核苷酸的可逆修饰的制作方法

核苷酸的可逆修饰
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年9月10日提交的美国临时申请第62/898,152号的权益，所述临时申请通过整体引用并出于所有目的并入本文。


背景技术：

3.本公开大体上涉及核苷酸和核酸的可逆封闭以抑制其3
′
羟基部分的酶催化修饰，并且对采用循环可逆终止的核酸测序过程具有特定的适用性。
4.基因组已类比为含有个别生物体的发育和功能说明的操作手册。已显示，基因组指导生长和发育，指导重要器官的功能，影响情绪和行为等。每一个体的独特性在很大程度上源自其基因组的独特组成。个体之间的差异可通过构成其基因组的dna中核苷酸序列的差异来观察。仅举几例，已在确定那些序列差异如何预测疾病风险、对某些治疗药物具有不良反应的可能性以及具有某些能力和人格特质的可能性方面取得巨大进步。
5.最近，由于能够在具有30亿个核苷酸序列的典型人类基因组规模上进行测序的dna测序平台的商业化，基因组信息的诊断潜力已经加速。尽管在过去几十年中测序的通量和成本已大大提高，但仍有许多疾病的诊断序列特征尚未确定并且测序成本对于许多临床应用来说仍然遥不可及。
6.已经开发的许多测序技术，包括一些广泛用于商业用途的测序技术，都采用了循环可逆终止子(crt)方法。所述crt方法沿着目标dna模板延伸引物以使得每个循环都会检测到模板中的单个位置。重复所述循环以有效地沿着dna中的模板向下步移，同时以单核苷酸步长读取序列。执行100个crt循环会产生100个核苷酸的序列读段。单核苷酸步长以及由此产生的序列读段的单核苷酸分辨率是通过用具有3
′
可逆终止子部分的核苷酸使引物增长来实现的。引物在添加可逆终止的核苷酸后不能进一步延伸，直到其用适当的解封闭试剂处理以去除可逆终止子部分。已知由于将可逆终止子并入引物中的步骤和用于解封闭引物的步骤的效率低下，大多数crt方法(包括当今商业使用的crt方法)的准确度和读段长度受损。此外，许多crt方法使用的解封闭试剂会损坏待测序的dna。由于测序是一个累积过程，即使是引物延伸、引物解封闭和dna损伤抗性方面的微小低效，也可能历经测序过程的许多循环而累加成明显不利的影响。
7.因此，需要用于核苷酸和核酸的可逆终止的改进试剂和方法。本发明满足了这种需要并且也提供了相关的优点。


技术实现要素：

8.本公开提供了一种组合物，所述组合物包括含有具有例如3
′‑
o-肟部分的保护基团的核苷酸和用于除去所述保护基团并将封闭基团递送到所述保护基团的位置的试剂(例如具有结构r2-onh2的试剂)的溶液。多个r2部分与本公开一致。在一些情况下，r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。可替代地或组合地，r2包括分子量为至少24、至少
25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36或大于36g/mol的部分。类似地，如本文所考虑的r2部分的分子量不超过1000、不超过500、不超过400、不超过300、不超过250、不超过200、不超过150或不超过100g/mol。可替代地或组合地，各种r2实施方案包括以下中的一者或多者：单独或与彼此组合的至少两个碳核、氟核、一个磷核、一个氮核、一个硅核、一个氧核、一个羟基部分、杂环、一个苯基环或另一部分。
9.在特定配置中，用于本文中的方法或组合物的代表性核苷酸起始材料具有结构：
[0010][0011]
b可为核碱基。r1可独立地为卤素、och3、h或oh，或者可在2
′
r1位置处携有替代修饰，以使得核苷酸不同地为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。q可独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、核酸、氢或例如表面或键结至表面的接头的另一部分。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。举例来说，核苷酸的3
′
位置处的保护基团部分可为醛肟(使得r3或r4中的一者为氢)或酮肟(其中r3和r4均不为氢)。本文考虑了其他保护基团部分并且其与本公开一致。
[0012]
本公开也提供了用于修饰核苷酸的方法。所述方法可通过以下来进行：使具有例如3
′‑
o-肟部分的保护基团的核苷酸与用于除去所述保护基团并将封闭基团递送到所述保护基团的位置的试剂(例如具有结构r2-onh2的试剂)反应以产生具有3
′‑
o-nh2部分的核苷酸，其中r2独立地为r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元、或5至6元)、被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)、或被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在一些情况下，r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。r2部分可包括单独或组合的多个成分以传达本文所公开的益处。一些r2部分不同地包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或超过6个碳核。类似地，一些r2包含以下中的至少一者：至少1个氮核、至少一个硅核、至少一个磷核、至少一个氟核或至少另一成分。在一些情况下，r2部分被部分或完全氟化，或被部分或完全氢化。在一些情况下，r2部分包含至少一个组分以促进溶解性。本文也考虑具有用于递送例如onhch3、o-ch2n3的替代封闭基团或可逆终止子部分或例如与核酸延伸的可逆终止一致的部分的另一部分的结构的试剂。在一些配置中，具有3
′‑
o-肟部分的核苷酸可具有结构：
[0013][0014]
并且具有3
′‑
o-nh2部分的核苷酸可具有结构：
[0015][0016]
b可为核碱基。r1可独立地为卤素、och3、h或oh。q可独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、核酸或例如表面或键结至表面的接头的另一部分。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。举例来说，核苷酸的3
′
位置处的部分可为醛肟(使得r3或r4中的一者为氢)或酮肟(r3或r4均不为氢)。在特定配置中，用于本文中的方法或组合物的核苷酸起始材料具有结构：
[0017][0018]
b可为核碱基。r1可独立地为卤素、och3、h或oh。q可独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、核酸或例如表面或键结至表面的接头的另一部分。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。举例来说，核苷酸的3
′
位置处的保护基团部分可为醛肟(使得r3或r4中的一者为氢)或酮肟(其中r3和r4均不为氢)。本文考虑其他保护基团部分并且其与本公开一致。本公开也提供了用于修饰核苷酸的方法。所述方法可通过以下来进行：使具有例如3
′‑
o-肟部分的保护基团的核苷酸与用于递送封闭基团的试剂(例如具有结构r2-onh2的试剂)反应以产生具有3
′‑
o-nh2部分的核苷酸，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。本文也考虑了具有用于递送例如onhch3、o-ch2n3的替代封闭基团或与核酸延伸的可逆终止一致的另一部分的结构的试剂。
[0019]
本公开进一步提供了包括含有具有3
′‑
o-肟部分的核苷酸的第一容器和含有具有
结构r2-onh2的试剂的第二容器的试剂盒，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。在一些配置中，所述核苷酸可具有结构：
[0020][0021]
b可为核碱基。r1可独立地为卤素、och3、h或oh。q可独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、核酸或例如表面或键结至表面的接头的另一部分。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。举例来说，核苷酸的3
′
位置处的部分可为醛肟(使得r3或r4中的一者为氢)或酮肟(r3或r4均不为氢)。
附图说明
[0022]
图1a示出了当用共享系栓至各种r2基团的-o-nh2可逆终止子部分的各种候选drt(
‘
解封闭可逆终止子’)氨氧基试剂处理时3
′‑
o-(n-丙酮肟)-dctp的核苷酸降解百分比对3
′‑
o-(n-丙酮肟)部分消耗百分比的曲线图。如实施例1中所描述执行反应并且在1小时后测定25c反应。图1a说明了随着r2分子量增加，可见dc降解减少。类似地，随着r2分子量增加，可见起始材料消耗增加。图1b列出了图1a中所测定的drt试剂的化学标识，指示其各种r2部分。
[0023]
图2呈现了解封闭试剂的实例。此图中的全部实例都共享系栓至在分子量和化学结构范围内的各种r2基团(在如所呈现的每个分子中在左侧)的共同-o-nh2可逆终止子部分(在如所呈现的每个分子中在右侧)。本文也考虑具有系栓至例如-o-nhch3、-o-ch2n3的替代可逆终止子部分或例如与核酸延伸的可逆终止一致的部分的另一部分的如本文所公开的r2基团的类似解封闭试剂以及此处所呈现或本文以其他方式公开的r2部分。
[0024]
图3.与胞苷进行的解封闭副反应的实例。这种副反应解释了图1a中所定量的dc降解中的至少一些。如图1a中所指示，随着r2尺寸增大，可见本文所描绘的副反应减少。
具体实施方式
[0025]
本公开提供了适用于合成在3
′
位置处具有部分，例如保护3
′
位置免于例如化学修饰和酶修饰(例如如通过模板定向的dna聚合酶实现的核苷酸添加)的修饰的部分的核苷酸的组合物和方法。以这种方式受保护的核苷酸可称为被封闭或终止。例如，当将具有受保护3
′
位置的核苷酸被并入延伸核酸链中作为核酸引物的3
′
核苷酸部分时，经延伸引物受到有效封闭以免于被聚合酶或连接酶进一步延伸。换句话说，引物延伸已受到终止。
[0026]
在特定配置或实施方案中，封闭或终止的核苷酸可具有例如3
′‑
onh2部分的可逆
终止子部分，与在脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的3
′
位置处发现的天然羟基不同，所述3
′‑
onh2部分对通过某些酶和化学试剂进行的修饰具有抗性。在某些条件下，例如当封闭的核苷酸用例如亚硝酸的酸处理时，3
′‑
onh2部分可被化学转化成羟基。用-oh部分置换整体-o-nh2部分或用-h置换-nh2部分均有效地引起解封闭，并且3
′
o在解封闭中的命运无关紧要，只要最终产物具有可用于聚合酶介导的核酸延伸的3
′
oh即可。因此，3
′‑
onh2部分在与本公开的解封闭试剂偶联时充当可逆终止子。易于除去以回收与酶链延伸相容的3
′
羟基部分的其他可逆终止子与本文公开内容一致，以使得并非全部本文实施方案都限于具有3
′‑
o-nh2部分的核苷酸的制备。示例性替代物包括3
′‑
o-nhch3、-o-ch2n3以及本领域中已知的其他替代物，其当附接在核酸链3
′
端的3
′
位置处时封闭链延伸，同时不排除通过dna或其他核酸聚合酶进行的结合以使得可将携有此类可逆终止子的核苷酸在其5
′
端处添加到未封闭的核苷酸或核苷酸聚合物的3
′
羟基以产生3
′
终止核酸链。
[0027]
核苷酸的可逆终止适用于多种应用。例如，各种核酸测序平台利用循环可逆终止子(crt)方法，在所述方法中读取模板核酸序列，同时递增地沿模板延伸引物核酸。递增延伸可在crt方法中通过构建每个循环以包括经由添加可逆地终止的核苷酸(或在其3
′
端处可逆地终止的寡核苷酸)延伸引物、接着对延伸引物进行解封闭的步骤来实现。在每个循环中，也进行检测步骤以识别存在于已相对于延伸引物对准的特定位置处的核苷酸的类型。
[0028]
本文所阐述的可逆地终止的核苷酸和其合成方法提供以下优势：极有效地置换例如3
′‑
o-肟的3
′
保护基团或所添加的其他基团以促进核酸其他区域的化学操纵，例如向核苷酸5
′
位置添加三磷酸酯部分。在不受理论束缚的情况下，预计由于crt是总体上累积方法，因此封闭和解封闭步骤中的任何差错或低效率都产生累积副作用。例如，定相是在crt方法过程期间例如由于封闭基团去除中的缺陷，导致未能在crt方法的一个或多个循环期间并有额外部分，因此群体内的个别核酸分子彼此损失同步的现象。定相可显现为
‘
落后于’群体中的其他引物分子的一个或多个引物分子的延伸，或替代地显现为导致一个或多个引物分子
‘
超前于’群体中的其他引物分子的缺陷。例如，每个循环仅0.5％的定相速率可能在120个循环之后造成约一半的用于测序或其他crt反应的真实信号的累加损失。由于产生于异相群体成员的虚假信号所致的背景噪声成比例增加而加剧了所述问题。信噪比的累加损失造成读取长度受限(继而造成测序通量减少)和尤其噪声淹没信号时后续循环的差错增加。本文所阐述的可逆地终止的核苷酸可用于抑制延伸阶段中的破坏，从而改善例如核酸测序方法中的准确度和读取长度反应。经由实践本文所公开的方法和使用本文所公开的组合物生成具有极高置换度的核苷酸组合物，所述置换是在如图1a中所描绘并且如一般适用于本文所公开的r2部分的低dc降解速率情况下用例如-o-nh2的可逆基团置换例如-o-肟的保护基团。因此，在一些情况下，使用本文中的组合物或经由本文所公开的方法生成的试剂适用于添加到核酸测序试剂中，例如不经进一步净化或纯化即直接添加到核酸测序试剂中，以产生如下实施例2中所描绘在相当长运行长度内具有高准确度的测序反应运行。这种试剂可还包括聚合酶表面活性剂、缓冲剂或适用于直接添加到测序装置中的其他试剂。在不受理论束缚的情况下，例如呈现于实施例2中的运行的运行效能至少部分归因于定相缺陷减少，所述定相缺陷减少可以其他方式由以下引起：用例如-o-nh2的可逆终止子低效地置换例如-o-肟基团的保护基团，产生类似呈现于图3中的基团、部分或碱基的留存保护基团、未封闭3
′
oh部分或降解dc碱基。
[0029]
在不受理论束缚的情况下，用于封闭核苷酸的3
′
位置的本文所阐述的合成方法和组合物的一个可能优点在于，所述方法对与核苷酸其他部分的不合需要的副反应具有相对惰性。因此，通过本文所阐述的方法或涉及本文所阐述的组合物制成的可逆地终止的核苷酸可不以在crt方法或利用可逆地终止的核苷酸的其他生物化学方法期间发生的封闭和解封闭步骤期间继续产生副作用的方式受到实质破坏或修饰。在各种情况下，经由实践本公开来对不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％或少于1％用于本文中的反应中或呈现于本文中的组合物中的例如胞嘧啶核苷酸的核苷酸进行修饰或降解。因此，本文所阐述的方法和组合物通过提供相对不含可能干扰测序反应的准确度、阶段或读取长度的例如降解或修饰胞嘧啶的降解或修饰碱基的测序起始材料来提供改善的测序准确度。类似地，本文所阐述的方法和组合物通过生成在一些情况下可不经进一步纯化或分离即直接添加到测序试剂中的具有一定纯度的可逆地终止的核苷酸来促进核酸测序试剂产生。
[0030]
因此，如本文所公开或经由本文所公开的方法产生的组合物通过作为或通过生成相对不含例如经降解或修饰胞嘧啶碱基的经降解或修饰碱基、同时相对不含例如-o-肟的留存3
′
保护基团并且具有相对低浓度的未封闭3
′
oh基团的可逆地终止的核苷酸来促进准确测序。单独或组合的这些特征促进测序反应的测序准确度、定相或读取长度。另外，更高效率的方法和更高纯度的由这些方法产生的组合物促进更具成本效益的测序，这是因为所述组合物在其用于测序反应中之前需要较少纯化，并且在一些情况下不经进一步分离或纯化即直接添加到测序试剂或试剂盒中。
[0031]
定义
[0032]
除非另外规定，否则本文所使用的术语应理解为取其在相关领域中的普通含义。本文所使用的若干术语和其含义阐述于下文中。
[0033]
在取代基是由其从左至右书写的常规化学式规定的情况下，其同样涵盖由从右向左书写结构产生的化学上一致的取代基，例如-ch2o-等效于-och
2-。在取代基或部分书写有所描绘的内部键的情况下，应理解所述取代基或部分也可描绘为不具有明确绘制的内部键，并且两个表示均应理解为相同取代基或部分，例如-onh2和-o-nh2是相同基团。
[0034]
如本文所使用的“烯基”是指在直链或支链烃链中含有一个或多个双键的烷基。烯基部分可未被取代或被取代。烯基部分可任选地具有介于本文针对烷基部分所示例的范围内的数目的碳原子。
[0035]
如本文所使用的“烷氧基”是指式-or，其中r是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基或环炔基。烷氧基的非限制性列表是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基。烷氧基部分可被取代或未被取代。
[0036]
如本文所使用的“烷氧基胺”是指式r
′‑
onr2，其中r
′
是烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基或环炔基。烷氧基的非限制性列表是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基，其中r
′
不为氢，并且其中键结至氮的一个或两个r基团独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基或环炔基。烷氧基的非限制性列表是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基。烷氧基胺部分可被取代或未被取代。
[0037]
如本文所使用的“烷基”是指包括完全饱和(无双键或三键)烃部分的直链或支链
烃链。烷基是未经环化的链。在一些实施方案中，烷基部分可具有1至20个碳原子(不论何时出现在本文中时，例如“1至20个”的数值范围是指在给定范围内的每个整数(包含端点)；例如“1至20个碳原子”意味着烷基部分可由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等、至多并包括20个碳原子组成，但本发明定义也涵盖在数值范围未经指定的情况下术语“烷基”的存在)。烷基部分也可为具有约7至约10个碳原子的中等尺寸烷基。烷基部分也可为具有1至6个碳原子的低级烷基。化合物的烷基部分可命名为“c
1-c4烷基”或类似名称。仅举例来说，“c
1-c4烷基”指示烷基链中存在一个至四个碳原子，即，烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型烷基部分包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。烷基部分可被取代或未被取代。具有至少两个碳原子的烷基部分可为特别适用的，例如当甲基部分不如较长链烷基部分有效时如此。
[0038]
如本文所使用的“炔基”是指在直链或支链烃链中含有一个或多个三键的烷基。炔基部分可未被取代或被取代。炔基部分可任选地具有在本文针对烷基部分所示例的范围内的数目的碳原子。
[0039]
除非另外说明，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚烷基”是指衍生自烷基的二价基，如示例为但不限于-ch2ch2ch2ch
2-。通常，烷基(或亚烷基)基团具有1至24个碳原子，其中具有10个或更少个碳原子的那些基团在本文中是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是通常具有八个或更少个碳原子的较短链烷基或亚烷基。除非另外说明，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚烯基”是指衍生自烯烃的二价基。除非另外说明，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚炔基”是指衍生自炔烃的二价基。
[0040]
除非另外说明，否则单独或与另一术语组合的术语“杂烷基”是指包含至少一个碳原子和至少一个杂原子(例如o、n、p、si和s)的稳定直链或支链或其组合，并且其中氮原子和硫原子可任选地被氧化，并且氮杂原子可任选地被季铵化。一个或多个杂原子(例如o、n、s、si或p)可置于杂烷基的任何内部位置处或烷基与分子其余部分附接的位置处。杂烷基是未经环化的链。实例包括但不限于：-ch
2-ch
2-o-ch3、-ch
2-ch
2-nh-ch3、-ch
2-ch
2-n(ch3)-ch3、-ch
2-s-ch
2-ch3、-ch
2-s-ch2、-s(o)-ch3、-ch
2-ch
2-s(o)
2-ch3、-ch＝ch-o-ch3、-si(ch3)3、-ch
2-ch＝n-och3、-ch＝ch-n(ch3)-ch3、-o-ch3、-o-ch
2-ch3和-cn。至多两个或三个杂原子可为连续的，例如-ch
2-nh-och3和-ch
2-o-si(ch3)3。杂烷基部分可包含一个杂原子(例如o、n、s、si或p)。杂烷基部分可包含两个任选地不同的杂原子(例如o、n、s、si或p)。杂烷基部分可包含三个任选地不同的杂原子(例如o、n、s、si或p)。杂烷基部分可包含四个任选地不同的杂原子(例如o、n、s、si或p)。杂烷基部分可包含五个任选地不同的杂原子(例如o、n、s、si或p)。杂烷基部分可包含至多8个任选地不同的杂原子(例如o、n、s、si或p)。除非另外说明，否则单独或与另一术语组合的术语“杂烯基”是指包含至少一个双键的杂烷基。杂烯基可任选地包含超过一个双键和/或除一个或多个双键之外的一个或多个三键。除非另外说明，否则单独或与另一术语组合的术语“杂炔基”是指包含至少一个三键的杂烷基。杂炔基可任选地包含超过一个三键和/或除一个或多个三键之外的一个或多个双键。在实施方案中，杂烷基的碳-碳键可为完全饱和的(无碳碳双键或碳碳三键)。
[0041]
类似地，除非另外说明，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚杂烷基”是指衍生自杂烷基的二价基，如示例为但不限于-ch
2-ch
2-s-ch
2-ch
2-和-ch
2-s-ch
2-ch
2-nh-ch
2-。对于亚杂烷基来说，杂原子也可占据任一个或两个链末端(例如亚烷基氧基、亚烷
基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。再此外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团来说，连接基团化学式书写方向不暗示连接基团定向。例如，式-c(o)2r
′‑
表示-c(o)2r
′‑
和-r
′
c(o)
2-。如上文所描述，如本文所使用的杂烷基包含经由杂原子附接至分子其余部分的那些基团，例如-c(o)r
′
、-c(o)nr
′
、-nr
′r″
、-or
′
、-sr
′
和/或-so2r
′
。在叙述“杂烷基”，接着叙述例如-nr
′r″
等的特定杂烷基的情况下，应理解术语杂烷基和-nr
′r″
不是冗余的或相互排斥的。相反地，叙述特定杂烷基以增加明确性。因此，术语“杂烷基”不应在本文中解释为排除例如-nr
′r″
等的特定杂烷基。除非另外说明，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚杂烯基”是指衍生自杂烯烃的二价基。除非另外说明，否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚杂炔基”是指衍生自杂炔烃的二价基。
[0042]
如本文所使用的“胺”是指-nr2部分，其中一个或多个r基团可独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。在实施方案中，每个r基团独立地被取代或未被取代。
[0043]
如本文所使用的“氨氧基”是指-o-nr2部分，其中一个或多个r基团可独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。在实施方案中，每个r基团独立地被取代或未被取代。
[0044]
如本文所使用的“阵列”是指附接至一个或多个固体支撑物的分子群，以使得一个位点处的分子可区别于其他位点处的分子。阵列可包括各自位于固体支撑物上的不同可寻址位点处的不同分子。或者，阵列可包括各自充当承载不同分子的位点的单独固体支撑物，其中可根据固体支撑物在与固体支撑物附接的表面上的位置或根据固体支撑物在例如流体流的液体中的位置来识别不同分子。例如，阵列的分子可为核苷酸、核酸、核酸引物、核酸模板、引发模板核酸，或例如聚合酶、连接酶、核酸外切酶的核酸酶或其组合。
[0045]
如本文所使用的“芳基”是指在至少一个环中具有完全离域π电子体系的碳环(全碳)单环或多环芳族环系(包括例如稠合、桥接或螺环体系，其中两个碳环，例如一个或多个芳基环与一个或多个芳基或非芳基环，共享一个化学键)。芳基部分中的碳原子数目可变化。例如，在一些实施方案中，芳基部分可为c
6-c
14
芳基部分、c
6-c
10
芳基部分或c6部分。芳基部分的实例包括但不限于苯、萘和薁。芳基部分可被取代或未被取代。在各种实施方案中，芳基部分独立地为苯基或萘基。在实施方案中，稠环芳基是指稠合在一起的多个环，其中稠环中的至少一个是芳基环并且其中多个环经由含于多个环的芳基环内的任何碳原子附接至母分子部分。单独或作为另一取代基的一部分的“亚芳基”是指衍生自芳基的二价基。
[0046]
如本文所使用的“芳烷基”和“芳(烷基)”是指作为取代基经由低级亚烷基部分连接的芳基。芳烷基的低级亚烷基和芳基部分可被取代或未被取代。实例包括但不限于苄基、2-苯基烷基、3-苯基烷基和萘基烷基。
[0047]
如本文所使用的“附接”是指两个事物彼此接合、紧固、附着、连接或结合的状态。例如，核酸可通过共价或非共价键附接至固相支撑物。类似地，两个核酸可通过共价(例如磷酸二酯)键或通过非共价键(例如两个核酸的碱基之间的氢键结)彼此附接。共价键的特征在于原子之间的电子对共享。非共价键是不涉及电子对共享的化学键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力(van der waals force)、亲水相互作用和疏水相互作用。
[0048]
如本文所使用的“封闭部分”在关于核苷酸使用时是指抑制或防止核苷酸的3
′
氧与另一核苷酸或与寡核苷酸形成共价键的核苷酸的一部分。例如，封闭部分可抑制或防止
在核酸聚合反应期间核苷酸的3
′
位置与下一恰当核苷酸之间的共价键的聚合酶催化形成。类似地，封闭部分可抑制或防止在核酸连接反应期间核苷酸的3
′
位置与寡核苷酸之间的共价键的连接酶催化形成。值得注意的是，如本文所考虑的封闭部分不干扰封闭碱基并入延伸引物链中(例如通过聚合酶催化)；相反地，一旦并入，则封闭的核苷酸干扰后续伸长，这是因为核苷酸的3
′
端不可接近后一核苷酸的5
′
磷酸酯。“可逆地终止的”核苷酸的封闭部分可在对延伸引物链或其互补序列无实质性损害的情况下从核苷酸类似物中除去或以其他方式修饰以使核苷酸的3
′‑
氧可用于共价连接至另一核苷酸或寡核苷酸。这种封闭部分可在本文中称为“可逆终止子部分”，这是因为引物延伸的封闭是经由除去封闭部分或终止子部分来进行逆转。具有例如可逆终止子部分的封闭部分的核苷酸可处于例如引物的核酸的3
′
端处，或者可为不共价附接至核酸的单体分子。示例性封闭部分包含3
′
onh2以及3
′
onhch3和3
′
o叠氮甲烷(3
′‑
och2n3)。在各种实施方案中，保护部分也可为封闭部分(例如3
′‑
o-肟部分可为封闭部分)。如本文所使用的r2-封闭物为键结至例如可逆终止子部分的封闭部分的r2。在一些情况下，于溶液中的r2-部分用于稳定化封闭部分以便防止不合需要地将其从核苷酸中除去以形成与聚合酶介导的延伸相容的3
′
oh基团。
[0049]
如本文所使用的“保护部分”是在例如非酶方法或非特定化学方法的化学方法期间保护其所附接的分子免于交叉反应或误定向反应的部分。与例如可逆终止部分的封闭部分不同，保护部分不一定易于在与受保护分子无交叉反应或降解风险的情况下除去。示例性部分包括在例如5
′
磷酸化反应期间保护核糖3
′
位置免于交叉反应的例如3
′‑
o-烷肟或3
′
o-酮肟的3
′‑
o-肟部分。在各种实施方案中，保护部分为3
′‑
o-肟(例如3
′‑
o-烷肟或3
′‑
o-酮肟)。在实施方案中，保护部分防止在核苷酸或核苷的磷酸化反应期间，例如可在向核苷酸5
′
位添加三磷酸酯部分期间发生的核苷酸或核苷的3
′
碳或3
′
氧的反应性。
[0050]
术语“包括”在本文中旨在是开放式的，包含所叙述的要素，但也开放包括额外的未叙述要素的可能性。
[0051]
如本文所使用的“环烷基”是指完全饱和(无双键或三键)的单环或多环烃环系。当由两个或更多个环构成时，环可以稠合方式接合在一起。环烷基部分可在一个或多个环中含有3至10个原子。在一些分子中，环烷基部分可在一个或多个环中含有3至8个原子。环烷基部分可未被取代或被取代。典型环烷基部分包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
[0052]
如本文所使用的“环烯基”是指在至少一个环中含有一个或多个双键的单环或多环烃环系；但如果存在超过一个双键，则双键不遍及全部环形成完全离域π电子体系(否则部分是如本文所定义的“芳基”)。当由两个或更多个环构成时，环可以稠合方式连接在一起。环烯基部分可未被取代或被取代。单独或作为另一取代基的一部分的“亚环烷基”是指衍生自环烷基的二价基。
[0053]
如本文所使用的“环炔基”是指在至少一个环中含有一个或多个三键的单环或多环烃环系。如果存在超过一个三键，则三键不遍及全部环形成完全离域π电子体系。当由两个或更多个环构成时，环可以稠合方式接合在一起。环炔基部分可未被取代或被取代。
[0054]
如本文所使用的“解封闭”是指例如经由暴露于3
′
oh或生成3
′
oh来除去或修饰核苷酸的例如可逆终止子部分的封闭部分以使核苷酸可延伸。这种解封闭核苷酸或核酸链能够与第二核苷酸一起形成磷酸二酯键，使得核苷酸能够形成涉及核苷酸的3
′
碳和第二核苷
酸的5
′
碳的磷酸二酯键。例如，可逆地终止的核苷酸可存在于引物的3
′
端处以使得解封闭使引物可延伸。或者，核苷酸可在解封闭时呈单体形式。
[0055]
如本文所使用的术语“每个”在关于物品集合使用时旨在识别集合中的个别物品，但不一定指集合中的每一物品。如果明确公开内容或上下文另外清楚地指示，则可能存在例外情况。
[0056]
除非另外指定，否则如本文所使用的短语“至少一个选自a、b和c的列表的要素”旨在读取包含来自所述列表的一个要素、来自所述列表的两个要素或所述列表的全部要素的组，并且可能但不一定旨在需要表示每个要素a、b和c。
[0057]
如本文所使用的“外源”在关于分子部分使用时是指不存在于分子天然类似物中的化学部分。例如，核苷酸的外源标记是不存在于天然存在的核苷酸上的标记。类似地，存在于核酸上的外源接头未在处于核酸天然环境下的核酸上发现到。
[0058]
如本文所使用的“延伸”在关于核酸使用时是指向核酸的3
′
端添加至少一个核苷酸的过程。术语“聚合酶延伸”在关于核酸使用时是指向核酸的3
′
端添加一个或多个个别核苷酸的聚合酶催化过程。术语“连接酶延伸”在关于核酸使用时是指向核酸的3
′
端添加至少一个寡核苷酸的连接酶催化过程。通过延伸添加到核酸中的核苷酸或寡核苷酸被称为并入核酸中。因此，术语“合并”可用于指通过形成磷酸二酯键将核苷酸或寡核苷酸接合至核酸的3
′
端的过程。
[0059]
如本文所使用的“可延伸”在关于核苷酸使用时意味着核苷酸在3
′
位置处具有氧或羟基部分，并且在并入核酸中的情况下和当并入核酸中时能够与下一恰当核苷酸(或寡核苷酸)形成共价键。可延伸核苷酸可处于引物的3
′
位置处或者其可为单体核苷酸。可延伸核苷酸缺乏例如可逆终止子部分的封闭部分，并且解封闭核苷酸或核酸链常常是可延伸的。
[0060]
如本文所使用的“流动池”是包括一个或多个将流体导引至检测区的通道的容器。所述检测区可耦合至检测器以使得可观测到发生在容器中的反应。例如，流动池可含有系栓至固相支撑物的引发模板核酸分子，向所述固相支撑物反复地施用核苷酸和辅助试剂并且将其洗掉。流动池可包括在发生期望反应之后容许样品成像的透明材料。例如，流动池可包括含有小流体通道的玻璃或塑料载片，聚合酶、dntp和缓冲剂可流动所述小流体通道。通道内部的玻璃或塑料可用待检测的一个或多个引发模板核酸分子装饰。外部成像系统可经定位以在检测区处检测分子。示例性流动池、其制造方法和其使用方法描述于以下中：2010年5月6日公开的美国专利申请公开第2010/0111768a1号或2012年10月25日公开的美国专利申请公开第2012/0270305 a1号；或2005年7月25日公开的美国专利申请公开第wo 05/065814号，所述申请公开中的每一者特此通过引用整体并入本文。
[0061]
如本文所使用的“流体”是指能够流动和改变其形状以填充容器的液体或气体。在许多条件下，流体在受到倾向于改变其形状的力作用时以稳定速率改变形状。示例性流体是作为含气泡液体的流体发泡体。可例如用于流体发泡体中的示例性液体包括含有例如结合反应、核酸测序反应或分析测定中所用反应的反应试剂或产物的液体。水性液体可为特别适用的。示例性气体包括例如氮气(n2)的惰性气体或稀有气体。适用的稀有气体包括例如氦气(he)、氖气(ne)、氩气(ar)、氪气(kr)和氙气(xe)。另一适用气体是地球大气。流体发泡体和用于制造并使用流体发泡体的方法的其他实例阐述于美国专利申请第62/883,276
号中，所述专利申请通过引用并入本文。
[0062]
如本文所使用的“卤素原子”、“卤素”或“卤基”是指例如氟、氯、溴和碘的元素周期表第7栏的辐射稳定原子中的任一者。另外，例如“卤烷基”的术语意在包括单卤烷基和多卤烷基。例如，术语“卤基(c
1-c4)烷基”包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
[0063]
如本文所使用的“杂环基”是指包括至少一个杂原子(例如o、n、s)的环系。此类体系可为不饱和的，可包括一些不饱和，或者可含有一些芳族部分，或者是全部芳族的。杂环基部分可未被取代或被取代。
[0064]
如本文所使用的“杂脂环”或“杂脂环基”是指三、四、五、六、七、八、九、十元或更多元至18元单环、双环和三环环系，其中碳原子与1至5个杂原子一起构成环系。杂环可任选地含有一个或多个不饱和键，然而所述一个或多个不饱和键以使得完全离域π电子体系不遍及全部环存在的方式定位。杂原子独立地选自氧、硫和氮。杂环可进一步含有一个或多个羰基或硫羰基官能团，并且因此定义包括例如内酰胺、内酯、环状酰亚胺、环状硫酰亚胺和环状氨基甲酸酯的氧代基-体系和硫基-体系。当由两个或更多个环构成时，环可以稠合方式接合在一起。另外，杂脂环部分中的任何氮可被季铵化。杂脂环基或杂脂环部分可未被取代或被取代。此类“杂脂环”或“杂脂环基”部分的实例包括但不限于1，3-二氧杂环己烯、1，3-二噁烷、1，4-二噁烷、1，2-二氧杂环戊烷、1，3-二氧杂环戊烷、1，4-二氧杂环戊烷、1，3-氧硫杂环己烷、1，4-噁噻嗪、1，3-氧硫杂环戊烷、1，3-二硫杂环戊烯、1，3-二硫杂环戊烷、1，4-氧硫杂环己烷、四氢-1，4-噻嗪、2h-1，2-噁嗪、顺丁烯二酰亚胺、丁二酰亚胺、巴比妥酸、硫基巴比妥酸、二氧代哌嗪、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、三噁烷、六氢-1，3，5-三嗪、咪唑啉、咪唑烷、异噁唑啉、异噁唑烷、噁唑啉、噁唑烷、噁唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷、吗啉、环氧乙烷、哌啶n-氧化物、哌啶、哌嗪、吡咯烷、吡咯烷酮、吡咯烷二酮、4-哌啶酮、吡唑啉、吡唑烷、2-氧代吡咯烷、四氢吡喃、4h-吡喃、四氢硫代吡喃、噻吗啉、噻吗啉亚砜、噻吗啉砜及其苯并稠合类似物(例如苯并咪唑烷酮、四氢喹啉、3，4-亚甲基二氧基苯基)。在实施方案中，稠环杂脂环基是指稠合在一起的多个环，其中稠环中的至少一个是杂脂环基环并且其中多个环经由含于多个环的杂脂环基环内的任何原子附接至母分子部分。单独或作为另一取代基的一部分的“亚杂脂环基”是指衍生自杂脂环基的二价基。
[0065]
如本文所使用的“杂芳基”是指含有一个或多个杂原子，即除碳以外的元素，包括但不限于氮、氧和硫和至少一个芳环的单环或多环芳族环系(具有具备完全离域π电子体系的至少一个环的环系)。杂芳基部分的一个或多个环中的原子数目可变化。例如，在一些实施方案中，杂芳基部分可在一个或多个环中含有4至14个原子、在一个或多个环中含有5至10个原子或在一个或多个环中含有5至6个原子。此外，术语“杂芳基”包含稠合环系，其中例如至少一个芳基环和至少一个杂芳基环或至少两个杂芳基环的两个环共享至少一个化学键。杂芳基环的实例包括但不限于呋喃、呋咱、噻吩、苯并噻吩、酞嗪、吡咯、噁唑、苯并噁唑、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、噻唑、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、苯并噻唑、咪唑、苯并咪唑、吲哚、吲唑、吡唑、苯并吡唑、异噁唑、苯并异噁唑、异噻唑、三唑、苯并三唑、噻二唑、四唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、嘌呤、蝶啶、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹噁啉、噌啉和三嗪。杂芳基部分可被取代或未被取代。在实施方案中，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基，其中多个环稠合在一起并且其中稠环中的至少一个是杂芳环并且其中多个环经由含于多个环的杂芳环内
的任何原子附接至母分子部分。单独或作为另一取代基的一部分的“亚杂芳基”是指衍生自杂芳基的二价基。
[0066]
如本文所使用的“(杂脂环基)烷基”是作为取代基经由低级亚烷基部分连接的杂环或杂脂环部分。(杂脂环基)烷基的低级亚烷基和杂环或杂环基可被取代或未被取代。实例包括但不限于四氢-2h-吡喃-4-基)甲基、(哌啶-4-基)乙基、(哌啶-4-基)丙基、(四氢-2h-硫代吡喃-4-基)甲基和(1，3-硫杂环己烷-4-基)甲基。
[0067]
如本文所使用的“杂芳烷基”和“杂芳(烷基)”是指作为取代基经由低级亚烷基部分连接的杂芳基。杂芳烷基的低级亚烷基和杂芳基部分可被取代或未被取代。实例包括但不限于2-噻吩基烷基、3-噻吩基烷基、呋喃基烷基、噻吩基烷基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、异噁唑基烷基和咪唑基烷基以及其苯并稠合类似物。
[0068]
如本文所使用的“羟基”是指-oh部分。类似地，“羟化”是指已添加有-oh部分例如以促进溶解性的分子。
[0069]
如本文所使用的“标记”是指提供可检测特征的分子或其部分。例如，可检测特征可为光信号，例如辐射吸光度、荧光发射、发光发射、荧光寿命、荧光偏振等；瑞利(rayleigh)和/或米氏(mie)散射；针对例如抗体或抗生蛋白链菌素的配体或受体的结合亲和力；磁特性；电特性；传导性；电荷；质量；放射性等。示例性标记包括但不限于荧光团、发光团、发色团、纳米粒子(例如金、银、碳纳米管)、重原子、放射性同位素、质量标记、电荷标记、自旋标记、受体、配体等。
[0070]
如本文所使用的“接头”和“接头部分”是指接合两个不同实体的原子或部分。通常，接头在两个实体之间提供或包括共价键或一系列共价键。然而，接头可包括例如在受体与配体之间形成的非共价键的非共价键。示例性可连接实体包括但不限于固体支撑物、部分(例如核酸的核苷酸单体或核苷酸的碱基)或分子(例如核酸或标记)。
[0071]
如本文所使用的“下一恰当核苷酸”是指在引物的3
′
端处结合和/或合并以补足当经恰当地碱基配对时与引物杂交的模板链中的碱基的核苷酸类型。模板链中的碱基称为“下一碱基”并且紧邻与引物的3
′
端杂交的模板中的碱基的5
′
。下一恰当核苷酸可称为下一碱基的“同源”物并且反之亦然。在三元复合物中或在双链核酸中彼此相互作用的同源核苷酸称为彼此“配对”。根据华特生-克里克配对规则(watson-crick pairing rule)，腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)配对，并且鸟嘌呤(g)与胞嘧啶(c)或尿嘧啶(u)配对。具有不与下一模板碱基互补的碱基的核苷酸称为“不恰当”、“错配”或“非同源”核苷酸。
[0072]
如本文所使用的“核碱基”(也称为“含氮碱基”或“碱基”)是指形成核苷酸的分化单元的嘌呤或嘌呤衍生物或嘧啶或嘧啶衍生物。五个初级或典型核碱基是腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)。腺嘌呤和鸟嘌呤是嘌呤碱基。胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶是嘧啶碱基。呈典型双螺旋形式的碱基对中的每一者包括嘌呤和嘧啶：a与t配对，a与u配对，或g与c配对或g与u配对。这些嘌呤-嘧啶对称为
‘
碱基互补序列’或称为彼此“互补”。特别是，依据用封闭基团置换一些保护基团，胞嘧啶核碱基经受修饰或降解。
[0073]
如本文所使用的“核酸”是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。因此，示例性“核酸”是例如dna、rna或其任何组合的多核苷酸。在核酸合成或检测期间，典型核酸可受聚合酶作用。术语“核酸”包括单链、双链或多链dna、rna和其类似物(衍生物)。
[0074]
如本文所使用的“核苷酸”可用于指天然核苷酸或其类似物。一般来说，核苷酸具
有三个部分：核碱基(例如嘌呤或嘧啶)、五碳糖(例如核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸酯。实例包括但不限于三磷酸核苷酸(ntp)，例如三磷酸核糖核苷酸(rntp)、三磷酸脱氧核糖核苷酸(dntp)或其非天然类似物，例如三磷酸二脱氧核糖核苷酸(ddntp)或可逆地终止的三磷酸核苷酸(rtntp)。核苷酸可呈单体形式，例如呈三磷酸核苷酸、二磷酸核苷酸或单磷酸核苷酸形式。核苷酸也可为例如根据其在核酸聚合物中的位置来识别的所述聚合物的部分，例如3
′
核苷酸(即，存在于所述聚合物3
′
端处的核苷酸部分)或5
′
核苷酸(即，存在于所述聚合物5
′
端处的核苷酸部分)。核苷含有核碱基和5碳糖。因此，核苷酸是具有磷酸酯部分的核苷。
[0075]
