方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中a是2-萘基，其在位置3任选地被羟基取代并且另外地被0、1或2个选自羟基、氰基、卤素、c
1-c4烷基、c
2-c4烯基、c
1-c4烷氧基的取代基取代，其中所述烷氧基是未取代的或被以下取代：羟基、c
1-c4烷氧基、氨基、n(h)c(o)c
1-c4烷基、n(h)c(o)2c
1-c4烷基、4至7元杂环以及单-和二-c
1-c4烷基氨基；或
[0294]
在第四十二剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第三十九至第四十一剪接调节子方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b是具有下式的基团：
[0295][0296]
其中m、n和p独立地选自0或1；r、r1、r2、r3和r4独立地选自由以下组成的组：氢、c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r5和r6是氢；或r和r3一起组合形成具有0或1个选自n、o或s的另外的环杂原子的稠合5或6元杂环；r1和r3一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r1和r5一起组合形成c
1-c3亚烷基基团；r3和r4与他们所附接的碳原子一起组合形成螺环c
3-c6环烷基；x是crarb、o、nr7或键；ra和rb独立地选自氢和c
1-c4烷基，或ra和rb一起组合形成二价c
2-c5亚烷基基团；z是cr8或n；当z是n时，x是键；r8是氢或与r6一起组合形成双键。
[0297]
在第四十三剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第三十八至第四十一剪接调节子方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中b是具有下式的基团：
[0298][0299]
其中p和q独立地选自由0、1和2组成的组；r9和r
13
独立地选自氢和c
1-c4烷基；r
10
和r
14
独立地选自氢、氨基、单-和二-c
1-c4烷基氨基以及c
1-c4烷基，所述烷基任选地被羟基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基取代；r
11
是氢、c
1-c4烷基、氨基或单-和二-c
1-c4烷基氨基；r
12
是氢或c
1-c4烷基；或r9和r
11
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环；或r
11
和r
12
一起组合形成任选地被1-3个c
1-c4烷基基团取代的、具有4至7个环原子的饱和氮杂环。
[0300]
在第四十四剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(xvi)所述的化合物：
[0301][0302]
或其药学上可接受的盐，其中r
15
是氢、羟基、c
1-c4烷氧基，所述烷氧基任选地被羟基、甲氧基、氨基、单-和二-甲基氨基或吗啉取代。
[0303]
在第四十五剪接调节子方面，所述剪接调节子是如式(xvii)所述的化合物：
[0304][0305]
或其药学上可接受的盐，其中r
16
是具有一个环氮原子和0或1个选自n、o或s的另外的环杂原子的5元杂芳基，其中所述杂芳基任选地被c
1-c4烷基取代。
[0306]
在第四十六剪接调节子方面，所述剪接调节子是如第三十八至第四十一、第四十四和第四十五剪接调节子方面所述的化合物，其中b选自由以下组成的组：
7元杂环c
1-c4烷基、氨基c
1-c4烷基以及单-和二-c
1-c4烷基氨基c
1-c4烷基。
[0318]
在某些实施例中，所述剪接调节子是具有以下结构的5-(1h-吡唑-4-基)-2-(6-((2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氧基)哒嗪-3-基)苯酚(lmi070；布雷那兰(branaplam))：
[0319][0320]
或其药学上可接受的盐。
[0321]
在某些实施例中，所述剪接调节子是剪接调节子2，其中所述化合物是具有以下结构的7-(6-(甲基(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基)氨基)哒嗪-3-基)异喹啉-6-醇：
[0322][0323]
或其药学上可接受的盐。
[0324]
另外的剪接调节子和被那些调节子结合的剪接调节子结合序列描述于例如专利申请公开us 2012/0083495、wo 2014/028459、wo 2015/017589、wo 2014/116845、wo 2017/100726、wo 2018/098446、wo 2018/226622、wo 2019/005993、wo 2019/005980、和wo 2019028440，将其内容通过引用以其全文并入本文，并且其中描述的剪接调节子和剪接调节子结合序列考虑用于在本文所述的方法、小基因以及其他方面和实施例中使用。
[0325]
切割位点
[0326]
在多个方面，本发明的核酸分子包括一个或多个编码切割位点的序列，所述切割位点起到将小基因编码的序列(例如，所有序列或基本上所有序列)从转基因编码的序列(例如，目的蛋白)切割的功能。在多个方面，所述切割位点可以是自切割位点、蛋白酶切割位点或其任何组合。可以将切割位点设计为被任何位点特异性蛋白酶切割，所述蛋白酶在目的细胞中按足以从目的蛋白切割开由小基因的一个或多个外显子编码的序列的水平表达(通过重组表达或内源表达)。在本发明的重要方面，选择蛋白酶切割位点以对应于天然(或借助于细胞工程改造)存在于与目的蛋白表达有关的细胞区室中的蛋白酶。即，蛋白酶的细胞内运输应与目的蛋白的细胞内运输重叠或部分重叠。例如，如果目的蛋白位于细胞表面上，则可以将切割它的酶外源添加至细胞。
[0327]
如果目的蛋白驻留在核内体/溶酶体系统中或穿过核内体/溶酶体系统，则可以使用针对驻留在那些区室中的酶的蛋白酶切割位点。此类蛋白酶/共有基序包括，例如，
[0328]
弗林蛋白酶：rx(k/r)r共有基序1
[0329]
弗林蛋白酶：rnrr(seq id no:39)
[0330]
pcsk1：rx(k/r)r共有基序
[0331]
pcsk5：rx(k/r)r共有基序
[0332]
pcsk6：rx(k/r)r共有基序
[0333]
pcsk7：rxxx[kr]r共有基序
[0334]
组织蛋白酶b：rrx
[0335]
颗粒酶b：i-e-p-d-x(seq id no:35)
[0336]
因子xa：ile-glu/asp-gly-arg
[0337]
肠激酶：asp-asp-asp-asp-lys(seq id no:36)
[0338]
普基酶：pro-gly-ala-ala-his-tyr(seq id no:37)
[0339]
分选酶：lpxtg/a
[0340]
切断前(prescission)蛋白酶：leu-glu-val-phe-gln-gly-pro(seq id no:38)
[0341]
凝血酶：leu-val-pro-arg-gly-ser(seq id no:40)
[0342]
tev蛋白酶：e-n-l-y-f-q-g(seq id no:41)
[0343]
弹性蛋白酶1[agsv]-x(seq id no:42)
[0344]
在一些实施例中，本文所述的核酸包括编码弗林蛋白酶切割位点的序列。在一些实施例中，本文所述的核酸包括编码表20中列出的任一弗林蛋白酶切割位点的序列。在实施例中，所述弗林蛋白酶切割位点是seq id no:39。在一些实施例中，本文所述的核酸包括编码弗林蛋白酶切割位点的序列，所述弗林蛋白酶切割位点包括seq id no:39或由其组成，例如，编码切割位点的序列包括seq id no:19或由其组成。
[0345]
在一些实施例中，本文所述的核酸包括编码选自以下的弗林蛋白酶切割位点的序列：rnrr(seq id no:39)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；rtkr(seq id no:43)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；gtgaedprpsrkrrslgdvg(seq id no:45)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；gtgaedprpsrkrr(seq id no:47)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；lqwleqqvakrrtkr(seq id no:49)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；gtgaedprpsrkrrslgg(seq id no:51)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；gtgaedprpsrkrrslg(seq id no:53)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；slnlteshnsrkkr(seq id no:55)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列；或ckingypkrgrkrr(seq id no:57)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列。
[0346]
在一些实施例中，本文所述的核酸包括编码选自以下的弗林蛋白酶切割位点的序列：rnrr(seq id no:39)；rtkr(seq id no:43)；gtgaedprpsrkrrslgdvg(seq id no:45)；gtgaedprpsrkrr(seq id no:47)；lqwleqqvakrrtkr(seq id no:49)；gtgaedprpsrkrrslgg(seq id no:51)；gtgaedprpsrkrrslg(seq id no:53)；slnlteshnsrkkr(seq id no:55)；以及ckingypkrgrkrr(seq id no:57)。
[0347]
在一些实施例中，本文所述的核酸包括编码选自以下的弗林蛋白酶切割位点的序列：rnrr(seq id no:39)或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列。在一些实施例中，本文所述的核酸包括seq id no:19或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列。在一些实施例中，本文所述的核酸包括seq id no:19。
[0348]
在一些实施例中，本文所述的核酸包括编码弗林蛋白酶切割位点的序列，所述弗林蛋白酶切割位点选自gtgaedprpsrkrrslgdvg(seq id no:45)或与其具有至少90％、
95％、97％、98％或99％同一性的序列、或gtgaedprpsrkrr(seq id no:47)或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施例中，本文所述的核酸包括seq id no:46或seq id no:48、或与其具有至少90％、95％、97％、98％、或99％同一性的序列。
[0349]
在一些实施例中，本文所述的核酸包括编码选自gtgaedprpsrkrrslgdvg(seq id no:45)或gtgaedprpsrkrr(seq id no:47)的弗林蛋白酶切割位点的序列。在一些实施例中，本文所述的核酸包括seq id no:46或seq id no:48。
[0350]
在一些实施例中，本文所述的核酸包括编码gtgaedprpsrkrrslgdvg(seq id no:45)的弗林蛋白酶切割位点的序列。
[0351]
表20.示例性弗林蛋白酶切割位点和编码他们的核酸序列。
[0352][0353]
在一些实施例中，包含例如本文所述的小基因和转基因的核酸序列可以包括一个或多个编码肽切割位点(例如，自切割肽或细胞内蛋白酶的底物)的序列。在实施例中，所述编码肽切割位点的序列设置在小基因与转基因之间。自切割肽切割位点序列的实例包括以下，其中括号中的gsg残基是任选的：
[0354]
