用于在样品制备期间搅拌流体的改进的转子混合器的制作方法

用于在样品制备期间搅拌流体的改进的转子混合器
1.相关申请的交叉引用。
2.n/a。
技术领域
3.适用的公开的领域本文的公开内容总体上涉及细胞裂解和核酸纯化和分离的领域。更特别地，本公开涉及一种新型的转子混合器和多孔托盘，其在分子诊断中的核酸提取领域中具有特定用途。


背景技术：

4.在使用磁珠的典型细胞裂解和核酸分离方案中，通过移液管系统将样品与细胞裂解缓冲液一起且通过一定量的磁珠移动到多孔板内的孔。磁珠被功能化，例如用二氧化硅表面功能化，以允许核酸分子（诸如dna）的选择性结合。对孔重复一系列外部振动混合、磁珠分离、上清液抽吸和稀释/洗涤步骤。也可以采用加热多孔板的一个或多个孔来促进裂解和/或结合。样品转移、洗涤和洗脱步骤需要单独的抽吸和分配尖端，以避免交叉污染。
5.由于用于处理多个样品的公共平台，加热和加热时间是有限的且不可定制。单个高架移液系统通常负责处理多孔板内的所有样品。
6.替代系统和技术涉及使用设置在密封探针内的磁体。探针选择性地设置在相应的孔内，以允许磁珠被位于孔内的磁体吸引到探针。在一个实施例中，探针可以被从一个孔移除并被插入到另一个孔内的流体中。然后，磁体可以从探针内抽出，从而释放将从探针表面释放的磁珠。随后可以进行进一步的处理。
7.在分子诊断学领域，需要用于裂解细胞和纯化样品以进行扩增子检测的高效且成本有效的系统和方法。