如本文所使用的“任选地被取代”在关于分子部分使用时意味着部分可未被取代或被所指示取代基中的一者或多者取代。同样，当部分描述为“被取代或未被取代”或“未被取代或被取代”时，取代基可选自一个或多个所指示取代基。如果未指示取代基，则意味着所指示“任选地被取代”或“被取代”的部分可单独地且独立地被一个或多个单独地且独立地选自一组官能团的部分取代，所述官能团包括但不限于烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、受保护羟基、烷氧基、芳氧基、酰基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、硫羰基、o-氨甲酰基、n-氨甲酰基、o-硫代氨甲酰基、n-硫代氨甲酰基、c-酰氨基、n-酰氨基、s-磺酰胺基、n-磺酰胺基、c-羧基、受保护c-羧基、o-羧基、异氰酸基、硫氰基、异硫氰基、硝基、甲硅烷基、次磺酰基、亚磺酰基、磺酰基、卤烷基、卤烷氧基、三卤甲磺酰基、三卤甲磺酰胺基、氨基、被单取代的氨基、被二取代的氨基和其受保护衍生物。如果未关于“未被取代”的部分指示取代基，则一个或多个所省略的部分可单独地且独立地选自一组官能团，所述官能团包括但不限于前一句或本文其他地方所阐述的官能团。
[0076]
上文术语(例如“烷基”、“烯基”、“炔基”、“杂烷基”、“环烷基”、“环烯基”、“环炔基”、“杂脂环基”、“芳基”、“杂芳基”、“亚烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”、“亚杂烷基”、“亚环烷基”、“亚环烯基”、“亚环炔基”、“亚杂脂环基”、“亚芳基”和“亚杂芳基”)中的每一者包括所指示基团的被取代形式和未被取代形式。下文提供每个类型的基团的优选取代基。
[0077]
烷基和杂烷基的取代基可为选自但不限于以下的各种基团中的一者或多者：-or
′
、＝o、＝nr
′
、＝n-or
′
、-nr
′r″
、-sr
′
、-卤索、-sir
′r″r″′
、-oc(o)r
′
、-c(o)r
′
、-co2r
′
、-conr
′r″
、-oc(o)nr
′r″
、-nr
″
c(o)r
′
、-nr
′
c(o)nr
″r″′
、-nr
″
c(o)2r
′
、-nrc(nr
′r″r″′
)＝nr
″′
、-nrc(nr
′r″
)＝nr
″′
、-s(o)r
′
、-s(o)2r
′
、-s(o)2nr
′r″
、-nrso2r
′
、-nr
′
nr
″r″′
、-onr
′r″
、-nr
′
c(o)nr
″
nr
″′r″″
、-cn、-no2、-nr
′
so2r
″
、-nr
′
c(o)r
″
、-nr
′
c(o)or
″
、-nr
′
or
″
、-n3，数值范围为零至(2m
′
+-1)，其中m
′
是所述基团中的碳原子总数。r、r
′
、r
″
、r
″′
和r
″″
各自优选独立地指氢、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳基(例如被1-3个卤素取代的芳基)、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基、或芳烷基。当本文所描述的化合物包括超过一个r基团时，例如当这些基团中超过一者存在时，r基团中的每一者各自独立地选择，如同每个r
′
、r
″
、r
″′
和r
″″
基团一样。当r
′
和r
″
附接至同一氮原子时，其可与氮原子组合以形成4元、5元、6元或7元环。例如，-nr
′r″
包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据上文对取代基的论述，本领域技术人员应理解术语“烷基”意在包括结合至除氢基团以外的基团的包含碳原子的基团，例如卤烷基(例如-cf3和-ch2cf3)和酰基(例如-c(o)ch3、-c(o)
n3、未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)、未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)、未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)、未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)、未被取代的环烷基(例如c
3-c8环烷基、c
3-c6环烷基或c
5-c6环烷基)、未被取代的环烯基(例如c
3-c8环烯基、c
3-c6环烯基或c
5-c6环烯基)、未被取代的环炔基(例如c
3-c8环炔基、c
3-c6环炔基或c
5-c6环炔基)、未被取代的杂脂环基(例如3至8元杂脂环基、3至6元杂脂环基或5至6元杂脂环基)、未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)，和
[0088]
(b)烷基(例如c
1-c
20
、c
1-c
12
、c
1-c8、c
1-c6、c
1-c4或c
1-c2)、烯基(例如c
2-c
20
、c
2-c
12
、c
2-c8、c
2-c6或c
2-c4)、炔基(例如c
2-c
20
、c
2-c
12
、c
2-c8、c
2-c6或c
2-c4)、杂烷基(例如2至20元、2至12元、2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、环烷基(例如c
3-c
10
、c
3-c8、c
3-c6、c
4-c6或c
5-c6)、环烯基(例如c
3-c
10
、c
3-c8、c
3-c6、c
4-c6或c
5-c6)、环炔基(例如c
3-c
10
、c
3-c8、c
3-c6、c
4-c6或c
5-c6)、杂脂环基(例如3至10元、3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、芳基(例如c
6-c
12
、c
6-c
10
或苯基)或杂芳基(例如5至12元、5至10元、5至9元或5至6元)，被至少一个选自以下的取代基取代：氧代基、卤索、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-oso3h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-n3、未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)、未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)、未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)、未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)、未被取代的环烷基(例如c
3-c8环烷基、c
3-c6环烷基或c
5-c6环烷基)、未被取代的环烯基(例如c
3-c8环烯基、c
3-c6环烯基或c
5-c6环烯基)、未被取代的环炔基(例如c
3-c8环炔基、c
3-c6环炔基或c
5-c6环炔基)、未被取代的杂脂环基(例如3至8元杂脂环基、3至6元杂脂环基或5至6元杂脂环基)、未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。
[0089]
如本文所使用的“尺寸受限的取代基”或“尺寸受限的取代基基团”是指选自上文针对“取代基”所描述的全部取代基的基团，其中每个被取代或未被取代的烷基是被取代或未被取代的c
1-c
20
烷基，每个被取代或未被取代的烯基是被取代或未被取代的c
2-c
20
烯基，每个被取代或未被取代的炔基是被取代或未被取代的c
2-c
20
炔基，每个被取代或未被取代的杂烷基是被取代或未被取代的2至20元杂烷基，每个被取代或未被取代的环烷基是被取代或未被取代的c
3-c8环烷基，每个被取代或未被取代的环烯基是被取代或未被取代的c
3-c8环烯基，每个被取代或未被取代的环炔基是被取代或未被取代的c
3-c8环炔基，每个被取代或未被取代的杂脂环基是被取代或未被取代的3至8元杂脂环基，每个被取代或未被取代的芳基是被取代或未被取代的c
6-c
10
芳基，并且每个被取代或未被取代的杂芳基是被取代或未被取代的5至10元杂芳基。
[0090]
如本文所使用的“低级取代基”或“低级取代基基团”是指选自上文针对“取代基”所描述的全部取代基的基团，其中每个被取代或未被取代的烷基是被取代或未被取代的c
1-c8烷基，每个被取代或未被取代的烯基是被取代或未被取代的c
2-c8烯基，每个被取代或
未被取代的炔基是被取代或未被取代的c
2-c8炔基，每个被取代或未被取代的杂烷基是被取代或未被取代的2至8元杂烷基，每个被取代或未被取代的环烷基是被取代或未被取代的c
3-c7环烷基，每个被取代或未被取代的环烯基是被取代或未被取代的c
3-c7环烯基，每个被取代或未被取代的环炔基是被取代或未被取代的c
3-c7环炔基，每个被取代或未被取代的杂脂环基是被取代或未被取代的3至7元杂脂环基，每个被取代或未被取代的芳基是被取代或未被取代的c
6-c
10
芳基，并且每个被取代或未被取代的杂芳基是被取代或未被取代的5至9元杂芳基。
[0091]
在一些实施方案中，本文化合物中所描述的每个被取代的基团是被至少一个取代基取代。更具体来说，在一些实施方案中，本文化合物中所描述的每个被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的杂烷基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、被取代的环炔基、被取代的杂脂环基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的亚烷基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳基和/或被取代的亚杂芳基是被至少一个取代基取代。在其他实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个尺寸受限的取代基取代。在其他实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个低级取代基取代。
[0092]
在本文化合物的其他实施方案中，每个被取代或未被取代的烷基可为被取代或未被取代的c
1-c
20
烷基，每个被取代或未被取代的烯基可为被取代或未被取代的c
2-c
20
烯基，每个被取代或未被取代的炔基可为被取代或未被取代的c
2-c
20
炔基，每个被取代或未被取代的杂烷基是被取代或未被取代的2至20元杂烷基，每个被取代或未被取代的环烷基是被取代或未被取代的c
3-c8环烷基，每个被取代或未被取代的环烯基是被取代或未被取代的c
3-c8环烯基，每个被取代或未被取代的环炔基是被取代或未被取代的c
3-c8环炔基，每个被取代或未被取代的杂脂环基是被取代或未被取代的3至8元杂脂环基，每个被取代或未被取代的芳基是被取代或未被取代的c
6-c
10
芳基，并且/或每个被取代或未被取代的杂芳基是被取代或未被取代的5至10元杂芳基。在本文化合物的一些实施方案中，每个被取代或未被取代的亚烷基是被取代或未被取代的c
1-c
20
亚烷基，每个被取代或未被取代的亚烯基是被取代或未被取代的c
2-c
20
亚烯基，每个被取代或未被取代的亚炔基是被取代或未被取代的c
2-c
20
亚炔基，每个被取代或未被取代的亚杂烷基是被取代或未被取代的2至20元亚杂烷基，每个被取代或未被取代的亚环烷基是被取代或未被取代的c
3-c8亚环烷基，每个被取代或未被取代的亚环烯基是被取代或未被取代的c
3-c8亚环烯基，每个被取代或未被取代的亚环炔基是被取代或未被取代的c
3-c8亚环炔基，每个被取代或未被取代的亚杂脂环基是被取代或未被取代的3至8元亚杂脂环基，每个被取代或未被取代的亚芳基是被取代或未被取代的c
6-c
10
亚芳基，并且/或每个被取代或未被取代的亚杂芳基是被取代或未被取代的5至10元亚杂芳基。
[0093]
在一些实施方案中，每个被取代或未被取代的烷基是被取代或未被取代的c
1-c8烷基，每个被取代或未被取代的烯基是被取代或未被取代的c
2-c8烯基，每个被取代或未被取代的炔基是被取代或未被取代的c
2-c8炔基，每个被取代或未被取代的杂烷基是被取代或未被取代的2至8元杂烷基，每个被取代或未被取代的环烷基是被取代或未被取代的c
3-c7环烷基，每个被取代或未被取代的环烯基是被取代或未被取代的c
3-c7环烯基，每个被取代或未被取代的环炔基是被取代或未被取代的c
3-c7环炔基，每个被取代或未被取代的杂脂环基是
被取代或未被取代的3至7元杂脂环基，每个被取代或未被取代的芳基是被取代或未被取代的c
6-c
10
芳基，并且/或每个被取代或未被取代的杂芳基是被取代或未被取代的5至9元杂芳基。在一些实施方案中，每个被取代或未被取代的亚烷基是被取代或未被取代的c
1-c8亚烷基，每个被取代或未被取代的亚烯基是被取代或未被取代的c
2-c8亚烯基，每个被取代或未被取代的亚炔基是被取代或未被取代的c
2-c8亚炔基，每个被取代或未被取代的亚杂烷基是被取代或未被取代的2至8元亚杂烷基，每个被取代或未被取代的亚环烷基是被取代或未被取代的c
3-c7亚环烷基，每个被取代或未被取代的亚环烯基是被取代或未被取代的c
3-c7亚环烯基，每个被取代或未被取代的亚环炔基是被取代或未被取代的c
3-c7亚环炔基，每个被取代或未被取代的亚杂脂环基是被取代或未被取代的3至7元亚杂脂环基，每个被取代或未被取代的亚芳基是被取代或未被取代的c
6-c
10
亚芳基，并且/或每个被取代或未被取代的亚杂芳基是被取代或未被取代的5至9元亚杂芳基。在一些实施方案中，化合物是应用(例如下文实施例部分、附图或表格)中所阐述的化学物质。
[0094]
在实施方案中，被取代或未被取代的部分(例如被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚烯基、被取代或未被取代的亚炔基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚环烯基、被取代或未被取代的亚环炔基、被取代或未被取代的亚杂脂环基、被取代或未被取代的亚芳基和/或被取代或未被取代的亚杂芳基)是未被取代的(例如分别是未被取代的烷基、未被取代的烯基、未被取代的炔基、未被取代的杂烷基、未被取代的环烷基、未被取代的环烯基、未被取代的环炔基、未被取代的杂脂环基、未被取代的芳基、未被取代的杂芳基、未被取代的亚烷基、未被取代的亚烯基、未被取代的亚炔基、未被取代的亚杂烷基、未被取代的亚环烷基、未被取代的亚环烯基、未被取代的亚环炔基、未被取代的亚杂脂环基、未被取代的亚芳基和/或未被取代的亚杂芳基)。在实施方案中，被取代或未被取代的部分(例如被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚烯基、被取代或未被取代的亚炔基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚环烯基、被取代或未被取代的亚环炔基、被取代或未被取代的亚杂脂环基、被取代或未被取代的亚芳基和/或被取代或未被取代的亚杂芳基)是被取代的(例如分别是被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的杂烷基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、被取代的环炔基、被取代的杂脂环基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳基和/或被取代的亚杂芳基)。
[0095]
在实施方案中，被取代的部分(例如被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的杂烷基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、被取代的环炔基、被取代的杂脂环基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取
代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳基和/或被取代的亚杂芳基)被至少一个取代基取代，其中如果被取代的部分被多个取代基取代，则每个取代基可任选地是不同的。在实施方案中，如果被取代的部分被多个取代基取代，则每个取代基是不同的。
[0096]
在实施方案中，被取代的部分(例如被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的杂烷基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、被取代的环炔基、被取代的杂脂环基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳基和/或被取代的亚杂芳基)被至少一个尺寸受限的取代基取代，其中如果被取代的部分被多个尺寸受限的取代基取代，则每个尺寸受限的取代基可任选地是不同的。在实施方案中，如果被取代的部分被多个尺寸受限的取代基取代，则每个尺寸受限的取代基是不同的。
[0097]
在实施方案中，被取代的部分(例如被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的杂烷基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、被取代的环炔基、被取代的杂脂环基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳基和/或被取代的亚杂芳基)被至少一个低级取代基取代，其中如果被取代的部分被多个低级取代基取代，则每个低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，如果被取代的部分被多个低级取代基取代，则每个低级取代基是不同的。
[0098]
在实施方案中，被取代的部分(例如被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的杂烷基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、被取代的环炔基、被取代的杂脂环基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳基和/或被取代的亚杂芳基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的部分被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，如果被取代的部分被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基是不同的。
[0099]
本公开的某些化合物具有不对称碳原子(光学或手性中心)或双键；就绝对立体化学来说可针对氨基酸定义为(r)-或(s)-或定义为(d)-或(l)-的对映异构体、外消旋物、非对映异构体、互变异构体、几何异构体、立体异构形式以及个别异构体涵盖于本公开的范围内。本公开的化合物不包括本领域中已知太不稳定而难以合成和/或分离的化合物。本公开意在包括呈外消旋和光学纯形式的化合物。光学活性(r)-和(s)-或(d)-和(l)-异构体可使用手性合成子或手性试剂来制备或使用常规技术来拆分。当本文所描述的化合物含有烯键或其他几何不对称中心时并且除非另外规定，否则希望所述化合物包括e几何异构体和z几何异构体。
[0100]
如本文所使用的术语“异构体”是指具有相同数目和种类的原子并因此具有相同分子量、但原子结构布置或构型不同的化合物。
[0101]
如本文所使用的术语“互变异构体”是指平衡存在并且易于从一种异构形式转化
成另一异构形式的两种或更多种结构异构体中的一者。
[0102]
本领域技术人员将显而易知，本公开的某些化合物可以互变异构形式存在，化合物的全部此类互变异构形式都在本公开的范围内。
[0103]
除非另外说明，否则本文所描绘的结构也意在包括结构的全部立体化学形式；即，关于每个不对称中心的r构型和s构型。因此，本发明化合物的单独立体化学异构体以及对映异构和非对映异构体混合物在本公开的范围内。
[0104]
除非另外说明，否则本文所描绘的结构也意在包括仅在存在一个或多个同位素富集原子的情况下有所不同的化合物。例如，除氢被氘或氚置换或碳被
13
c或
14
c富集碳置换之外具有本发明结构的化合物在本公开的范围内。
[0105]
本公开的化合物也可在构成此类化合物的原子中的一者或多者处含有非天然比例的原子同位素。例如，化合物可用例如氚(3h)、碘-125(
125
i)或碳-14(
14
c)的放射性同位素进行放射性标记。本公开的化合物的全部同位素变体无论是否具放射性均涵盖于本公开的范围内。
[0106]
应注意，在整个本技术中，将替代物写入马库什组(markush group)中，例如每个含有超过一个可能的氨基酸的氨基酸位置。特定地考虑，马库什组的每个成员应分开予以考虑，由此包括另一实施方案，并且马库什组不作为单个单元来读取。
[0107]“类似物(analog/analogue)”是根据其在《化学生物学(chemistry and biology)》内的普通一般含义来使用并且是指与另一化合物(即所谓的“参考化合物”)结构上类似、但组成不同的化合物，所述组成例如一个原子被不同元素的原子置换、或特定官能团的存在、或一个官能团被另一官能团置换、或参考化合物的一个或多个手性中心的绝对立体化学。因此，类似物是与参考化合物在功能和外观上类似或相当、但在结构或起源上不类似或相当的化合物。
[0108]
如本文所使用的术语“一个”或“一种”是指一个或多个/一种或多种。另外，如本文所使用的短语“被a[n]取代”是指规定基团可被任何或全部命名取代基中的一者或多者取代。例如，在例如烷基或杂芳基的基团“被未被取代的c
1-c
20
烷基或未被取代的2至20元杂烷基取代”的情况下，所述基团可含有一个或多个未被取代的c
1-c
20
烷基和/或一个或多个未被取代的2至20元杂烷基。
[0109]
如本文所使用的术语“约”是指包含规定值的值范围，本领域一般技术人员将所述值范围视为与规定值合理地类似。在实施方案中，约是指在使用本领域中一般可接受的测量结果的标准偏差内。在实施方案中，约是指延伸至规定值的+/-10％的范围。在实施方案中，约包括规定值。
[0110]
在本公开中，“包含”、“含有”和“具有”等可具有在美国专利法中归属于其的含义并且可指“包括”等。“基本上由......组成”或“基本上组成”同样具有在美国专利法中所归属的含义并且所述术语是开放式的，允许存在所列举内容以外的内容，只要所列举内容的基础或新颖特征不因所列举内容以外的内容的存在而变化即可，但排除现有技术实施方案。
[0111]
此外，在部分被r取代基取代的情况下，基团可称为“被r取代的”。在部分是被r取代的情况下，部分被至少一个r取代基取代并且每个r取代基任选地是不同的。在特定r基团存在于化学属(例如式(i))描述中的情况下，可使用罗马字母符号以区分所述特定r基团的
每个外观。例如，在多个r
13
取代基存在的情况下，每个r
13
取代基可区分为r
13a
、r
13b
、r
13c
、r
13d
等，其中r
13a
、r
13b
、r
13c
、r
13d
等中的每一者的定义是在r
13
定义的范围内并且任选地不同。
[0112]“可检测剂”或“可检测部分”是可通过例如光谱法、光化学、生物化学、免疫化学、化学、磁共振成像或其他物理手段的适当手段来检测的物质、元素、化合物或组合物；或其部分。例如，适用可检测剂包括
18
f、
32
p、
33
p、
45
ti、
47
sc、
52
fe、
59
fe、
62
cu、
64
cu、
67
cu、
67
ga、
68
ga、
77
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86
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90
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89
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94
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99
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105
pd、
105
rh、
111
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111
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123
i、
124
i、
125
i、
131
i、
142
pr、
143
pr、
149
pm、
153
sm、
154-1581
gd、
161
tb、
166
dy、
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169
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175
lu、
177
lu、
186
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188
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189
re、
194
ir、
198
au、
199
au、
211
at、
211
pb、
212
bi、
212
pb、
213
bi、
223
ra、
225
ac、cr、v、mn、fe、co、ni、cu、la、ce、pr、nd、pm、sm、eu、gd、tb、dy、ho、er、tm、yb、lu、
32
p、荧光团(例如荧光染料)、电子致密试剂、酶(例如如elisa中所常用)、生物素、洋地黄毒苷、顺磁分子、顺磁纳米粒子、超小超顺磁氧化铁(“uspio”)纳米粒子、uspio纳米粒子聚集体、超顺磁氧化铁(“spio”)纳米粒子、spio纳米粒子聚集体、单结晶氧化铁纳米粒子、单结晶氧化铁、纳米粒子造影剂、脂质体或含有钆螫合物(“gd-螫合物”)分子的其他递送媒介物、钆、放射性同位素、放射性核素(例如碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、铷-82)、氟脱氧葡萄糖(例如氟-18标记)、任何γ射线发射放射性核素、正电子发射放射性核素、放射性标记葡萄糖、放射性标记水、放射性标记氨、生物胶体、微泡(例如包括有包含白蛋白、半乳糖、脂质和/或聚合物的微泡壳体；包含空气、重气、全氟碳、氮、八氟丙烷、全氟己烷脂质微球、全氟丙烷等的微泡气体核)、碘化造影剂(例如碘海醇、碘克沙醇、碘佛醇、碘帕醇、碘昔兰、碘普罗胺、泛影酸盐、甲泛影酸盐、碘克沙酸盐)、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米粒子、金纳米粒子聚集体、荧光团、双光子荧光团或半抗原和蛋白质或者可例如通过将放射性标记并入特定地对靶肽具反应性的肽中而可检测的其他实体。可检测部分是单价可检测剂或能够与另一组合物形成键的可检测剂。
[0113]
可根据本公开的实施方案用作成像和/或标记剂的放射性物质(例如放射性同位素)包括但不限于
18
f、
32
p、
33
p、
45
ti、
47
sc、
52
fe、
59
fe、
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lu、
177
lu、
186
re、
188
re、
189
re、
194
ir、
198
au、
199
au、
211
at、
211
pb、
212
bi、
212
pb、
213
bi、
223
ra和
225
ac。可根据本公开的实施方案用作额外成像剂的顺磁离子包括但不限于过渡和镧系金属(例如原子序数是21-29、42、43、44或57-71的金属)的离子。这些金属包括cr、v、mn、fe、co、ni、cu、la、ce、pr、nd、pm、sm、eu、gd、tb、dy、ho、er、tm、yb和lu的离子。
[0114]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物，其中所述聚合物可任选地与不由氨基酸组成的部分缀合。所述术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0115]
如本文所使用的“肟”是指具有以下结构的部分：
[0116]
肟部分可经由氧原子附接至另一部分，在这种情况下，部分可称为“o-肟”部分。醛肟部分在r或r
′
中的一者处具有氢。酮肟在r和r
′
处均不具有氢。在本文所公开的一些实施
方案中，肟是示例性保护基团。3
′‑
o-肟是经由肟氧附接至核苷酸或核苷的3
′
碳的肟部分。
[0117]
如本文所使用的“聚合酶”可用于指核酸合成酶，包括但不限于dna聚合酶、rna聚合酶、逆转录酶、引物酶和转移酶。通常，聚合酶具有一个或多个活性位点，在所述一个或多个活性位点处可发生核苷酸结合和/或核苷酸聚合的催化。聚合酶可催化核苷酸聚合至双链核酸分子的第一链的3
′
端。例如，聚合酶可催化下一恰当核苷酸经由磷酸二酯键添加到双链核酸分子的第一链的3
′
氧基团中，由此将核苷酸共价并入双链核酸分子的第一链中。任选地，聚合酶不需要能够在本文所阐述的方法中所用的一个或多个条件下进行核苷酸并入。例如，突变聚合酶可能能够形成三元复合物，但不能够催化核苷酸并入。
[0118]
如本文所使用的“引发模板核酸”或“引发模板”是指具有双链区域以使得一个链是引物并且另一个链是模板的核酸。两个链可为相连核酸分子的部分(例如发夹式结构)或者两个链可为彼此不共价附接的可分离分子。
[0119]
如本文所使用的“引物”是指具有在模板序列处或附近结合至核酸的序列的核酸。在特定配置中，引物以允许例如经由引物的聚合酶延伸或引物的连接酶延伸来进行模板复制的配置结合。引物可为结合至核酸分子的第二部分的核酸分子的第一部分，第一部分是引物序列并且第二部分是引物结合序列(例如发夹式引物)。或者，引物可为结合至具有模板序列的第二核酸分子的第一核酸分子。引物可由dna、rna或其类似物组成。引物可具有可延伸3
′
端或被封闭例如可逆地终止以阻止引物延伸直至除去封闭部分为止的3
′
端。
[0120]
如本文所使用的“位点”在关于阵列使用时是指其中存在特定分子的阵列中的位置。位点可仅含有单个分子或者其可含有相同种类的若干分子群体(例如分子集合)。或者，位点可包括不同种类的分子群体(例如不同模板序列群体)。阵列位点通常是离散的。离散位点可为相连的或者其彼此之间可具有空间。本文适用的阵列可具有例如间隔小于100微米、50微米、10微米、5微米、1微米或0.5微米的位点。可替代地或另外，阵列可具有间隔大于0.5微米、1微米、5微米、10微米、50微米或100微米的位点。位点的面积可各自小于1平方毫米、500平方微米、100平方微米、25平方微米、1平方微米或更小。阵列中的位点的位点密度可为例如至少约10个位点/cm2、100个位点/cm2、1
×
103个位点/cm2、1
×
104个位点/cm2、1
×
105个位点/cm2、1
×
106个位点/cm2或更高。
[0121]
如本文所使用的“固体支撑物”或“固相支撑物”是指不可溶于水性液体中的刚性基质。基质可为无孔或多孔的。基质可任选地能够吸收液体(例如由于孔隙度)，但将通常具有足够刚性以使得基质在吸收液体时基本上不膨胀并且在通过干燥除去液体时基本上不收缩。无孔固体支撑物通常对液体或气体来说不可渗透。示例性固体支撑物包括但不限于玻璃和改性或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸聚合物、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、teflon
tm
、环状烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、zeonor、二氧化硅或包括硅和改性硅的二氧化硅基材料、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物。
[0122]
如本文所使用的术语“表面”是指接触流体的固体支撑物的一部分。流体可为气体或液体。表面可为基本上扁平或平坦的。或者，表面可为圆的或波状的。可包括在表面上的示例性轮廓是孔、凹陷部分、柱、脊、通道等。可用作固体支撑物的示例性材料包括但不限于上文所阐述的材料。
[0123]
如本文所使用的“三元复合物”是指聚合酶、双链核酸与核苷酸之间的分子间缔
合。通常，聚合酶促进下一恰当核苷酸与引发核酸的模板链之间的相互作用。下一恰当核苷酸可经由华特生-克里克氢键结与模板链相互作用。术语“稳定三元复合物”是指三元复合物具有经促进或延长的存在或对三元复合物的破坏已得到抑制。一般来说，三元复合物的稳定防止三元复合物的核苷酸组分共价并入三元复合物的引发核酸组分中。
[0124]
如本文所使用的“类型”是用于识别共享同一化学结构的分子。例如，核苷酸混合物可包括若干dctp分子。dctp分子应理解为彼此类型相同的核苷酸，但与datp、dgtp、dttp等相比类型不同的核苷酸。类似地，具有相同核苷酸序列的个别dna分子是相同类型，而具有不同序列的dna分子是不同类型。术语“类型”也可识别共享同一化学结构的部分。例如，模板核酸中的胞嘧啶碱基应独立于其在模板序列中的位置而理解为彼此类型相同的碱基。
[0125]
如本文所使用的“容器”是用于将一个化学过程(例如结合事件；合并反应；向延伸链中添加核苷酸；从封闭的核苷酸或延伸引物的3
′
端除去可逆终止子；或由封闭部分置换保护部分；或例如涉及核酸化学反应的反应的其他反应)与另一化学过程间隔开或用于提供其中可发生化学过程的空间的容器。可结合所公开的技术使用的容器的非限制性实例包括：流动池；多孔板的孔；显微镜载片；管(例如毛细管)；液滴；小泡；试管；塔盘；离心管；阵列中的特征；导管；基质中的通道或核酸化学反应中所用的其他容积。如本文所使用的“制造容器”是人类制造或人类改进并用于将一个化学过程(例如结合事件；合并反应；保护部分的添加或去除；例如可逆终止子的封闭部分的添加或去除)与另一化学过程间隔开或用于提供其中可发生化学过程的空间的容器。
[0126]
如本文所使用的术语“降解(degrade/degradation)”在关于核苷酸或核苷酸的一部分时是指核苷酸或核苷酸的一部分的化学修饰，产生相对于原始(即未经降解)核苷酸或核苷酸部分来说具有至少一种经调节功能或活性的不同分子。在一些实施方案中，术语“降解”在关于核碱基时是指核碱基的化学修饰，引起核碱基或包含核碱基的核苷酸或核苷的活性或功能得到调节。在实施方案中，核碱基降解可称为“核苷酸降解”。在实施方案中，特定类型的核碱基或核苷酸的降解可称为特定核碱基类型或核苷酸类型的降解，例如“dc降解”是指脱氧胞苷降解(例如脱氧胞苷中的胞嘧啶核碱基降解、三磷酸脱氧胞苷中的脱氧胞苷降解、dna核酸中的胞嘧啶核碱基降解)。图3描绘产生降解dc的反应的实例。
[0127]
下文所阐述和权利要求中所叙述的实施方案可鉴于上文定义进行理解。
[0128]
组合物和方法
[0129]
本公开提供了组合物，其包含含有具有例如3
′‑
o-肟部分的保护基团的核苷酸和具有系栓至例如r2-onh2的可逆终止子的结构r2的试剂的溶液，其中r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)、被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r2具有大于甲基的分子量。在实施方案中，r2具有大于乙基的分子量。在实施方案中，r2的分子量大于36g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于57g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于100g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于200g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于300g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于400g/mol。在实施方案
中，r2的分子量大于500g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于600g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于700g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于800g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于900g/mol。在实施方案中，r2的分子量小于或等于1000g/mol。在实施方案中，r2的分子量小于1000g/mol。尽管不希望受机理限制，但据认为具有比氢和甲基更大的空间体积的r2部分产生与较小部分相比改进的合成结果，并且对核酸和核苷酸产生较少不合需要的修饰。参见下文实施例1a的结果。在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。类似地，在一些情况下，r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。在特定配置中，所述核苷酸具有结构：
[0130][0131]
b可为核碱基。r1可独立地为卤素、och3、h或oh。q可独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、氢或核酸。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体或外源标记部分。在实施方案中，r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。举例来说，核苷酸的3
′
位置处的部分可为醛肟(即，r3或r4中的一者为氢)或酮肟(r3或r4均不为氢)。
[0132]
被取代的b部分和未被取代的b部分均与本文公开内容一致。在实施方案中，b被取代。在实施方案中，b未被取代。在实施方案中，被取代的b(例如被取代的核碱基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的b被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当b被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当b被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当b被取代时，其被至少一个低级取代基取代。在实施方案中，b是被取代的腺嘌呤部分。在实施方案中，b是被取代的胞嘧啶部分。在实施方案中，b是被取代的鸟嘌呤部分。在实施方案中，b是被取代的胸腺嘧啶部分。在实施方案中，b是被取代的尿嘧啶部分。在实施方案中，b是未被取代的腺嘌呤部分。在实施方案中，b是未被取代的胞嘧啶部分。在实施方案中，b是未被取代的鸟嘌呤部分。在实施方案中，b是未被取代的胸腺嘧啶部分。在实施方案中，b是未被取代的尿嘧啶部分。
[0133]
类似地，被取代的q部分和未被取代的q部分与本文公开内容一致。在实施方案中，q被取代。在实施方案中，q未被取代。在实施方案中，被取代的q(例如被取代的单磷酸酯、被取代的二磷酸酯、被取代的三磷酸酯、氢原子和/或被取代的核酸)被至少一个取代基、尺寸
受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的q被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当q被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当q被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当q被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0134]
在实施方案中，q为脱氧核糖核酸。在实施方案中，q为核糖核酸。在实施方案中，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸。
[0135]
在实施方案中，r1为h。在实施方案中，r1为oh。
[0136]
在实施方案中，被取代的r3(例如被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、被取代的环炔基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的杂脂环基、被取代的芳烷基、被取代的杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的r3被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当r3被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当r3被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当r3被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0137]
在实施方案中，r3独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体或外源标记部分。在实施方案中，r3独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。在实施方案中，r3独立地为外源标记部分。
[0138]