表21.示例性自切割肽序列和编码他们的核酸序列(每个序列中的gsg序列是任选的)。
[0355]
[0356][0357]
在一些实施例中，核酸分子包括编码蛋白酶切割位点(如弗林蛋白酶切割位点)的序列和编码自切割肽(例如2a肽，例如t2a肽)的序列。在实施例中，核酸包含编码弗林蛋白酶切割位点的序列，所述弗林蛋白酶切割位点在编码2a编码序列的序列的5’。在实施例中，弗林蛋白酶切割位点包含seq id no:39或由其组成，并且t2a序列包含seq id no:59或seq id no:61或由其组成。在实施例中，编码弗林蛋白酶切割位点的序列是或包含seq id no:19，并且编码肽切割位点的序列是或包含seq id no:20或seq id no:62。在实施例中，编码2a序列的序列设置为紧接转基因的5’(例如，编码目的蛋白的序列)，使得切割后，小基因、弗林蛋白酶切割位点和/或2a肽的少于10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸留在目的蛋白上。
[0358]
启动子
[0359]
动物或人体中的所有细胞都含有相同的dna，但不同组织中的不同细胞一方面表达一组共同的基因，而另一方面表达一组根据组织类型和发育阶段而变化的基因。不受理论的束缚，不含有内含子的任何启动子可在本文所述的各个方面和实施例中(例如，在核酸分子中)使用。可用于本文描述的各个方面和实施例的示例性启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)启动子、cag启动子、sv40启动子、jet启动子、pgk启动子和鸡β-肌动蛋白启动子(cba)启动子。在实施例中，启动子在一种以上的细胞类型中具有活性。在其他实施例中，启动子在一种细胞类型(例如，细胞特异性)或在一种组织(例如，组织特异性)如例如中枢神经组织(例如，脑组织)的细胞类型中具有活性。在实施例中，启动子是神经元特异性的。可用于本文所述的各个方面和实施例的神经元特异性启动子的实例包括但不限于在载体和其他核酸中使用以驱动可操作地连接的小基因和转基因的表达的分离的或合成的神经元特异性启动子及其功能性片段，例如衍生自神经元特异性烯醇化酶(nse)的启动子(参见例如，embl hseno2，x51956)；芳香族氨基酸脱羧酶(aadc)启动子；神经丝启动子(参见例如，基因库(genbank)humnfl，l04147)；突触蛋白启动子(参见例如，基因库humsynib，m55301)；thy-1启动子(参见例如，chen等人,(1987)cell[细胞],51:7-19；llewellyn等人(2010)nat.med.[自然医学],16(10):1161-1166)；5-羟色胺受体启动子(参见例如基因库s62283)；酪氨酸羟化酶启动子(th)(参见例如，oh等人,(2009)gene ther.[基因疗法],16:437；sasaoka等人,(1992)mol.brain res.[分子脑研究],16:274；boundy等人,(1998)j.neurosci.[神经科学杂志],18:9989；和kaneda等人,(1991)neuron[神经元],6:583-594)；gnrh启动子(参见例如，radovick等人,(1991)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科
学院院刊],88:3402-3406)；l7启动子(参见例如，oberdick等人,(1990)science[科学],248:223-226)；dnmt启动子(参见例如，bartge等人,(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊],85:3648-3652)；脑啡肽启动子(参见例如，comb等人,(1988)embo j.[欧洲分子生物学学会杂志],17:3793-3805)；髓鞘碱性蛋白(mbp)启动子；ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii-α(camkim)启动子(参见例如，mayford等人,(1996)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊],93:13250；和casanova等人,(2001)genesis[遗传],31:37)；cmv增强子/血小板衍生的生长因子-p启动子(参见例如，liu等人(2004)gene ther.[基因疗法],11:52-60)；等等。在一些实施例中，使用部分或全部最小人突触蛋白1启动子(syn)。kugler等人,(2003)gene ther.[基因疗法],10(4):337-47；thiel等人,(1991)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊],88(8)3431-5；castle等人,(2016)methods mol.biol.[分子生物学方法],1382:133-49；mclean等人,(2014)neurosci.lett.[神经科学快报],576:73-78；kugler等人,(2003)virology[病毒学],311(1):89-95。
[0360]
在一些实施例中，组织或细胞特异性启动子被构建为相对于在非神经元细胞中的表达提供在神经元细胞或组织中的可操作地连接的小基因和/或转基因的更高表达。在一些实施例中，神经元特异性启动子被构建为相对于在非神经元细胞中的表达提供在神经元中的可操作地连接的小基因和/或转基因的更高表达。神经元细胞或组织的实例包括包含神经元的那些，以及雪旺氏细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞等。非神经元细胞的实例包括但不限于肝细胞、心肌细胞、红细胞、上皮细胞等。可操作地连接的小基因和/或转基因的更高水平的表达可包括由小基因和/或转基因的转录产生的rna转录物的数目的增加。在一些实施例中，产生的rna转录物的数目可以通过pcr来测量。在一些其他实施例中，产生的rna转录物的数目可以通过rt-pcr(例如，qpcr)来测量。在一些实施例中，产生的rna转录物的数目可以通过测序来测量。在一些实施例中，产生的rna转录物的数目可以通过单分子荧光原位杂交(fish)来测量。在一些实施例中，产生的rna转录物的数目可以通过rna印迹分析(northern blot analysis)来测量。当小基因和/或转基因编码目的蛋白时，可操作地连接的小基因和/或转基因的更高水平的表达可以可替代地或另外地包括产生的蛋白的量的增加。在一些实施例中，所述产生的蛋白的量可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)来测量。在一些实施例中，所述产生的蛋白的量可以通过蛋白质印迹分析来测量。在一些实施例中，所述产生的蛋白的量可以通过免疫染色来测量。在一些实施例中，所述产生的蛋白的量可以通过时间分辨福斯特共振能量转移(tr-fret)来测量。在一些实施例中，所述产生的蛋白的量可以通过免疫组织化学(ihc)来测量。在一些实施例中，表达的水平通过一种以上这些或其他方法测量。
[0361]
在多个方面和实施例中，所述启动子是包含seq id no:13的jet启动子。在多个方面和实施例中，所述启动子是包含seq id no:86的人突触蛋白启动子。
[0362]
poly a信号序列
[0363]
在各个实施例中，本文披露的核酸、载体和其他组合物可包含一种或多种多腺苷酸化(polya)信号序列。所述多腺苷酸化信号序列可以包含侧接辅助序列元件的中心序列(例如，aauaaa)。不受理论的束缚，所述序列可以发出转录物结束的信号，并充当通过多腺苷酸聚合酶在3’端添加均聚a序列的位点。
[0364]
考虑本领域已知的多腺苷酸化信号序列，包括但不限于sv40 polya、人生长激素(hgh)polya、牛生长激素(bgh)polya、β-珠蛋白polya、α-珠蛋白polya、卵清蛋白polya、κ-轻链polya、和合成polya。polya信号序列可在本文披露的核酸和其他组合物中使用。在一些实施例中，转基因或核酸序列中的polya序列由seq id no:22或其功能性片段组成。在一些实施例中，转基因或核酸序列包含与seq id no:22具有至少约80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列或其功能性片段。在一些实施例中，转基因或核酸中的polya序列由与seq id no:22具有至少约80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列或其功能性片段组成。在一些实施例中，转基因或核酸序列中的polya序列由seq id no:89或其功能性片段组成。在一些实施例中，转基因或核酸序列包含与seq id no:89具有至少约80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列或其功能性片段。在一些实施例中，转基因或核酸中的polya序列由与seq id no:89具有至少约80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列或其功能性片段组成。
[0365]
转录后调节元件
[0366]
在各个实施例中，本文披露的核酸、转基因和其他组合物可包含一种或多种转录后调节元件(pre)，例如，可以增强或以其他方式改善转基因的表达的那些。不受理论的束缚，pre可以通过使mrna稳定和3’端形成来增强表达，和/或可以促进未剪接的mrna的核质输出。pre还可包含针对rna结合蛋白(rbp)或微rna的结合位点。
[0367]
示例性pre包括但不限于来自乙型肝炎病毒(hpre)、蝙蝠病毒(bpre)、地松鼠病毒(gspre)、北极松鼠病毒(aspre)、鸭病毒(dpre)、黑猩猩病毒(cpre)、毛猴病毒(wmpre)或土拨鼠病毒(wpre)的pre。在一些实施例中，核酸或转基因包含pre。在某些实施例中，pre包含hpre。
[0368]
在一些实施例中，使用合成pre。合成pre的实例序列包括hpre-nox seq id no:88的序列或其片段。在一些实施例中，pre可以设置在启动子元件的下游(或3’)。
[0369]
示例性pre还包括但不限于包含seq id no:72或其片段(例如由其组成)的pre。示例性pre还包括但不限于包含seq id no:73或其片段(例如由其组成)的pre。
[0370][0371]
示例性pre还包括包含与本文所述的pre(例如与seq id no:88、seq id no:72或seq id no:73)具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％，至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列或由其组成。
[0372]
在一些实施例中，pre可以设置在转基因序列或蛋白编码序列的下游(或3’)。在一些实施例中，pre可以设置在polya序列的上游(或5’)。在一些实施例中，pre可以设置在转基因序列或蛋白编码序列的上游(或5’)。
[0373]
转基因
[0374]
在各个实施例中，本文披露的小基因和其他调节元件可用于调节可操作地连接的转基因的表达。在一些实施例中，所述转基因编码蛋白，如抗体或功能性结合片段、受体、酶等。在一些实施例中，所述转基因编码用于crispr的治疗性核酸，如shrna、sirna、grna等。在一些实施例中，可以使用一种以上的转基因(例如，核酸或载体可以编码一种以上提供治疗性益处的蛋白或rna)。增加细胞中这些功能性多肽或核酸的水平的方法的实例包括转染或转导编码例如在本文披露的核酸或载体(例如aav病毒载体)中的目的多肽的核酸序列。
[0375]
i.蛋白
[0376]
在各个实施例中，本文披露的小基因和其他调节元件可用于调节(例如，在剪接调节子存在或不存在的情况下，打开或关闭)多肽的表达。不受理论的束缚，增加多肽的水平可以通过提供在受试患者组织中表达减少或缺少的多肽来提供治疗性效果。不受理论的束
缚，例如通过应用或撤回剪接调节子控制表达的时机或位置，可通过确保仅在需要其时进行表达来改善这种治疗性蛋白的有效性和/或安全性。可由本文所述的小基因调节的示例性多肽包括但不限于超氧化物歧化酶，芳香酸脱羧酶(aadc)，运动神经元存活(smn)蛋白，颗粒蛋白前体(prgn)，cas9蛋白，锌指核酸酶或talen，或治疗性蛋白，如例如选自mecp2、cln2、cln3、cln4、cln5、cln6、cln7、和cln8的蛋白，或与脊髓小脑性失调(sca)相关的蛋白，任选地sca1-sca29中的任一个。