在实施方案中，被取代的r4(例如被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、被取代的环炔基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的杂脂环基、被取代的芳烷基、被取代的杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的r4被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当r4被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当r4被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当r4被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0139]
在实施方案中，r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体或外源标记部分。在实施方案中，r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。在实施方案中，r4独立地为外源标记部分。
[0140]
在实施方案中，溶液是水溶液。在实施方案中，核苷酸附接至固体支撑物，并且其中所述固体支撑物与溶液接触。在实施方案中，包括结构r2-onh2的试剂附接至与水溶液接触的固体支撑物。在实施方案中，核碱基包括外源标记部分。
[0141]
本公开也提供了用于修饰核苷酸的方法。所述方法可通过以下来进行：使具有例如3
′‑
o-肟部分的保护部分的核苷酸与具有结构r2-封闭物的试剂反应，其中封闭是例如可
chbr2。在实施方案中，r6独立地为-chf2。在实施方案中，r6独立地为-chi2。在实施方案中，r6独立地为-ch2cl。在实施方案中，r6独立地为-ch2br。在实施方案中，r6独立地为-ch2f。在实施方案中，r6独立地为-ch2i。在实施方案中，r6独立地为-cn。在实施方案中，r6独立地为-oh。在实施方案中，r6独立地为-nh2。在实施方案中，r6独立地为-cooh。在实施方案中，r6独立地为-conh2。在实施方案中，r6独立地为-no2。在实施方案中，r6独立地为-sh。在实施方案中，r6独立地为-so3h。在实施方案中，r6独立地为-so4h。在实施方案中，r6独立地为-so2nh2。在实施方案中，r6独立地为-nhnh2。在实施方案中，r6独立地为-onh2。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)nhnh2。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)nh2。在实施方案中，r6独立地为-nhso2h。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)h。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)oh。在实施方案中，r6独立地为-nhoh。在实施方案中，r6独立地为-occl3。在实施方案中，r6独立地为-ocf3。在实施方案中，r6独立地为-ocbr3。在实施方案中，r6独立地为-oci3。在实施方案中，r6独立地为-ochcl2。在实施方案中，r6独立地为-ochbr2。在实施方案中，r6独立地为-ochi2。在实施方案中，r6独立地为-ochf2。在实施方案中，r6独立地为-och2cl。在实施方案中，r6独立地为-och2br。在实施方案中，r6独立地为-och2i。在实施方案中，r6独立地为-och2f。在实施方案中，r6独立地为-sf5。在实施方案中，r6独立地为-n3。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的芳烷基。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r6独立地为外源标记部分。
[0149]
在实施方案中，r6独立地为未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的芳烷基。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r6独立地为未被取代的(杂脂环基)
烷基。
[0150]
在实施方案中，被取代的r7(例如被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的杂烷基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、被取代的环炔基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的杂脂环基、被取代的芳烷基、被取代的杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的r7被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当r7被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当r7被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当r7被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0151]
在实施方案中，r7独立地为氢。在实施方案中，r7独立地为卤素。在实施方案中，r7独立地为-ccl3。在实施方案中，r7独立地为-cbr3。在实施方案中，r7独立地为-cf3。在实施方案中，r7独立地为-ci3。在实施方案中，r7独立地为-chcl2。在实施方案中，r7独立地为-chbr2。在实施方案中，r7独立地为-chf2。在实施方案中，r7独立地为-chi2。在实施方案中，r7独立地为-ch2cl。在实施方案中，r7独立地为-ch2br。在实施方案中，r7独立地为-ch2f。在实施方案中，r7独立地为-ch2i。在实施方案中，r7独立地为-cn。在实施方案中，r7独立地为-oh。在实施方案中，r7独立地为-nh2。在实施方案中，r7独立地为-cooh。在实施方案中，r7独立地为-conh2。在实施方案中，r7独立地为-no2。在实施方案中，r7独立地为-sh。在实施方案中，r7独立地为-so3h。在实施方案中，r7独立地为-so4h。在实施方案中，r7独立地为-so2nh2。在实施方案中，r7独立地为-nhnh2。在实施方案中，r7独立地为-onh2。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)nhnh2。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)nh2。在实施方案中，r7独立地为-nhso2h。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)h。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)oh。在实施方案中，r7独立地为-nhoh。在实施方案中，r7独立地为-occl3。在实施方案中，r7独立地为-ocf3。在实施方案中，r7独立地为-ocbr3。在实施方案中，r7独立地为-oci3。在实施方案中，r7独立地为-ochcl2。在实施方案中，r7独立地为-ochbr2。在实施方案中，r7独立地为-ochi2。在实施方案中，r7独立地为-ochf2。在实施方案中，r7独立地为-och2cl。在实施方案中，r7独立地为-och2br。在实施方案中，r7独立地为-och2i。在实施方案中，r7独立地为-och2f。在实施方案中，r7独立地为-sf5。在实施方案中，r7独立地为-n3。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的芳烷基。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的
(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r7独立地为外源标记部分。
[0152]
在实施方案中，r7独立地为未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的芳烷基。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r7独立地为未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0153]
在实施方案中，被取代的r8(例如被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的杂烷基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、被取代的环炔基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的杂脂环基、被取代的芳烷基、被取代的杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的r8被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当r8被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当r8被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当r8被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0154]
在实施方案中，r8独立地为氢。在实施方案中，r8独立地为卤素。在实施方案中，r8独立地为-ccl3。在实施方案中，r8独立地为-cbr3。在实施方案中，r8独立地为-cf3。在实施方案中，r8独立地为-ci3。在实施方案中，r8独立地为-chcl2。在实施方案中，r8独立地为-chbr2。在实施方案中，r8独立地为-chf2。在实施方案中，r8独立地为-chi2。在实施方案中，r8独立地为-ch2cl。在实施方案中，r8独立地为-ch2br。在实施方案中，r8独立地为-ch2f。在实施方案中，r8独立地为-ch2i。在实施方案中，r8独立地为-cn。在实施方案中，r8独立地为-oh。在实施方案中，r8独立地为-nh2。在实施方案中，r8独立地为-cooh。在实施方案中，r8独立地为-conh2。在实施方案中，r8独立地为-no2。在实施方案中，r8独立地为-sh。在实施方案中，r8独立地为-so3h。在实施方案中，r8独立地为-so4h。在实施方案中，r8独立地为-so2nh2。在实施方案中，r8独立地为-nhnh2。在实施方案中，r8独立地为-onh2。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)nhnh2。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)nh2。在实施方案中，r8独立地为-nhso2h。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)h。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)oh。在实施方案中，r8独立地为-nhoh。在实施方案中，r8独立地为-occl3。在实施方案中，r8独立地为-ocf3。在实施方案中，r8独立地为-ocbr3。在实施方案中，r8独立地为-oci3。在实施方案中，r8独立地为-ochcl2。在实施方案中，r8独立地为-ochbr2。在实施方案中，r8独立地为-ochi2。在实施方案中，r8独立地为-ochf2。在实施方案中，r8独立地为-och2cl。在实施方案中，r8独立地为-och2br。在实施方案中，r8独立地为-och2i。在实施方案中，r8独立地为-och2f。在实施方案中，r8独立地为-sf5。在实施方案中，r8独立地为-n3。在实施方案中，
r8独立地为被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的芳烷基。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r8独立地为外源标记部分。
[0155]
在实施方案中，r8独立地为未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的芳烷基。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r8独立地为未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0156]
转至图1a，可见随着r2尺寸增大，如在60分钟25c反应之后所观测，我们观测到最终反应产物中的dc降解百分比降低。也观测到就起始材料消耗来说，具有至少两个碳原子的r2部分比较小r2部分执行地更好。
[0157]
在一些配置中，具有3
′‑
o-肟部分的核苷酸可具有结构：
[0158][0159]
并且具有3
′‑
o-nh2部分的核苷酸可具有结构：
[0160][0161]
b可为核碱基。r1可独立地为卤素、och3、h或oh。q可独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。举例来说，核苷酸的3
′
位置处的部分可为醛肟(即，r3或r4中的一者为氢)或酮肟(r3或r4均不为氢)。
[0162]
在实施方案中，反应在水溶液中发生。在实施方案中，核苷酸附接至与水溶液接触的固体支撑物。
[0163]
在实施方案中，所产生的核苷酸包括脱氧核苷酸。在实施方案中，所产生的核苷酸包含：
[0164][0165]
其中碱基是核碱基，并且其中dna独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。在实施方案中，碱基的值为b。
[0166]
在实施方案中，试剂独立地为以下中的一者：
[0167]
试剂的额外个别实例包括图1b中所列的分子和图2中所列的分子。
[0168]
本公开也提供了用于修饰核苷酸的方法。所述方法可通过以下来进行：使具有3
′‑
o-肟部分的核苷酸与具有结构r2-onh2的试剂反应以产生具有3
′‑
o-nh2部分的核苷酸，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。在一些配置中，具有3
′‑
o-肟部分的核苷酸可具有结构：
[0169]
[0170]
并且具有3
′‑
o-nh2部分的核苷酸可具有结构：
[0171][0172]
b可为核碱基。r1可独立地为卤素、och3、h或oh。q可独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。例如，核苷酸的3
′
位置处的部分可为醛肟(即，r3或r4中的一者为氢)或酮肟(r3或r4均不为氢)。
[0173]
本公开的方法或组合物可包括各种核苷酸中的任一者。核苷酸可根据期望为天然核苷酸、核苷酸类似物或经修饰核苷酸以适合本文所阐述的特定应用或配置。任选地，核苷酸具有含氮碱基、五碳糖和磷酸基，其中与天然核苷酸相比，核苷酸的任何部分可经修饰、去除和/或置换。例如，核苷酸的5
′
氧不需要具有磷酸酯部分并且可替代地用例如二甲氧基三苯甲基(dmt)部分的外源部分保护。在需要时，核苷酸的碱基部分中的反应性原子可用外源部分保护。本文所公开的方法和组合物常常包括胞嘧啶碱基，并且如例如通过图1a中的点drt 1所呈现，胞嘧啶碱基以比现有技术中的相当方法或组合物更高的速率以未降解或未修饰的形式保存。
[0174]
用于本文中的组合物、方法、设备或系统中的核苷酸可包括在将类似物并入引物中之后可逆地防止引物3
′
端处的后续核苷酸并入的终止子。例如，u.s.7,544,794(2009年6月9日公开)、u.s.8,034,923(2011年10月11日公开)和us 10,472,383(2019年11月12日公开)(所述文献中的每一者的公开内容分别通过引用整体并入本文)描述其中3
′‑
oh基团被3
′‑
onh2部分置换的可逆终止子。这些可逆终止子对通过例如聚合酶和连接酶的核酸酶进行的修饰具有抗性以使得当将其并入时其防止3
′
封闭位置处的后续碱基添加，由此终止核酸链的延伸。氨基部分可通过亚硝酸(hono)从核苷酸(例如当核苷酸处于引物3
′
端处时)中除去，从而对核苷酸进行解封闭。解封闭核苷酸具有在称为并入反应或延伸反应的反应中可受聚合酶作用以使得3
′
氧与另一核苷酸的5
′
磷酸酯形成共价键的3
′
oh。经由解封闭步骤从核苷酸中除去氨基部分可类似地在并入或延伸反应中使核苷酸受连接酶作用以使得3
′
氧与寡核苷酸的5
′
磷酸酯形成共价键。
[0175]
封闭部分的数目与本文中的公开内容一致。一些封闭部分共享以下特征：其不阻止将其所结合的核苷酸通过核苷酸聚合酶在其5
′
端处并入至可用3
′
oh部分，以便并入封闭进一步延伸的核苷酸。一般来说，例如保护部分的较大部分常常太大而难以通过核酸聚合酶并入。在实施方案中，3
′
可逆终止子和3
′
封闭部分包括-onh2、-onhch3、-och2n3和-onhcoch3。在实施方案中，3
′
封闭部分为-onh2。在实施方案中，3
′
封闭部分为-onhch3。在实施方案中，3
′
封闭部分为-och2n3。在实施方案中，3
′
封闭部分为-onhcoch3。在实施方案中，3
′
封闭部分为3
′‑
o-肟部分。在实施方案中，3
′
可逆终止子部分为3
′‑
o-肟部分。
[0176]
本公开提供了用于合成可逆地终止的核苷酸(例如具有3
′‑
onh2部分的可逆地终止的核苷酸)的新型且适用的试剂和方法。此类可逆地终止的核苷酸可通过使具有3
′‑
o-肟部分的前体核苷酸与具有结构r2-onh2的烷氧基胺试剂反应来合成。特别适用的试剂包括
其中r2为除氢以外的部分的试剂。例如，r2可为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。特别适用的r2部分包括例如-ch2ch3、-ch2chch2和-c(ch3)3。在实施方案中，r2如本文中，包括实施方案、权利要求和附图中所描述。因此，适用的烷氧基胺试剂可包括以下分子中的一者或多者：
[0177]
以及图1a或图2中所列的分子中的任一者。
[0178]
可对上文r2部分作出各种取代中的任一者。例如，-ch2ch3或-ch2chch2部分中的氢中的一者或多者可用羰基(-co2)、醇(-oh)、胺(-nh2)或卤素(例如溴、氟、氯或碘)取代。类似地，-c(ch3)3部分的甲基中的一者或多者中的氢中的一者或多者可以此方式被取代。在特定应用中，由这些类型的取代提供的额外空间体积可有益地促进在修饰核苷酸的核碱基部分的不合需要的副反应内核苷酸的3
′‑
o-肟部分转化成3
′‑
o-nh2部分。
[0179]
在实施方案中，r2独立地为
[0180]
在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案
中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为在实施方案中，r2独立地为
[0181]
在本文所阐述的方法和组合物的一些配置中，式r2-onh2中的r2可为ch3。然而，r2不必是ch3。更确切而言，r2可为比甲基更高阶的烷基(即r2可具有超过一个碳)。因此，r2可为除甲基以外的烷基。在实施方案中，r2不为-ch3。在实施方案中，r2不为氢。在实施方案中，r2不为氢或-ch3。在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)、被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r2具有大于甲基的分子量。在实施方案中，r2具有大于乙基的分子量。在实施方案中，r2的分子量大于36g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于57g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于100g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于200g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于300g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于400g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于500g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于600g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于700g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于800g/mol。在实施方案中，r2的分子量大于900g/mol。在实施方案中，r2的分子量小于或等于1000g/mol。在实施方案中，r2的分子量小于1000g/mol。尽管不希望受机理限制，但据认为具有比氢和甲基更大的空间体积的r2部分产生与较小部分相比改进的合成结果，并且对核酸和核苷酸产生较少不合需要的修饰。参见下文实施例1的结果。在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。在实施方案中，r2不为未被取代的甲基。在实施方案中，r2不为未被取代的乙基。在实施方案中，r2不为未被取代的丙基。
[0182]
经由本文中的公开内容，观测到以下内容。如本文所公开的r2部分比驱动反应几乎完成的现有技术试剂执行地基本上更好。例如，在于25℃下执行的60分钟反应中，观测到如本文所公开的r2部分展现至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或大于99％核苷酸起始材料消耗的起始材料消耗，而现有技术方法实现小于92％。
[0183]
类似地，观测到随着r2尺寸增大，可见例如dc碱基的核苷酸降解量降低，以使得在dc降解不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％或小于1％的情况下如本文所公开的r2部分达到上文所提及的完成百分比。
[0184]
类似地，在一些情况下，可见r2尺寸与例如dc降解的核苷酸减少之间的相关性。因此，本文公开了分子量为以下值中的至少任一者的r2部分：24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、39,50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或大于100。
[0185]
在实施方案中，r2部分在一些情况下受溶解性限制以使得在实施方案中较大部分变得不可溶。因此，在实施方案中，r2部分不同地限于以下分子量中的至多任一者：1000、900、800、700、650、600、550、500、450、400、350、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100或小于100g/mol。
[0186]
r2部分可包括单独或组合的多个成分以传达本文所公开的益处。一些r2部分不同地包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或超过6个碳核。类似地，一些r2包含以下中的至少一者：至少1个氮核、至少一个硅核、至少一个磷核、至少一个氟核或至少另一成分。在一些情况下，r2部分被部分或完全氟化，或被部分或完全氢化。在一些情况下，r2部分包含至少一个组分以促进溶解性。
[0187]
具有其中r2为-ch2ch3、-ch2chch2和-c(ch3)3的结构r2-onh2的烷氧基胺试剂可溶于水溶液中，使其特别适用于核苷酸合成和修饰。也可使用提供水溶性的其他r2部分。在一些配置中，合成可使用不可溶或仅微溶于水溶液中的烷氧基胺试剂来进行。例如，合成可在非水溶液中或在由水性溶剂和有机溶剂的混合物形成的液体中进行。可用于非水性液体或部分水性液体中的示例性烷氧基胺试剂包括具有苯基部分和/或卤素部分的烷氧基胺试剂，例如：
[0188]
或者，提供水溶性的一些部分可包括羟基、胺、羧基或其他亲水性或极性部分。
[0189]
上文烷氧基胺试剂在氨氧基部分中具有伯胺。烷氧基胺试剂可在氨氧基部分中具有仲胺。例如，烷氧基胺试剂可具有结构
[0190][0191]
在本文所阐述的方法或组合物的特定配置中，具有结构r2-onh2的烷氧基胺试剂
可附接至固体支撑物。在实施方案中，包括结构r2-onh2的试剂附接至与水溶液接触的固体支撑物。例如，所述试剂可通过用键取代氢中的一者经由氮原子附接至固体支撑物。使用固体支撑物附接的试剂的益处在于反应产生固体支撑物附接的产物，可通过将固体支撑物与发生反应之处的液体分离来从反应物和其他反应组分中纯化所述产物。将试剂附接至固体支撑物也可经由与r2部分的键联发生。
[0192]
一般来说，用于使用本文所阐述的烷氧基胺试剂合成具有3
′‑
onh2部分的核苷酸的溶液的ph可为4至8。当ph在此范围内降低时，将核苷酸的3
′‑
o-肟部分转化成3
′‑
o-nh2部分的速率增大。然而，随着ph接近范围下端值，对核苷酸的其他部分造成不合需要的修饰的副反应风险也增加。因此，本文所阐述的合成反应的ph可在5至8、6至8或7至8的范围内。在需要时，ph可在4至7、4至6或4至5以及5至7、5至6或6至7或本文所公开的具有下ph值和上ph值的范围所涵盖的任何上范围值和下范围值的范围内。类似地，本文所阐述的合成反应的ph可为至少4、至少5、至少6、至少7或不超过8、不超过7、不超过6或不超过5。
[0193]
具有除3
′‑
o-肟或3
′‑
onh2以外的可逆终止子的核苷酸可用于本文方法或组合物中。例如，当希望封闭引物群体以使得可选择性地对一个或多个引物亚群进行解封闭时，具有不同类型的可逆终止子的核苷酸可为适用的。更具体来说，可用3
′‑
o-肟或3
′‑
onh2部分封闭第一引物亚群，并且可用第二类型的封闭部分封闭第二群体。第二类型的封闭部分可有利地通过与本文所阐述的解封闭方法正交的用于3
′‑
o-肟或3
′‑
onh2部分的方法来解封闭。正交方法是基本上不会交叉反应的方法。因此，分别地，3
′‑
o-肟或3
′‑
onh2部分可通过基本上不会对第二封闭部分进行解封闭的方法来解封闭，并且第二封闭部分可通过基本上不会对3
′‑
o-肟或3
′‑
onh2部分进行解封闭的方法来解封闭。
[0194]
其他类型的可逆终止子部分和其解封闭方法的实例包括但不限于以下内容。适用的可逆终止子部分包括可在化学上解封闭的可逆终止子部分，例如可通过膦除去的3
′
叠氮基甲基、可通过碱基水解或金属催化剂解封闭的酯，以及美国专利第7,427,673号、第7,414,116号、第7,057,026号、第7,544,794号或第8,034,923号；或pct公开wo 91/06678或wo 07/123744中所阐述的其他可逆终止子部分，所述文献中的每一者通过引用并入本文。其他适用的可逆终止子包括可通过光除去的3
′
光反应性部分，例如美国专利第7,964,352号、第9,399,798号和第10,041,115号(所述专利中的每一者通过引用整体并入本文)中所描述的3
′
光反应性部分；或以酶方式可除去的部分，例如可通过磷酸酶除去的3
′
磷酸酯部分，例如美国专利第10,378,051号(所述专利通过引用整体并入本文)中所阐述的3
′
磷酸酯部分。
[0195]
具有不可逆终止子的核苷酸可用于本文方法或组合物中。例如，当希望封闭引物群体以使得第一引物亚群可被解封闭并且第二亚群对解封闭具有抗性时，具有不可逆终止子的核苷酸可为适用的。更具体来说，可用3
′‑
onh2部分封闭第一引物亚群，并且可用不可逆封闭部分封闭第二群体。不可逆核苷酸包括2
′
，3
′‑
双脱氧核苷酸(ddntp，例如ddgtp、ddatp、ddttp、ddctp)。双脱氧核苷酸缺乏dntp的3
′‑
oh基团，否则将参与聚合酶介导或连接酶介导的引物延伸。因此，3
′
位置具有代替天然羟基部分的氢部分。
[0196]
用于本文方法和组合物的特定配置以例如参与稳定三元复合物的核苷酸不必包含防止在将类似物并入引物中之后引物3
′
端处的后续核苷酸并入的封闭基团(例如可逆终止子)。这种情况可为是否使用具有例如可逆终止子的封闭基团的一个或多个核苷酸进行延伸步骤的情况。
[0197]
作为本文组合物或例如在合成程序期间或在测序方法期间经由本文方法产生的组合物的成分的核苷酸可任选地包括外源标记。外源性标记的核苷酸可包括可逆或不可逆终止子部分，外源性标记的核苷酸可为非可并入的，外源性标记的核苷酸可缺乏终止子部分，外源性标记的核苷酸可为可并入的，或外源性标记的核苷酸可为可并入的和未被终止的。外源性标记的核苷酸可为核酸中的部分，例如为引物的3
′
核苷酸。外源性标记的核苷酸可在用于与未被标记的聚合酶一起形成稳定三元复合物时特别适用于sequencing by binding
tm
方法中。外源性标记的核苷酸可在通过聚合酶并入引物中时适用于边合成边测序方法中。
[0198]
适用的外源标记的实例包括但不限于放射性标记部分、发光团部分、荧光团部分、量子点部分、发色团部分、酶部分、电磁自旋标记部分、纳米粒子光散射部分以及本领域中已知的各种其他信号生成部分中的任一者。合适的酶部分包括例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。示例性荧光团标记包括但不限于对甲氨基苯酚(rhodol)；试卤灵(resorufin)；香豆素；二苯并吡喃；吖啶；荧光素；罗丹明；赤藓素；矢车菊色素苷；邻苯二甲醛；萘胺；荧光胺；苯并噁二唑；芪；芘；吲哚；硼聚氮杂二环戊二烯并苯(borapolyazaindacene)；喹唑啉酮；曙红；赤藻红；孔雀绿；cy染料(ge biosciences)，包括cy3(和其衍生物)、cy5(和其衍生物)和cy7(和其衍生物)；dyomics和dylight染料(dyomics)，包括dy-547、dy-630、dy-631、dy-632、dy-633、dy-634、dy-635、dy-647、dy-649、dy-652、dy-678、dy-680、dy-682、dy-701、dy-734、dy-752、dy-777和dy-782；荧光黄；cascade blue；texas red；bodipy(硼-二吡咯亚甲基)(molecular probes)染料，包括bodipy 630/650和bodipy 650/670；atto染料(atto-tec)，包括atto 390、atto 425、atto 465、atto 610 611x、atto 610、atto 635；alexa fluors，包括alexa fluor 633、alexa fluor 647、alexa fluor 660、alexa fluor 700、alexa fluor 750和alexa fluor 680(molecular probes)；ddao(7-羟基-9h-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮或其任何衍生物)(molecular probes)；quasar染料(biosearch)；irdyes染料(licor)，包括irdye 700dx(nhs酯)、irdye 800rs(nhs酯)和irdye 800cw(nhs酯)；evoblue染料(evotech biosystems)；joda 4染料(applied biosystems)；hilyte染料(anaspec)；mr121和mr200染料(roche)；hoechst染料33258和33242(invitrogen)；fair oaks red (molecular devices)；sunnyvale red(molecular devices)；light cycler red(roche)；epoch(glen research)染料，包括epoch redmond red、epoch yakima yellow、epoch gig harbor green；tokyo绿(m.kamiya等人，2005 angew.chem.int.ed.44：5439-5441)；和cf染料，包括cf 647和cf555(biotium)；以及本领域中已知的其他荧光团标记，例如principles of fluorescence spectroscopy，joseph r.lakowicz(编辑)，plenum pub corp，第2版(1999年7月)和richard p.hoagland的第6版《分子探针手册(molecular probes handbook)》中所描述的荧光团标记。在实施方案中，外源标记是可检测部分。在实施方案中，外源标记是可检测剂。
[0199]
外源标记可经由接头附接至核苷酸或核酸。存在于核苷酸或核酸中的接头能够但未必可裂解。例如，外源标记可经由接头附接至核苷酸或核酸的核碱基，并且接头可对具有式r2-onh2的烷氧基胺试剂具有惰性并且/或接头可对亚硝酸(hono)具有惰性。接头可对本文所阐述的方法中所用的条件稳定以使得接头的共价结构在本文所阐述的方法的任何特
定步骤期间或在整个全部步骤中不变。或者，将外源标记附接至核碱基的接头可对具有式r2-onh2的烷氧基胺试剂具反应性以使得反应使外源标记与核碱基分离。例如，接头可包括具有以下结构的部分：
[0200][0201]
其中r3、r4或r5中的至少一者直接或经由接头的第二部分附接至外源标记，并且其中r3、r4或r5中的至少一者直接或经由接头的第三部分附接至核碱基。另一适用接头部分是腙。例如，接头可包括具有以下结构的部分：
[0202][0203]
其中r3、r4或r5中的至少一者直接或经由接头的第二部分附接至外源标记，并且其中r3、r4或r5中的至少一者直接或经由接头的第三部分附接至核碱基。这些接头部分可与r2-onh2分子反应以从核碱基裂解外源标记。在实施方案中，b、碱基、r3、r4、r5、r6、r7或r8可独立地包括外源标记。在实施方案中，b、碱基、r3、r4、r5、r6、r7或r8可独立地包括标记。在实施方案中，b、碱、r3、r4、r5、r6、r7或r8可独立地包括可检测部分。在实施方案中，b、碱、r3、r4、r5、r6、r7或r8可独立地包括荧光团部分。在实施方案中，r3、r4、r5、r6、r7或r8独立地为外源标记。在实施方案中，r3、r4、r5、r6、r7或r8独立地为标记。在实施方案中，r3、r4、r5、r6、r7或r8独立地为可检测部分。在实施方案中，r3、r4、r5、r6、r7或r8独立地为荧光团部分。在实施方案中，封闭部分为外源标记部分。在实施方案中，封闭部分包括外源标记部分。在实施方案中，保护部分为外源标记部分。在实施方案中，保护部分包括外源标记部分。
[0204]
r5独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体或外源标记部分。
[0205]
在实施方案中，被取代的r5(例如被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的炔基、被取代的环烷基、被取代的环烯基、被取代的环炔基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、被取代的杂脂环基、被取代的芳烷基、被取代的杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的r5被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当r5被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当r5被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当r5被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0206]
在实施方案中，r5独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。在实施方案中，r5独立地为外源标记部分。
[0207]
在替代实施方案中，核苷酸、核酸、本文所阐述的方法的反应物或本文所阐述的方法的产物可缺乏外源标记。例如，核酸、核苷酸、聚合酶和/或稳定三元复合物可缺乏一个、
若干或全部的本文中或引用且并入本文的参考文献中所描述的外源标记。例如，未被标记的三元复合物可基于例如质量、电荷、本质光学特性等的稳定三元复合物的本质特性来加以检测。示例性的用于检测未被标记的三元复合物的方法阐述于共同拥有的美国专利申请公开第2017/0191125 a1号或第2017/0022553 a1号或美国专利第10,246,744号中，所述文献中的每一者通过引用并入本文。
[0208]
在实施方案中，核碱基包括外源标记部分(例如经由接头、荧光团部分、用于抗体识别的抗原而连接至核碱基)。在实施方案中，核碱基用外源标记部分(例如经由接头、荧光团部分、用于抗体识别的抗原连接至核碱基)取代。在实施方案中，核碱基经由接头共价键结至外源标记部分。在实施方案中，接头包括在实施方案中，接头包括在实施方案中，接头是在实施方案中，接头是l3和l5各自独立地为共价接头。在实施方案中，l5键结至核碱基。在实施方案中，l3键结至核碱基。在实施方案中，l5键结至外源标记部分。在实施方案中，l3键结至外源标记部分。在实施方案中，l5为-l5a-l5b-l5c-l5d-l5e-。在实施方案中，l3为-l3a-l3b-l3c-l3d-l3e-。在实施方案中，将核碱基连接至外源标记部分的接头是-l6-l7-l8-l9-l10-。l3a、l3b、l3c、l3d、l3e、l5a、l5b、l5c、l5d、l5e、l6、l7、l8、l9和l10独立地为键、-nh-、-o-、-s-、-so
2-、-c(o)-、-c(o)nh-、-nhc(o)-、-nhc(o)nh-、-c(o)o-、-oc(o)-、-so2nh-、-nhso
2-、被取代或未被取代的亚烷基(例如c
1-c8、c
1-c6或c
1-c4)、被取代或未被取代的亚烯基(例如c
2-c8、c
2-c6或c
2-c4)、被取代或未被取代的亚炔基(例如c
2-c8、c
2-c6或c
2-c4)、被取代或未被取代的亚杂烷基(例如2至8元、2至6元或2至4元)、被取代或未被取代的亚环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的亚环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的亚环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的亚芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或亚苯基)、被取代或未被取代的亚杂芳基(例如5至10元、5至9元或5至6元)、被取代或未被取代的亚杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)、被取代或未被取代的亚芳烷基、被取代或未被取代的亚杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)亚烷基。
[0209]
在实施方案中，l3被取代。在实施方案中，l3未被取代。在实施方案中，被取代的l3(例如被取代的共价接头)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l3被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l3被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l3被取代时，其被至少一个尺寸受限的
取代基取代。在实施方案中，当l3被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0210]
在实施方案中，l5被取代。在实施方案中，l5未被取代。在实施方案中，被取代的l5(例如被取代的共价接头)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l5被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l5被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l5被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l5被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0211]
在实施方案中，被取代的l3a(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l3a被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l3a被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l3a被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l3a被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0212]
在实施方案中，被取代的l3b(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l3b被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l3b被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l3b被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l3b被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0213]
在实施方案中，被取代的l3c(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l3c被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l3c被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l3c被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l3c被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0214]
在实施方案中，被取代的l3d(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l3d被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基
团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l3d被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l3d被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l3d被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0215]
在实施方案中，被取代的l3e(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l3e被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l3e被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l3e被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l3e被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0216]
在实施方案中，被取代的l5a(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l5a被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l5a被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l5a被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l5a被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0217]
在实施方案中，被取代的l5b(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l5b被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l5b被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l5b被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l5b被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0218]
在实施方案中，被取代的l5c(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l5c被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l5c被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l5c被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l5c被取代时，其被至少一个低级取代基取
代。
[0219]
在实施方案中，被取代的l5d(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l5d被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l5d被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l5d被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l5d被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0220]
在实施方案中，被取代的l5e(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l5e被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l5e被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l5e被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l5e被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0221]
在实施方案中，被取代的l6(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l6被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l6被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l6被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l6被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0222]
在实施方案中，被取代的l7(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l7被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l7被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l7被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l7被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0223]
在实施方案中，被取代的l8(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取
代基取代；其中如果被取代的l8被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l8被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l8被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l8被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0224]
在实施方案中，被取代的l9(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l9被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l9被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l9被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l9被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0225]
在实施方案中，被取代的l10(例如被取代的亚烷基、被取代的亚烯基、被取代的亚炔基、被取代的亚杂烷基、被取代的亚环烷基、被取代的亚环烯基、被取代的亚环炔基、被取代的亚芳基、被取代的亚杂芳基、被取代的亚杂脂环基、被取代的亚芳烷基、被取代的亚杂芳烷基和/或被取代的(杂脂环基)亚烷基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的l10被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当l10被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当l10被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当l10被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0226]
或者，在本文中例如用于延伸引物或用于参与三元复合物形成的核苷酸可缺乏外源标记(即，核苷酸可“未被标记”)。未被标记的核苷酸可包括例如3
′‑
onh2部分的可逆终止子或不可逆终止子部分。未被标记的核苷酸可为非可并入的，未被标记的核苷酸可缺乏终止子部分，未被标记的核苷酸可为可并入的，或未被标记的核苷酸可为可并入的和未被终止的。当使用聚合酶上的标记以检测稳定三元复合物时或当使用无标记检测时，未被标记的核苷酸可适用于例如sequencing by binding
tm
(sbb
tm
)方法中。未被标记的核苷酸也可适用于sbbtm方法或本文所阐述的其他方法的延伸步骤。应理解，核苷酸的部分或功能不存在是指核苷酸不具有所述功能或部分。然而，也应理解可在本文所阐述的方法或组合物中特定地省略本文所阐述的核苷酸或其类似物的功能或部分或本领域中已知的核苷酸或其类似物的其他功能或部分中的一者或多者。
[0227]
核苷酸的核碱基可为嘌呤或嘧啶。例如，核碱基可为例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶的典型或初级核碱基。例如与初级或典型核碱基中的一者或多者互补的核碱基的其他核碱基可为适用的。在实施方案中，核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。可使用经修饰的核苷酸，例如甲基化核碱基，例如5-甲基胞嘧啶或7-甲基鸟苷；或羟化和甲基化核碱基，例如5-羟甲基胞嘧啶。其他适用核碱基包括例如次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤或异胞嘧啶。异鸟嘌呤和异胞嘧啶可为特别适用的，这是因为其与彼此互补，并且当与两个天然碱基对腺嘌呤：胸腺嘧啶和胞嘧啶：鸟嘌呤相比时对彼此具有特异性以便形成第三碱基对。特别适用的核碱基是7-去氮鸟嘌呤，所述
7-去氮鸟嘌呤可为将标记附接至核碱基的合成程序提供适宜核碱基，同时也能够在经标记核碱基存在于核酸链中时与胞嘧啶配对。在实施方案中，核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。在实施方案中，核碱基(例如b、碱基)包括任选地直接键结至核碱基或任选地经由接头(例如l5)键结的外源标记(例如可检测部分、荧光团部分、抗原)。
[0228]
核苷酸的糖部分可为脱氧核糖、核糖或其类似物。例如，核苷酸可具有以下结构中的一个：
[0229][0230]
其中r1为h，b为核碱基并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。此脱氧核糖核苷酸可呈单体形式，由此q为氢、外源保护部分或至少一个磷酸酯(例如单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或大于三个磷酸酯，前述磷酸酯中的任一者可被取代或未被取代)。或者，核苷酸可为例如其中q为脱氧核糖核酸(dna)的核酸部分。dna可为单链或双链的。在其中dna为双链的配置中，核苷酸可为例如引物3
′
端处的引物链的部分，或者核苷酸部分可在模板链中。核苷酸可为作为由具有不同主链的链形成的混合杂交体的核酸部分，所述混合杂交体例如dna：rna杂交体、dna：pna杂交体、rna：pna杂交体等(其中pna是肽核酸)。
[0231]
或者，核苷酸的糖部分可具有以下结构中的一个：
[0232][0233]
其中r1为oh，b为核碱基并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。此核糖核苷酸可呈单体形式，由此q为至少一个磷酸酯(例如单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或大于三个磷酸酯，前述磷酸酯中的任一者可被取代或未被取代)。或者，核苷酸可为例如其中q为核糖核酸(rna)的核酸部分。rna可为单链或双链的。在其中rna为双链
的配置中，核苷酸可为例如引物3
′
端处的引物链的部分，或者核苷酸部分可在模板链中。核苷酸可为作为由具有不同主链的链形成的混合杂交体的核酸部分，所述混合杂交体例如dna：rna杂交体、dna：pna杂交体、rna：pna杂交体等(其中pna是肽核酸)。
[0234]
用于本文方法或组合物中的核酸可为例如基因组dna、合成dna、扩增dna、互补dna(cdna)等的dna。也可使用例如mrna、核糖体rna、trna等的rna。本文也可使用核酸类似物如pna或本领域中已知的其他核酸类似物。核酸引物、探针或模板可为dna、rna或其类似物。
[0235]
核酸可为单链或双链的。双链核酸可具有单链切口或间隙。在双链的情况下，核酸分子可为钝端的或具有突出端(例如5
′
突出端或3
′
突出端)。此类核酸分子可通过本领域中已知的任何化学或酶方法产生。此类方法的实例包括体内或体外氨基磷酸酯合成或复制。本公开的核酸可为线性的(例如具有游离3
′
端和5
′
端)或者其可为圆形的(例如缺乏5
′
端和3
′
端)。
[0236]
脱氧核糖核酸(dna)是特别适用的核酸。dna可为单链或双链脱氧核糖核酸。脱氧核糖核苷酸通常通过磷酸二酯键接合，尽管在一些情况下，可具有替代主链的核酸类似物包括在内，所述替代主链例如磷酰胺(例如beaucage等人，tetrahedron，49(10)：1925(1993)和其中的参考文献；letsinger，j.org.chem.，35：3800(1970)；sprinzl等人，eur.j.biochem.，81：579(1977)；letsinger等人，nucl.acids res.，14：3487(1986)；sawai等人，chem.lett.，805(1984)；letsinger等人，j.am.chem.soc.，110：4470(1988)；和pauwels等人，chemica scripta，26：141(1986))、硫代磷酸酯(例如mag等人，nucleic.acids res.，19：1437(1991)；和美国专利第5,644,048号)、二硫代磷酸酯(例如briu等人，j.am.chem.soc.，111：2321(1989))、o-甲基亚磷酰胺键(例如eckstein，oligonucleotides and analogues：a practical approach，oxford university press)以及肽核酸(pna)主链和键(例如egholm，j.am.chem.soc.，114：1895(1992)；meier等人，chem.int.ed.engl.，31：1008(1992)；nielsen，nature，365：566(1993)；carlsson等人，nature，380：207(1996))。其他类似核酸包括具有以下的类似核酸：正主链(例如denpcy等人，proc，natl.acad.sci.usa，92：6097(1995))；非离子主链(例如美国专利第5,386,023号；第5,637,684号；第5,602,240号；第5,216,141号；和第4,469,863号；kiedrowshi等人，angew.chem.intl.ed.enrlish，30：423(1991)；letsinger等人，j.am.chem.soc.，110：4470(1988)：letsinger等人，nucleosides&nucleotides，13：1597(1994)；第2和3章，asc symposium series 580，
″
carbohydrate modifications in antisense research
″
，编辑y.s.sanrhui和p.dan cook；mesmaeker等人，bioorganic&medicinal chem.lett.，4：395(1994)；jeffs等人，j.biomolecular nmr，34：17(1994)；tetrahedron lett.，37：743(1996))；和非核糖主链，包括例如美国专利第5,235,033号和第5,034,506号以及第6和7章，asc symposium series 580，
″
carbohydrate modifications in antisense research
″
，编辑y.s.sanghui和p.dan cook中所描述的非核糖主链。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸定义内(例如jenkins等人，chem.soc.rev.，(1995)第169176页)。若干核酸类似物描述于rawls，c&e news，1997年6月2日，第35页中。这些参考文献全部都特此通过引用明确地并入。核糖-磷酸酯主链的这些修饰可存在以促进例如标记的外源部分的添加，或以增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。另外，可制造天然存在的核酸和类似物的混合物。或者，可制造不同核酸类似物的混合物和天然存在的核酸类似物和非天
然类似物的混合物。
[0237]
可衍生核酸的示例性生物体包括例如来自以下的生物体：哺乳动物，例如啮齿动物、小鼠、大鼠、免、天竺鼠、有蹄类动物、马、绵羊、猪、山羊、母牛、猫、狗、灵长类动物、人类或非人类灵长类动物；植物，例如阿拉伯芥(arabidopsis thaliana)、玉米、高粱、燕麦、小麦、稻米、芥花或大豆；海藻，例如莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)；线虫，例如秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)；昆虫，例如黑腹果蝇(drosophila melanogaster)、蚊虫、果蝇、蜜蜂或蜘蛛；鱼，例如斑马鱼；爬行动物；两栖动物，例如蛙或有爪蟾蜍(xenopus laevis)；盘基网柄菌(dictyostelium discoideum)；真菌，例如肺炎肺囊虫(pneumocystis carinii)、红鳍东方鲀(takifugu rubripes)、酵母、酿酒酵母(saccharamoyces cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)；顶复门囊泡虫病原体(aplicomplexan alveolate pathogen)，例如恶性疟原虫(plasmodium falciparum.)；环境样品；或任何其他真核、真细菌或古细菌源。核酸也可源自真细菌原核生物，例如细菌、大肠杆菌(escherichia coli)、葡萄球菌(staphylococci)或肺炎霉浆菌(mycoplasma pneumoniae)；古细菌原核生物；病毒，例如丙型肝炎病毒、冠状病毒或人类免疫缺乏病毒；或类病毒。核酸可源自上文生物体的均质培养物或群体或可替代地源自例如群落或生态系统中的若干不同生物体的集合。核酸可使用本领域中已知的方法来分离，所述方法包括例如sambrook等人，molecular cloning：a laboratory manual，第3版，cold spring harbor laboratory，new york(2001)或ausubel等人，current protocols in molecular biology，john wiley and sons，baltimore，md.(1998)中所描述的方法，所述文献中的每一者通过引用并入本文。细胞、组织、生物流体、蛋白质和其他样品可从这些生物体获得并且用于本文所阐述的组合物、设备或方法中。
[0238]
核酸可从例如基因组分离、基因组断裂、基因克隆和/或扩增的制备方法获得。核酸可从例如聚合酶链反应(pcr)、滚环扩增(rca)、多重置换扩增(mda)等的扩增技术获得。扩增也可使用sambrook等人，molecular cloning：a laboratory manual，第3版，cold spring harbor laboratory，new york(2001)或ausubel等人，current protocols in molecular biology，john wiley and sons，baltimore，md.(1998)中所阐述的方法来进行，所述文献中的每一者通过引用并入本文。
[0239]
在本文所阐述的方法和组合物的一些配置中，可对单核苷酸或单核酸分子进行操纵、修饰或检测。单核苷酸或单核酸分子可在溶液相或固相中(例如附接至表面)。在一些配置中，单分子经受在其中将个别分子彼此分解的条件下的检测(例如单分子测序)。或者，可制造或使用多个特定类型的核苷酸或多个核酸拷贝。所得集合可例如在核酸测序方案中进行操纵、修饰或检测。例如，核酸可使用下文进一步详细阐述的技术而在溶液中或在表面上(例如在流动池内壁上)进行扩增。
[0240]
在多重实施方案中，对多个不同核酸分子(即，具有各种不同序列的群体)进行操纵或检测。分子可任选地附接至流动池或其他容器中的表面。核酸可附接在表面上的独特位点处，并且可对彼此在空间上可区分的单核酸分子进行并行操纵、修饰或检测。或者，核酸可在表面上进行扩增以产生多个表面附接的集合。集合可彼此在空间上区分并且进行并行操纵、修饰或检测。
[0241]
本文所阐述的方法可使用各种核酸扩增技术中的任一种。可使用的示例性技术包
括但不限于聚合酶链反应(pcr)、滚环扩增(rca)、多重置换扩增(mda)、桥式扩增或随机引发扩增(rpa)。在特定配置中，一个或多个用于扩增的引物可附接至流动池中的表面。在此类实施方案中，表面附接的引物沿模板核酸的延伸引起模板的互补拷贝附接至表面。此类扩增方法可用于例如实时pcr或定量pcr的分析性目的。或者，扩增可用于制备用于例如核酸测序的下游应用的核酸。在固体支撑物上产生一个或多个位点的制备型扩增方法可称为“簇聚”方法，其中每个位点附接至特定核酸模板的多个拷贝。用于dna扩增技术的引物可包括待转化成如本文所公开的可逆终止子部分的3
′‑
o-肟部分或3
′‑
onh2或如本文所公开的其他可逆终止子部分，以使得本文所阐述的脱保护方法可用于生成适用于解封闭的可逆地终止的引物以便在扩增反应中在一个或多个点处启动延伸或控制延伸。
[0242]
在pcr技术中，用于扩增的一个或两个引物可附接至表面。利用两种所附接引物的格式常常称为桥式扩增，这是因为双链扩增子在侧接已拷贝的模板序列的两个所附接引物之间形成桥状结构。可用于桥式扩增的示例性试剂和条件描述于例如美国专利第5,641,658号或第7,115,400号、美国专利公开第2002/0055100 a1号、第2004/0096853 a1号、第2004/0002090 a1号、第2007/0128624 a1号或第2008/0009420 a1号中，所述文献中的每一者通过引用并入本文。pcr扩增也可用附接至表面的扩增引物中的一者和于溶液中的第二引物进行。使用一个固相附接的引物和溶液相引物的组合的示例性格式称为引物步移并且可如通过引用并入本文的美国专利第9,476,080号中所描述来进行。另一个实例是可如例如dressman等人，proc.natl.acad.sci.usa 100：8817-8822(2003)、wo 05/010145或美国专利公开第2005/0130173 a1号或第2005/0064460 a1号中所描述来进行的乳液pcr，所述文献中的每一者通过引用并入本文。pcr技术中所用的引物中的一者或两者可例如在启动扩增之前或在扩增将要停止或暂停的点处包括3
′‑
o-肟部分或3
′‑
onh2部分。扩增可通过使用本文所阐述的方法对3
′
位置进行解封闭来继续进行。
[0243]
rca技术可用于本文所阐述的方法中。可用于使rca可产生扩增子的rca反应和方法中的示例性试剂描述于例如lizardi等人，nat.genet.19：225-232(1998)或美国专利申请公开第2007/0099208 a1号中，所述文献中的每一者通过引用并入本文。用于rca的引物可在溶液中或附接至流动池中的表面。引物可例如在启动扩增之前或在扩增将要停止或暂停的点处任选地包括3
′‑
o-肟部分或3
′‑
onh2部分。扩增可通过使用本文所阐述的方法对3
′
位置进行解封闭来继续进行。
[0244]
mda技术也可用于本公开的方法中。用于mda的一些试剂和适用条件描述于例如dean等人，proc natl.acad.sci.usa 99：5261-66(2002)；lage等人，genome research 13：294-307(2003)；walker等人，molecular methods for virus detection，academic press，inc.，1995；walker等人，nucl.acids res.20：1691-96(1992)；或美国专利第5,455,166号；第5,130,238号；或第6,214,587号中，所述文献中的每一者通过引用并入本文。用于mda的引物可在溶液中或附接至流动池中的表面。引物可例如在启动扩增之前或在扩增将要停止或暂停的点处任选地包括3
′‑
o-肟部分或3
′‑
onh2部分。扩增可通过使用本文所阐述的方法对3
′
位置进行解封闭来继续进行。
[0245]
用于本文方法或组合物中的核酸模板可为例如基因组dna、合成dna、扩增dna、互补dna(cdna)等的dna。也可使用例如mrna、核糖体rna、trna等的rna。核酸类似物也可用作本文模板。本文所使用的引物可为dna、rna或其类似物。
[0246]
用于本文方法或组合物中的核酸可为线性的，例如由3
′
端和5
′
端侧接。或者，核酸可为圆形的，由此缺乏3
′
端和5
′
端。无论线性、圆形或呈任何其他构型，本文所使用的核酸均可具有为特定用途所期望或为在核酸上进行的操纵结果的尺寸。例如，核酸长度可为至少50个碱基、100个碱基、1
×
103个碱基、1
×
104个碱基、1
×
105个碱基、1
×
106个碱基或更多个碱基。可替代地或另外，核酸长度可为至多1
×
106个碱基、1
×
105个碱基、1
×
104个碱基、1
×
103个碱基、100个碱基、50个碱基或更少个碱基。当使用核酸群体时，群体的平均长度可具有选自那些范围的下限值和/或上限值。
[0247]
核苷酸可附接至固体支撑物。核苷酸可呈单体形式或者其可为核酸部分。通常，核苷酸经由除3
′
位置以外的部分附接至固体支撑物。因此，3
′
位置可如本文所阐述进行封闭或解封闭。因此，尽管核苷酸附接至固体支撑物，但可与溶液接触。溶液可含有用于封闭或解封闭固相核苷酸的试剂。举例来说，所附接核苷酸可具有以下结构中的一者：
[0248][0249]
其中碱基是核碱基，并且其中dna独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。任选地，核苷酸可经由dna附接至固体支撑物。或者，糖可为核糖而非脱氧核糖，并且核苷酸可处于rna而非dna的3
′
端处。在这种情况下，rna可为单链或双链的。任选地，核苷酸可经由rna附接至固体支撑物。
[0250]
在实施方案中，被取代的碱基(例如被取代的核碱基)被至少一个取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代；其中如果被取代的碱基被多个选自取代基、尺寸受限的取代基和低级取代基的基团取代，则每个取代基、尺寸受限的取代基和/或低级取代基可任选地是不同的。在实施方案中，当碱基被取代时，其被至少一个取代基取代。在实施方案中，当碱基被取代时，其被至少一个尺寸受限的取代基取代。在实施方案中，当碱基被取代时，其被至少一个低级取代基取代。
[0251]
特别适用的固体支撑物是阵列。阵列提供分析物多重处理的优点，由此对多个不同类型的分析物进行并行操纵或检测。尽管使用本文所阐述的方法或组合物连续处理不同类型的分析物也是有可能的，但并行处理可提供成本节省、时间节省和测定条件均一性。阵列可包括至少2、10、100、1
×
103、1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
109个或更多个不同的分析物位点。可替代地或另外，阵列可包括至多1
×
109、1
×
106、1
×
105、1
×
104、1
×
103、100、10、2个或更少个不同分析物位点。
[0252]
阵列可附接至容器内表面(例如流动池内壁)或附接至容器内部固体支撑物(例如流动池内部珠粒或其他固体支撑物)。容器或固体支撑物可由用于分析性生物化学的各种材料中的任一种制成。合适材料可包括玻璃、聚合物材料、硅、石英(熔融硅石)、硼硅酸盐浮法玻璃、二氧化硅、二氧化硅基材料、碳、金属、光纤或光纤束、蓝宝石或塑料材料。材料可基于特定用途所期望的特性来进行选择。例如，期望辐射波长可穿透的材料适用于利用所述
波长下的辐射的分析技术。相反地，可能期望选择不透过特定波长的辐射(例如不透明、具吸收性或反射性)的材料。可采用的材料的其他特性是对下游过程中所用的试剂，例如本文所阐述的试剂具惰性或反应性，或操纵容易性，或低制造成本。
[0253]
特别适用于流动池或其他容器中的固体支撑物是例如珠粒或微球的粒子。珠粒群体可用于附接例如核苷酸、核酸、可逆地终止的引物、解封闭引物、可延伸引物、聚合酶、稳定三元复合物等的分析物群体。在一些配置中，每个珠粒具有单个类型的稳定三元复合物、单个类型的能够形成所述复合物的组分、或单个类型的本文中或本文所引用的参考文献中所阐述的一些其他分析物。例如，个别珠粒可附接至单个类型的三元复合物、单个类型的模板等位基因、单个类型的模板基因座、单个类型的引物、单个类型的可逆地终止的引物、单个类型的解封闭引物、单个类型的可延伸引物或单个类型的核苷酸。或者，不同类型的组分无需在逐珠粒基础上分离。因此，单个珠粒可携带多个不同类型的：三元复合物、模板核酸、引物(无论封闭的或可延伸的)、引发模板核酸(无论引物是封闭的或可延伸的)和/或核苷酸(无论封闭的或可延伸的)。珠粒组合物可根据例如待使用的附接格式、化学物质和/或方法而变化。示例性珠粒组合物包括用于蛋白质和核酸捕获方法中的固体支撑物和其上的化学官能团。此类组合物包括例如塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、三聚氰胺、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、受控微孔玻璃(cpg)、例如sepharose
tm
的乳胶或交联聚葡萄糖、纤维素、尼龙、交联微胞和teflon
tm
以及通过引用并入本文的bangs laboratories，fishers ind.的
″
microsphere detection guide
″
中所阐述的其他材料。
[0254]
珠粒可具有例如球面、多面体、圆柱形等的对称形状。或者，珠粒可具有不规则或非对称形状。本文所使用的示例性珠粒尺寸的平均直径可为至少约10nm、100nm、1μm、5μm、10μm、100μm、1mm或更大。可替代地或另外，本文所使用的珠粒的平均直径可为至多约1mm、100μm、10μm、5μm、1μm、100nm、10nm、1nm或更小。这些尺寸范围内的珠粒可用作阵列特征或用作于流体中的粒子。
[0255]
可用于制造珠粒阵列的示例性组合物和技术包括但不限于用于可获自illumina公司(san diego，ca)的beadchip
tm
阵列的组合物和技术，美国专利第6,266,459号、第6,355,431号、第6,770,441号、第6,859,570号或第7,622,294号或pct公开第wo 00/63437号中所描述的组合物和技术，所述文献中的每一者通过引用并入本文。珠粒可位于固体支撑物上的例如孔的离散位置处，由此每个位置容纳单个珠粒。或者，珠粒驻存的离散位置可各自包括如例如美国专利申请公开第2004/0263923 a1号、第2004/0233485 a1号、第2004/0132205 a1号或第2004/0125424 a1号中所描述的多个珠粒，所述文献中的每一者通过引用并入本文。
[0256]
其他适用阵列包括用于核酸测序应用中的阵列。例如，用于固定基因组片段扩增子的阵列(常常称为簇)可为特别适用的。可用于本文中的核酸测序阵列的实例包括bentley等人，nature 456：53-59(2008)、pct公开第wo 91/06678号、第wo 04/018497号或第wo 07/123744号、美国专利第7,057,026号、第7,211,414号、第7,315,019号、第7,329,492号或第7,405,281号、或美国专利申请公开第2008/0108082号中所描述的核酸测序阵列，所述文献中的每一者通过引用并入本文。用于商业测序平台的形成于流动池上的阵列，例如illumina(san diego，ca)、life technologies(thermo fisher，waltham ma的子公司)、pacific biosciences(menlo park，ca)、mgi(中国广东深圳的bgi的子公司)所开发的
阵列也可为适用的。
[0257]
核酸或其他分析物可以提供单分子水平或集合水平下的检测的方式附接至支撑物。例如，多个不同核酸可以支撑物上的封闭或解封闭状态的个别核酸分子可区别于支撑物上的全部邻近核酸分子的方式附接至固体支撑物。因此，例如在本文所阐述的测序方法中，一个或多个不同模板可以其中每个单分子模板以单分子从固体支撑物上的全部其他分子分解的方式经物理上分离和检测的格式附接至固体支撑物。
[0258]
或者，本公开的组合物或方法可采用一个或多个集合，集合是相同类型的分析物群体，例如具有共同模板序列的核酸群体。簇聚方法可用于将一个或多个核酸集合附接至固体支撑物。因此，阵列可具有多个集合，集合中的每一者称为簇或所述格式中的阵列位点。簇可使用例如桥式扩增、乳液pcr或本文所阐述的其他方法的本领域中已知的方法形成。簇中的核酸可包括可逆地终止的核苷酸、解封闭核苷酸或可延伸核苷酸。
[0259]
本公开的系统可被配置以使用流动池。流动池可包括其中可观测到目标分析性反应的检测通道。分析性反应可发生在流动池内的溶液相中。或者，分析性反应可发生在检测通道内的固体支撑物上。例如，试剂溶液可在附接至例如核酸的目标分析物的固体支撑物上流动，并且可在固体支撑物上观测到所得反应物。无论是表面附接或是未表面附接，存在于流动池中的核酸均可包括可逆地终止、解封闭或可延伸的3
′
核苷酸。流动池允许通过使溶液通过进入开口到达检测通道中和通过外出开口到达内部外进行适宜流体操纵。例如，检测通道可具有例如可经由其观测到光信号的光学透明窗口、可经由其观测到电子信号的电接点等的观测面积或体积。特别适用的流动池具有用于发光检测的激发辐射和发射辐射可穿透的窗口。可用于本文中的示例性流动池描述于例如美国专利申请公开第2010/0111768 a1号、wo 05/065814或美国专利申请公开第2012/0270305 a1号中，所述文献中的每一者通过引用并入本文。
[0260]
本公开提供用于对核酸进行测序的方法。所述方法可在引发模板核酸上进行，在所述引发模板核酸中引物具有与具有亚硝酸(hono)的解封闭试剂反应的3
′
onh2可逆终止子部分，由此将引物转化成具有3
′
羟基部分的可延伸引物。在一些配置中，可逆地终止的引物可具有以下结构：
[0261][0262]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh；并且q为核酸引物。
[0263]
或者，测序方法可在引发模板核酸上进行，在所述引发模板核酸中引物具有通过用具有结构r2-onh2的试剂处理来除去的3
′‑
o-肟保护部分或其他可逆终止子并且由此将引物转化成可逆地终止的引物，然后可通过例如与亚硝酸(hono)反应将所述可逆地终止的引物转化成具有3
′
羟基部分的可延伸引物。或者，测序方法可在引发模板核酸上进行，在所述引发模板核酸中引物具有通过用具有结构r2-onh2的试剂和用亚硝酸(hono)处理来解封闭的3
′‑
o-肟可逆终止子部分，由此将引物转化成具有3
′
羟基部分的可延伸引物。r2可独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、
chbr2。在实施方案中，r6独立地为-chf2。在实施方案中，r6独立地为-chi2。在实施方案中，r6独立地为-ch2cl。在实施方案中，r6独立地为-ch2br。在实施方案中，r6独立地为-ch2f。在实施方案中，r6独立地为-ch2i。在实施方案中，r6独立地为-cn。在实施方案中，r6独立地为-oh。在实施方案中，r6独立地为-nh2。在实施方案中，r6独立地为-cooh。在实施方案中，r6独立地为-conh2。在实施方案中，r6独立地为-no2。在实施方案中，r6独立地为-sh。在实施方案中，r6独立地为-so3h。在实施方案中，r6独立地为-so4h。在实施方案中，r6独立地为-so2nh2。在实施方案中，r6独立地为-nhnh2。在实施方案中，r6独立地为-onh2。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)nhnh2。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)nh2。在实施方案中，r6独立地为-nhso2h。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)h。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)oh。在实施方案中，r6独立地为-nhoh。在实施方案中，r6独立地为-occl3。在实施方案中，r6独立地为-ocf3。在实施方案中，r6独立地为-ocbr3。在实施方案中，r6独立地为-oci3。在实施方案中，r6独立地为-ochcl2。在实施方案中，r6独立地为-ochbr2。在实施方案中，r6独立地为-ochi2。在实施方案中，r6独立地为-ochf2。在实施方案中，r6独立地为-och2cl。在实施方案中，r6独立地为-och2br。在实施方案中，r6独立地为-och2i。在实施方案中，r6独立地为-och2f。在实施方案中，r6独立地为-sf5。在实施方案中，r6独立地为-n3。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的芳烷基。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0268]
在实施方案中，r6独立地为未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的芳烷基。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r6独立地为未被取代的(杂脂环基)
烷基。
[0269]
在实施方案中，r7独立地为氢。在实施方案中，r7独立地为卤素。在实施方案中，r7独立地为-ccl3。在实施方案中，r7独立地为-cbr3。在实施方案中，r7独立地为-cf3。在实施方案中，r7独立地为-ci3。在实施方案中，r7独立地为-chcl2。在实施方案中，r7独立地为-chbr2。在实施方案中，r7独立地为-chf2。在实施方案中，r7独立地为-chi2。在实施方案中，r7独立地为-ch2cl。在实施方案中，r7独立地为-ch2br。在实施方案中，r7独立地为-ch2f。在实施方案中，r7独立地为-ch2i。在实施方案中，r7独立地为-cn。在实施方案中，r7独立地为-oh。在实施方案中，r7独立地为-nh2。在实施方案中，r7独立地为-cooh。在实施方案中，r7独立地为-conh2。在实施方案中，r7独立地为-no2。在实施方案中，r7独立地为-sh。在实施方案中，r7独立地为-so3h。在实施方案中，r7独立地为-so4h。在实施方案中，r7独立地为-so2nh2。在实施方案中，r7独立地为-nhnh2。在实施方案中，r7独立地为-onh2。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)nhnh2。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)nh2。在实施方案中，r7独立地为-nhso2h。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)h。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)oh。在实施方案中，r7独立地为-nhoh。在实施方案中，r7独立地为-occl3。在实施方案中，r7独立地为-ocf3。在实施方案中，r7独立地为-ocbr3。在实施方案中，r7独立地为-oci3。在实施方案中，r7独立地为-ochcl2。在实施方案中，r7独立地为-ochbr2。在实施方案中，r7独立地为-ochi2。在实施方案中，r7独立地为-ochf2。在实施方案中，r7独立地为-och2cl。在实施方案中，r7独立地为-och2br。在实施方案中，r7独立地为-och2i。在实施方案中，r7独立地为-och2f。在实施方案中，r7独立地为-sf5。在实施方案中，r7独立地为-n3。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的芳烷基。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0270]
在实施方案中，r7独立地为未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的芳基(例
如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的芳烷基。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r7独立地为未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0271]