[0377]
在各个实施例中，本文披露的小基因其他调节元件可用于调节颗粒蛋白前体(pgrn)的表达。不受理论的束缚，神经元中功能性prgn多肽的水平的增加可例如在ftd的治疗中提供治疗性效果。不受理论的束缚，典型地在人中观察到pgrn作为普遍表达的88kda分泌糖蛋白。它由人颗粒蛋白基因(grn)编码。编码颗粒蛋白前体蛋白的示例性核酸包括如refseqgene定义的ng_007886.1和nm_002087.3，以及由ncbi参考序列定义的nc_000017.11和nc_000017.10。示例性颗粒蛋白前体多肽序列包括np_002078.1。在一些实施例中，颗粒蛋白前体多肽含有七个颗粒蛋白样结构域，所述七个颗粒蛋白样结构域由通过接头序列连接的罕见的12个半胱氨酰基序(seq id no:102)的高度保守的串联重复组成。
[0378]
在一些实施例中，pgrn的肽片段和编码他们的核酸在它们保留pgrn的一种或多种功能的程度上被术语pgrn涵盖。切割pgrn以形成颗粒蛋白(grn)或上皮蛋白可产生具有不同功能的蛋白，并且超出了如本文所用的pgrn的片段的含义。在一些实施例中，本文披露的核酸、载体、或其他组合物包含编码人蛋白的转基因序列。在一些实施例中，转基因序列编码pgrn。在一些实施例中，转基因序列编码人颗粒蛋白前体(hpgrn)蛋白。在一些实施例中，转基因序列编码密码子优化版本的hpgrn蛋白。在一些实施例中，转基因序列包含seq id no:87的序列或其功能性片段，例如，能够在由完整pgrn提供的一种或多种功能中提供可检测变化的片段。在一些实施例中，转基因序列包含与seq id no:87具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、或70％序列同一性(或在两者之间的任何百分比)的序列。在一些实施例中，由转基因编码的hpgrn包含seq id no:87的氨基酸序列。在一些实施例中，由异源核酸序列编码的hpgrn包含具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、或70％序列同一性的序列，包含seq id no:81的氨基酸序列。
[0379][0380]
ii.rna
[0381]
在各个实施例中，本文披露的分离的核酸、载体、和其他组合物可包含编码提供神经元组织特异性治疗性效果而不需要蛋白翻译的序列的转基因序列。在一些实施例中，本文披露的启动子、沉默子、调节元件、和其他核酸元件可用于调节rna的神经元组织或神经元特异性表达。在一些实施例中，转基因序列编码提供特定治疗性功能的核糖核酸。在一些实施例中，转基因序列编码sirna。在一些实施例中，转基因序列编码shrna。在一些实施例中，转基因序列编码mirna。在一些实施例中，转基因序列编码trna。
[0382]
iii.抗体
[0383]
在各个实施例中，本文披露的启动子、沉默子、和其他核酸元件可用于调节抗体或其片段的神经元组织或神经元特异性表达。例如，在一些实施例中，转基因序列编码抗体。在一些实施例中，转基因序列编码抗体的片段，例如，保留抗原结合能力的片段。在一些实施例中，转基因序列编码抗体的轻链。在一些实施例中，转基因序列编码抗体的重链。在一些实施例中，转基因序列编码vh。在一些实施例中，转基因序列编码v
l
。在一些实施例中，转基因序列编码vh。在一些实施例中，转基因序列编码fab。在一些实施例中，转基因序列编码scfv。在一些实施例中，转基因序列编码具有神经元特异性功能的酶。
[0384]
iii.一个以上的组分
[0385]
在各个实施例中，本文披露的启动子、沉默子、和其他调节元件可用于调节一个以上转基因的神经元组织或神经元特异性表达。在一些实施例中，所述转基因序列编码rna和多肽两者。在一些实施例中，所述转基因序列编码crispr/cas系统的组分。在一些实施例中，所述转基因序列编码cas9蛋白。在一些实施例中，所述转基因序列编码cpf1蛋白。在一些实施例中，所述转基因序列编码crispr rna(crrna)。在一些实施例中，所述转基因编码反式激活crrna(tracrna)。
[0386]
在一些实施例中，本文披露的核酸、载体、或其他组合物包含例如以从5’到3’的顺序存在的小基因(例如，如本文所述)、编码hpgrn的转基因序列、pre、和polya信号序列。在一些实施例中，所述核酸、载体、或其他组合物从5’到3’包含启动子、小基因、编码蛋白酶切割位点(例如，弗林蛋白酶切割位点)的序列、编码自切割肽(例如，t2a肽)的序列、编码hpgrn的转基因序列、pre、和polya信号序列。在一些实施例中，所述核酸、载体、或其他组合物从5’到3’包含启动子、包含seq id no:16的小基因(例如，包含seq id no:71或seq id no:94或由其组成的小基因)、编码包含seq id no:19或由其组成的弗林蛋白酶切割位点的序列、编码包含seq id no:20或由其组成的自切割t2a肽的序列、编码prgn(例如，seq id no:87)的转基因、包含seq id no:88的pre序列、和polya序列(例如，包含seq id no:89或由其组成的polya)。
[0387]
在任何上述方面和实施例中，所考虑的核酸序列可以是dna、rna、或其修饰版本。修饰的核酸可以通过对多核苷酸链的骨架的修饰与天然存在的核酸区分开来，例如肽核酸(pna)、吗啉核酸(morpholinos)、锁核酸(lna)、乙二醇核酸(gna)和苏糖核酸(tna)。修饰的核酸还可以包括具有对四个核碱基进行的修饰的类似物。在一些实施例中，这些核酸是pna。在一些实施例中，这些核酸是lna。在一些实施例中，这些核酸是吗啉核酸。在一些实施例中，这些核酸是单链形式。在一些实施例中，这些核酸是双链形式。在一些实施例中，这些核酸是线性的。在一些实施例中，这些核酸是环状的。在一些实施例中，这些核酸是质粒。
[0388]
病毒载体
[0389]
本文还披露了包含本文讨论的核酸(例如，小基因、转基因、其他核酸组分(如启动子、pre和polya)，及其组合)的载体。在一些实施例中，载体可用于将转基因递送至靶细胞和/或增加该转基因在靶细胞中的表达。在各个实施例中，所述载体可通过与剪接调节子组合使用来用于调节蛋白、抗体或功能性结合片段、酶等、和/或核酸(例如，用于crispr的shrna、sirna、grna等)的表达。
[0390]
例如，载体可包含与编码治疗性蛋白和/或rna的转基因连接的“打开开关”小基因，并且在添加剪接调节子后增加该转基因的表达。在其他实施例中，载体可包含与编码治
疗性蛋白和/或rna的转基因连接的“关闭开关”小基因，并且在添加剪接调节子后降低该转基因的表达。在一些实施例中，所述载体可包含含有插入物(例如，转基因序列的至少一个开放阅读框)和一个或多个另外的元件的dna或rna(或其混合物)序列。所述载体可用于将遗传信息转移到另一细胞。载体可用于克隆，例如，作为克隆载体或质粒。载体也可以特别地设计用于其他目的，如例如在人神经元细胞中的细胞感染，以驱动表达例如治疗性蛋白和/或rna表达。在一些实施例中，考虑了包含本文披露的核酸的载体。这些载体可以是dna载体、环状载体或质粒。在一些实施例中，所述载体是双链的。在其他实施例中，所述载体是单链的。
[0391]
在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述载体是用于将一个或多个转基因序列递送至神经元细胞或组织的病毒载体。用于载体的病毒的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、和其他杂合病毒。在一些实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒(aav)载体、嵌合aav载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、dna病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、或其任何突变体或衍生物。
[0392]
不受理论的束缚，本文披露的病毒载体可以将他们的基因组插入他们感染的宿主细胞中，从而将其核酸序列递送至宿主。插入的病毒基因组可以是附加体(episomal)或可以在可以是随机或靶向的位点处整合到宿主细胞的染色体中。在实施例中，所述载体是用于将转基因序列递送至细胞的病毒载体。用于载体的病毒的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、和其他杂合病毒。warnock等人,(2011)methods mol.biol.[分子生物学方法],737:1-25。慢病毒是逆转录病毒属，其可以将大量病毒dna整合到宿主细胞中，使它们成为基因递送的高效方法。另一方面，腺病毒引入未整合到宿主细胞的染色体中的遗传物质，从而降低破坏宿主细胞的风险。在一些实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒(aav)载体、嵌合aav载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、dna病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、或其任何突变体或衍生物。
[0393]
在一些实施例中，包含所述转基因的载体是或衍生自腺相关病毒(aav)。在一些实施例中，所述载体是重组腺相关病毒载体(raav)。raav基因组可以包含一个或多个侧接小基因和转基因序列的aav itr，所述小基因和转基因序列编码多肽(包括但不限于hpgrn多肽)或编码针对突变蛋白或他们的基因的控制序列的sirna、shrna、反义和/或mirna。所述小基因和转基因序列可操作地连接，并且可以通过编码一个或多个蛋白酶切割位点的序列或编码一个或多个自切割肽的序列或其组合连接。在实施例中，这些载体另外地包含其他转录控制元件，如本文披露的那些，例如在靶细胞中具有驱动转基因序列的表达的功能的启动子、增强子、pre、和/或polya序列。所述转基因序列还可包括内含子序列，以在哺乳动物细胞中表达时促进rna转录物的加工。
[0394]
在各个实施例中，所述aav载体(例如，raav载体)是自互补aav载体(scaav)。如本文所用，“自互补”意指编码区已设计为例如在一个或多个反向末端重复(itr)中形成分子内双链模板。不受理论的束缚，针对aav基因组的限速步骤通常涉及第二链合成，因为典型的aav基因组是单链的dna模板。ferrari等人,(1996)j.virology[病毒学杂志],70(5):3227-34；fisher等人,(1996)j.virology[病毒学杂志],70(1):520-32。然而，对于scaav基因组，在感染后，scaav的互补的两半可能结合形成可立即用于复制和转录的一个双链dna(dsdna)单元，而不是等待细胞介导的第二链的合成。在一些实施例中，本文披露的raav载
体是scaav载体并且提供更快和/或增加的表达。
[0395]
在一些实施例中，本文披露的raav载体缺乏一个或多个(例如，所有)aav rep和/或cap基因。aav载体可以(例如，在其itr中)包含来自任何适合的aav血清型的核酸序列(例如，dna)。适合的aav血清型包括但不限于aav血清型aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10、aav-11、aav-12、aavrh8、aavrh10、aav.anc80、aav.anc80l65、aav-dj、和aav-dj/8、aavrh37、aav-dj、aav-dj/8、aav-php.b、aav-php.b2、aav-php.b3、aav-php.a、aav-php.eb、和aav-php.s。例如，aav载体(例如，scaav载体)可以包含来自aav2的核酸序列，例如来自aav2的itr序列。aav载体(例如，scaav载体)还可包含来自一种以上血清型的核酸。aav血清型的基因组的核苷酸序列为本领域已知的。例如，aav1的完整基因组在基因库登录号nc_002077中提供；aav2的完整基因组在基因库登录号nc 001401和srivastava等人,virol.[病毒学],45:555-564{1983)中提供；aav3的完整基因组在基因库登录号nc_1829中提供；aav4的完整基因组在基因库登录号nc_001829中提供；aav5基因组在基因库登录号af085716中提供；aav-6的完整基因组在基因库登录号nc_00 1862中提供；至少部分aav7和aav8基因组分别在基因库登录号ax753246和ax753249中提供；aav9基因组在gao等人,j.virol.[病毒学杂志],78:6381-6388(2004)中提供；aav10基因组在williams,(2006)mol.ther.[分子疗法],13(1):67-76中提供；并且aav11基因组在mori等人,(2004)virology[病毒学],330(2):375-383中提供。