在实施方案中，r8独立地为氢。在实施方案中，r8独立地为卤素。在实施方案中，r8独立地为-ccl3。在实施方案中，r8独立地为-cbr3。在实施方案中，r8独立地为-cf3。在实施方案中，r8独立地为-ci3。在实施方案中，r8独立地为-chcl2。在实施方案中，r8独立地为-chbr2。在实施方案中，r8独立地为-chf2。在实施方案中，r8独立地为-chi2。在实施方案中，r8独立地为-ch2cl。在实施方案中，r8独立地为-ch2br。在实施方案中，r8独立地为-ch2f。在实施方案中，r8独立地为-ch2i。在实施方案中，r8独立地为-cn。在实施方案中，r8独立地为-oh。在实施方案中，r8独立地为-nh2。在实施方案中，r8独立地为-cooh。在实施方案中，r8独立地为-conh2。在实施方案中，r8独立地为-no2。在实施方案中，r8独立地为-sh。在实施方案中，r8独立地为-so3h。在实施方案中，r8独立地为-so4h。在实施方案中，r8独立地为-so2nh2。在实施方案中，r8独立地为-nhnh2。在实施方案中，r8独立地为-onh2。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)nhnh2。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)nh2。在实施方案中，r8独立地为-nhso2h。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)h。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)oh。在实施方案中，r8独立地为-nhoh。在实施方案中，r8独立地为-occl3。在实施方案中，r8独立地为-ocf3。在实施方案中，r8独立地为-ocbr3。在实施方案中，r8独立地为-oci3。在实施方案中，r8独立地为-ochcl2。在实施方案中，r8独立地为-ochbr2。在实施方案中，r8独立地为-ochi2。在实施方案中，r8独立地为-ochf2。在实施方案中，r8独立地为-och2cl。在实施方案中，r8独立地为-och2br。在实施方案中，r8独立地为-och2i。在实施方案中，r8独立地为-och2f。在实施方案中，r8独立地为-sf5。在实施方案中，r8独立地为-n3。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的芳烷基。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0272]
在实施方案中，r8独立地为未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实
施方案中，r8独立地为未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的芳烷基。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r8独立地为未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0273]
脱保护处理可通过以下来进行：使3
′‑
o-肟可逆终止子部分与r2-onh2反应以产生3
′‑
onh2可逆终止子部分，并且然后用hono处理3
′‑
onh2部分以产生3
′
羟基部分。在一些配置中，受保护的引物可具有以下结构：
[0274][0275]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh；并且q为核酸引物。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。解封闭处理可通过以下来进行：使3
′‑
o-肟可逆终止子部分与r2-onh2反应以产生3
′‑
onh2部分，并且然后用hono处理3
′‑
onh2部分以产生3
′
羟基部分。在一些配置中，可逆地终止的引物可具有以下结构：
[0276][0277]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh；并且q为核酸引物。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0278]
在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)、被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基
so2nh2。在实施方案中，r6独立地为-nhnh2。在实施方案中，r6独立地为-onh2。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)nhnh2。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)nh2。在实施方案中，r6独立地为-nhso2h。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)h。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)oh。在实施方案中，r6独立地为-nhoh。在实施方案中，r6独立地为-occl3。在实施方案中，r6独立地为-ocf3。在实施方案中，r6独立地为-ocbr3。在实施方案中，r6独立地为-oci3。在实施方案中，r6独立地为-ochcl2。在实施方案中，r6独立地为-ochbr2。在实施方案中，r6独立地为-ochi2。在实施方案中，r6独立地为-ochf2。在实施方案中，r6独立地为-och2cl。在实施方案中，r6独立地为-och2br。在实施方案中，r6独立地为-och2i。在实施方案中，r6独立地为-och2f。在实施方案中，r6独立地为-sf5。在实施方案中，r6独立地为-n3。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的芳烷基。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0282]
在实施方案中，r6独立地为未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的芳烷基。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r6独立地为未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0283]
在实施方案中，r7独立地为氢。在实施方案中，r7独立地为卤素。在实施方案中，r7独立地为-ccl3。在实施方案中，r7独立地为-cbr3。在实施方案中，r7独立地为-cf3。在实施方案中，r7独立地为-ci3。在实施方案中，r7独立地为-chcl2。在实施方案中，r7独立地为-chbr2。在实施方案中，r7独立地为-chf2。在实施方案中，r7独立地为-chi2。在实施方案中，r7独立地为-ch2cl。在实施方案中，r7独立地为-ch2br。在实施方案中，r7独立地为-ch2f。在
实施方案中，r7独立地为-ch2i。在实施方案中，r7独立地为-cn。在实施方案中，r7独立地为-oh。在实施方案中，r7独立地为-nh2。在实施方案中，r7独立地为-cooh。在实施方案中，r7独立地为-conh2。在实施方案中，r7独立地为-no2。在实施方案中，r7独立地为-sh。在实施方案中，r7独立地为-so3h。在实施方案中，r7独立地为-so4h。在实施方案中，r7独立地为-so2nh2。在实施方案中，r7独立地为-nhnh2。在实施方案中，r7独立地为-onh2。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)nhnh2。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)nh2。在实施方案中，r7独立地为-nhso2h。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)h。在实施方案中，r7独立地为-nhc(o)oh。在实施方案中，r7独立地为-nhoh。在实施方案中，r7独立地为-occl3。在实施方案中，r7独立地为-ocf3。在实施方案中，r7独立地为-ocbr3。在实施方案中，r7独立地为-oci3。在实施方案中，r7独立地为-ochcl2。在实施方案中，r7独立地为-ochbr2。在实施方案中，r7独立地为-ochi2。在实施方案中，r7独立地为-ochf2。在实施方案中，r7独立地为-och2cl。在实施方案中，r7独立地为-och2br。在实施方案中，r7独立地为-och2i。在实施方案中，r7独立地为-och2f。在实施方案中，r7独立地为-sf5。在实施方案中，r7独立地为-n3。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的芳烷基。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r7独立地为被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0284]
在实施方案中，r7独立地为未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r7独立地为未被取代的芳烷基。在实施方案中，r7独立地为未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r7独立地为未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0285]
在实施方案中，r8独立地为氢。在实施方案中，r8独立地为卤素。在实施方案中，r8
独立地为-ccl3。在实施方案中，r8独立地为-cbr3。在实施方案中，r8独立地为-cf3。在实施方案中，r8独立地为-ci3。在实施方案中，r8独立地为-chcl2。在实施方案中，r8独立地为-chbr2。在实施方案中，r8独立地为-chf2。在实施方案中，r8独立地为-chi2。在实施方案中，r8独立地为-ch2cl。在实施方案中，r8独立地为-ch2br。在实施方案中，r8独立地为-ch2f。在实施方案中，r8独立地为-ch2i。在实施方案中，r8独立地为-cn。在实施方案中，r8独立地为-oh。在实施方案中，r8独立地为-nh2。在实施方案中，r8独立地为-cooh。在实施方案中，r8独立地为-conh2。在实施方案中，r8独立地为-no2。在实施方案中，r8独立地为-sh。在实施方案中，r8独立地为-so3h。在实施方案中，r8独立地为-so4h。在实施方案中，r8独立地为-so2nh2。在实施方案中，r8独立地为-nhnh2。在实施方案中，r8独立地为-onh2。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)nhnh2。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)nh2。在实施方案中，r8独立地为-nhso2h。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)h。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)oh。在实施方案中，r8独立地为-nhoh。在实施方案中，r8独立地为-occl3。在实施方案中，r8独立地为-ocf3。在实施方案中，r8独立地为-ocbr3。在实施方案中，r8独立地为-oci3。在实施方案中，r8独立地为-ochcl2。在实施方案中，r8独立地为-ochbr2。在实施方案中，r8独立地为-ochi2。在实施方案中，r8独立地为-ochf2。在实施方案中，r8独立地为-och2cl。在实施方案中，r8独立地为-och2br。在实施方案中，r8独立地为-och2i。在实施方案中，r8独立地为-och2f。在实施方案中，r8独立地为-sf5。在实施方案中，r8独立地为-n3。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的芳烷基。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0286]
在实施方案中，r8独立地为未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂脂环基
(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的芳烷基。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r8独立地为未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0287]
测序通常使用dna模板和dna引物来进行。因此，测序方法中所用的引物可具有以下结构：
[0288][0289]
其中碱基是核碱基，并且其中dna是脱氧核糖核酸引物。应理解，rna可代替dna用于测序方法。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0290]
本公开的测序方法可包括延伸步骤，由此将核苷酸添加到解封闭引物的3
′
端。核苷酸通常经由聚合酶催化来添加。核苷酸可包括可逆终止子部分以使得在延伸步骤中仅将单核苷酸添加到引物中。类似地，测序方法可包括延伸步骤，由此将寡核苷酸添加到解封闭引物的3
′
端。寡核苷酸通常经由连接酶催化来添加。寡核苷酸3
′
端处的核苷酸可包括可逆终止子部分以使得在延伸步骤中仅将单寡核苷酸添加到引物中。可逆地终止的核苷酸或寡核苷酸可包括外源标记，或者，可逆地终止的核苷酸或寡核苷酸可缺乏外源标记。举例来说，用于引物延伸的可逆地终止的核苷酸可具有结构：
[0291]
并且可经由对例如以下的核苷酸进行解封闭而产生：
[0292]
其中碱基是核碱基。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0293]
在一些测序方法中，在延伸步骤中添加到引物中的核苷酸或寡核苷酸可具有外源标记部分以使得外源标记附接至延伸引物。对延伸引物进行标记可用于边合成边测序方法或连接测序方法，例如下文描述和所引用参考文献中进一步详细阐述的测序方法。在替代
性测序方法中，在延伸步骤中添加的核苷酸或寡核苷酸缺乏外源标记部分以使得延伸引物不具有外源标记。未被标记的延伸引物可用于sequencing by synthesis
tm
方法，例如下文描述和所引用参考文献中进一步详细阐述的方法。
[0294]
本文所阐述的可逆地终止的核苷酸用途和解封闭方法可有益地促进采用试剂递送和产物检测的重复循环的循环技术。每个循环可包括一个步骤或多个步骤。例如，每个循环可包括检测指示模板核酸中的单核苷酸位置的信号所需的全部步骤。此类测序方法可称为循环可逆终止子(crt)技术。crt技术中的每个循环可包括以下步骤：(i)添加单个可逆地终止的核苷酸(或单个可逆地终止的寡核苷酸)以将初生引物增量至待检测的核苷酸位置；(ii)检测单核苷酸位置处或邻接位置处的核苷酸；以及(iii)对初生引物进行解封闭以允许返回至步骤(i)来开始后续循环。
[0295]
适用crt核酸测序方法的特定实例是例如如共同拥有的美国专利申请公开第2017/0022553 a1号、第2018/0044727 a1号、第2018/0187245 a1号或第2018/0208983 a1号中所描述的sequencing by binding
tm
(sbb
tm
)反应，所述文献中的每一者通过引用并入本文。用于确定模板核酸分子的序列的sbb
tm
方法可任选地基于在规定条件下三元复合物(在聚合酶、引发核酸与下一恰当核苷酸之间)的形成。所述方法可包括检查阶段、接着是核苷酸并入阶段(也称为延伸阶段)。
[0296]
sbb
tm
方法的检查阶段可针对至少一个与引物杂交的模板核酸分子进行。引物可以可逆地终止。引发模板可与包括聚合酶和至少一个核苷酸类型的反应混合物接触。聚合酶和核苷酸与一个或多个引发模板核酸分子的相互作用可在其中不将核苷酸共价添加到一个或多个引物中的条件下进行观测；并且每个模板核酸中的下一碱基可使用所观测到的聚合酶和核苷酸与一个或多个引发模板核酸分子的相互作用来加以识别。引发模板、聚合酶与核苷酸之间的相互作用可在多种流程中加以检测。例如，核苷酸可含有可检测标记。具有不同核碱基类型的核苷酸可分别通过不同标记来加以区分。相对于其他类型的核碱基来说，每个类型的核碱基可具有可区分标记。或者，不同核碱基类型中的一些或全部可具有相同标记，并且不同核苷酸类型可基于相应核苷酸类型至流动池的单独递送来加以区分。在一些实施方案中，聚合酶可被标记。与不同核碱基类型缔合的聚合酶可具有区分核苷酸类型与其相关核苷酸类型的独特标记。或者，聚合酶可具有类似标记，并且不同核碱基类型可基于不同核苷酸类型至流动池的单独递送来加以区分。
[0297]
在sbb
tm
方法的检查阶段期间，恰当核苷酸与不恰当核苷酸之间的区分可通过三元复合物稳定来促进。各种条件和试剂可为适用的。例如，引物可含有例如本文所阐述的可逆终止子部分的可逆终止子部分；并且/或例如二价金属离子的延伸所需的聚合酶辅因子可不存在；并且/或抑制基于聚合酶的引物延伸的抑制性二价阳离子可存在；并且/或检查阶段中存在的聚合酶可具有抑制引物延伸的化学修饰和/或突变；并且/或核苷酸可具有例如除去或更改天然三磷酸酯部分的5
′
修饰的抑制并入的化学修饰。检查阶段可包括使用本文所阐述的设备和方法进行的检测。一旦完成检查，则sbb
tm
方法可通过除去用于检查的聚合酶和核苷酸并且使引发模板核酸经受另外解封闭、延伸和检查循环而继续进行至下一循环。
[0298]
洗涤可在sbb
tm
方法的各个递送步骤之间进行。洗涤步骤可在本文所阐述的各个步骤中的任一个之间执行。例如，在sbb
tm
方法期间，洗涤步骤可用于在三元复合物稳定条件下
将引发模板核酸与接触引发模板核酸的其他试剂分离。这种洗涤可除去一种或多种试剂以免干扰混合物检查或以免污染待形成于先前已与第一混合物接触的基质上(或容器中)的第二混合物。例如，引发模板核酸可在三元复合物稳定条件下与聚合酶和至少一个核苷酸类型接触以形成第一混合物，并且可对第一混合物进行检查。任选地，洗涤可在检查之前进行以除去不参与稳定三元复合物形成的试剂。可替代地或另外，洗涤可在检查步骤之后进行以从引发模板核酸除去第一混合物的一种或多种组分。然后，引发模板核酸可在三元复合物稳定条件下与聚合酶和至少一个其他核苷酸接触以形成第二混合物，并且可针对三元复合物形成对第二混合物进行检查。如前所述，任选的洗涤可在第二检查之前进行以除去不参与稳定三元复合物形成的试剂。
[0299]
另一适用crt测序方法是边合成边测序(sbs)。sbs通常涉及经由反复添加针对与引物杂交的模板链的核苷酸来以酶方式延伸初生引物。简言之，sbs可通过使附接至流动池中的位点的靶核酸与一个或多个经标记核苷酸、dna聚合酶等接触来引发。其中使用靶核酸作为模板来延伸引物的那些位点并入可检测的经标记核苷酸。任选地，经标记核苷酸可还包括例如本文所阐述的可逆终止子中的任一者的可逆终止子。例如，可将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到引物中以使得后续延伸无法发生直至递送本公开的解封闭试剂以除去所述部分为止。因此，关于使用可逆终止的实施方案，可将解封闭试剂递送到容器(在检测发生之前或之后)。洗涤可在各个递送步骤之间进行。循环可执行n次以通过n个核苷酸延伸引物，由此检测长度为n的序列。可易于修改以采用本公开的可逆终止子和解封闭试剂的示例性sbs程序、试剂和检测组件描述于例如bentley等人，nature 456：53-59(2008)、wo 04/018497、wo 91/06678、wo 07/123744、美国专利第7,057,026号、第7,329,492号、第7,211,414号、第7,315,019号或第7,405,281号和美国专利申请公开第2008/0108082 a1号中，所述文献中的每一者通过引用并入本文。可商购自illumina公司(san diego，ca)的sbs方法也是适用的。
[0300]
边连接边测序反应也是适用的，包括例如shendure等人，science 309：1728-1732(2005)、美国专利第5,599,675号或美国专利第5,750,341号中所描述的反应，所述文献中的每一者通过引用并入本文。一些实施方案可包括如例如以下中所描述的边杂交边测序程序：bains等人，journal of theoretical biology 135(3)，303-7(1988)；drmanac等人，nature biotechnology 16，54-58(1998)；fodor等人，science 251(4995)，767-773(1995)；或wo 1989/10977，所述文献中的每一者通过引用并入本文。在边连接边测序程序和边杂交边测序程序中，与核酸模板杂交的引物经受通过寡核苷酸连接进行的延伸的重复循环。通常，寡核苷酸经荧光标记并且可进行检测以确定模板序列。此类方法中所用的引物和寡核苷酸可包括本文所阐述的可逆终止子并且其可使用本文所阐述的试剂来进行解封闭。
[0301]
上文测序方法的步骤可循环进行。例如，sbb
tm
方法的检查和延伸步骤可重复进行以使得在每个循环中检查单个下一恰当核苷酸(即，下一恰当核苷酸是恰当地结合至紧靠与杂交引物3
′
端杂交的模板中的碱基的5
′
定位的模板核酸中的核苷酸的核苷酸)，并且随后将单个下一恰当核苷酸添加到引物中。可进行本文所阐述的测序方法的任何数目的循环，包括例如至少1、2、10、25、50、100、150、250、500个或更多个循环。可替代地或另外，进行不超过500、250、150、100、50、25、10、2或1个循环。
[0302]
各种聚合酶中的任一种可用于本文所阐述的方法中。除非另外指示，否则提及例如本公开通篇示例的聚合酶的特定聚合酶应理解为包括其功能变体。特别适用的聚合酶功能包括形成三元复合物、延伸引物以引入核苷酸(例如可逆地终止的核苷酸)或使用现有核酸作为模板来催化核酸链聚合。
[0303]
聚合酶可基于结构同源性进行分类，例如将聚合酶分类至识别为a、b、c、d、x、y和rt的家族中。家族a中的dna聚合酶包括例如t7 dna聚合酶、真核线粒体dna聚合酶γ、大肠杆菌dna pol i、水生栖热菌(thermus aquaticus)pol i和脂肪嗜热芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)pol i。家族b中的dna聚合酶包括例如真核dna聚合酶α、δ和ε；dna聚合酶ζ；t4 dna聚合酶；phi29 dna聚合酶；和rb69噬菌体dna聚合酶。家族c包括例如大肠杆菌dna聚合酶iiiα亚单元。家族b太古菌dna聚合酶包括例如vent、deep vent、pfu和9
°
n聚合酶(例如来自马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室公司(new england biolabs inc.；ipswich，ma)的therminator
tm dna聚合酶)。家族d包括例如来源于古细菌(archaea)的广古菌门(euryarchaeota)亚域的聚合酶。家族x中的dna聚合酶包括例如真核聚合酶polβ、polσ、polλ和polμ以及酿酒酵母(s.cerevisiae)pol4。家族y中的dna聚合酶包括例如polη、polι、polκ、大肠杆菌poliv(dinb)和大肠杆菌pol v(umud
′
2c)。rt(逆转录酶)家族的dna聚合酶包括例如逆转录病毒逆转录酶和真核端粒酶。示例性rna聚合酶包括但不限于病毒rna聚合酶，例如t7 rna聚合酶；真核rna聚合酶，例如rna聚合酶i、rna聚合酶ii、rna聚合酶iii、rna聚合酶iv和rna聚合酶v；以及古细菌rna聚合酶。
[0304]
适用dna聚合酶的其他实例包括细菌dna聚合酶、真核dna聚合酶、古细菌dna聚合酶、病毒dna聚合酶和噬菌体dna聚合酶。细菌dna聚合酶包括大肠杆菌dna聚合酶i、ii和iii、iv和v、大肠杆菌dna聚合酶的克列诺片段(klenow fragment)、粪堆梭菌(clostridium stercorarium，cst)dna聚合酶、热纤梭菌(clostridium thermocellum，cth)dna聚合酶和硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus，sso)dna聚合酶。真核dna聚合酶包括dna聚合酶α、β、γ、δ、η、ζ、λ、σ、μ和k以及revl聚合酶(末端脱氧胞苷转移酶)和末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)。病毒dna聚合酶包括t4 dna聚合酶、phi-29 dna聚合酶、ga-1、phi-29样dna聚合酶、pza dna聚合酶、phi-15 dna聚合酶、cpl dna聚合酶、cp7 dna聚合酶、t7 dna聚合酶和t4聚合酶。其他适用dna聚合酶包括热稳定和/或嗜热性dna聚合酶，例如水生栖热菌(taq)dna聚合酶、丝状栖热菌(thermus filiformis，tfi)dna聚合酶、速生热球菌(thermococcus zilligi，tzi)dna聚合酶、嗜热栖热菌(thermus thermophilus，tth)dna聚合酶、黄色栖热菌(thermus flavusu，tfl)dna聚合酶、乌兹火球菌(pyrococcus woesei，pwo)dna聚合酶、激烈火球菌(pyrococcus furiosus，pfu)dna聚合酶和turbo pfu dna聚合酶、海滨嗜热球菌(thermococcus litoralis，tli)dna聚合酶、火球菌属(pyrococcus sp.)gb-d聚合酶、海栖热孢菌(thermotoga maritima，tma)dna聚合酶、脂肪嗜热芽孢杆菌(bst)dna聚合酶、鹿儿岛火球菌(pyrococcus kodakaraensis，kod)dna聚合酶、pfx dna聚合酶、热球菌属(thermococcus sp.)jdf-3(jdf-3)dna聚合酶、蛇发女怪热球菌(thermococcus gorgonarius，tgo)dna聚合酶、嗜酸热球菌(thermococcus acidophilium)dna聚合酶；嗜酸热硫化叶菌(sulfolobus acidocaldarius)dna聚合酶；热球菌属go n-7dna聚合酶；隐蔽热网菌(pyrodictium occultum)dna聚合酶；沃氏甲烷球菌(methanococcus voltae)dna聚合酶；嗜热自养甲烷球菌(methanococcus thermoautotrophicum)dna聚合酶；詹氏甲烷球菌
(methanococcus jannaschii)dna聚合酶；除硫球菌(desulfurococcus)菌株tok dna聚合酶(d.tok pol)；深海火球菌(pyrococcus abyssi)dna聚合酶；掘越氏火球菌(pyrococcus horikoshii)dna聚合酶；岛火球菌(pyrococcus islandicum)dna聚合酶；烟生热球菌(thermococcus fumicolans)dna聚合酶；敏捷气热菌(aeropyrum pernix)dna聚合酶；和杂二聚体dna聚合酶dp1/dp2。结合所公开的技术的经工程改造且经修饰聚合酶也是适用的。例如，可使用极端嗜热性海洋古细菌热球菌属9
°
n的经修饰型式(例如来自马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室公司的therminator
tm dna聚合酶)。
[0305]
适用rna聚合酶包括但不限于病毒rna聚合酶，例如t7 rna聚合酶、t3聚合酶、sp6聚合酶和kll聚合酶；真核rna聚合酶，例如rna聚合酶i、rna聚合酶ii、rna聚合酶iii、rna聚合酶iv和rna聚合酶v；以及古细菌rna聚合酶。
[0306]
另一适用类型的聚合酶是逆转录酶。示例性逆转录酶包括但不限于来自人类免疫缺乏病毒1型的hiv-1逆转录酶(pdb 1hmv)、来自人类免疫缺乏病毒2型的hiv-2逆转录酶、来自莫罗尼鼠类白血病病毒(moloney murine leukemia virus)的m-mlv逆转录酶、来自禽成髓细胞增多症病毒的amv逆转录酶和维护真核染色体端粒的端粒酶逆转录酶。
[0307]
具有本质3
′‑5′
改正核酸外切酶活性的聚合酶可用于本文所阐述的方法和系统的一些应用。例如，3
′‑5′
核酸外切酶活性可用于从引物3
′
端除去可逆地终止的核苷酸。基本上缺乏3
′‑5′
改正核酸外切酶活性的聚合酶也适用于例如大部分测序系统和方法中的一些配置。不存在核酸外切酶活性可为野生型特征或由变异或经工程改造聚合酶结构赋予的特征。例如，核酸外切酶缺失(exo minus)克列诺片段是缺乏3
′‑5′
改正核酸外切酶活性的克列诺片段的突变型式。克列诺片段及其核酸外切酶缺失变体可适用于本文所阐述的方法或组合物。
[0308]
可用于本文所阐述的方法或组合物中的聚合酶包括天然存在的聚合酶和包括但不限于突变体、重组体、融合体、基因修饰物、化学修饰物、合成物和类似物的其经修饰变体。适用于三元复合物形成和检测的聚合酶不限于具有催化聚合反应的能力的聚合酶。任选地，适用聚合酶具有在稳定三元复合物形成或检查期间不使用的至少一种条件下催化聚合反应的能力。可用于形成稳定三元复合物的示例性聚合酶包括例如美国专利申请公开第2017/0314072 a1号或第2018/0155698 a1号或美国专利申请第62/732,510号中所阐述的野生型和突变聚合酶，所述文献中的每一者通过引用并入本文。
[0309]
含有可用于检测聚合酶(例如在sbb
tm
检查步骤期间)的外源标记部分(例如外源发光团)的聚合酶可适用于一些实施方案中。任选地，外源标记部分可例如使用聚合酶的游离硫氢基或游离胺部分以化学方式连接至聚合酶。外源标记部分也可经由蛋白质融合附接至聚合酶。可经由蛋白质融合来附接的示例性标记部分包括例如绿荧光蛋白(gfp)、藻胆蛋白(例如藻蓝素和藻红素)或gfp或藻胆蛋白的波长移位变体。
[0310]
也提供了包括流体试剂递送系统、检测系统和流动池的核酸检测设备，其中流体试剂递送系统被配置为将流体试剂递送到流动池，其中检测系统被配置为检测流动池中的信号，其中流动池附接至具有以下结构的第一分子：
[0311][0312]
其中碱基是核碱基，其中dna独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸，并且其中流体试剂包括包含结构r2-onh2的第二分子，其中r2、r3和r4独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0313]
本公开的设备可被配置为检测发光或荧光。因此，设备可包括具有例如激光、led或灯的光学激发设备和例如摄影机(例如互补金属氧化物半导体(cmos)摄影机或电荷耦合装置(ccd)摄影机)的发光检测器的检测系统。可用于本文系统或方法中的检测设备和其组件的实例描述于例如美国专利申请公开第2010/0111768 a1号或美国专利第7,329,860号、第8,951,781号或第9,193,996号中，所述文献中的每一者通过引用并入本文。其他检测设备包括经商业化以用于核酸测序的检测设备，例如由以下提供的检测设备：illumina
tm
公司(例如hiseq
tm
、miseq
tm
、nextseq
tm
或novaseq
tm
系统)、life technologies
tm
(例如abi prism
tm
或solid
tm
系统)、pacific biosciences(例如使用smrt
tm
技术的系统，例如sequel
tm
或rs ii
tm
系统)或qiagen(例如genereader
tm
系统)。其他适用检测器描述于美国专利第5,888,737号、第6,175,002号、第5,695,934号、第6,140,489号或第5,863,722号或美国专利公开第2007/007991 a1号、第2009/0247414a1号或第2010/0111768号或wo2007/123744中，所述文献中的每一者通过引用整体并入本文。
[0314]
尽管本公开的组合物和方法是在于本文若干示例性配置中的光学检测的情形下说明，但应理解可另外或替代地使用其他检测模态。例如，检测器可为用于检测质子或焦磷酸酯的电子检测器(参见例如美国专利申请公开第2009/0026082 a1号、第2009/0127589 a1号、第2010/0137143 a1号或第2010/0282617 a1号，所述文献中的每一者通过引用整体并入本文，或可商购自thermofisher，waltham，ma的ion torrent
tm
系统)，或如用于检测纳米孔的电子检测器，例如由英国牛津(oxford uk)的oxford nanopore
tm
商业化的电子检测器(例如minion
tm
或promethion
tm
系统)或美国专利第7,001,792号、soni和meller，clin.chem.53，1996-2001(2007)；healy，nanomed.2，459-481(2007)；或cockroft等人，j.am.chem.soc.130，818-820(2008)中所阐述的电子检测器，所述文献中的每一者通过引用并入本文。可使用fet检测器，例如美国专利申请第62/767,712号、美国专利申请公开第2017/0240962 a1号、第2018/0051316 a1号、第2018/0112265 a1号、第2018/0155773 a1号或第2018/0305727 a1号或美国专利第9,164,053号、第9,829,456号、第10,036,064号或第10,125,391号中所描述的fet检测器中的一者或多者，所述文献中的每一者通过引用并入本文。
[0315]
可用于本文所阐述的方法中的其他检测技术包括例如可用于感知质量的质谱法；可用于感知与表面的结合的表面等离子体共振；可用于感知能量标记吸收波长的吸收；可
用于感知因标记存在所致的温度变化的热量测定法；可用于感知标记电特性的电导或阻抗；或其他已知分析技术。
[0316]
适用检测设备可包括流体试剂递送系统。流体递送系统可包括被配置以进行本文所阐述的化学反应的反应容器(例如流动池)。反应容器也可被配置以允许检测反应或反应产物。流体递送系统可包括用于储存试剂的储集器。来自试剂的流体可经由流体递送系统递送到反应容器(例如流动池)。来自反应的废试剂和产物或废料可从反应容器排至废料储集器中。
[0317]
在特定配置中，流体试剂递送系统被配置以将引物延伸试剂递送到流动池，其中引物延伸试剂包括聚合酶和具有3
′
onh2部分的核苷酸。例如，通过流体试剂递送系统储存或递送的核苷酸可具有以下结构：
[0318][0319]
其中碱基是核碱基。r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。例如适用于crt测序方法的试剂的本文所阐述的其他试剂可经由流体试剂递送系统来储存或递送。例如，流体试剂递送系统可被配置以将三元复合物形成试剂递送到反应容器，其中三元复合物形成试剂包括聚合酶和作为用于引发模板核酸的下一恰当核苷酸的核苷酸。
[0320]
本公开的检测设备可包括被配置以导引设备执行核酸测序方法的程序模块，其中核酸测序方法包括经由流体试剂递送系统将流体试剂重复递送到反应容器和通过检测系统重复检测反应容器。设备组件控制可利用设计成执行本文所描述功能的通用处理器、数字信号处理器(dsp)、特殊应用集成电路(asic)、场可程序化门阵列(fpga)或其他可程序化逻辑设备、离散闸或晶体管逻辑、离散硬件组件或其任何组合。通用处理器可为微处理器，但在替代方案中，处理器可为任何常规处理器、控制器、微控制器或状态机。处理器也可以例如dsp和微处理器、多个微处理器、一个或多个微处理器以及dsp芯或任何其他此类配置的组合的计算装置组合的形式实施。用于控制流体的相同或不同处理器可与用于获取、储存和处理信号(例如本文所阐述的方法中所检测的信号)的系统相互作用。在特定实施方案中，处理器可用于根据信号确定模板核酸中的特定位置处存在的核苷酸的标识。在一些情况下，处理器根据所检测的信号识别用于模板的核苷酸序列。
[0321]
适用处理器可包括以下中的一者或多者：个人计算机系统、服务器计算机系统、瘦客户端、复杂型客户端、手持式或膝上型装置、多处理器系统、基于微处理器的系统、机顶盒、可程序化消费型电子产品、网络pc、小型计算机系统、大型计算机系统、智能型手机和包括以上系统或装置中的任一者的分布云端计算环境等。处理器可包括一个或多个处理器或处理单元、可包括ram和非易失性存储器的存储器架构。存储器架构还可包括可移除/不可移除、易失性/非易失性计算机系统储存介质。此外，存储器架构可包括用于从不可移除、非
易失性磁性介质(例如硬盘驱动器)读取和书写至不可移除、非易失性磁性介质(例如硬盘驱动器)的一个或多个读取器；用于从可移除、非易失性磁盘读取和书写至可移除、非易失性磁盘的磁盘驱动器；和/或用于从可移除、非易失性光盘(例如cd-rom或dvd-rom)读取或书写至可移除、非易失性光盘(例如cd-rom或dvd-rom)的光盘驱动器。处理器也可包括各种计算机系统可读介质。所述介质可为例如易失性和非易失性介质以及可移除和不可移除介质的云端计算环境可访问的任何可用介质。
[0322]
存储器架构可包括具有以可执行指令形式实施的至少一个程序模块的至少一个程序产品，所述可执行指令被配置以进行本文所阐述的方法的一个或多个步骤。例如，可执行指令可包括操作系统、一个或多个应用程序、其他程序模块和程序数据。一般来说，程序模块可包括执行本文所阐述的特定任务的例程、程序、对象、组件、逻辑、数据结构等。
[0323]
处理器或其他可程序化装置的组件可通过内部总线耦合，所述内部总线可以若干类型的总线结构，包括存储器总线或存储器控制器、外围总线、加速图形端口和使用各种总线架构中的任一者的处理器或本地总线中任一者的一者或多者形式实施。作为实例而非限制，此类架构包括工业标准架构(isa)总线、微通道架构(mca)总线、增强型isa(eisa)总线、视频电子标准协会(vesa)本地总线和外围组件互连(pci)总线。
[0324]
处理器可任选地与例如键盘、指向装置(例如鼠标)、显示器(例如图形用户界面(gui))或促进用户与本公开系统互动的其他装置的一个或多个外部装置连通。类似地，处理器可与其他装置连通(例如经由网卡、调制解调器等)。这种连通可经由i/o界面发生。然而，本文系统的处理器可经由合适网络适配器与例如局域网络(lan)、通用广域网(wan)和/或公用网络(例如因特网)的一个或多个网络连通。
[0325]
本公开还提供了例如可用于表征核酸的试剂盒。试剂盒可包括用于进行本文所阐述的方法中的一种或多种或使用或生成本文所公开的组合物的试剂。例如，试剂盒可包括用于对可逆地终止的核苷酸或核酸进行解封闭的本文所阐述的一种或多种试剂。可替代地或另外，本公开的试剂盒可包括用于进行引物延伸步骤的一种或多种试剂，包括例如可逆地终止的核苷酸或可逆地终止的核酸和/或聚合酶。用于延伸步骤或用于检查步骤的聚合酶也可包括在试剂盒中。本发明的试剂盒可任选地包括用于进行测序方法的其他步骤，包括例如用于产生并检测稳定三元复合物的检查步骤、洗涤步骤、用于产生核酸簇的步骤等的试剂。
[0326]
因此，本公开提供了一种试剂盒，其包括含有包含3
′‑
o-肟部分的核苷酸的第一容器和含有包含结构r2-onh2的试剂的第二容器，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0327]
在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)、被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)或被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。
[0328]
在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)。在实施方案中，r2为-c(o)(r6)。在实施方案
中，r2为-p(o)(r6)(r7)。在实施方案中，r2为-c(r6)(＝c(r7)(r8))。在实施方案中，r2为-si(r6)(r7)(r8)。在实施方案中，r2为-so2(r6)。在实施方案中，r2为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r2为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r2为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r2为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r2为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r2为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r2为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r2为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r2为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r2为未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r2为未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r2为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r2不为未被取代的甲基。在实施方案中，r2不为未被取代的乙基。在实施方案中，r2不为未被取代的丙基。
[0329]