[0396]
在一些实施例中，功能性反向末端重复(itr)序列可用于支持例如aav病毒粒子的拯救、复制和包装。因此，本文披露的aav载体可包括用于实现病毒的复制及封装的呈顺式(例如功能性itr)的序列。这些itr可以但无需为野生型核苷酸序列且可变化，例如通过核苷酸的插入、缺失或取代，只要这些序列实现功能性拯救、复制及封装即可。这些itr可来自能够衍生重组病毒的任何aav血清型，包括但不限于aav血清型aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10和aav-11。aav血清型的基因组的核苷酸序列为本领域已知的。例如，aav-1的完整基因组在基因库登录号nc_002077中提供；aav-2的完整基因组在基因库登录号nc 001401和srivastava等人,virol.[病毒学],45:555-564{1983)中提供；aav-3的完整基因组在基因库登录号nc_1829中提供；aav-4的完整基因组在基因库登录号nc_001829中提供；aav-5基因组在基因库登录号af085716中提供；aav-6的完整基因组在基因库登录号nc_00 1862中提供；至少部分aav-7和aav-8基因组分别在基因库登录号ax753246和ax753249中提供；aav-9基因组在gao等人,(2004)j.virol.[病毒学杂志],78:6381-6388中提供；aav-10基因组在williams,(2006)mol.ther.[分子疗法],13(1):67-76中提供；并且aav-11基因组在mori等人,(2004)virology[病毒学],330(2):375-383中提供。在一个实施例中，所述载体为aav-9载体，具有aav-2衍生的itr。
[0397]
在一些实施例中，本文披露的raav载体包含一个或多个itr，例如两个itr，一个在转基因(例如，编码hpgrn)和/或上文讨论的其他核酸元件的上游并且另一个在其下游。在一些实施例中，本文披露的核酸(例如，在scaav载体中)包含设置在启动子、小基因、转基因、转录后调节元件和/或polya的5’的第一itr和设置在其3’的第二itr，例如，其中这些itr独立地是在其他元件的5’和/或3’的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、150、200、250个核苷酸。itr序列可以是野生型的，或者它可以包含一个或多个突变，例如，只要它保留野生型itr的一个或多个功能即可。在一些实施例中，野生型
itr可以被修饰以包含末端解析位点的缺失。在一些实施例中，如本文披露的scaav可以包含两个itr序列，其中两个都是野生型、变体、或经修饰的aav itr序列。在一些实施例中，至少一个itr序列为野生型、变体或经修饰的aav itr序列。在一些实施例中，所述两个itr序列均为野生型、变体或经修饰的aav itr序列。在一些实施例中，“左侧”或5
’‑
itr为经修饰的aav itr序列，其实现自互补基因组的产生，且“右侧”或3
’‑
itr为野生型aav itr序列。在一些实施例中，“右侧”或3
’‑
itr为经修饰的aav itr序列，其实现自互补基因组的产生，且“左侧”或5
’‑
itr为野生型aav itr序列。在一些实施例中，这些itr序列为野生型、变体、或经修饰的aav2 itr序列。在一些实施例中，至少一个itr序列为野生型、变体或修饰aav2 itr序列。在一些实施例中，所述两个itr序列均为野生型、变体或经修饰的aav2 itr序列。在一些实施例中，“左侧”或5
’‑
itr为经修饰的aav2 itr序列，其实现自互补基因组的产生，且“右侧”或3
’‑
itr为野生型aav2 itr序列。在一些实施例中，“右侧”或3
’‑
itr为经修饰的aav2 itr序列，其实现自互补基因组的产生，且“左侧”或5
’‑
itr为野生型aav2 itr序列。本文描述了可用于一个或多个itr的示例性序列。在一些实施例中，所述aav载体包含seq id no:12和seq id no:23。在一些实施例中，所述aav载体包含seq id no:85和seq id no:90。wo/2019/094253(pct/us2018/058744)(将其通过引用以其全文并入本文)中提供的aav itr的实施例也可用于本文披露的任何aav itr。
[0398]
在各个实施例中，本文披露的载体可包含小基因和编码本文披露的hpgrn的核酸序列。在一些实施例中，剪接调节子的添加增加了靶细胞中功能性prgn多肽的表达。在其他实施例中，剪接调节子的添加降低了靶细胞中功能性prgn多肽的表达。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，包含编码hpgrn的转基因的载体是或衍生自aav。在一些实施例中，所述载体是raav。在各个实施例中，包含编码本文披露的hpgrn的转基因的aav载体(例如raav载体)是scaav。raav基因组可包含一个或多个侧接编码hpgrn的转基因序列的aav itr。所述转基因序列可以与转录控制元件可操作地连接，所述转录控制元件如本文披露的那些，例如在靶细胞中具有驱动转基因序列的表达的功能的启动子、增强子、pre、和/或polya序列。
[0399]
在一些实施例中，所述raav载体缺乏一个或多个(例如，所有)aav rep和/或cap基因。aav载体可以(例如，在其itr中)包含来自任何适合的aav血清型的核酸序列(例如，dna)。适合的aav血清型包括但不限于aav血清型aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10和aav-11。例如，aav载体(例如，scaav载体)可以包含来自aav-2的核酸序列，例如来自aav-2的itr序列。aav载体(例如，scaav载体)还可包含来自一种以上血清型的核酸。基因库登录号nc 001401和srivastava等人,virol.[病毒学],45；555-564{1983)；基因库登录号nc_1829；基因库登录号nc_001829；基因库登录号af085716；基因库登录号nc_00 1862；基因库登录号ax753246和ax753249；gao等人,j.virol.[病毒学杂志],78:6381-6388(2004)；williams,(2006)mol.ther.[分子疗法],13(1):67-76；以及moris等人,(2004)virology[病毒学],330(2):375-383。
[0400]
在一些实施例中，在本文披露的包含编码hpgrn的转基因的病毒载体中的功能性反向末端重复(itr)序列可用于支持例如aav病毒粒子的拯救、复制和包装。因此，本文披露的aav载体可包括用于实现病毒的复制及封装的呈顺式(例如功能性itr)的序列。这些itr无需为野生型核苷酸序列且可变化，例如通过核苷酸的插入、缺失或取代，只要这些序列实
现功能性拯救、复制及封装即可。这些itr可来自能够衍生重组病毒的任何aav血清型，包括但不限于aav血清型aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10和aav-11。基因库登录号nc_002077；基因库登录号nc 001401和srivastava等人,virol.[病毒学],45；555-564{1983)；基因库登录号nc_1829；基因库登录号nc_001829；基因库登录号af085716；基因库登录号nc_00 1862；基因库登录号分别为ax753246和ax753249；gao等人,(2004)j.virol.[病毒学杂志],78:6381-6388；williams,(2006)mol.ther.[分子疗法],13(1):67-76；以及moris等人,(2004)virology[病毒学],330(2):375-383。在一个实施例中，所述载体为aav-9载体，具有aav-2衍生的itr。
[0401]
在一些实施例中，所述aav病毒载体包含seq id no:91的序列。在一些实施例中，所述aav病毒载体包含seq id no:11的序列。在这些实施例的每一个实施例中，所述转基因序列可以被编码可替代的目的分子的序列替代，例如，如本文所述。
[0402]
在一些实施例中，本文披露的载体或核酸序列形成克隆载体或表达载体。在此类实施例中，所述载体可包含促进所述载体的复制或维持的其他组分。在一些实施例中，所述载体进一步包含针对克隆选择的可选择标记。在一些实施例中，所述载体中的可选择标记包含原核或真核抗生素抗性基因。在一些实施例中，所述载体中的可选择标记包含卡那霉素抗性基因。在一些实施例中，所述载体中的可选择标记包含氨苄西林抗性基因。在一些实施例中，所述载体进一步包含嘌呤霉素抗性基因。在一些实施例中，所述载体中的可选择标记包含潮霉素抗性基因。在一些实施例中，所述载体(例如，质粒)包含seq id no:92的核酸序列。
[0403]
包含小基因和编码egfp的转基因的示例性aav载体序列：
[0404][0405]
表2和表3描述了所述核酸、载体、和小基因的示例性序列。
[0406]
表2.示例性小基因和具有snx7衍生的小基因的aav载体序列。
[0407]
[0408]
[0409]
[0410][0411]
表3.示例性组分、以及编码包含小基因和编码人颗粒蛋白前体的转基因的单链aav的质粒的序列
[0412]
[0413]
[0414]
[0415]
[0416]
[0417]
[0418]
[0419]
[0420]
[0421]
[0422]
[0423]
[0424]
[0425][0426]
在各个实施例中，本文披露的小基因或载体可用于对剪接调节子的存在或不存在进行应答而增加功能性多肽的水平，例如hpgrn的水平。在一些实施例中，与在剪接调节子不存在的情况下相同载体的表达相比，本文披露的载体在所述剪接调节子存在的情况下表现出更高的转基因序列的表达。在一些实施例中，在剪接调节子存在的情况下目的分子的表达水平高于在剪接调节子不存在的情况下目的分子的表达水平，例如，高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100倍。在一些实施例中，在剪接调节子不存在的情况下目的分子的表达水平高于在剪接调节子存在的情况下目的分子的表达水平，例如，高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100倍。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过所述转基因序列的rna转录物的数目的增加来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过pcr来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过rt-pcr来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过qpcr来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过qrt-pcr来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过测序来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过rna印迹分析来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过单分子荧光原位杂交(fish)来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过由产生的转基因编码的蛋白的量的增加来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的
增加通过酶联免疫吸附测定(elisa)来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过蛋白质印迹分析来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过免疫染色来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过一种以上的上列方法来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过包括第二外显子的mrna的量来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过包括直接的第一外显子至第三外显子剪接的mrna的量来测量。在剪接调节子存在或不存在的情况下，从并入打开开关小基因或关闭开关小基因的载体产生的示例性多肽描绘在图3中(在每种情况下，在所述蛋白酶切割位点和/或自切割肽序列切割之前)。
[0427]
重组病毒
[0428]
在各个实施例中，本文讨论的核酸和载体可以存在于一种或多种病毒颗粒(如重组病毒颗粒)中。重组病毒是通过重组方式生成的病毒。可以使用各种不同的病毒类型，例如，逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、aav、鼠白血病病毒等。不受理论的束缚，从逆转录病毒(如慢病毒)递送的载体可以提供长期基因转移，因为他们允许转基因长期稳定的整合及其在子细胞中的增殖，并且也可能提供低免疫原性。其他适合的逆转录病毒包括γ逆转录病毒。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(mlv)、形成脾脏病灶病毒(sffv)、和骨髓增生性肉瘤病毒(mpsv)、以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如tobias maetzig等人,“gammaretroviral vectors:biology,technology and application[γ逆转录病毒载体：生物学/技术和应用]”viruses[病毒].2011年6月；3(6):677-713。在一些实施例中，所述病毒是包含本文披露的核酸或载体的重组腺病毒。在一些实施例中，所述病毒是包含本文披露的核酸或载体的重组aav。
[0429]
在一些实施例中，本文披露的核酸或载体用于制造重组病毒。在一些实施例中，本文披露的核酸或载体用于制造raav。因此，在各个实施例中，本文还披露了病毒组合物(也称为病毒粒子)，例如，包含上文披露的病毒载体或核酸的raav病毒组合物。在一些实施例中，所述重组病毒是腺相关病毒(aav)或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，所述重组病毒是嵌合aav或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，所述重组病毒是腺病毒或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，所述重组病毒是逆转录病毒或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，所述重组病毒是慢病毒或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，所述重组病毒是dna病毒或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，所述重组病毒是单纯疱疹病毒或其任何突变体或衍生物。在一些实施例中，所述重组病毒是杆状病毒或其任何突变体或衍生物。
[0430]
在一些实施例中，本文披露的aav可以包含一种或多种aav衣壳蛋白。aav衣壳蛋白可以来自能够衍生重组病毒的任何aav血清型，包括但不限于aav血清型aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10、aav-11、aav-12、aavrh8、aavfh10、aav-dj、aav-dj/8、aav-php.b、aav-php.b2、aav-php.b3、aav-php.a、aav-php.eb、和aav-php.s。在一些实施例中，aav中的一种或多种衣壳蛋白来自aav-9。不受理论的束缚，典型地在aav中，三种衣壳蛋白vp1、vp2和vp3多聚化以形成衣壳。这些衣壳蛋白的多肽序列是本领域已知的，并且也可衍生自所述aav的基因组。这些可用作本文披露的aav病毒组合物中的示例性衣壳。例如，aav-1的完整基因组在基因库登录号nc_002077中提供；aav-2的完整基因组在基因库登录号nc 001401和srivastava等人,virol.[病毒学],45:555-564{1983)中
提供；aav-3的完整基因组在基因库登录号nc_1829中提供；aav-4的完整基因组在基因库登录号nc_001829中提供；aav-5基因组在基因库登录号af085716中提供；aav-6的完整基因组在基因库登录号nc_00 1862中提供；至少部分aav-7和aav-8基因组分别在基因库登录号ax753246和ax753249中提供；aav-9基因组在gao等人,j.virol.[病毒学杂志],78:6381-6388(2004)中提供；aav-10基因组在williams,(2006)mol.ther.[分子疗法],13(1):67-76中提供；并且aav-11基因组在mori等人,(2004)virology[病毒学],330(2):375-383中提供。衣壳蛋白aav-php.b、aav-php.b2、aav-php.b3、aav-php.a、aav-php.eb、或aav-php.s在deverman等人,(2016)nat.biotech.[自然生物技术],34:204-209和chan等人,(2017)nat.neurosci.[自然神经科学],20:1172-1179中提供。在一些实施例中，所述重组病毒是包含一种或多种aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、和aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj、aav-dj/8、aav-php.b、aav-php.b2、aav-php.b3、aav-php.a、aav-php.eb、或aav-php.s衣壳血清型或其功能变体的aav。在一些实施例中，所述重组病毒是包含来自一种以上的aav血清型的衣壳的组合的aav。
[0431]
在一些实施例中，本文披露的aav组合物包含指导病毒dna复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的一种或多种顺式作用序列，这些序列包含在itr内。在一些实施例中，这些序列中的一个或多个也可以例如在宿主细胞中的病毒制造过程期间在单独的质粒上以反式而不是顺式存在。典型地，三种aav启动子(针对其相对应图定位命名为p5、p19及p40)驱动野生型病毒中编码两个aav内部开放阅读框的rep及cap基因的表达。在一些实施例中，一个或多个这些启动子和/或开放阅读框顺式存在于本文披露的aav载体和/或aav病毒粒子中，或例如在产生病毒的宿主细胞中在aav病毒制造过程中存在于单独的质粒上。两个rep启动子(p5及p19)与单个aav内含子的差异性剪接(在核苷酸2107及2227处)偶联可引起自rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52及rep 40)。rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多种酶学特性。所述cap基因典型地由p40启动子表达，且其编码三种衣壳蛋白vp1、vp2及vp3。可变剪接及非共有翻译起始位点负责产生三种相关衣壳蛋白。单个共有多腺苷酸化位点位于aav基因组的图位置95处。aav的生命周期和遗传学在muzyczka,(1992)curr.topics microbiol.imm.[微生物学和免疫学的当前主题],158:97-129中进行了综述。
[0432]
在一些实施例中，在本文披露的aav中使用的aav衣壳蛋白vp1、vp2、vp3由以下序列编码或包含以下序列：
[0433]
vp1核酸(seq id no:74)：
[0434][0435]
vp2核酸(seq id no:75)：
[0436][0437]
vp3核酸(seq id no:76)：
[0438][0439]
vp1蛋白(seq id no:77)：
[0440][0441]
vp2蛋白(seq id no:78)：
[0442][0443]
vp3蛋白(seq id no:79)：
[0444][0445]
在一个实施例中，所述重组病毒是包含aav9衣壳血清型或其任何突变体或衍生物的aav。在一些实施例中，所述重组病毒包含aav9衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。在一些实施例中，所述重组病毒是scaav。
[0446]
在一些实施例中，重组病毒可以用来增加特定细胞类型中的功能性多肽的水平。在一些实施例中，与在不同组织类型中相同病毒的表达相比，本文披露的病毒在特定组织类型中表现出更高的转基因序列的表达。在一些实施例中，与在非神经元组织、流体或细胞
中相同病毒的表达相比，病毒在神经元组织、流体或细胞中表现出更高的转基因序列的表达。在一些实施例中，与在剪接调节子不存在的情况下相同载体的表达相比，本文披露的载体在所述剪接调节子存在的情况下表现出更高的转基因序列的表达。在一些实施例中，在剪接调节子存在的情况下来自重组病毒的目的分子的表达水平高于在剪接调节子不存在的情况下来自重组病毒的目的分子的表达水平，例如，高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100倍。在一些实施例中，在剪接调节子不存在的情况下来自重组病毒的目的分子的表达水平高于在剪接调节子存在的情况下来自重组病毒的目的分子的表达水平，例如，高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100倍。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过所述转基因序列的rna转录物的数目的增加来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过pcr来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过rt-pcr来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过qpcr来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过qrt-pcr来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过测序来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过rna印迹分析来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过单分子荧光原位杂交(fish)来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过由产生的转基因编码的蛋白的量的增加来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过酶联免疫吸附测定(elisa)来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过蛋白质印迹分析来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过免疫染色来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过一种以上的上列方法来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过包括第二外显子的mrna的量来测量。在一些实施例中，所述转基因序列的表达的增加通过包括直接的第一外显子至第三外显子剪接的mrna的量来测量。在剪接调节子存在或不存在的情况下，从并入打开开关小基因或关闭开关小基因的载体产生的示例性多肽描绘在图3中(在每种情况下，在所述蛋白酶切割位点和/或自切割肽序列切割之前)。预期一旦包含蛋白酶切割位点和/或自切割肽序列的多肽，一个或多个序列被切割，从而产生目的蛋白而没有衍生自所述小基因或切割序列的异源序列(或少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个其氨基酸)。