r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)、被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)、被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)、被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)、被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)、被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)、被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)、被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r6、r7和r8不都为氢。在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0330]
在实施方案中，r6独立地为氢。在实施方案中，r6独立地为卤素。在实施方案中，r6独立地为-ccl3。在实施方案中，r6独立地为-cbr3。在实施方案中，r6独立地为-cf3。在实施方案中，r6独立地为-ci3。在实施方案中，r6独立地为-chcl2。在实施方案中，r6独立地为-chbr2。在实施方案中，r6独立地为-chf2。在实施方案中，r6独立地为-chi2。在实施方案中，r6独立地为-ch2cl。在实施方案中，r6独立地为-ch2br。在实施方案中，r6独立地为-ch2f。在实施方案中，r6独立地为-ch2i。在实施方案中，r6独立地为-cn。在实施方案中，r6独立地为-oh。在实施方案中，r6独立地为-nh2。在实施方案中，r6独立地为-cooh。在实施方案中，r6独立地为-conh2。在实施方案中，r6独立地为-no2。在实施方案中，r6独立地为-sh。在实施方案中，r6独立地为-so3h。在实施方案中，r6独立地为-so4h。在实施方案中，r6独立地为-so2nh2。在实施方案中，r6独立地为-nhnh2。在实施方案中，r6独立地为-onh2。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)nhnh2。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)nh2。在实施方案中，r6独
立地为-nhso2h。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)h。在实施方案中，r6独立地为-nhc(o)oh。在实施方案中，r6独立地为-nhoh。在实施方案中，r6独立地为-occl3。在实施方案中，r6独立地为-ocf3。在实施方案中，r6独立地为-ocbr3。在实施方案中，r6独立地为-oci3。在实施方案中，r6独立地为-ochcl2。在实施方案中，r6独立地为-ochbr2。在实施方案中，r6独立地为-ochi2。在实施方案中，r6独立地为-ochf2。在实施方案中，r6独立地为-och2cl。在实施方案中，r6独立地为-och2br。在实施方案中，r6独立地为-och2i。在实施方案中，r6独立地为-och2f。在实施方案中，r6独立地为-sf5。在实施方案中，r6独立地为-n3。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的芳烷基。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r6独立地为被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0331]
在实施方案中，r6独立地为未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的炔基(例如c
2-c8烷基、c
2-c6烷基或c
2-c4烷基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r6独立地为未被取代的芳烷基。在实施方案中，r6独立地为未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r6独立地为未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0332]
在实施方案中，r7独立地为氢。在实施方案中，r7独立地为卤素。在实施方案中，r7独立地为-ccl3。在实施方案中，r7独立地为-cbr3。在实施方案中，r7独立地为-cf3。在实施方案中，r7独立地为-ci3。在实施方案中，r7独立地为-chcl2。在实施方案中，r7独立地为-chbr2。在实施方案中，r7独立地为-chf2。在实施方案中，r7独立地为-chi2。在实施方案中，r7独立地为-ch2cl。在实施方案中，r7独立地为-ch2br。在实施方案中，r7独立地为-ch2f。在实施方案中，r7独立地为-ch2i。在实施方案中，r7独立地为-cn。在实施方案中，r7独立地为-oh。在实施方案中，r7独立地为-nh2。在实施方案中，r7独立地为-cooh。在实施方案中，
chbr2。在实施方案中，r8独立地为-chf2。在实施方案中，r8独立地为-chi2。在实施方案中，r8独立地为-ch2cl。在实施方案中，r8独立地为-ch2br。在实施方案中，r8独立地为-ch2f。在实施方案中，r8独立地为-ch2i。在实施方案中，r8独立地为-cn。在实施方案中，r8独立地为-oh。在实施方案中，r8独立地为-nh2。在实施方案中，r8独立地为-cooh。在实施方案中，r8独立地为-conh2。在实施方案中，r8独立地为-no2。在实施方案中，r8独立地为-sh。在实施方案中，r8独立地为-so3h。在实施方案中，r8独立地为-so4h。在实施方案中，r8独立地为-so2nh2。在实施方案中，r8独立地为-nhnh2。在实施方案中，r8独立地为-onh2。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)nhnh2。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)nh2。在实施方案中，r8独立地为-nhso2h。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)h。在实施方案中，r8独立地为-nhc(o)oh。在实施方案中，r8独立地为-nhoh。在实施方案中，r8独立地为-occl3。在实施方案中，r8独立地为-ocf3。在实施方案中，r8独立地为-ocbr3。在实施方案中，r8独立地为-oci3。在实施方案中，r8独立地为-ochcl2。在实施方案中，r8独立地为-ochbr2。在实施方案中，r8独立地为-ochi2。在实施方案中，r8独立地为-ochf2。在实施方案中，r8独立地为-och2cl。在实施方案中，r8独立地为-och2br。在实施方案中，r8独立地为-och2i。在实施方案中，r8独立地为-och2f。在实施方案中，r8独立地为-sf5。在实施方案中，r8独立地为-n3。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的芳烷基。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r8独立地为被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0335]
在实施方案中，r8独立地为未被取代的烷基(例如c
1-c8烷基、c
1-c6烷基或c
1-c4烷基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的烯基(例如c
2-c8烯基、c
2-c6烯基或c
2-c4烯基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的炔基(例如c
2-c8炔基、c
2-c6炔基或c
2-c4炔基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环烷基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环烯基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的环炔基(例如c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的芳基(例如c
6-c
10
芳基、c
10
芳基或苯基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂脂环基(例如3至8元、3至6元或5至6元)。在实施方案中，r8独立地为未被取代的芳烷基。在实施方案中，r8独立地为未被取代的杂芳烷基。在实施方案中，r8独立地为未被取代的(杂脂环基)
烷基。
[0336]
任选地，试剂盒可包括亚硝酸(hono)。例如，在第三容器中。在特定配置中，核苷酸可具有结构：
[0337][0338]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4可独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0339]
在实施方案中，q独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。
[0340]
执行本文所阐述的方法中所用的组分或制品中的任一者可有用地封装至试剂盒中。例如，试剂盒可经封装以包括执行本文所阐述的方法中所用的组分或制品中的一些、许多或全部。示例性组分包括例如被标记的核苷酸(例如可延伸的标记核苷酸)；聚合酶(被标记或未被标记)；具有例如-onh2部分的终止子部分的核苷酸(例如未被标记的可逆地终止的核苷酸)；例如本文所阐述的n-烷氧基胺试剂的试剂；以及如本文中和本文所引用的参考文献中所阐述的其类似物。此类试剂中的任一种可包括例如用于执行引发模板核酸分析的后续步骤中的一者或多者的流体、组分和/或制品中的一些、许多或全部。试剂盒未必包括引物或模板核酸。相反地，试剂盒使用者可提供有待与试剂盒组分组合的引发模板核酸。类似地，试剂盒可排除本文所阐述的组件中的一者或多者(例如流动池或其他容器)，并且任选地，此类被排除的组件可由最终用户提供。
[0341]
一种或多种辅助试剂也可包括在试剂盒中。此类辅助试剂可包括上文所示例的试剂和/或其他类型的适用于执行本文所阐述的方法的试剂中的任一者。指令可还包括在试剂盒中。指令可包括例如用于制造本文所阐述的方法中所用的任何组分、执行本文所阐述的方法的任何实施方案的一个或多个步骤的程序和/或用于执行采用引发模板核酸的后续分析步骤中的任一者的指令。例如，试剂盒可包括用于用可逆地终止的核苷酸或可逆地终止的寡核苷酸延伸引物的指令或用于对可逆地终止的核苷酸或引物进行解封闭的指令。
[0342]
任选地，试剂盒可包括呈可由人类用户读取的标记形式的识别信息。例如条形码、微芯片或无线射频识别(rfid)卷标的机器可读取标记也可为适用的。
[0343]
在特定实施方案中，试剂盒包括具有用于含有试剂的储集器并且进一步具有用于将试剂从储集器转移至检测仪器的流体组件的筒。例如，流体组件可被配置以将试剂转移至其中检测稳定三元复合物的流动池。筒可被配置以非永久性地引入例如核酸测序平台的核酸分析系统中。因此，筒可被配置以与检测设备一起安装和从检测设备除去。可包括在本公开的试剂盒(或系统)中的示例性流体筒描述于美国专利申请公开第2018/0280975 a1号或第2019/0055596 a1号中，所述文献中的每一者通过引用并入本文。
[0344]
在一个方面，提供了将3
′‑
o-nh2部分添加到具有3
′
保护基团的核苷酸的方法，其包括使具有3
′
保护基团的核苷酸与包括结构r2-o-nh2的试剂接触，其中r2的分子量为至少24。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括核糖或脱氧核糖。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括核糖。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括2
′
脱氧核糖。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括磷酸酯。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括三磷酸酯。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括结构：
[0345][0346]
其中包括3
′‑
o-nh2部分的核苷酸包括结构：
[0347][0348]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0349]
在实施方案中，3
′
封闭基团包括3
′‑
o-肟。在实施方案中，3
′
封闭基团包括3
′‑
o-醛肟。在实施方案中，3
′
封闭基团包括3
′‑
o-酮肟。
[0350]
在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括结构：
[0351]
其中包括3
′‑
o-nh2部分的核苷酸包括结构：其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，o独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、
环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0352]
在实施方案中，所述方法在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少94％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。在实施方案中，所述方法在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少96％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。在实施方案中，所述方法在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少98％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。在实施方案中，所述方法在不超过1小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少98％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0353]
在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过6％的胞嘧啶碱基。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过5％的胞嘧啶碱基。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过4％的胞嘧啶碱基。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过3％的胞嘧啶碱基。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过2％的胞嘧啶碱基。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过1％的胞嘧啶碱基。
[0354]
在一个方面，提供了制造3
′
封闭核苷酸的方法，所述方法包括使3
′
保护核苷酸与具有结构r2-o-nh2、r2-o-nhch3、r2-o-nhcoch3或r2-o-ch2n3的试剂接触，其中r2的分子量为至少24g/mol，并且由此由3
′
保护核苷酸制造3
′
封闭核苷酸。
[0355]
在实施方案中，r2的分子量为至少36。在实施方案中，r2包括氟核。在实施方案中，r2包括至少两个碳核。在实施方案中，r2包括碳碳双键。在实施方案中，r2包括叔碳。在实施方案中，r2包括叔丁基部分。在实施方案中，r2包括环状部分。在实施方案中，r2包括硅核。在实施方案中，r2包括苯基环。在实施方案中，r2包括氮核。在实施方案中，r2包括氧核。在实施方案中，r2包括羟化部分。
[0356]
在一个方面，提供了制造3
′
封闭核苷酸的方法，所述方法包括使3
′
保护核苷酸与具有结构r2-o-nh2或r2-o-ch2n3的试剂接触，其中r2的分子量为至少24g/mol，并由此由3
′
保护核苷酸制造3
′
封闭核苷酸。
[0357]
在实施方案中，3
′
封闭核苷酸包括直接键结至核苷酸的核糖3
′
碳的封闭部分；并且封闭部分为-onh2、-onhcoch3、-onhch3、-och2n3。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸包括直接键结至核苷酸的核糖3
′
碳的封闭部分；并且封闭部分为-onh2或-och2n3。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸包括直接键结至核苷酸的核糖3
′
碳的封闭部分；并且封闭部分为-onh2。
[0358]
在实施方案中，3
′
保护核苷酸包括直接共价键结至核苷酸的核糖3
′
碳的保护部分；并且保护部分为3
′‑
o-肟部分。
[0359]
在实施方案中，-o-肟部分具有式：-o-n＝c(r3)(r4)；并且r3和r4独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被
取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0360]
在实施方案中，-o-肟部分具有式：-o-n＝c(r3)(r4)；r3为氢；并且r4为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0361]
在实施方案中，-o-肟部分具有式：-o-n＝c(r3)(r4)；并且r3和r4独立地为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0362]
在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括腺嘌呤部分或其衍生物、鸟嘌呤部分或其衍生物、胞嘧啶部分或其衍生物、胸腺嘧啶部分或其衍生物、或尿嘧啶部分或其衍生物。在实施方案中，腺嘌呤衍生物部分、鸟嘌呤衍生物部分、胞嘧啶衍生物部分、胸腺嘧啶衍生物部分和尿嘧啶衍生物部分包括可检测部分。
[0363]
在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括单磷酸酯部分或其衍生物、二磷酸酯部分或其衍生物、三磷酸酯部分或其衍生物、或单价核酸部分或其衍生物。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括单磷酸酯部分、二磷酸酯部分、三磷酸酯部分或单价核酸部分。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括三磷酸酯部分。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括单价核酸部分。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括核糖部分。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括2
′
脱氧核糖部分。
[0364]
在实施方案中，r2的分子量为1000g/mol或更小。在实施方案中，r2的分子量为至少36g/mol。在实施方案中，r2的分子量为至少57g/mol。
[0365]
在实施方案中，r2包括至少两个碳核、氟核、碳碳双键、叔碳、叔丁基部分、环状部分、硅核、苯基环、氮核、氧核或羟化部分。
[0366]
在实施方案中，r2为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r2不为未被取代的甲基。在实施方案中，r2不为未被取代的乙基。在实施方案中，r2不为未被取代的丙基。
[0367]
在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代
的芳基、被取代或未被取代的杂芳基；并且r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0368]
在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、未被取代的6元杂脂环基、未被取代的苯基、被取代或未被取代的杂芳基；并且r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r6、r7和r8不都为氢。
[0369]
在实施方案中，试剂具有式：
[0370][0371]
在实施方案中，试剂具有式：
[0372][0373]
在实施方案中，3
′
保护核苷酸具有结构：
[0374]3′
封闭核苷酸具有结构：b为核碱基；
r1为氢、-oh、卤素、-och3；q独立地为核酸部分、三磷酸酯部分、二磷酸酯部分或单磷酸酯部分；r3和r4独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0375]
在实施方案中，所述方法在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少94％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。在实施方案中，所述方法在不超过1小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少98％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0376]
在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的所述具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过6％的胞嘧啶碱基。在实施方案中，具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的所述具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过1％的胞嘧啶碱基。
[0377]
在实施方案中，所述方法还包括制造第一组多个3
′
封闭核苷酸，所述方法包括使第二组多个3
′
保护核苷酸与第三组多个试剂接触，并且由此由第二组多个3
′
保护核苷酸制造第一组多个3
′
封闭核苷酸。在实施方案中，制造第一组多个3
′
封闭核苷酸持续3小时或更少时间。在实施方案中，制造第一组多个3
′
封闭核苷酸持续2小时或更少时间。在实施方案中，制造第一组多个3
′
封闭核苷酸持续1小时或更少时间。
[0378]
在实施方案中，将至少94％的第一组多个3
′
保护核苷酸制成第二组多个3
′
封闭核苷酸。在实施方案中，将至少96％的第一组多个3
′
保护核苷酸制成第二组多个3
′
封闭核苷酸。在实施方案中，将至少98％的第一组多个3
′
保护核苷酸制成第二组多个3
′
封闭核苷酸。
[0379]
在实施方案中，第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且6％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。在实施方案中，第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且5％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。在实施方案中，第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且4％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。在实施方案中，第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且3％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。在实施方案中，第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且2％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。在实施方案中，第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且1％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。
[0380]
在一个方面，提供了包括胞嘧啶核苷酸群体的组合物，其中至少94％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′
o-nh2，其中不超过8％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分，并且其中不超过6％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。
[0381]
在实施方案中，至少96％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′‑
o-nh2。在实施方案中，至少98％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′‑
o-nh2。在实施方案中，至少99％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′‑
o-nh2。
[0382]
在实施方案中，不超过6％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分。在实
施方案中，不超过4％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分。在实施方案中，不超过2％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分。在实施方案中，不超过1％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分。
[0383]
在实施方案中，不超过4％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。在实施方案中，不超过2％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。在实施方案中，不超过1％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。
[0384]
在实施方案中，至少98％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′‑
o-nh2，其中不超过1％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分，并且其中不超过1％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。
[0385]
在实施方案中，组合物是水溶液。在实施方案中，溶液的ph不小于4且不大于8。
[0386]
在实施方案中，组合物包含包括结构r2-o-nh2的试剂。在实施方案中，r2包括至少24、26、57或100的分子量。在实施方案中，r2包括至少24的分子量。在实施方案中，r2包括至少36的分子量。在实施方案中，r2包括至少两个碳核、氟核、碳碳双键、叔碳、叔丁基部分、环状部分、硅核、苯基环、氮核、氧核或羟化部分。在实施方案中，r2包括至少两个碳核。在实施方案中，r2包括氟核。在实施方案中，r2包括碳碳双键。在实施方案中，r2包括叔碳。在实施方案中，r2包括叔丁基部分。在实施方案中，r2包括环状部分。在实施方案中，r2包括硅核。在实施方案中，r2包括苯基环。在实施方案中，r2包括氮核。在实施方案中，r2包括苯基环。在实施方案中，r2包括氧核。在实施方案中，r2包括羟化部分。
[0387]
在实施方案中，包括结构r2-o-nh2的试剂选自由以下组成的组：
[0388][0389]
在实施方案中，包括结构r2-o-nh2的试剂选自由以下组成的组：
[0390]
在实施方案中，包括结构r2-o-nh2的试剂是在实施方案中，包括结构r2-o-nh2的试剂是在实施方案中，包括结构r2-o-nh2的试剂是
[0391]
在实施方案中，除-o-nh2以外的3
′
部分包括3
′
o-肟。在实施方案中，除-o-nh2以外的3
′
部分包括3
′
o-醛肟。在实施方案中，除-o-nh2以外的3
′
部分包括3
′
o-酮肟。
[0392]
在实施方案中，组合物包含包括结构r2-o-nhch3或r2-o-ch2n3的试剂。在实施方案中，组合物包含包括结构r2-o-nhch3的试剂。在实施方案中，组合物包含包括结构r2-o-ch2n3的试剂。
[0393]
在实施方案中，具有除-o-nh2核苷酸以外的3
′
部分的胞嘧啶核苷酸中的至少一些包括结构：
[0394]
其中b是胞嘧啶核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0395]
在一个方面，提供了配制测序试剂的方法，其包括使包含3
′
保护核苷酸的组合物与包含可逆终止子部分的试剂接触以产生包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物，以及将包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物配制为测序试剂，其中配制包含可逆终止子部分的组合物不包括进一步纯化包含可逆终止子部分的组合物。
[0396]
在实施方案中，所述方法还包括将所述测序试剂施用至测序试剂以产生质量评分为至少q30的至少100个碱基的测序操作。在实施方案中，包含可逆终止子部分的试剂具有结构r2-o-nh2。
[0397]
在实施方案中，r2选自由以下组成的组：-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基；并且r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r2为-c(ch3)3。在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0398]
在实施方案中，r2包括至少两个碳核、氟核、碳碳双键、叔碳、叔丁基部分、环状部分、硅核、苯基环、氮核、氧核或羟化部分。在实施方案中，r2包括至少两个碳核、碳碳双键、叔碳、叔丁基部分、环状部分或苯基环。在实施方案中，r2包括至少两个碳核。在实施方案中，r2包括氟核、硅核、氮核、氧核或羟化部分。在实施方案中，r2为-ch2ch3、-ch2chch2或-c(ch3)3。在实施方案中，r2为-c(ch3)3。在实施方案中，r2不为未被取代的甲基。在实施方案
中，r2不为未被取代的乙基。在实施方案中，r2不为未被取代的丙基。
[0399]
在实施方案中，r2的分子量大于24、36、57或100。在实施方案中，r2的分子量为至少24、36、57、100、200、300、400、500、600、700、800或900。在实施方案中，r2的分子量为至少24。在实施方案中，r2的分子量为至少36。在实施方案中，r2的分子量为至少57。在实施方案中，r2的分子量为至少100。在实施方案中，r2的分子量为至少200。在实施方案中，r2的分子量为至少300。在实施方案中，r2的分子量为至少400。在实施方案中，r2的分子量为至少500。在实施方案中，r2的分子量为至少600。在实施方案中，r2的分子量为至少700。在实施方案中，r2的分子量为至少800。在实施方案中，r2的分子量为至少900。
[0400]
在实施方案中，3
′
保护核苷酸包括3
′‑
o-肟部分。在实施方案中，肟是醛肟或酮肟。在实施方案中，肟是醛肟。在实施方案中，肟是酮肟。
[0401]
在实施方案中，相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过6％的3
′
保护核苷酸。在实施方案中，相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过5％、4％、3％、2％或1％的3
′
保护核苷酸。在实施方案中，相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过5％的3
′
保护核苷酸。在实施方案中，相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过4％的3
′
保护核苷酸。在实施方案中，相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过3％的3
′
保护核苷酸。在实施方案中，相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过2％的3
′
保护核苷酸。在实施方案中，相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过1％的3
′
保护核苷酸。
[0402]
在实施方案中，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过6％的降解或修饰的dc核碱基。在实施方案中，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过5％、4％、3％、2％或1％的降解或修饰的dc核碱基。在实施方案中，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过5％的降解或修饰的dc核碱基。在实施方案中，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过4％的降解或修饰的dc核碱基。在实施方案中，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过3％的降解或修饰的dc核碱基。在实施方案中，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过2％的降解或修饰的dc核碱基。在实施方案中，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过1％的降解或修饰的dc核碱基。
[0403]
在一个方面，提供了用于修饰核苷酸的方法，其包括使包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸与包括结构r2-o-nh2的试剂反应以产生包括3
′‑
o-nh2部分的核苷酸，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0404]
在实施方案中，包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸包括结构：
[0405]
其中包括3
′‑
o-nh2部分的核苷酸包括结构：其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0406]
在实施方案中，所产生的核苷酸包括脱氧核苷酸。在实施方案中，所产生的核苷酸包括：
[0407]
其中碱基是核碱基，并且其中dna独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。
[0408]
在实施方案中，核碱基是嘌呤或嘧啶。在实施方案中，核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在实施方案中，核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。
[0409]
在实施方案中，试剂独立地为以下中的一者：
[0410][0411]
在实施方案中，反应在水溶液中发生。在实施方案中，核苷酸附接至与水溶液接触的固体支撑物。在实施方案中，包括结构r2-o-nh2的试剂附接至与水溶液接触的固体支撑物。在实施方案中，溶液的ph不小于4且不大于8。
[0412]
在一个方面，提供了包含包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸和包括结构r2-o-nh2的试剂的溶液，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。在实施方案中，r2不为未被取代的甲基。在实施方案中，r2不为未被取代的乙基。在实施方案中，r2不为未被取代的丙基。
[0413]
在实施方案中，核苷酸包括结构：
[0414]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0415]
在实施方案中，核碱基是嘌呤或嘧啶。在实施方案中，核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在实施方案中，核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。在实施方案中，核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。在实施方案中，核碱基包括外源标记部分。
[0416]
在实施方案中，r1为h。在实施方案中，q为脱氧核糖核酸。在实施方案中，r1为oh。在实施方案中，q为核糖核酸。
[0417]
在实施方案中，r2-o-nh2分子独立地为以下中的一者：
[0418][0419]
在实施方案中，溶液是水溶液。在实施方案中，核苷酸附接至固体支撑物，并且其中固体支撑物与溶液接触。在实施方案中，包括结构r2-o-nh2的试剂附接至与水溶液接触的固体支撑物。在实施方案中，溶液的ph不小于4且不大于8。
[0420]
在一个方面，提供了对核酸进行测序的方法，其包括以下步骤：
[0421]
a.使用本文所描述的方法制造3
′
封闭核苷酸，包括在实施方案中，其中制造方法不包括将3
′
封闭核苷酸与包含3
′
保护核苷酸与试剂接触的反应物和产物的组合物分离；
[0422]
b.在反应容器中使包含步骤a的3
′
封闭核苷酸的组合物与核酸模板、引物和聚合酶接触；
[0423]
c.识别同时接触模板核酸、引物3
′
末端和聚合酶的3
′
封闭核苷酸；以及任选地将3
′
封闭核苷酸共价结合至引物3
′
末端，制造延伸引物；并且由此识别与3
′
封闭核苷酸同源的模板核酸的核苷酸；
[0424]
d.从步骤c的延伸引物的3
′
封闭核苷酸除去3
′
封闭部分；以及
[0425]
e.重复步骤b至d并且由此对模板核酸进行测序。
[0426]
在实施方案中，执行步骤e至少99次。在实施方案中，组合物包含试剂r2-onh2。在实施方案中，试剂r2为未被取代的叔丁基。在实施方案中，试剂r2不为氢。在实施方案中，试
剂r2不为未被取代的甲基。在实施方案中，试剂r2不为未被取代的乙基。在实施方案中，试剂r2不为未被取代的丙基。在实施方案中，组合物不包含honh2。在实施方案中，组合物不包含ch3onh2。
[0427]
在实施方案中，测序的质量评分为至少q20。在实施方案中，测序的质量评分为至少q30。在实施方案中，测序的质量评分为至少q50。
[0428]
在一个方面，提供了包括含有3
′
封闭核苷酸的第一容器和含有具有式r2-o-nh2、r2-o-nhch3或r2-o-ch2n3的试剂的第二容器的试剂盒，其中r2的分子量为至少24g/mol。
[0429]
在实施方案中，3
′
封闭核苷酸包括直接键结至核苷酸的核糖3
′
碳的封闭部分；并且封闭部分为-onh2、-onhch3或-och2ch3。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸包括直接键结至核苷酸的核糖3
′
碳的封闭部分；并且封闭部分为-onh2。
[0430]
在实施方案中，3
′
保护核苷酸包括直接共价键结至核苷酸的核糖3
′
碳的保护部分；并且保护部分为3
′
肟部分。
[0431]
在实施方案中，-o-肟部分具有式：-o-n＝c(r3)(r4)；并且r3和r4独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0432]
在实施方案中，-o-肟部分具有式：-o-n＝c(r3)(r4)；r3为氢；并且r4为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0433]
在实施方案中，-o-肟部分具有式：-o-n＝c(r3)(r4)；并且r3和r4独立地为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0434]
在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括腺嘌呤部分或其衍生物、鸟嘌呤部分或其衍生物、胞嘧啶部分或其衍生物、胸腺嘧啶部分或其衍生物、或尿嘧啶部分或其衍生物。在实施方案中，腺嘌呤衍生物部分、鸟嘌呤衍生物部分、胞嘧啶衍生物部分、胸腺嘧啶衍生物部分和尿嘧啶衍生物部分包括可检测部分。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括单磷酸酯部分或其衍生物、二磷酸酯部分或其衍生物、三磷酸酯部分或其衍生物、或单价核酸部分或其衍生物。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括单磷酸酯部分、二磷酸酯部分、三磷酸酯部分或单价核酸部分。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括三磷酸酯部分。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括单价核酸部分。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括核糖部分。在实施方案中，3
′
封闭核苷酸和3
′
保护核苷酸包括2
′
脱氧核糖部分。
[0435]
在实施方案中，r2的分子量为1000g/mol或更小。在实施方案中，r2的分子量为至少36g/mol。在实施方案中，r2的分子量为至少57g/mol。
[0436]
在实施方案中，r2为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r2不为未被取代的甲基。在实施方案中，r2不为未被取代的乙基。在实施方案中，r2不为未被取代的丙基。
[0437]
在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基；并且r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0438]
在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、未被取代的6元杂脂环基、未被取代的苯基、被取代或未被取代的杂芳基；并且r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0439]
在实施方案中，试剂具有式：
[0440][0441]
在实施方案中，试剂具有式：
[0442][0443]
在实施方案中，3
′
保护核苷酸具有结构：
[0444]3′
封闭核苷酸具有结构：b为核碱基；r1为氢、-oh、卤素、-och3；q独立地为核酸部分、三磷酸酯部分、二磷酸酯部分或单磷酸酯部
分；并且r3和r4独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0445]
在一个方面，提供了包括含有包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸的第一容器和含有包括结构r2-o-nh2的试剂的第二容器的试剂盒，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0446]
在实施方案中，核苷酸包括结构：
[0447]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0448]
在实施方案中，核碱基是嘌呤或嘧啶。在实施方案中，核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在实施方案中，核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。在实施方案中，核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。在实施方案中，核碱基包括外源标记部分。
[0449]
在实施方案中，q独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。
[0450]
在实施方案中，r2-o-nh2分子独立地为以下中的一者：
[0451][0452]
在实施方案中，试剂盒包括rfid标签或条形码。
[0453]
在实施方案中，核苷酸附接至固体支撑物。在实施方案中，包括结构r2-o-nh2的试剂附接至固体支撑物。
[0454]
在一个方面，提供了在核苷酸的3
′
位置处由封闭基团置换保护基团的方法，其包括使核苷酸与包括结构r2-封闭物的试剂接触，其中r2的分子量为至少24，其中r2-封闭物是水溶性的，并且其中封闭物包括封闭基团部分。在实施方案中，封闭物包括可逆终止子部分。在实施方案中，可逆终止子部分不阻止由此可逆地终止的核苷酸组装成三元复合物。
[0455]
在实施方案中，r2-封闭物选自由以下组成的组：r2-o-nh2、r2-o-nhch3、r2-o-nhcoch3或r2-o-ch2n3。在实施方案中，r2-封闭物为r2-o-nh2。在实施方案中，r2-封闭物为r2-o-nhch3。在实施方案中，r2-封闭物为r2-o-nhcoch3。在实施方案中，r2-封闭物为r2-o-ch2n3。
[0456]
在实施方案中，包括3
′
保护基团的核苷酸是：
[0457]
其中包括3
′
封闭基团的核苷酸是：其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0458]
在实施方案中，保护基团包括o-肟。在实施方案中，肟部分具有式：-o-n＝c(r3)(r4)；并且r3和r4独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r3为氢。在实施方案中，r4为氢。在实施方案中，核苷酸包括三磷酸酯部分。
[0459]
在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基；并且r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。在实施方案中，r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0460]
在实施方案中，r2-封闭物具有选自由以下组成的组的式：
[0461][0461]
在实施方案中，r2-封闭物具有选自由以下组成的组的式：
[0462]
在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封
闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式在实施方案中，r2-封闭物具有式
[0463]
在实施方案中，r2包括羟化部分。在实施方案中，r2包括至少两个碳核、氟核、碳碳
双键、叔碳、叔丁基部分、环状部分、硅核、苯基环、氮核、氧核或羟化部分。
[0464]
在实施方案中，r2的分子量不超过280g/mol。在实施方案中，r2的分子量不超过100g/mol。
[0465]
在实施方案中，所述方法在25℃下在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的封闭基团添加到至少94％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。在实施方案中，所述方法在25℃下在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的封闭基团添加到至少98％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0466]
在实施方案中，所述方法降解各自包括胞嘧啶核碱基的核苷酸群体中不超过6％的胞嘧啶核碱基。在实施方案中，所述方法降解来自具有胞嘧啶核碱基的核苷酸群体的不超过1％的胞嘧啶碱基。
[0467]
在实施方案中，组合物包含(ch3)3c-onh2。在实施方案中，溶液包含(ch3)3c-onh2。在实施方案中，水溶液包含(ch3)3c-onh2。在实施方案中，容器包含(ch3)3c-onh2。在实施方案中，试剂盒包含(ch3)3c-onh2。在实施方案中，组合物不包含ch
3-onh2。在实施方案中，溶液不包含ch
3-onh2。在实施方案中，水溶液不包含ch
3-onh2。在实施方案中，容器不包含ch
3-onh2。在实施方案中，试剂盒不包含ch
3-onh2。在实施方案中，组合物不包含h-onh2。在实施方案中，溶液不包含h-onh2。在实施方案中，水溶液不包含h-onh2。在实施方案中，容器不包含h-onh2。在实施方案中，试剂盒不包含h-onh2。
[0468]
实施方案
[0469]
实施方案p1.一种用于修饰核苷酸的方法，所述方法包括使包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸与包括结构r2-onh2的试剂反应以产生包括3
′‑
o-nh2部分的核苷酸，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0470]
实施方案p2.如实施方案p1的方法，其中包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸包括结构：
[0471][0472]
其中包括3
′‑
o-nh2部分的核苷酸包括结构：
[0473][0474]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0475]
实施方案p3.如实施方案p1的方法，其中所述反应在水溶液中发生。
[0476]
实施方案p4.如实施方案p3的方法，其中所述核苷酸附接至与所述水溶液接触的固体支撑物。
[0477]
实施方案p5.如实施方案p3的方法，其中将包括结构r2-onh2的试剂附接至与所述水溶液接触的固体支撑物。
[0478]
实施方案p6.如实施方案p1至p5中任一项的方法，其中所述核碱基是嘌呤或嘧啶。
[0479]
实施方案p7.如实施方案p6的方法，其中所述核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
[0480]
实施方案p8.如实施方案p6的方法，其中所述核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。
[0481]
实施方案p9.如实施方案p6的方法，其中所述核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。
[0482]
实施方案p10.如实施方案p1至p9中任一项的方法，其中所述溶液的ph在4与8之间。
[0483]
实施方案p11.如实施方案p1至p10中任一项的方法，其中所产生的核苷酸包括脱氧核苷酸。
[0484]
实施方案p12.如实施方案p11的方法，其中所产生的核苷酸包括：
[0485][0486]
其中碱基是核碱基，并且其中dna独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。
[0487]
实施方案p13.如实施方案p1至p12中任一项的方法，其中所述试剂独立地为以下中的一者：
[0488][0489]
实施方案p14.一种包含包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸和包括结构r2-onh2的试剂的溶液，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0490]
实施方案p15.如实施方案p14的溶液，其中所述核苷酸包括结构：
[0491][0492]
其中b为核碱基；r1独立地为卤索、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0493]
实施方案p16.如实施方案p15的溶液，其中r1为h。
[0494]
实施方案p17.如实施方案p16的溶液，其中q为脱氧核糖核酸。
[0495]
实施方案p18.如实施方案p15的溶液，其中r1为oh。
[0496]
实施方案p19.如实施方案p18的溶液，其中q为核糖核酸。
[0497]
实施方案p20.如实施方案p14的溶液，其中所述溶液是水溶液。
[0498]
实施方案p21.如实施方案p20的溶液，其中所述核苷酸附接至固体支撑物，并且其中所述固体支撑物与所述溶液接触。
[0499]
实施方案p22.如实施方案p20的溶液，其中将包括结构r2-onh2的试剂附接至与所述水溶液接触的固体支撑物。
[0500]
实施方案p23.如实施方案p14至p2a3中任一项的溶液，其中所述核碱基是嘌呤或嘧啶。
[0501]
实施方案p24.如实施方案p23的溶液，其中所述核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
[0502]
实施方案p25.如实施方案p23的溶液，其中所述核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。
[0503]
实施方案p26.如实施方案p23的溶液，其中所述核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。
[0504]
实施方案p27.如实施方案p14至p26中任一项的溶液，其中所述核碱基包括外源标记部分。
[0505]
实施方案p28.如实施方案p14至p27中任一项的溶液，其中所述溶液的ph在4与8之间。
[0506]
实施方案p29.如实施方案p14至p28中任一项的溶液，其中r2-onh2分子独立地为以下中的一者：
[0507][0508]
实施方案p30.一种试剂盒，所述试剂盒包括含有包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸的第一容器和含有包括结构r2-onh2的试剂的第二容器，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0509]
实施方案p31.如实施方案p30的试剂盒，其中所述核苷酸包括结构：
[0510][0511]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0512]
实施方案p32.如实施方案p30的试剂盒，其中所述试剂盒包括rfid标签或条形码。
[0513]
实施方案p33.如实施方案p31或p32的试剂盒，其中q独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。
[0514]
实施方案p34.如实施方案p33的试剂盒，其中所述核苷酸附接至固体支撑物。
[0515]
实施方案p35.如实施方案p30的试剂盒，其中将包括结构r2-onh2的试剂附接至固体支撑物。
[0516]
实施方案p36.如实施方案p30至p35中任一项的试剂盒，其中所述核碱基是嘌呤或嘧啶。
[0517]
实施方案p38.如实施方案p36的试剂盒，其中所述核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
[0518]
实施方案p39.如实施方案p36的试剂盒，其中所述核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。
[0519]
实施方案p40.如实施方案p36的试剂盒，其中所述核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、
次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。
[0520]
实施方案p41.如实施方案p30至p40中任一项的试剂盒，其中所述核碱基包括外源标记部分。
[0521]
实施方案p42.如实施方案p30至p41中任一项的试剂盒，其中r2-onh2分子独立地为以下中的一者：
[0522][0523]
实施方案pp1.一种用于修饰核苷酸的方法，所述方法包括使包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸与包括结构r2-onh2的试剂反应以产生包括3
′‑
o-nh2部分的核苷酸，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0524]
实施方案pp2.如实施方案pp1的方法，其中包括3
′‑
o-肟部分的所述核苷酸包括结构：
[0525][0526]
其中包括3
′‑
o-nh2部分的所述核苷酸包括结构：
[0527][0528]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0529]
实施方案pp3.如实施方案pp1的方法，其中所述反应在水溶液中发生。
[0530]
实施方案pp4.如实施方案pp3的方法，其中所述核苷酸附接至与所述水溶液接触的固体支撑物。
[0531]
实施方案pp5.如实施方案pp3的方法，其中将包括结构r2-onh2的试剂附接至与所述水溶液接触的固体支撑物。
[0532]
实施方案pp6.如实施方案pp1至pp5中任一项的方法，其中所述核碱基是嘌呤或嘧啶。
[0533]
实施方案pp7.如实施方案pp6的方法，其中所述核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
[0534]
实施方案pp8.如实施方案pp6的方法，其中所述核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。
[0535]
实施方案pp9.如实施方案pp6的方法，其中所述核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。
[0536]
实施方案pp10.如实施方案pp1至pp9中任一项的方法，其中所述溶液的ph在4与8之间。
[0537]
实施方案pp11.如实施方案pp1至pp10中任一项的方法，其中所产生的核苷酸包括脱氧核苷酸。
[0538]
实施方案pp12.如实施方案pp11的方法，其中所产生的核苷酸包括：
[0539][0540]
其中碱基是核碱基，并且其中dna独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。
[0541]
实施方案pp13.如实施方案pp1至pp12中任一项的方法，其中所述试剂独立地为以下中的一者：
[0542][0543]
实施方案pp14.一种包含包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸和包括结构r2-onh2的试剂的溶液，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0544]
实施方案pp15.如实施方案pp14的溶液，其中所述核苷酸包括结构：
[0545][0546]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0547]
实施方案pp16.如实施方案pp15的溶液，其中r1为h。
[0548]
实施方案pp17.如实施方案pp16的溶液，其中q为脱氧核糖核酸。
[0549]
实施方案ppl8.如实施方案pp15的溶液，其中r1为oh。
[0550]
实施方案pp19.如实施方案pp18的溶液，其中q为核糖核酸。
[0551]
实施方案pp20.如实施方案pp14的溶液，其中所述溶液是水溶液。
[0552]
实施方案pp21.如实施方案pp20的溶液，其中所述核苷酸附接至固体支撑物，并且其中所述固体支撑物与所述溶液接触。
[0553]
实施方案pp22.如实施方案pp20的溶液，其中将包括结构r2-onh2的试剂附接至与所述水溶液接触的固体支撑物。
[0554]
实施方案pp23.如实施方案pp14至pp22中任一项的溶液，其中所述核碱基是嘌呤或嘧啶。
[0555]
实施方案pp24.如实施方案pp23的溶液，其中所述核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
[0556]
实施方案pp25.如实施方案pp23的溶液，其中所述核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。
[0557]
实施方案pp26.如实施方案pp23的溶液，其中所述核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。
[0558]
实施方案pp27.如实施方案pp14至pp26中任一项的溶液，其中所述核碱基包括外源标记部分。
[0559]
实施方案pp28.如实施方案pp14至pp27中任一项的溶液，其中所述溶液的ph在4与8之间。
[0560]
实施方案pp29.如实施方案pp14至pp28中任一项的溶液，其中r2-onh2分子独立地为以下中的一者：
[0561][0562]
实施方案pp30.一种试剂盒，所述试剂盒包括含有包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸的第一容器和含有包括结构r2-onh2的试剂的第二容器，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0563]
实施方案pp31.如实施方案pp30的试剂盒，其中所述核苷酸包括结构：
[0564][0565]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0566]
实施方案pp32.如实施方案pp30的试剂盒，其中所述试剂盒包括rfid标签或条形码。
[0567]
实施方案pp33.如实施方案pp31或pp32的试剂盒，其中q独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。
[0568]
实施方案pp34.如实施方案pp33的试剂盒，其中所述核苷酸附接至固体支撑物。
[0569]
实施方案pp35.如实施方案pp30的试剂盒，其中将包括结构r2-onh2的所述试剂附接至固体支撑物。
[0570]
实施方案pp36.如实施方案pp30至pp35中任一项的试剂盒，其中所述核碱基是嘌呤或嘧啶。
[0571]
实施方案pp38.如实施方案pp36的试剂盒，其中所述核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
[0572]
实施方案pp39.如实施方案pp36的试剂盒，其中所述核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。
[0573]
实施方案pp40.如实施方案pp36的试剂盒，其中所述核碱基独立地为5-甲基胞嘧
啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。
[0574]
实施方案pp41.如实施方案pp30至pp40中任一项的试剂盒，其中所述核碱基包括外源标记部分。
[0575]
实施方案pp42.如实施方案pp30至pp41中任一项的试剂盒，其中r2-onh2分子独立地为以下中的一者：
[0576][0577]
其他实施方案
[0578]
实施方案s1.一种将3
′‑
o-nh2部分添加到具有3
′
保护基团的核苷酸的方法，所述方法包括使具有3
′
保护基团的核苷酸与包括结构r2-o-nh2的试剂接触，其中r2的分子量为至少24。
[0579]
实施方案s2.如实施方案s1的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括核糖或脱氧核糖。
[0580]
实施方案s3.如实施方案s2的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括三磷酸酯。
[0581]
实施方案s4.如实施方案s1的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括结构：
[0582][0583]
其中包括3
′‑
o-nh2部分的所述核苷酸包括结构：
[0584]
[0585]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0586]
实施方案s5.一种制造3
′
封闭核苷酸的方法，所述方法包括使3
′
保护核苷酸与具有结构r2-o-nh2、r2-o-nhch3、r2-o-nhcoch3或r2-o-ch2n3的试剂接触，其中r2的分子量为至少24g/mol，并且由此由3
′
保护核苷酸制造3
′
封闭核苷酸。
[0587]
实施方案s6.一种制造3
′
封闭核苷酸的方法，所述方法包括使3
′
保护核苷酸与具有结构r2-o-nh2或r2-o-ch2n3的试剂接触，其中r2的分子量为至少24g/mol，并且由此由3
′
保护核苷酸制造3
′
封闭核苷酸。
[0588]
实施方案s7.如实施方案s5的方法，其中所述3
′
封闭核苷酸包括直接键结至所述核苷酸的核糖3
′
碳的封闭部分；并且所述封闭部分为-onh2、-onhcoch3、-onhch3、-och2n3。
[0589]
实施方案s8.如实施方案s5至s6中一项的方法，其中所述3
′
封闭核苷酸包括直接键结至所述核苷酸的核糖3
′
碳的封闭部分；并且所述封闭部分为-onh2或-och2n3。
[0590]
实施方案s9.如实施方案s5至s6中一项的方法，其中所述3
′
封闭核苷酸包括直接键结至所述核苷酸的核糖3
′
碳的封闭部分；并且所述封闭部分为-onh2。
[0591]
实施方案s10.如实施方案s5至s9中一项的方法，其中所述3
′
保护核苷酸包括直接共价键结至所述核苷酸的核糖3
′
碳的保护部分；并且所述保护部分为3
′‑
o-肟部分。
[0592]
实施方案s11.如实施方案s10的方法，其中所述-o-肟部分具有式：
[0593]-o-n＝c(r3)(r4)；并且
[0594]
r3和r4独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0595]
实施方案s12.如实施方案s10的方法，其中所述-o-肟部分具有式：
[0596]-o-n＝c(r3)(r4)；
[0597]
r3为氢；并且
[0598]
r4为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0599]
实施方案s13.如实施方案s10的方法，其中所述-o-肟部分具有式：
[0600]-o-n＝c(r3)(r4)；并且
[0601]
r3和r4独立地为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0617]
实施方案s28.如实施方案s27的方法，其中r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0618]
实施方案s29.如实施方案s27的方法，其中r2不为未被取代的甲基。
[0619]
实施方案s30.如实施方案s27的方法，其中r2不为未被取代的乙基。
[0620]
实施方案s31.如实施方案s27的方法，其中r2不为未被取代的丙基。
[0621]
实施方案s32.如实施方案s1至s22中一项的方法，其中r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、未被取代的6元杂脂环基、未被取代的苯基、被取代或未被取代的杂芳基；并且
[0622]
r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0623]
实施方案s33.如实施方案s32的方法，其中r2为-c((r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0624]
实施方案s34.如实施方案s32的方法，其中r2不为未被取代的甲基。
[0625]
实施方案s35.如实施方案s32的方法，其中r2不为未被取代的乙基。
[0626]
实施方案s36.如实施方案s32的方法，其中r2不为未被取代的丙基。
[0627]
实施方案s37.如实施方案s1至s22中一项的方法，其中所述试剂具有式：
[0628][0629][0630]
实施方案s38.如实施方案s1至s22中一项的方法，其中所述试剂具有式：
[0631][0632]
实施方案s39.如实施方案s5至s11中一项的方法，其中所述3
′
保护核苷酸具有结构：
[0633]
[0634]
所述3
′
封闭核苷酸具有结构：
[0635][0636]
b为核碱基；
[0637]
r1为氢、-oh、卤素、-och3；
[0638]
q独立地为核酸部分、三磷酸酯部分、二磷酸酯部分或单磷酸酯部分；
[0639]
r3和r4独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0640]
实施方案s40.如实施方案s1至s4中一项的方法，其中所述方法在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少94％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0641]
实施方案s41.如实施方案s1至s4中一项的方法，其中所述方法在不超过1小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少98％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0642]
实施方案s42.如实施方案s1至s4中一项的方法，其中具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的所述具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过6％的胞嘧啶碱基。
[0643]
实施方案s43.如实施方案s1至s4中一项的方法，其中具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的所述具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过1％的胞嘧啶碱基。
[0644]
实施方案s44.如实施方案s5至s39中一项的方法，所述方法还包括制造第一组多个3
′
封闭核苷酸，所述方法包括使第二组多个3
′
保护核苷酸与第三组多个试剂接触，由此由第二组多个3
′
保护核苷酸制造第一组多个3
′
封闭核苷酸。
[0645]
实施方案s45.如实施方案s44的方法，其中制造所述第一组多个3
′
封闭核苷酸持续3小时或更少时间。
[0646]
实施方案s46.如实施方案s44的方法，其中制造所述第一组多个3
′
封闭核苷酸持续2小时或更少时间。
[0647]
实施方案s47.如实施方案s44的方法，其中制造所述第一组多个3
′
封闭核苷酸持续1小时或更少时间。
[0648]
实施方案s48.如实施方案s44至s47中一项的方法，其中将至少94％的第一组多个3
′
保护核苷酸制成第二组多个3
′
封闭核苷酸。
[0649]
实施方案s49.如实施方案s44至s47中一项的方法，其中将至少96％的第一组多个3
′
保护核苷酸制成第二组多个3
′
封闭核苷酸。
[0650]
实施方案s50.如实施方案s44至s47中一项的方法，其中将至少98％的第一组多个3
′
保护核苷酸制成第二组多个3
′
封闭核苷酸。
[0651]
实施方案s51.如实施方案s44至s50中一项的方法，其中第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且6％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。
[0652]
实施方案s52.如实施方案s44至s50中一项的方法，其中第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且5％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。
[0653]
实施方案s53.如实施方案s44至s50中一项的方法，其中第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且4％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。
[0654]
实施方案s54.如实施方案s44至s50中一项的方法，其中第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且3％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。
[0655]
实施方案s55.如实施方案s44至s50中一项的方法，其中第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且2％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。
[0656]
实施方案s56.如实施方案s44至s50中一项的方法，其中第一组多个3
′
封闭核苷酸包括第四组多个包括胞嘧啶的3
′
封闭核苷酸；并且1％或更少的胞嘧啶通过第三组多个试剂进行化学修饰。
[0657]
实施方案s57.一种包括胞嘧啶核苷酸群体的组合物，其中至少94％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′
o-nh2，其中不超过8％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分，并且其中不超过6％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。
[0658]
实施方案s58.如实施方案s57的组合物，其中至少98％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′‑
o-nh2，其中不超过1％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分，并且其中不超过1％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。
[0659]
实施方案s59.如实施方案s57的组合物，其中所述组合物是水溶液。
[0660]
实施方案s60.如实施方案s57的组合物，其中所述溶液的ph不小于4且不大于8。
[0661]
实施方案s61.如实施方案s57的组合物，其中所述组合物包含包括结构r2-o-nh2的试剂。
[0662]
实施方案s62.如实施方案s61的组合物，其中r2包括至少24、26、57或100的分子量。
[0663]
实施方案s63.如实施方案s61的组合物，其中r2包括至少两个碳核、氟核、碳碳双键、叔碳、叔丁基部分、环状部分、硅核、苯基环、氮核、氧核或羟化部分。
[0664]
实施方案s64.如实施方案s61的组合物，其中包括结构r2-o-nh2的所述试剂选自由以下组成的组：
[0665][0666][0667]
实施方案s65.如实施方案s57至s64中一项的组合物，共中除-o-nh2以外的3
′
部分包括3
′
o-肟。
[0668]
实施方案s66.如实施方案s57的组合物，其中所述组合物包含包括结构r2-o-nhch3或r2-o-ch2n3的试剂。
[0669]
实施方案s67.如实施方案s57至s66中一项的组合物，其中具有除-o-nh2核苷酸以外的3
′
部分的胞嘧啶核苷酸中的至少一些包括结构：
[0670][0671]
其中b是胞嘧啶核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0672]
实施方案s68.一种配制测序试剂的方法，所述方法包括使包含3
′
保护核苷酸的组合物与包含可逆终止子部分的试剂接触以产生包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物，以及将包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物配制为测序试剂，其中配制包含可逆终止子部分的组合物不包括进一步纯化包含可逆终止子部分的组合物。
[0673]
实施方案s69.如实施方案s68的方法，所述方法还包括将所述测序试剂施用至测序试剂以产生质量评分为至少q30的至少100个碱基的测序操作。
[0674]
实施方案s70.如实施方案s68的方法，其中包含可逆终止子部分的试剂具有结构r2-o-nh2。
[0675]
实施方案s71.如实施方案s70的方法，其中r2选自由以下组成的组：-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基；并且
[0676]
r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0677]
实施方案s72.如实施方案s71的方法，其中r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0678]
实施方案s73.如实施方案s71的方法，其中r2不为未被取代的甲基。
[0679]
实施方案s74.如实施方案s71的方法，其中r2不为未被取代的乙基。
[0680]
实施方案s75.如实施方案s71的方法，其中r2不为未被取代的丙基。
[0681]
实施方案s76.如实施方案s70的方法，其中r2为-c(ch3)3。
[0682]
实施方案s77.如实施方案s70的方法，其中r2的分子量大于24、36、57或100。
[0683]
实施方案s78.如实施方案s70的方法，其中r2包括至少两个碳核、氟核、碳碳双键、
叔碳、叔丁基部分、环状部分、硅核、苯基环、氮核、氧核或羟化部分。
[0684]
实施方案s79.如实施方案s68的方法，其中3
′
保护核苷酸包括3
′‑
o-肟部分。
[0685]
实施方案s80.如实施方案s68的方法，其中相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过6％的3
′
保护核苷酸。
[0686]
实施方案s81.如实施方案s68的方法，其中包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过6％的降解或修饰的dc核碱基。
[0687]
实施方案s82.一种修饰核苷酸的方法，所述方法包括使包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸与包括结构r2-o-nh2的试剂反应以产生包括3
′‑
o-nh2部分的核苷酸、其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0688]
实施方案s83.如实施方案s82的方法，其中包括3
′‑
o-肟部分的所述核苷酸包括结构：
[0689][0690]
其中包括3
′‑
o-nh2部分的所述核苷酸包括结构：
[0691][0692]
其中b为核碱基；r1独立地为卤索、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0693]
实施方案s84.如实施方案s82至s83中一项的方法，其中所产生的核苷酸包括脱氧核苷酸。
[0694]
实施方案s85.如实施方案s82的方法，其中所产生的核苷酸包括：
[0695][0696]
其中碱基是核碱基，并且其中dna独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。
[0697]
实施方案s86.如实施方案s82至s85中任一项的方法，其中所述试剂独立地为以下中的一者：
[0698][0699]
实施方案s87.一种包含包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸和包括结构r2-o-nh2的试剂的溶液，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0700]
实施方案s88.如实施方案s87的溶液，其中所述核苷酸包括结构：
[0701][0702]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0703]
实施方案s89.如实施方案s87至s88中一项的溶液，其中所述核碱基包括外源标记部分。
[0704]
实施方案s90.如实施方案s87至s89中一项的溶液，其中所述r2-o-nh2分子独立地为以下中的一者：
[0705][0706]
实施方案s91.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
[0707]
a.使用如实施方案s5至s56中一项的方法制造3
′
封闭核苷酸，其中所述制造方法不包括将所述3
′
封闭核苷酸与包括3
′
保护核苷酸与试剂接触的反应物和产物的组合物分离；
[0708]
b.在反应容器中使包括步骤a的3
′
封闭核苷酸的组合物与核酸模板、引物和聚合酶接触；
[0709]
c.识别同时接触模板核酸、引物3
′
端和聚合酶的3
′
封闭核苷酸；并且任选地将所述3
′
封闭核苷酸共价结合至所述引物3
′
端，制造延伸引物；并且由此识别与所述3
′
封闭核苷酸同源的模板核酸的核苷酸；
[0710]
d.从步骤c的延伸引物的3
′
封闭核苷酸除去3
′
封闭部分；以及
[0711]
e.重复步骤b至d并由此对所述模板核酸进行测序。
[0712]
实施方案s92.如实施方案s91的方法，其中执行步骤e至少99次。
[0713]
实施方案s93.如实施方案s91至s92中一项的方法，其中所述测序的质量评分为至少q20。
[0714]
实施方案s94.如实施方案s91至s92中一项的方法，其中所述测序的质量评分为至少q30。
[0715]
实施方案s95.如实施方案s91至s92中一项的方法，其中所述测序的质量评分为至少q50。
[0716]
实施方案s96.一种试剂盒，所述试剂盒包括含有3
′
封闭核苷酸的第一容器和含有具有式r2-o-nh2、r2-o-nhch3或r2-o-ch2n3的试剂的第二容器，其中r2的分子量为至少24g/mol。
[0717]
实施方案s97.如实施方案s96的试剂盒，其中所述3
′
封闭核苷酸包括直接键结至核苷酸的核糖3
′
碳的封闭部分；并且所述封闭部分为-onh2、-onhch3或-och2ch3。
[0718]
实施方案s98.如实施方案s96的试剂盒，其中所述3
′
封闭核苷酸包括直接键结至核苷酸的核糖3
′
碳的封闭部分；并且所述封闭部分为-onh2。
[0719]
实施方案s99.如实施方案s96至s98中一项的试剂盒，其中3
′
保护核苷酸包括直接共价键结至核苷酸的核糖3
′
碳的保护部分；并且所述保护部分为3
′
肟部分。
[0720]
实施方案s100.如实施方案s99的试剂盒，其中所述-o-肟部分具有式：
[0721]-o-n＝c(r3)(r4)；并且
[0722]
r3和r4独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0723]
实施方案s101.如实施方案s99的试剂盒，其中所述-o-肟部分具有式：
[0724]-o-n＝c(r3)(r4)；
[0725]
r3为氢；并且
[0726]
r4为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0727]