[0447]
在各个实施例中，本披露的这些靶细胞可以是任何哺乳动物细胞类型。在本披露的一些方面，这些核酸和载体调节在神经元组织或流体或细胞中的表达。在一些实施例中，所述神经元组织是脑。在一些实施例中，所述神经元组织是脑的额叶。在一些实施例中，所述神经元组织是脑的颞叶。在一些实施例中，所述神经元组织是中枢神经系统。在一些实施例中，所述神经元组织是脊髓。在一些实施例中，所述神经元细胞是人神经元细胞。在一些实施例中，所述神经元细胞是神经元。在一些实施例中，所述神经元细胞是星形胶质细胞。在一些实施例中，所述神经元流体是脑脊液。在一些实施例中，非神经元组织是肝。在一些实施例中，所述非神经元流体是血浆。在一些实施例中，非神经元细胞是肝细胞。在一些实施例中，非神经元细胞是星状脂肪储存细胞。在一些实施例中，非神经元细胞是库普弗细胞。在一些实施例中，非神经元细胞是肝内皮细胞。在一些实施例中，所述非神经元流体是血浆。在一些实施例中，所述非神经元流体是血清。在一些实施例中，所述非神经元流体是血液。
[0448]
产生重组病毒的方法
4666)。然后用辅助病毒(如腺病毒)和/或编码辅助病毒的质粒感染包装细胞系。此方法的优点是，细胞是可选择的，并且适合raav的大规模生产。适合的方法的其他实例采用了腺病毒或杆状病毒而不是质粒来将raav载体和/或rep和cap基因引入包装细胞中。
[0452]
在一些实施例中，产生重组病毒的方法包括提供待包装的核酸。在一些实施例中，所述核酸是质粒。在其他实施例中，所述核酸包含插入在第一aav末端重复与第二aav末端重复之间的转基因序列。在一些实施例中，所述转基因编码人颗粒蛋白前体(hpgrn)。在一些实施例中，所述产生重组病毒的方法包括提供一个或多个另外的核酸。在一些实施例中，所述一个或多个另外的核酸包含aav rep基因和/或aav cap基因。在一些实施例中，所述一个或多个另外的核酸包含衍生自aav血清型1、aav血清型2、aav血清型3、aav血清型4、aav血清型5、aav血清型6、aav血清型7、aav血清型8、或aav血清型9的aav rep基因。在一些实施例中，所述一个或多个另外的核酸包含衍生自aav血清型1、aav血清型2、aav血清型3、aav血清型4、aav血清型5、aav血清型6、aav血清型7、aav血清型8、或aav血清型9的aav cap基因。在一些实施例中，所述一个或多个另外的核酸包含一个或多个腺病毒辅助功能基因。
[0453]
在一些实施例中，将这些核酸共转染到感受态细胞或包装细胞中。共转染的方法是本领域已知的，并且包括但不限于通过脂质体转染、电穿孔、和聚乙烯亚胺进行的转染。感受态细胞或包装细胞可以是悬浮培养的非贴壁细胞或贴壁细胞。在一个实施例中，可以使用任何适合的包装细胞系，如海拉细胞(hela cell)、hek 293细胞和perc.6细胞(同源293系)。在一个实施例中，这些包装细胞是人细胞。在一个实施例中，这些包装细胞是hek 293细胞。在一个实施例中，这些包装细胞是昆虫细胞。在一个实施例中，这些包装细胞是sf9细胞。在一些实施例中，所述方法包括培养转染的细胞以产生重组病毒。在一些实施例中，所述方法包括回收重组病毒。回收重组病毒的方法包括例如在美国专利号6,143,548和美国专利号9,408,904中披露的那些。在一些实施例中，重组病毒分泌到细胞培养基中并从所述培养基中纯化。在一些实施例中，裂解包装细胞并纯化内容物以回收重组病毒。在一些实施例中，通过过滤或离心从包装细胞中回收病毒。在一些实施例中，通过色谱法从包装细胞中回收病毒。
[0454]
在各个实施例中，本文披露了包含本文披露的核酸的细胞、包含本文披露的载体的细胞、或包含本文披露的病毒的细胞。包含本文披露的核酸的细胞、包含本文披露的载体的细胞、或包含本文披露的病毒的细胞可以是人细胞。包含本文披露的核酸的细胞、包含本文披露的载体的细胞、或包含本文披露的病毒的细胞可以是昆虫细胞。在一些实施例中，包含本文披露的核酸的细胞、包含本文披露的载体的细胞、或包含本文披露的病毒的细胞是hek293细胞。在一些其他实施例中，包含本文披露的核酸的细胞、包含本文披露的载体的细胞、或包含本文披露的病毒的细胞是sf9细胞。
[0455]
在一些实施例中，所述产生重组病毒的方法包括转染昆虫细胞。在一些实施例中，所述方法包括用包含如本文披露的核酸的杆状病毒转染昆虫细胞。在一些实施例中，所述方法包括用包含以下核酸的杆状病毒转染昆虫细胞，所述核酸包含插入在第一aav末端重复与第二aav末端重复之间的转基因序列。在一些实施例中，所述方法包括用包含一个或多个另外的核酸的杆状病毒转染昆虫细胞。在一些实施例中，所述一个或多个另外的核酸包含aav rep基因和/或aav cap基因。在一些实施例中，所述一个或多个另外的核酸包含衍生自aav血清型1、aav血清型2、aav血清型3、aav血清型4、aav血清型5、aav血清型6、aav血清型
7、aav血清型8、或aav血清型9的aav rep基因。在一些实施例中，所述一个或多个另外的核酸包含衍生自aav血清型1、aav血清型2、aav血清型3、aav血清型4、aav血清型5、aav血清型6、aav血清型7、aav血清型8、或aav血清型9.c的aav cap基因。在一些实施例中，所述一个或多个另外的核酸包含一个或多个腺病毒辅助功能基因。在一些实施例中，在适合产生重组病毒的条件下培养昆虫细胞。在一些实施例中，从昆虫细胞中回收病毒。在一些实施例中，通过过滤或离心从昆虫细胞中回收病毒。在一些实施例中，通过色谱法从昆虫细胞中回收病毒。
[0456]
药物组合物
[0457]
在各个实施例中，披露了药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包含本文披露的一个或多个核酸、载体和/或病毒。在一些实施例中，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂。
[0458]
可配制如本披露所述的核酸、载体、和/或重组病毒(例如，病毒颗粒)以制备药学上有用的组合物。示例性配制品包括例如在美国专利号9,051,542和美国专利号6,703,237中披露的那些，将这些专利通过引用以其全文并入。可配制本披露的这些组合物用于向哺乳动物受试者(例如，人)施用。在一些实施例中，可配制递送系统用于肌内、皮内、粘膜、皮下、静脉内、鞘内、可注射贮库型装置、或局部施用。
[0459]
在一些实施例中，当所述递送系统配制为溶液或悬浮液时，所述递送系统在可接受的载剂(例如，水性载剂)中。可以使用多种水性载剂，例如，水、缓冲水、0.8％生理盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可经灭菌和/或无菌过滤。可以将所得水性溶液直接包装使用或冻干。在一些实施例中，将冻干制剂在施用前与无菌溶液组合。
[0460]
在一些实施例中，这些组合物(例如，药物组合物)可含有药学上可接受的助剂物质以模拟生理学条件，如ph值调节剂及缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸脱水山梨糖醇酯、油酸三乙醇胺等。在一些实施例中，所述药物组合物包含防腐剂。在一些其他实施例中，所述药物组合物不包含防腐剂。
[0461]
使用和治疗方法
[0462]
不受理论的束缚，本文所述的核酸和其他实施例在有条件地表达目的分子(例如，蛋白)的方法中使用，所述方法包括：使表达系统(例如包含本文所述的核酸分子、本文所述的载体或本文所述的重组病毒的细胞)与剪接调节子(例如，lmi070)接触，其中：a)在所述剪接调节子存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子不存在的情况下所述目的蛋白的表达水平增加，例如高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、或100倍；并且b)在所述剪接调节子不存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子存在的情况下所述目的蛋白的表达水平大幅降低，例如低2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍。
[0463]
在实施例中，本文所述的核酸和其他实施例在有条件地表达目的蛋白的方法中使用，所述方法包括：使表达系统(例如包含本文所述的核酸分子、本文所述的载体或本文所述的重组病毒的细胞)与剪接调节子(例如，lmi070)接触，其中：a)在所述剪接调节子不存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子存在的情况下所述目的蛋白的表达水平增加，例如高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍；并且b)在所述剪接调节子存在的情况下，所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子不存在的情况下所述目的蛋白的表达水平大幅降低，例如低2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍。
[0464]
在实施例中，提供了一种治疗需要基因疗法的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的核酸分子、本文所述的载体、本文所述的重组病毒、或本文所述的药物组合物。在实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用剪接调节子。在实施例中，所述剪接调节子定期施用(例如，持续一段时间，由不施用的次数隔开)。在实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用以下量的剪接调节子(例如，lmi070)，所述量有效引起所述目的蛋白的表达相对于在所述剪接调节子不存在的情况下所述目的蛋白的表达水平增加或降低至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍。
[0465]
不受理论的束缚，编码神经元特异性蛋白(如颗粒蛋白前体)的基因中的突变可能与神经退行性疾病有关。在一些实施例中，可以施用本文披露的核酸、载体、和病毒以增加野生型基因的神经元特异性表达，所述野生型基因的丢失与神经退行性疾病有关。例如，施用可用于增加功能性颗粒蛋白前体多肽的水平。与剪接调节子的联合治疗允许控制(调节)表达水平。在一些实施例中，施用本文披露的核酸、载体、和/或病毒可用于治疗、预防、延迟、减缓疾病，例如像额颞叶痴呆。在一些实施例中，本文披露的核酸、载体、和病毒连同剪接调节子一起使用以调节转基因的表达。
[0466]
如本文所用，“额颞叶痴呆”(ftd)是主要影响脑的额叶和颞叶(这些区域通常与性格、行为和语言相关)的多种障碍的总称。ftd典型地由脑的额颞叶区的退化驱动。在额颞叶痴呆中，这些叶的部分收缩(萎缩)。体征和症状根据受影响的脑的部分可能不同。额颞叶痴呆最常见的体征和症状涉及行为和性格的极端变化。这些包括越来越不适当的活动、失去同理心和其他人际交往能力、缺乏判断力和抑制力、冷漠、重复的强迫行为、个人卫生下降、饮食习惯改变(主要是暴饮暴食、口腔探索和食用不可食用的物品)、以及缺乏对思想或行为变化的认识。较罕见的ftd亚型的特征是运动问题，类似于与帕金森病或肌萎缩侧索硬化相关的那些。自从发现几种基因突变可同时引起ftd和肌萎缩侧索硬化(als)以来，越来越多的人认识到ftd和als共有神经退行性通路，并且可能是共同谱的一部分。颗粒蛋白前体基因(grn)突变最近被鉴定为ftd的主要病因，大多数突变导致功能性hpgrn多肽丢失。babykumari等人,(2017)brain[脑],140(12):3081-3104；baker等人,(2006)nature[自然],442:916-19；cruts等人,(2006)nature[自然],442:920-4；gaweda-walerych等人,(2018)neurobiol.aging[神经生物学老化],72:186.e9-186.e12；galimerti等人,(2018)expert opin.ther.targets[关于治疗靶标的专家意见],22(7):579-585；wauters等人,(2018)neurobiol.aging[神经生物学老化],67:84-94；和mendez,(2018)neuropsychiatr.dis.treat.[神经精神疾病和治疗],26:14:657-662。用于检测pgrn中的突变的方法包括例如wo 2008/019187中披露的那些。
[0467]
在各个实施例中，本文披露的核酸、载体、和/或病毒可在治疗由编码颗粒蛋白前体的基因中的一个或多个突变引起的障碍的方法中使用。在一个实施例中，术语“治疗”包括向有需要的动物(包括人类)施用有效剂量或有效多剂量的组合物的步骤，该组合物包含如本文披露的核酸、载体、重组病毒、或药物组合物。如果在障碍/疾病发展前施用所述剂量，则所述施用是预防性的。若在障碍/疾病发展之后施用所述剂量，则所述施用是治疗性的。在实施例中，有效剂量为可检测地缓解(消除或减少)至少一种与所治疗的障碍/疾病病况相关的症状的剂量、减缓或防止进展至障碍/疾病病况的剂量、减缓或防止障碍/疾病病况进展的剂量、减轻疾病程度的剂量、引起疾病缓解(部分或全部)的剂量、和/或延长存活
期的剂量。所述术语涵盖但不要求完全治疗(即，治愈)和/或预防。在一些实施例中，有效剂量包含1x10
10
至1x10
15
个载体基因组/毫升(vg/ml)如本文披露的病毒。在一些实施例中，有效剂量包含1x106至1x10
10
个空斑形成单位/毫升(pfu/ml)如本文披露的病毒。在一些实施例中，有效剂量包含1x106至1x109个转导单位/毫升(tu/ml)如本文披露的病毒。本文中阐述了预期治疗的疾病病况的实例。
[0468]
在一些实施例中，所述编码颗粒蛋白前体的基因中的突变是缺失突变。在一些实施例中，所述编码颗粒蛋白前体的基因中的突变是无效突变。在一些实施例中，所述编码颗粒蛋白前体的基因中的突变是插入缺失。在一些实施例中，所述编码颗粒蛋白前体的基因中的突变是功能丢失突变。在一些实施例中，所述编码颗粒蛋白前体的基因中的突变是敲除突变。在一些实施例中，所述编码颗粒蛋白前体的基因中的突变导致所述颗粒蛋白前体蛋白的表达和/或功能的丧失。在一些实施例中，需要用本文披露的核酸、载体、和/或病毒治疗的患者通过在施用前针对颗粒蛋白前体突变进行筛选来鉴定。在一些实施例中，筛选包括从受试者获得细胞或组织的样品并对样品中的一个或多个基因座进行测序或基因分型以检查颗粒蛋白前体突变的存在。在一些实施例中，所述筛选在来自样品的遗传物质上进行，所述样品如(但不限于)唾液、血液、和/或皮肤细胞。
[0469]
在一些实施例中，治疗方法包括向有需要的受试者递送治疗有效量的本文披露的核酸。在一些实施例中，治疗方法包括向有需要的受试者递送治疗有效量的本文披露的载体。在一些实施例中，治疗方法包括向有需要的受试者递送治疗有效量的本文披露的重组病毒。在一些实施例中，治疗方法包括向有需要的受试者递送治疗有效量的本文披露的药物组合物。在一些实施例中，所述障碍是神经退行性障碍。在一些实施例中，所述障碍是额颞叶痴呆。在一些实施例中，所述障碍是阿尔茨海默病。在一些实施例中，所述障碍是帕金森病。在一些实施例中，所述障碍是肌萎缩侧索硬化(als)。
[0470]
在一些实施例中，本文披露的核酸、载体、重组病毒、或药物组合物在治疗由编码颗粒蛋白前体的基因中的一个或多个突变(例如，导致颗粒蛋白前体蛋白的表达和/或功能丧失的突变)引起的障碍中使用。在一些实施例中，所述障碍是神经退行性障碍。在一些实施例中，所述障碍是额颞叶痴呆。在一些实施例中，所述障碍是阿尔茨海默病。在一些实施例中，所述障碍是帕金森病。在一些实施例中，所述障碍是肌萎缩侧索硬化(als)。
[0471]
在一些实施例中，本文披露的核酸、载体、重组病毒、或药物组合物在制造针对治疗有需要的受试者的药物中使用。在实施例中，所述受试者患有由编码颗粒蛋白前体的基因中的一个或多个突变(例如，导致颗粒蛋白前体蛋白的表达和/或功能丧失的突变)引起的障碍。
[0472]
在各个实施例中，本文披露的核酸、载体、重组病毒、或药物组合物可通过以下递送至有需要的受试者：静脉内施用、直接脑施用(例如，鞘内、脑内、和/或脑室内施用)、鼻内施用、耳内施用、或眼内途径施用，或其任何组合。在一些实施例中，所述核酸、载体、重组病毒、或药物组合物可通过鞘内施用进行递送。在一些实施例中，所述核酸、载体、重组病毒、或药物组合物可通过脑内或脑室内施用途径进行递送。在一些实施例中，施用的核酸、载体、重组病毒、或药物组合物在施用至单独的组织或流体(例如，血液)后，直接或通过转移最终递送至脑、脊髓、外周神经系统、和/或cns。
[0473]
不受理论的束缚，在一些实施例中，本文披露的方法可以拯救携带在编码多肽(例
如，颗粒蛋白前体)的基因上的突变的细胞，这些突变导致无功能的多肽。在一些实施例中，表达分子(例如蛋白或核糖核酸(例如，sirna))的方法包括将本文披露的核酸、病毒载体、病毒、或药物组合物递送至细胞。在一些实施例中，所述细胞是神经元细胞。在一些实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述细胞是人细胞。在一些实施例中，所述神经元细胞是神经元。在一些实施例中，递送是在体外进行的。在一些实施例中，递送是离体进行的。在一些实施例中，所述递送是通过全身性施用进行的。在一些实施例中，所述递送是局部的。在一些实施例中，所述递送是通过直接应用至靶组织进行的。在一些实施例中，所述靶组织是脑。在一些实施例中，所述递送是通过注射到脑中进行的。在一些实施例中，所述递送是通过鞘内施用进行的。不受理论的束缚，本文披露的方法可以减少具有pgrn蛋白中的突变的人或小鼠的脑中的脂褐素沉积、星形胶质细胞和小胶质细胞活化、和/或炎症，从而为有需要的受试者提供潜在的益处。
[0474]
在各个实施例中，本文披露的核酸、载体、病毒、和药物组合物可用于治疗障碍，例如，ftd。在一些实施例中，本文披露的核酸、载体、病毒、和/或药物组合物可在制造用于治疗障碍(例如，ftd)的药物中使用。在一些实施例中，所述障碍由编码颗粒蛋白前体的基因中的一个或多个突变引起。在一些实施例中，颗粒蛋白前体基因中的突变导致颗粒蛋白前体蛋白的表达的丧失。在一些实施例中，颗粒蛋白前体中的突变导致颗粒蛋白前体蛋白的功能的丧失。在一些实施例中，所述使用包括向有需要的受试者递送治疗有效量的例如在本文披露的载体、病毒、和/或药物组合物中的编码hpgrn的核酸。
[0475]
本文还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的核酸分子、本文所述的载体、本文所述的重组病毒、本文所述的细胞、或本文所述的药物组合物；以及剪接调节子。
[0476]
通过以下实例进一步说明本披露，这些实例不应解释为限制性的。出于所有目的，本技术中所引用的所有参考文献、专利及公开专利申请的内容以及图均通过引用以其全文并入本文。
[0477]
实例
[0478]
以下实例被认为是说明性的，而不是对上文披露的披露范围的限制。
[0479]
实例1.来自人基因组的剪接调节子结合位点的鉴定。
[0480]
将正常人成纤维细胞系(hd1994)用活性(lmi070和剪接调节子2)和非活性类似物(剪接调节子3)或dmso处理24小时。在nsc34和hd1994细胞系1两者中使用以下这些化合物剂量：
[0481]-lmi070在(100nm)的浓度和(5μm)的高剂量下进行测试
[0482]-剪接调节子2在750nm下进行测试
[0483]-剪接调节子3在5μm下进行测试
[0484]
两种细胞系均包括dmso处理对照。每组有3个生物学重复。
[0485]
使用凯杰rneasy微量分离试剂盒(qiagen rneasy mini isolation kit)分离总rna。使用illumina truseq rna样品制备试剂盒v2制备rna-seq文库，并使用illumina hiseq2500平台测序。
[0486]
每个样品在属于相同流动池的四个不同泳道上测序为长度2x76个碱基对(bp)。通过在测序实验室提供的fastq文件(针对dm00012.txt的数据发布文件)上运行fastqc(版本0.10.1)来评估生成的读段的质量。为每个样品计算了以phred得分的每碱基平均质量。这
些读段的质量非常好(所有碱基位置的平均phred得分》28)。如illumina化学预期的，观察到类似的向5’和3’端降低的质量趋势。
[0487]
使用tophat(2.0.3)，共有8.47亿个76-碱基对(bp)配对末端读段被映射到智人基因组(hg19)(人refseq(pruitt等人，2007)转录物(发布59，2013年5月3日))
[0488]
针对人基因组(hg19)的tophat(2.0.3)比对分别对15个重复中的每个重复进行了计算。为了提高检测外显子的能力，针对五个条件(dmso，5μm的lmi070、100nm的lmi070、750nm的剪接调节子2和5μm的剪接调节子3)中的每个条件，在用cufflinks(2.1.1)进行转录物组装之前，合并三个比对文件(bam文件)。转录物组装后，从转录物gtf文件中提取外显子坐标。排除了可替代染色体和m染色体上的外显子，并且忽略了链信息。这产生了273866个推定外显子。不与任何refseq外显子(发布59，2013年5月3日)相交的外显子被视为事件中未注释的剪接的候选者。结果有19474个候选者。为了获得更大的置信度，在所有refseq外显子加上最初的19474个候选者的完整集中合并重叠的外显子，从而产生了229665个不重叠的外显子。对于这组外显子，考虑了每个refseq基因内的所有可能的外显子-外显子连接。使用r(2.15.2)脚本和bedtool(2.15.0)创建了连接数据库。然后将每个配对末端读段的第一配对针对数据库进行映射。仅保留了由至少一个连接比对支持的未注释的外显子。这尤其排除了不与refseq基因附接的候选者。剩下10898个最终候选者。使用bedtools从hg19提取这些候选者的序列。为了评估可变性，针对每个重复计算单独的cufflinks组装，并检查是否在这样的组装中看到每个候选者。另外，针对连接数据库的比对用于确定跳过新颖外显子的连接的数目。信息用于估计以分数而言的剪接。此外，使用bedtools在tophat比对(bam文件)上确定每个重复的10898个候选者的读段覆盖率，并且然后在五个条件中的每个条件中进行合计。将原始fastq文件用star(020201)重新处理，并与人基因组(hg38)比对。使用ucsc基因组浏览器工具将10898个候选外显子转换至hg38——7个候选者无法转换。将star检测到的连接映射到其余10891个候选者，并提供了连接计数的可替代来源。从人sma rna seq数据集中发现的10898个推定未注释外显子中如下选择用于验证的最后10个候选者(如表1中所述)：1)对于所有样品的剪接调节子3和dmso(无泄漏)，star合计连接计数和tophat外显子覆盖率＝0；2)lmi070和剪接调节子2star合计连接计数和tophat外显子覆盖率》60(动态范围)；3)外显子长度《100bp(针对可行性)；并且3’端aga/gtaag(以确认剪接调节子结合位点的存在)
[0489]
实例2.小基因开关的构建。
[0490]
考虑设计概念(图1a和图1b)，使用实例1中鉴定的snx7基因序列设计了特定的小基因打开开关。图2a示出了在实例1中鉴定的snx7基因座的示意图，所述snx7基因座含有：在以下染色体处的剪接调节子(lmi070)外显子靶结合位点：grch37:1:99204216:99204359:1(agtttgcaaaggaaggaaaggagcagagacttgaatgagcagaaaatcatttcagggcctgttctctatgtccttgctatccctgtcttctgtagctattctgaaaccatcaacaaaggagcacaccattccatcagcaaaaga(seq id no:80))，以及在以下染色体处的外显子8下游的内含子序列：grch37:1:99203793:99203946:1(cttccagaggagattggaaaacttgaagataaagtggaatgtgctaataatgccctgaaagcagattgggagagatggaaacaaaatatgcaaaatgatatcaagttagcatttacagatatggctgaggagaatatccattattatgaacag(seq id no:99))，和在以下染色体处的外显子9上游的21,251个核苷酸：grch37:1:99225610:99225687:1(tgccttgctacgtgggagtcattccttacatcacagacca