实施方案s102.如实施方案s99的试剂盒，其中所述-o-肟部分具有式：
[0728]-o-n＝c(r3)(r4)；并且
[0729]
r3和r4独立地为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0730]
实施方案s103.如实施方案s96至s102中一项的试剂盒，其中所述3
′
封闭核苷酸和所述3
′
保护核苷酸包括腺嘌呤部分或其衍生物、鸟嘌呤部分或其衍生物、胞嘧啶部分或其衍生物、胸腺嘧啶部分或其衍生物、或尿嘧啶部分或其衍生物。
[0731]
实施方案s104.如实施方案s103的试剂盒，其中所述腺嘌呤衍生物部分、鸟嘌呤衍生物部分、胞嘧啶衍生物部分、胸腺嘧啶衍生物部分和尿嘧啶衍生物部分包括可检测部分。
[0732]
实施方案s105.如实施方案s96至s104中一项的试剂盒，其中所述3
′
封闭核苷酸和所述3
′
保护核苷酸包括单磷酸酯部分或其衍生物、二磷酸酯部分或其衍生物、三磷酸酯部分或其衍生物、或单价核酸部分或其衍生物。
[0733]
实施方案s106.如实施方案s105的试剂盒，其中所述3
′
封闭核苷酸和所述3
′
保护核苷酸包括单磷酸酯部分、二磷酸酯部分、三磷酸酯部分或单价核酸部分。
[0734]
实施方案s107.如实施方案s105的试剂盒，其中所述3
′
封闭核苷酸和所述3
′
保护核苷酸包括三磷酸酯部分。
[0735]
实施方案s108.如实施方案s105的试剂盒，其中所述3
′
封闭核苷酸和所述3
′
保护核苷酸包括单价核酸部分。
[0736]
实施方案s109.如实施方案s96至s108中一项的试剂盒，其中所述3
′
封闭核苷酸和所述3
′
保护核苷酸包括核糖部分。
[0737]
实施方案s110.如实施方案s96至s108中一项的试剂盒，其中所述3
′
封闭核苷酸和所述3
′
保护核苷酸包括2
′
脱氧核糖部分。
[0738]
实施方案s111.如实施方案s96至s110中一项的试剂盒，其中r2的分子量为1000g/mol或更小。
[0739]
实施方案s112.如实施方案s96至s111中一项的试剂盒，其中r2的分子量为至少36g/mol。
[0740]
实施方案s113.如实施方案s96至s111中一项的试剂盒，其中r2的分子量为至少57g/mol。
[0741]
实施方案s114.如实施方案s96至s111中一项的试剂盒，其中r2为被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0742]
实施方案s115.如实施方案s96至s111中一项的试剂盒，其中r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基；并且
[0743]
r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环
烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0744]
实施方案s116.如实施方案s115的试剂盒，其中r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0745]
实施方案s117.如实施方案s115的试剂盒，其中r2不为未被取代的甲基。
[0746]
实施方案s118.如实施方案s115的试剂盒，其中r2不为未被取代的乙基。
[0747]
实施方案s119.如实施方案s115的试剂盒，其中r2不为未被取代的丙基。
[0748]
实施方案s120.如实施方案s96至s111中一项的试剂盒，其中r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、未被取代的6元杂脂环基、未被取代的苯基、被取代或未被取代的杂芳基；并且
[0749]
r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0750]
实施方案s121.如实施方案s120的试剂盒，其中r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0751]
实施方案s122.如实施方案s120的试剂盒，其中r2不为未被取代的甲基。
[0752]
实施方案s123.如实施方案s120的试剂盒，其中r2不为未被取代的乙基。
[0753]
实施方案s124.如实施方案s120的试剂盒，其中r2不为未被取代的丙基。
[0754]
实施方案s125.如实施方案s96至s111中一项的试剂盒，其中试剂具有式：
[0755][0756]
实施方案s126.如实施方案s96至s111中一项的试剂盒，其中所述试剂具有式：
[0757][0758]
实施方案s127.如实施方案s96至s100中一项的试剂盒，其中所述3
′
保护核苷酸具有结构：
[0759][0760]
所述3
′
封闭核苷酸具有结构：
[0761][0762]
b为核碱基；
[0763]
r1为氢、-oh、卤素、-och3；
[0764]
q独立地为核酸部分、三磷酸酯部分、二磷酸酯部分或单磷酸酯部分；并且
[0765]
r3和r4独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0766]
实施方案s128.一种试剂盒，所述试剂盒包括含有包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸的第一容器和含有包括结构r2-o-nh2的试剂的第二容器，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0767]
实施方案s129.如实施方案s128的试剂盒，其中所述核苷酸包括结构：
[0768][0769]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0770]
实施方案s130.如实施方案s128至s129中一项的试剂盒，其中所述核碱基包括外源标记部分。
[0771]
实施方案s131.如实施方案s128至s130中一项的试剂盒，其中r2-o-nh2分子独立地为以下中的一者：
[0772][0773]
实施方案t1.一种将3
′‑
o-nh2部分添加到具有3
′
保护基团的核苷酸的方法，所述方法包括使具有3
′
保护基团的核苷酸与包括结构r2-o-nh2的试剂接触，其中r2的分子量为至少24。
[0774]
实施方案t2.如实施方案t1的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括核糖。
[0775]
实施方案t3.如实施方案t1的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括2
′
脱氧核糖。
[0776]
实施方案t4.如实施方案t2的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括磷酸酯。
[0777]
实施方案t5.如实施方案t4的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括三磷
酸酯。
[0778]
实施方案t6.如实施方案t3的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括磷酸酯。
[0779]
实施方案t7.如实施方案t6的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括三磷酸酯。
[0780]
实施方案t8.如实施方案t1的方法，其中r2的分子量为至少36。
[0781]
实施方案t9.如实施方案t1的方法，其中r2包括氟核。
[0782]
实施方案t10.如实施方案t1的方法，其中r2包括至少两个碳核。
[0783]
实施方案t11.如实施方案t1的方法，其中r2包括碳碳双键。
[0784]
实施方案t12.如实施方案t1的方法，其中r2包括叔碳。
[0785]
实施方案t13.如实施方案t12的方法，其中r2包括叔丁基部分。
[0786]
实施方案t14.如实施方案t1的方法，其中r2包括环状部分。
[0787]
实施方案t15.如实施方案t1的方法，其中r2包括硅核。
[0788]
实施方案t16.如实施方案t1的方法，其中r2包括苯基环。
[0789]
实施方案t17.如实施方案t1的方法，其中r2包括氮核。
[0790]
实施方案t18.如实施方案t1的方法，其中r2包括氧核。
[0791]
实施方案t19.如实施方案t1的方法，其中r2包括羟化部分。
[0792]
实施方案t20.如实施方案t1的方法，其中包括结构r2-o-nh2的试剂选自由以下组成的组：
[0793][0794]
实施方案t21.如实施方案t20的方法，其中包括结构r2-o-nh2的所述试剂是
[0795]
实施方案t22.如实施方案t20的方法，其中包括结构r2-o-nh2的所述试剂是
[0796]
实施方案t23.如实施方案t1的方法，其中包括结构r2-o-nh2的所述试剂选自由以下组成的组：
[0797][0797][0798]
实施方案t24.如实施方案t8至t23中任一项的方法，其中所述3
′
封闭基团包括3
′‑
o-肟。
[0799]
实施方案t25.如实施方案t8至t23中任一项的方法，其中所述3
′
封闭基团包括3
′‑
o-醛肟。
[0800]
实施方案t26.如实施方案t8至t23中任一项的方法，其中所述3
′
封闭基团包括3
′‑
o-酮肟。
[0801]
实施方案t27.如实施方案t8至t23中任一项的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括结构：
[0802][0803]
其中包括3
′‑
o-nh2部分的所述核苷酸包括结构：
[0804][0805]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0806]
实施方案t28.如实施方案t1至t27中任一项的方法，其中所述方法在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少94％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0807]
实施方案t29.如实施方案t1至t27中任一项的方法，其中所述方法在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少96％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0808]
实施方案t30.如实施方案t1至t27中任一项的方法，其中所述方法在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少98％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0809]
实施方案t31.如实施方案t1至t27中任一项的方法，其中所述方法在不超过2小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少98％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0810]
实施方案t32.如实施方案t1至t27中任一项的方法，其中所述方法在不超过1小时内将代替3
′
保护基团的3
′
onh2添加到至少98％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0811]
实施方案t33.如实施方案t1至t32中任一项的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的所述具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过6％的胞嘧啶碱基。
[0812]
实施方案t34.如实施方案t1至t32中任一项的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的所述具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过5％的胞嘧啶碱基。
[0813]
实施方案t35.如实施方案t1至t32中任一项的方法，其中具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的所述具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过4％的胞嘧啶碱基。
[0814]
实施方案t36.如实施方案t1至t32中任一项的方法，其中具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的所述具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过3％的胞嘧啶碱基。
[0815]
实施方案t37.如实施方案t1至t32中任一项的方法，其中具有3
′
保护基团的核苷
酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的所述具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过2％的胞嘧啶碱基。
[0816]
实施方案t38.如实施方案t1至t32中任一项的方法，其中所述具有3
′
保护基团的核苷酸包括胞嘧啶，并且其中方法降解来自包括多个包括胞嘧啶的所述具有3
′
保护基团的核苷酸的群体的不超过1％的胞嘧啶碱基。
[0817]
实施方案t39.一种包括胞嘧啶核苷酸群体的组合物，其中至少94％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′
o-nh2，其中不超过8％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分，并且其中不超过6％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。
[0818]
实施方案t40.如实施方案t39的组合物，其中至少96％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′‑
o-nh2。
[0819]
实施方案t41.如实施方案t39的组合物，其中至少98％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′‑
o-nh2。
[0820]
实施方案t42.如实施方案t39的组合物，其中至少99％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′‑
o-nh2。
[0821]
实施方案t43.如实施方案t39的组合物，其中不超过6％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分。
[0822]
实施方案t44.如实施方案t39的组合物，其中不超过4％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分。
[0823]
实施方案t45.如实施方案t39的组合物，其中不超过2％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分。
[0824]
实施方案t46.如实施方案t39的组合物，其中不超过1％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分。
[0825]
实施方案t47.如实施方案t39的组合物，其中不超过4％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。
[0826]
实施方案t48.如实施方案t39的组合物，其中不超过2％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。
[0827]
实施方案t49.如实施方案t39的组合物，其中不超过1％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。
[0828]
实施方案t50.如实施方案t39的组合物，其中至少98％的胞嘧啶核苷酸群体包括3
′‑
o-nh2，其中不超过1％的胞嘧啶核苷酸群体包括除-o-nh2以外的3
′
部分，并且其中不超过1％的胞嘧啶核苷酸群体包括修饰的胞嘧啶碱基。
[0829]
实施方案t51.如实施方案t39的组合物，其中所述组合物是水溶液。
[0830]
实施方案t52.如实施方案t51的组合物，其中所述溶液的ph不小于4且不大于8。
[0831]
实施方案t53.如实施方案t39的组合物，其中所述组合物包含包括结构r2-o-nh2的试剂。
[0832]
实施方案t54.如实施方案t53的组合物，其中r2包括至少24的分子量。
[0833]
实施方案t55.如实施方案t53的组合物，其中r2包括至少36的分子量。
[0834]
实施方案t56.如实施方案t53的组合物，其中r2包括氟核。
[0835]
实施方案t57.如实施方案t53的组合物，其中r2包括至少两个碳核。
[0836]
实施方案t58.如实施方案t53的组合物，其中r2包括碳碳双键。
[0837]
实施方案t59.如实施方案t53的组合物，其中r2包括叔碳。
[0838]
实施方案t60.如实施方案t59的组合物，其中r2包括叔丁基部分。
[0839]
实施方案t61.如实施方案t53的组合物，其中r2包括环状部分。
[0840]
实施方案t62.如实施方案t53的组合物，其中r2包括硅核。
[0841]
实施方案t63.如实施方案t53的组合物，其中r2包括苯基环。
[0842]
实施方案t64.如实施方案t53的组合物，其中r2包括氮核。
[0843]
实施方案t65.如实施方案t53的组合物，其中r2包括氧核。
[0844]
实施方案t66.如实施方案t53的组合物，其中r2包括羟化部分。
[0845]
实施方案t67.如实施方案t53的组合物，其中包括结构r2-o-nh2的所述试剂选自由以下组成的组：
[0846][0847]
实施方案t68.如实施方案t53的组合物，其中包括结构r2-o-nh2的所述试剂是
[0848]
实施方案t69.如实施方案t53的组合物，其中包括结构r2-o-nh2的所述试剂是
[0849]
实施方案t70.如实施方案t53的组合物，其中包括结构r2-o-nh2的所述试剂选自由以下组成的组：
[0850][0851]
实施方案t71.如实施方案t39至t70中任一项的组合物，其中除-o-nh2以外的3
′
部分包括3
′
o-肟。
[0852]
实施方案t72.如实施方案t39至t70中任一项的组合物，其中除-o-nh2以外的3
′
部分包括3
′
o-醛肟。
[0853]
实施方案t73.如实施方案t39至t70中任一项的组合物，其中除-o-nh2以外的3
′
部分包括3
′
o-酮肟。
[0854]
实施方案t74.如实施方案t39的组合物，其中所述组合物包含包括结构r2-o-nhch3的试剂。
[0855]
实施方案t75.如实施方案t39的组合物，其中所述组合物包含包括结构r2-o-ch2n3的试剂。
[0856]
实施方案t76.如实施方案t39至t70中任一项的组合物，其中具有除-o-nh2核苷酸以外的3
′
部分的胞嘧啶核苷酸中的至少一些包括结构：
[0857][0858]
其中b是胞嘧啶核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0859]
实施方案t77.一种配制测序试剂的方法，所述方法包括使包含3
′
保护核苷酸的组合物与包含可逆终止子部分的试剂接触以产生包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物，并且将包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物配制为测序试剂，其中配制包含可逆终止子部分的组合物不包括进一步纯化包含可逆终止子部分的组合物。
[0860]
实施方案t78.如实施方案t77的方法，所述方法还包括将所述测序试剂施用至测序试剂以产生质量评分为至少q30的至少100个碱基的测序操作。
[0861]
实施方案t79.如实施方案t77的方法，其中包含可逆终止子部分的所述试剂具有结构r2-o-nh2。
[0862]
实施方案t80.如实施方案t79的方法，其中r2包括至少两个碳核、氟核、碳碳双键、叔碳、叔丁基部分、环状部分、硅核、苯基环、氮核、氧核或羟化部分。
[0863]
实施方案t81.如实施方案t80的方法，其中r2包括至少两个碳核、碳碳双键、叔碳、叔丁基部分、环状部分或苯基环。
[0864]
实施方案t82.如实施方案t81的方法，其中r2为-ch2ch3、-ch2chch2或-c(ch3)3。
[0865]
实施方案t83.如实施方案t82的方法，其中r2为-c(ch3)3。
[0866]
实施方案t84.如实施方案t79的方法，其中r2的分子量为至少24。
[0867]
实施方案t85.如实施方案t84的方法，其中r2的分子量为至少36。
[0868]
实施方案t86.如实施方案t84的方法，其中r2的分子量为至少57。
[0869]
实施方案t87.如实施方案t84的方法，其中r2的分子量为至少100。
[0870]
实施方案t88.如实施方案t84的方法，其中r2的分子量为至少200。
[0871]
实施方案t89.如实施方案t84的方法，其中r2的分子量为至少300。
[0872]
实施方案t90.如实施方案t84的方法，其中r2的分子量为至少400。
[0873]
实施方案t91.如实施方案t84的方法，其中r2的分子量为至少500。
[0874]
实施方案t92.如实施方案t84的方法，其中r2的分子量为至少600。
[0875]
实施方案t93.如实施方案t84的方法，其中r2的分子量为至少700。
[0876]
实施方案t94.如实施方案t84的方法，其中r2的分子量为至少800。
[0877]
实施方案t95.如实施方案t84的方法，其中r2的分子量为至少900。
[0878]
实施方案t96.如实施方案t79的方法，其中r2包括至少两个碳核。
[0879]
实施方案t97.如实施方案t79的方法，其中r2包括氟核、硅核、氮核、氧核或羟化部
分。
[0880]
实施方案t98.如实施方案t79的方法，其中所述3
′
保护核苷酸包括3
′‑
o-肟部分。
[0881]
实施方案t99.如实施方案t98的方法，其中所述肟是醛肟。
[0882]
实施方案t100.如实施方案t98的方法，其中所述肟是酮肟。
[0883]
实施方案t101.如实施方案t79的方法，其中相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过6％的3
′
保护核苷酸。
[0884]
实施方案t102.如实施方案t101的方法，其中相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过5％的3
′
保护核苷酸。
[0885]
实施方案t103.如实施方案t101的方法，其中相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过4％的3
′
保护核苷酸。
[0886]
实施方案t104.如实施方案t101的方法，其中相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过3％的3
′
保护核苷酸。
[0887]
实施方案t105.如实施方案t101的方法，其中相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过2％的3
′
保护核苷酸。
[0888]
实施方案t106.如实施方案t101的方法，其中相对于最初存在的3
′
保护核苷酸来说，包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括不超过1％的3
′
保护核苷酸。
[0889]
实施方案t107.如实施方案t79的方法，其中包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过6％的降解或修饰的dc核碱基。
[0890]
实施方案t108.如实施方案t79的方法，其中包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过5％的降解或修饰的dc核碱基。
[0891]
实施方案t109.如实施方案t79的方法，其中包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过4％的降解或修饰的dc核碱基。
[0892]
实施方案t110.如实施方案t79的方法，其中包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过3％的降解或修饰的dc核碱基。
[0893]
实施方案t111.如实施方案t79的方法，其中包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过2％的降解或修饰的dc核碱基。
[0894]
实施方案t112.如实施方案t79的方法，其中包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物包括浓度为包含包括可逆终止子部分的核苷酸的组合物中总dc核碱基的不超过1％的降解或修饰的dc核碱基。
[0895]
实施方案t113.一种修饰核苷酸的方法，所述方法包括使包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸与包括结构r2-o-nh2的试剂反应以产生包括3
′‑
o-nh2部分的核苷酸，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0896]
实施方案t114.如实施方案t113的方法，其中包括3
′‑
o-肟部分的所述核苷酸包括
结构：
[0897][0898]
其中包括3
′‑
o-nh2部分的所述核苷酸包括结构：
[0899][0900]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0901]
实施方案t115.如实施方案t113的方法，其中所述反应在水溶液中发生。
[0902]
实施方案t116.如实施方案t115的方法，其中所述核苷酸附接至与所述水溶液接触的固体支撑物。
[0903]
实施方案t117.如实施方案t115的方法，其中包括结构r2-o-nh2的所述试剂附接至与所述水溶液接触的固体支撑物。
[0904]
实施方案t118.如实施方案t113至t117中任一项的方法，其中所述核碱基是嘌呤或嘧啶。
[0905]
实施方案t119.如实施方案t118的方法，其中所述核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
[0906]
实施方案t120.如实施方案t118的方法，其中所述核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。
[0907]
实施方案t121.如实施方案t118的方法，其中所述核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。
[0908]
实施方案t122.如实施方案t113至t121中任一项的方法，其中所述溶液的ph不小于4且不大于8。
[0909]
实施方案t123.如实施方案t113至t122中任一项的方法，其中所产生的核苷酸包括脱氧核苷酸。
[0910]
实施方案t124.如实施方案t123的方法，其中所产生的核苷酸包括：
[0911][0912]
其中碱基是核碱基，并且其中dna独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。
[0913]
实施方案t125.如实施方案t113至t124中任一项的方法，其中所述试剂独立地为以下中的一者：
[0914][0915]
实施方案t126.一种包含包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸和包括结构r2-o-nh2的试剂的溶液，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0916]
实施方案t127.如实施方案t126的溶液，其中所述核苷酸包括结构：
[0917][0918]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0919]
实施方案t128.如实施方案t127的溶液，其中r1为h。
[0920]
实施方案t129.如实施方案t128的溶液，其中q为脱氧核糖核酸。
[0921]
实施方案t130.如实施方案t127的溶液，其中r1为oh。
[0922]
实施方案t131.如实施方案t130的溶液，其中q为核糖核酸。
[0923]
实施方案t132.如实施方案t126的溶液，其中所述溶液是水溶液。
[0924]
实施方案t133.如实施方案t132的溶液，其中所述核苷酸附接至固体支撑物，并且其中所述固体支撑物与所述溶液接触。
[0925]
实施方案t134如实施方案t132的溶液，其中包括结构r2-o-nh2的所述试剂附接至与所述水溶液接触的固体支撑物。
[0926]
实施方案t135.如实施方案t126至t134中任一项的溶液，其中所述核碱基是嘌呤或嘧啶。
[0927]
实施方案t136.如实施方案t135的溶液，其中所述核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧
啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
[0928]
实施方案t137.如实施方案t135的溶液，其中所述核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。
[0929]
实施方案t138.如实施方案t135的溶液，其中所述核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。
[0930]
实施方案t139.如实施方案t126至t138中任一项的溶液，其中所述核碱基包括外源标记部分。
[0931]
实施方案t140.如实施方案t126至t139中任一项的溶液，其中所述溶液的ph不小于4且不大于8。
[0932]
实施方案t141.如实施方案t126至t140中任一项的溶液，其中r2-o-nh2分子独立地为以下中的一者：
[0933][0934]
实施方案t142.一种试剂盒，所述试剂盒包括含有包括3
′‑
o-肟部分的核苷酸的第一容器和含有包括结构r2-o-nh2的试剂的第二容器，其中r2独立地为烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0935]
实施方案t143.如实施方案t142的试剂盒，其中所述核苷酸包括结构：
[0936][0937]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0938]
实施方案t144.如实施方案t142的试剂盒，其中所述试剂盒包括rfid标签或条形码。
[0939]
实施方案t145.如实施方案t143或t144的试剂盒，其中q独立地为单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸。
[0940]
实施方案t146.如实施方案t145的试剂盒，其中所述核苷酸附接至固体支撑物。
[0941]
实施方案t147.如实施方案t142的试剂盒，其中包括结构r2-o-nh2的所述试剂附接至固体支撑物。
[0942]
实施方案t148.如实施方案t142至t147中任一项的试剂盒，其中所述核碱基是嘌
呤或嘧啶。
[0943]
实施方案t149.如实施方案t148的试剂盒，其中所述核碱基独立地为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
[0944]
实施方案t150.如实施方案t148的试剂盒，其中所述核碱基与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互补。
[0945]
实施方案t151.如实施方案t148的试剂盒，其中所述核碱基独立地为5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤假尿苷、二氢尿苷、肌苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤或7-甲基鸟苷。
[0946]
实施方案t152.如实施方案t142至t151中任一项的试剂盒，其中所述核碱基包括外源标记部分。
[0947]
实施方案t153.如实施方案t142至t152中任一项的试剂盒，其中r2-o-nh2分子独立地为以下中的一者：
[0948][0949]
额外实施方案
[0950]
实施方案1.一种在核苷酸的3
′
位置处由封闭基团置换保护基团的方法，所述方法包括使所述核苷酸与包括结构r2-封闭物的试剂接触，其中r2的分子量为至少24，其中r2-封闭物是水溶性的，并且其中封闭物包括封闭基团部分。
[0951]
实施方案2.如实施方案1的方法，其中封闭物包括可逆终止子部分。
[0952]
实施方案3.如实施方案2的方法，其中所述可逆终止子部分不阻止由此可逆地终止的核苷酸组装成三元复合物。
[0953]
实施方案4.如实施方案1至3中任一项的方法，其中r2-封闭物选自由以下组成的组：r2-o-nh2、r2-o-nhch3、r2-o-nhcoch3或r2-o-ch2n3。
[0954]
实施方案5.如实施方案1至4中任一项的方法，其中r2-封闭物为r2-o-ch2n3。
[0955]
实施方案6.如实施方案1至4中任一项的方法，其中r2-封闭物为r2-o-nh2。
[0956]
实施方案7.如实施方案1至4中任一项的方法，其中包括3
′
保护基团的所述核苷酸是：
[0957][0958]
其中包括3
′
封闭基团的所述核苷酸是：
[0959][0960]
其中b为核碱基；r1独立地为卤素、och3、h或oh，q独立地为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，并且r3和r4独立地为h、ch3、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基或其任选地被取代的变体。
[0961]
实施方案8.如实施方案1至7中任一项的方法，其中所述保护基团包括-o-肟。
[0962]
实施方案9.如实施方案8的方法，其中所述-o-肟部分具有式：-o-n＝c(r3)(r4)；并且r3和r4独立地为氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0963]
实施方案10.如实施方案9的方法，其中r3为氢。
[0964]
实施方案11.如实施方案9至10中任一项的方法，其中r4为氢。
[0965]
实施方案12.如实施方案1至11中任一项的方法，其中所述核苷酸包括三磷酸酯部分。
[0966]
实施方案13.如实施方案1至4中任一项的方法，其中r2为-c(r6)(r7)(r8)、-c(o)(r6)、-p(o)(r6)(r7)、-c(r6)(＝c(r7)(r8))、-si(r6)(r7)(r8)、-so2(r6)、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基；并且
[0967]
r6、r7和r8独立地为氢、卤素、-ccl3、-cbr3、-cf3、-ci3、-chcl2、-chbr2、-chf2、-chi2、-ch2cl、-ch2br、-ch2f、-ch2i、-cn、-oh、-nh2、-cooh、-conh2、-no2、-sh、-so3h、-so4h、-so2nh2、-nhnh2、-onh2、-nhc(o)nhnh2、-nhc(o)nh2、-nhso2h、-nhc(o)h、-nhc(o)oh、-nhoh、-occl3、-ocf3、-ocbr3、-oci3、-ochcl2、-ochbr2、-ochi2、-ochf2、-och2cl、-och2br、-och2i、-och2f、-sf5、-n3、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的烯基、被取代或未被取代的炔基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的环烯基、被取代或未被取代的环炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂脂环基、被取代或未被取代的芳烷基、被取代或未被取代的杂芳烷基、或被取代或未被取代的(杂脂环基)烷基。
[0968]
实施方案14.如实施方案13的方法，其中r2为-c(r6)(r7)(r8)，并且r6、r7和r8不都为氢。
[0969]
实施方案15.如实施方案13的方法，其中r2不为未被取代的甲基。
[0970]
实施方案16.如实施方案13的方法，其中r2不为未被取代的乙基。
[0971]
实施方案17.如实施方案13的方法，其中r2不为未被取代的丙基。
[0972]
实施方案18.如实施方案13的方法，其中r2-封闭物具有选自由以下组成的组的式：
[0973][0974]
实施方案19.如实施方案18的方法，其中r2-封闭物具有选自由以下组成的组的式：
[0975][0976]
实施方案20.如实施方案19的方法，其中r2-封闭物具有式
[0977][0978]
实施方案21.如实施方案19的方法，其中r2-封闭物具有式
[0979][0980]
实施方案22.如实施方案19的方法，其中r2-封闭物具有式
[0981][0982]
实施方案23.如实施方案13的方法，其中r2包括羟化部分。
[0983]
实施方案24.如实施方案13的方法，其中r2包括至少两个碳核、氟核、碳碳双键、叔碳、叔丁基部分、环状部分、硅核、苯基环、氮核、氧核或羟化部分。
[0984]
实施方案25.如实施方案13的方法，其中r2的分子量不超过280g/mol。
[0985]
实施方案26.如实施方案13的方法，其中r2的分子量不超过100g/mol。
[0986]
实施方案27如实施方案1至4中任一项的方法，其中所述方法在25℃下在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的封闭基团添加到至少94％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0987]
实施方案28.如实施方案27的方法，其中所述方法在25℃下在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的封闭基团添加到至少98％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0988]
实施方案29.如实施方案28的方法，其中所述方法降解各自包括胞嘧啶核碱基的核苷酸群体中不超过6％的胞嘧啶核碱基。
[0989]
实施方案30.如实施方案29的方法，其中所述方法降解来自具有胞嘧啶核碱基的核苷酸群体的不超过1％的胞嘧啶碱基。
[0990]
实施方案31.如实施方案1至19中任一项的方法，其中所述方法在25℃下在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的封闭基团添加到至少94％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0991]
实施方案32.如实施方案31的方法，其中所述方法在25℃下在不超过3小时内将代替3
′
保护基团的封闭基团添加到至少98％的具有3
′
保护基团的核苷酸群体。
[0992]
实施方案33.如实施方案32的方法，其中所述方法降解各自包括胞嘧啶核碱基的核苷酸群体中不超过6％的胞嘧啶核碱基。
[0993]
实施方案34.如实施方案33的方法，其中所述方法降解来自具有胞嘧啶核碱基的核苷酸群体的不超过1％的胞嘧啶核碱基。
[0994]
实施例
[0995]
实施例1.这个实施例展现使用各种烷氧基胺试剂进行的核苷酸解封闭效率和解封闭试剂对不合需要的核苷酸结构修饰和降解的惰性。将每个氨氧基解封闭试剂配制为3.2m水溶液，并且用10m氢氧化钠将ph调节至5.25。然后，将这些氨氧基溶液中的每一者与100mm dctp三磷酸肟溶液1∶1混合并在25℃下温育1小时。此时，将反应物用含10％异丙基甲基酮的50％异丙醇/水稀释50倍。通过hplc使用phenomenex gemini c18柱(5μm nx-x18 110a，lc柱250
×
4.6mm)分析消耗和降解百分比。
[0996]
图1a示出了当用各种候选试剂处理时核苷酸降解百分比对用于dctp的3
′
肟消耗百分比的曲线图。结果指示当使dctp-3
′‑
肟与具有结构r2-onh2的试剂反应时，相较于与羟胺反应来说，具有-ch3、-ch2ch3、-ch2chch2或-c(ch3)3的r2部分的物质产生更高产率的3
′‑
onh2核苷酸。具有-c(ch3)3的r2部分的候选试剂产生最高产率的3
′‑
onh2核苷酸。
[0997]
图1a结果显示相较于用羟胺进行的处理来说，具有-ch3、-ch2chch2或-c(ch3)3的r2部分的物质产生基本上较少不合需要的核苷酸降解。具有-ch2ch3的r2部分的物质展现与用羟胺进行的处理大致相当的降解水平。在图1a中所测试的试剂中，具有-c(ch3)3的r2部分的
试剂展现最低水平的不合需要的核苷酸降解。
[0998]
实施例2.在不经进一步纯化的情况下使用经由使用叔丁基-o-nh2产生的图1组合物以配制测序试剂。在测序操作中使用还包含聚合酶的测序试剂，并且对于至少100个碱基的读段，观测到至少q30的读段质量。
[0999]
这个实施例展现本文方法的实践产生适合于在不经进一步纯化的情况下配制成测序试剂的核苷酸组合物，所述测序试剂例如包含聚合酶、表面活性剂或适用于测序反应的其他试剂的测序试剂。
[1000]
在整个本技术中，已引用了各种出版物、专利和/或专利申请。这些文件的公开内容特此通过引用整体并入本技术。
[1001]
已经描述了多个实施方案。尽管如此，应理解可进行各种修改。因此，其他实施方案是在以下权利要求的范围内。