accttcacttggaagaagcctctgaagataaaccttaa(seq id no:100))。使用这些序列，使用以下构建非天然存在的snx7小基因(版本1)(图2)：外显子8(称为外显子a)、位于外显子8与已鉴定的包含剪接调节子结合位点的隐藏外显子之间的270个核苷酸的内含子(ab)、在其3’端包含剪接调节子(例如，lmi070)结合位点的外显子(称为外显子b)、和在隐藏外显子和外显子9之间的407个核苷酸的内含子片段(从21,251nt缩短；bc)、以及外显子9(称为外显子c)。对所述小基因进行了另外的修饰以改善其性能，如：1)在外显子a中位置65处插入科扎克共有序列和atg密码子(gccaccatg)；2)用ttg替代小基因中的所有其他atg序列；3)用ag替代在外显子a的位置20处的ta，以制备gaagaagaa序列(seq id no:69)；4)从外显子b去除1nt，以在orf中创建移码(核苷酸的数目＝3n-1)；5)在外显子c的位置4处插入t，以在orf中创建移码，产生多个终止密码子；6)将在外显子c的位置9处的tac改为taa，以创建提前停止密码子；7)将在外显子c的位置34处的cag改为acc，以突变潜在的隐藏剪接位点；8)将在外显子c的位置60处的ctct改为tagc，以创建nhe i限制性位点；以及9)去除在外显子c的末端的taa，以创建连续的orf。然后使用分子克隆技术将该序列插入到scaav载体中。所述scaav是通过将以下各项进行组合创建的：含有trs缺失的aav2 itr、随后是jet启动子、随后是snx7小基因(参见图2b)、随后是添加到外显子c末端的针对弗林蛋白酶切割位点的编码序列(rnrr(seq id no:39))、随后是针对t2a肽的编码序列、随后是转基因序列(此处是针对没有第一个atg的egfp的编码序列)、随后是sv40晚期多腺苷酸化信号、随后是aav2 itr(参见图2c)。图3示出了在剪接调节子存在或不存在的情况下预测的scaav的mrna产物。
[0491]
实例3.hek293细胞中的打开开关的体外性能。
[0492]
将hek293细胞维持在完全dmem培养基中，并在转染前一天以100,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中。根据制造商的方案，使用lipofectamine2000(英杰公司(invitrogen))用2μg的pjsnx-gfp质粒dna转染每个孔。4小时后用完全dmem替代转染培养基。在24小时后添加到细胞时，将在dmso中的初始1mm lmi070储备液以1/1,000-1/500,000稀释在dmem中，以达到2nm-1μm的浓度。对照细胞接受0.1％dmso。使用荧光显微镜在转染后48小时评估gfp表达。在对照dmso处理的细胞中未观察到gfp表达(图4a)。为了定量分析gfp表达，将细胞进行胰蛋白酶化并通过facs使用sony sh-800流式细胞仪进行分析。平均荧光强度用于gfp表达的相对测量。对照dmso处理的细胞没有示出可检测的gfp表达，而在lmi070处理的样品中观察到gfp表达的剂量依赖性增加(图4b)。对于rna剪接分析，根据制造商的方案，使用trizol(英杰公司)从细胞中提取总rna。使用用于qrt-pcr的superscript iii第一链超混合物(supermix)(英杰公司)合成cdna。使用qpcr通过测量由caacaaaggagcacaccattc(seq id no:103)和gcggttgcgaggtttatct(seq id no:104)引物对扩增的外显子b-外显子c的量(与由外显子c特异性引物gcggttgcgaggtttatct(seq id no:104)和ctcttgctaagtgggagtcatt(seq id no:105)扩增的总转基因mrna相比)，评估外显子b的纳入情况。发现与dmso处理的细胞相比，在125nm lmi070处理的细胞中的外显子b的纳入上调了75倍(图4c)。使用gtgctaataatgccctgaaagc(seq id no:106)和ccacttagcaagagcactgt(seq id no:107)引物对测量组成型剪接的rna(即外显子a-外显子c)的量。与对照dmso处理的细胞相比，1μm lmi070处理的细胞表现出低60倍的外显子a-外显子c剪接。
[0493]
实例4.在大鼠皮质神经元中通过snx7开关进行的gfp表达的调节。
[0494]
从用木瓜蛋白酶消化的解剖大鼠胚胎皮质制备原代大鼠神经元，并在24孔聚d-赖氨酸板(康宁公司(corning))中的完全神经基础培养基中以150,000个细胞/孔的密度培养7天。在转染前一天用新鲜培养基替代一半的培养基。除了在添加dna-脂质体混合物之前用optimem洗涤细胞三次以外，根据制造商的方案，使用lipofectamine2000(英杰公司)用2μg的pjsnx-gfp质粒dna转染每个孔。4小时后，用含有50％新鲜完全神经基础培养基的条件培养基替代转染培养基。第二天，当添加到细胞时，将在dmso中的1mm lmi070储备液以1/1,000-1/500,000稀释在dmem中，以达到2nm-1μm的浓度。对照细胞接受0.1％dmso。使用荧光显微镜在转染后6天评估gfp表达。在对照dmso处理的细胞中未观察到gfp表达(图4a)。对于rna剪接分析，根据制造商的方案，使用trizol(英杰公司)从细胞中提取总rna。使用用于qrt-pcr的superscript iii第一链超混合物(英杰公司)合成cdna。使用qpcr通过测量由caacaaaggagcacaccattc(seq id no:103)和gcggttgcgaggtttatct(seq id no:104)引物对扩增的外显子b-外显子c的量(与由外显子c特异性引物gcggttgcgaggtttatct(seq id no:104)和ctcttgctaagtgggagtcatt(seq id no:105)扩增的总转基因mrna相比)，评估外显子b的纳入情况。发现与dmso处理的细胞相比，在31nm lmi070处理的细胞中的外显子b的纳入上调了超过100倍(图4b)。使用gtgctaataatgccctgaaagc(seq id no:106)和ccacttagcaagagcactgt(seq id no:107)引物对测量组成型剪接的rna(即外显子a-外显子c)的量。与对照dmso处理的细胞相比，500nm lmi070处理的细胞表现出低30倍的外显子a-外显子c剪接。
[0495]
实例5.通过snx7开关在大鼠皮层神经元中进行的人颗粒蛋白前体的可调节表达。
[0496]
从用木瓜蛋白酶消化的解剖大鼠胚胎皮质制备原代大鼠神经元，并在24孔聚d-赖氨酸板(康宁公司(corning))中的完全神经基础培养基中以150,000个细胞/孔的密度培养7天。在转染前一天用新鲜培养基替代一半的培养基。除了在添加dna-脂质体混合物之前用optimem洗涤细胞三次以外，根据制造商的方案，使用lipofectamine2000(英杰公司)用2μg的psyn-snx7-pgrn(图6a)或对照psyn-pgrn质粒(其不含有snx7小基因)转染每个孔。4小时后，用含有50％新鲜完全神经基础培养基的条件培养基替代转染培养基。第二天，当添加到细胞时，将在dmso中的1mm lmi070储备液以1/10,000稀释在dmem中，以达到100nm的浓度。对照细胞接受0.01％dmso。使用tr-fret测定法在转染后6天测量hpgrn表达。在psyn-snx7-pgrn转染的细胞中，与dmso处理的对照相比，lmi070诱导hpgrn的表达超过30倍(图6b)。对于rna剪接分析，根据制造商的方案，使用trizol(英杰公司)从细胞中提取总rna。使用用于qrt-pcr的superscript iii第一链超混合物(英杰公司)合成cdna。使用qpcr通过测量由caacaaaggagcacaccattc(seq id no:103)和gcggttgcgaggtttatct(seq id no:104)引物对扩增的外显子b-外显子c连接的量(与由外显子c特异性引物gcggttgcgaggtttatct(seq id no:104)和ctcttgctaagtgggagtcatt(seq id no:105)扩增的总转基因mrna相比)，评估外显子b的纳入情况。对于psyn-snx7-pgrn转染的细胞，发现与dmso处理的细胞相比，在lmi070处理的细胞中的外显子b的纳入上调了超过150倍(图6c)。使用gtgctaataatgccctgaaagc(seq id no:106)和ccacttagcaagagcactgt(seq id no:107)引物对测量组成型剪接的rna(即外显子a-外显子c)的量。与dmso处理的细胞相比，lmi070处理的细胞表现出低10倍的在psyn-snx7-pgrn转染的细胞中的外显子a-外显子c剪接。
[0497]
实例6.修饰小基因以减小尺寸并消除在lmi070不存在的情况下的肽表达
[0498]
进一步修饰snx7小基因以减小整体尺寸并消除在lmi070不存在的情况下的肽表达。特别地，将外显子a缩短为109nt至53nt，同时保留与3’剪接位点相邻的区，所得外显子a具有seq id no:96的序列。将第一内含子从150nt缩短到120nt，同时保留剪接位点和分支点。所得第一内含子具有seq id no:97的序列。缺失第一版snx7小基因外显子a中含有起始密码子的区域，并通过将新版本的snx7小基因的外显子b中的tc改为gg构建起始密码子。所得外显子b具有seq id no:98的序列。通过将起始密码子切换为外显子b，蛋白表达仅在lmi070存在的情况下发生。第二内含子保持不变，因为发现该序列含有必需的顺式元件。经修饰的snx小基因(版本2)的序列在seq id no:94中示出。图9示出了与先前版本的snx7小基因(版本1)相比的新版本(版本2)的小基因的示意图。
[0499]
使用分子克隆技术将经修饰的snx7小基因(版本2)插入scaav载体中。包含经修饰的snx7小基因(版本2)的载体的序列在seq id no:95中示出。将hek293细胞维持在完全dmem培养基中，并在转染前一天以100,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中。根据制造商的方案，使用lipofectamine2000(英杰公司)用2μg的含有snx7开关版本1的质粒dna dl180或含有snx7版本2的质粒dl182转染每个孔。4小时后用完全dmem替代转染培养基。在24小时后添加到细胞时，将在dmso中的初始1mm lmi070储备液以1/1,000-1/500,000稀释在dmem中，以达到100nm-1μm的浓度。对照细胞接受0.1％dmso。使用荧光显微镜在转染后48小时评估gfp表达。图10示出了经修饰的snx7小基因(版本2)比先前版本更敏感。
[0500]
实例7.经口施用lmi070以时间依赖性方式开启小鼠脑中的转基因表达
[0501]
在hek293细胞中产生编码在具有snx7开关(版本1)的突触蛋白启动子控制下的hpgrn的ssaav9病毒载体，并通过碘克沙醇进行纯化。将2μl中的2e10 vg的aav载体icv注射到p0的c57bl/6新生小鼠中。在4周龄时，通过灌胃经口施用30mg/kg的lmi070或媒介物对照。在指定的时间点取下每组4-6只小鼠(图7a)。在用pbs经心脏灌注后，将左半球的后半部分在precellys管中匀浆。使用tr-fret测定法测量从aav载体表达的人pgrn。结果表明了lmi070施用后24小时后脑中hpgrn表达的快速和瞬时诱导。lmi070施用后4天后，转基因蛋白表达恢复到未处理的水平(图7b)。
[0502]
实例8.lmi070以剂量依赖性方式开启体内转基因表达
[0503]
在hek293细胞中产生编码在具有snx7开关(版本1)的突触蛋白启动子控制下的hpgrn的ssaav9病毒载体，并通过碘克沙醇进行纯化。将2μl中的2e10 vg的aav载体icv注射到p0的fvb新生小鼠中。在4周龄时，通过灌胃经口施用3、10或30mg/kg的lmi070或媒介物对照。在指定的时间点取下每组6-7只小鼠(图8a)。在用pbs经心脏灌注后，将左半球的后半部分在precellys管中匀浆。使用tr-fret测定法测量从aav载体表达的人pgrn。将人皮层的样品用作生理pgrn水平(约200pg/mg)的对照。结果表明转基因hpgrn在脑中快速(lmi070施用后12小时)积累，在24小时的点开始下降。转基因表达表明了对lmi070施用的剂量应答。