技术实现要素：

8.为了克服用于细胞裂解和纯化的现有技术自动化过程的不灵活性和费用，本公开提供了一种以磁性尖端为特征的新型转子混合器。转子产生涡旋，用于将生物样品与裂解缓冲液和磁珠结合，以在裂解孔中形成裂解混合物。为了优化磁珠上的核酸吸附，涡旋速度足以克服磁珠和转子混合器的磁性尖端之间的磁引力，并允许磁珠在裂解混合物中自由分散。当涡旋停止时，磁珠重新附着在磁性尖端。结果，转子尖端可以用于将来自裂解混合物的磁珠转移到其它孔中和在其它孔之间转移，在其它孔中磁珠经历洗涤并最终洗脱从样品裂解物收集的核酸。
9.与使用样品孔外部振动的传统实验室涡旋设备相比，具有磁性尖端的转子混合器提供了用于在孔之间转移磁珠的高效、简单且可靠的方式，并且该设置特别适用于自动化样品制备技术。
10.还提供了与转子混合器一起使用的一次性多孔板，其具有一系列敞开的流体孔。
第一孔用作裂解容器，其中裂解混合物通过转子诱导的涡旋进行处理，并且磁珠结合到核酸分子。其他孔用作洗涤容器，其中用洗涤缓冲液处理磁珠以除去不期望的裂解混合物残余物。在最后一个洗脱孔中，将洗涤过的磁珠浸入洗脱缓冲液中，以从原始样品裂解物中收集核酸分子。如果期望，还提供对一个或多个裂解孔和洗脱孔的选择性、可定制的直接加热，以增强裂解和/或洗脱。
11.本系统和方法使得能够提供多孔板，其孔由制造商预装缓冲液，从而加快整个过程并降低操作员出错的可能性。替代地，可以以堆叠的配置大量提供多个托盘，任选地，其中每个裂解孔具有相应预装载的磁珠。
12.当前公开的系统和方法的其他独特特征包括提供一次性保护套筒，以在核酸分离过程的涡旋和其他步骤期间保护转子的磁性尖端。任选地，保护套筒可以通过增强涡旋的特征来装配，诸如螺旋桨形突出物或桨叶。
附图说明
13.下文参照所附附图详细描述了所公开技术的说明性实施例，附图通过引用并入本文，并且其中：图1是根据本公开的样品裂解和核酸提取设备的透视图；图2图示了在磁珠存在的情况下，通过图1的设备对裂解混合物的涡旋；图3图示了将外部磁场应用于多孔板的裂解孔；图4图示了从多孔板移除图3的外部磁场并降低磁性尖端以收集磁珠；图5图示了从裂解孔中移除具有磁性地附着到其上的磁珠的转子混合器尖端；图6图示了将图1设备的转子混合器尖端及磁性地附着到其上的磁珠朝向洗涤孔地水平移动；图7是根据本公开的多孔板的透视图；图8是图7的多孔板的侧视截面图；图9是图7的多孔板的俯视图；图10是图7的多孔板的后视图；图11是图7的多孔板的前视图；图12是图7的多孔板的侧视图；图13是图7的多孔板的仰视图；和图14是样品裂解、纯化和洗脱方法的流程图。
具体实施方式
14.本文公开了一种用于从生物样品提取核酸（诸如dna分子）的设备。使用目前公开和描述的设备使得能够以特别适合于自动化样品制备技术的方式在孔之间简化、容易和可靠地转移磁珠。
15.图1图示了根据本公开的设备100的示例性实施例。设备100包括转子混合器102，该转子混合器102具有磁性尖端104，诸如封装在惰性聚合物涂层内的铁磁材料，该磁性尖端104经由转子轴106连接到转子毂108。一次性保护套筒（在这种情况下是图2所示的圆锥形透明塑料套筒107）保护磁性尖端104和转子轴106免受核酸提取中使用的缓冲液和混合
物的内容物的影响。当使流体和诸如磁珠的其他成分的混合物进行涡旋时，转子引擎110为转子混合器102提供动力。当转子混合器102不进行涡旋时，磁珠磁性地附着到磁性尖端104。因此，当核酸分离过程的一个步骤完成时，附着到磁性尖端104的磁珠可以容易地转移到另一个容器，在那里进行下一个步骤。为此，该设备装配有竖直致动器112，该致动器112被配置成沿着竖直轨道114在向上或向下的方向上移动转子混合器102，并且装配有水平致动器（未示出），用于将转子混合器102从一个容器重新定位到另一个容器。此外，该设备100可以包括外部磁体116，该外部磁体116可以选择性地平移到和远离容器的侧壁，以便分别吸引和释放设置在容器内的磁珠。外部磁体也可以选择性地相对于容器竖直地平移，这将在随后讨论。
16.容器可以以一次性多孔板或保持器中的过程孔的形式提供，用于细胞裂解和核苷酸纯化。与目前实践的方法相比，使用目前公开和描述的多孔板实现了简化且更快的细胞裂解和核苷酸提取。图7-13图示了根据本公开的多孔板200的实施例，该多孔板200具有主体构件和从主体构件的底板沿向下方向延伸的多个孔。在该实施例中，主体构件是通道202，并且过程孔包括裂解孔204、洗涤孔206、208、210、212、214和洗脱孔216。该通道可以有助于阻止工作流体意外流出多孔板。
17.裂解孔204设置在多孔板的第一端201处，而洗涤孔设置在第一端和洗脱孔216所在的相对的第二端203中间。每个孔从通道202的底板沿基本正交的方向延伸，并且具有经由通道底板中的孔口与通道连通的内部容积。图示的孔口是圆形的，并且与底板表面共面，尽管也可以考虑不同形状和取向的实施例。这些孔也基本上沿着底板表面共线，并且以多孔板的纵向轴线218为中心。
18.在一个实施例中，孔预填充有适当的缓冲液和其他成分，并且然后密封，例如用在使用时移除的剥离层密封。在另一个实施例中，每个孔都具有渐缩的下部范围。这使得多个多孔板能够被竖直堆叠，由此第一保持器的裂解孔的外表面被接收在下部第二保持器的裂解孔内。类似地，第一保持器的洗涤孔的外表面每个都被接收在下部第二保持器的相应洗涤孔内。
19.为了优化涡旋和磁珠收集性能，裂解孔204的下部范围可具有能够接收磁性尖端104的几何形状。如例如在图8的侧视截面图中所见，裂解孔204可以具有比洗涤孔更大的容积，以便为生物样品、裂解缓冲液和磁珠提供足够的空间。相反地，洗脱孔216可以具有比洗涤孔更小的容积，以便最小化最终核酸产物的稀释，并且可以以圆锥形横截面为特征，以便于用移液器或用于转移流体的其他装置移除产物。
20.多孔板200的裂解孔204可经受加热，这取决于用其实施的裂解过程的特性。例如，裂解孔204的下部范围的外表面可以被配置成被接收在该整体式结构外部的加热器内。这种加热器可以是放置在保持器下方的加热块118，在所需或所期望的时间段内接收其内的裂解孔的下部范围的外表面。类似地，多孔板200的洗脱孔216可以用该整体式结构外部的另一个加热器加热，诸如加热块120，这取决于用其实施的洗脱过程。
21.多孔板200可设置有固持特征，诸如从通道202的上边沿突出的突出部220或在多孔板200任一侧上从多孔板延伸的其他横向突出物。在诸如加热和涡旋的过程期间，当外部装置相对于多孔板200移动时，固持特征可以选择性地由外部夹持机构接合，从而将多孔板保持在相对于外部装置的固定位置中。当移液系统向下压洗脱孔216的内表面时，在将样
品、缓冲液、磁珠或其它成分引入孔或洗脱产物回收期间，固持特征也可以是有用的。替代地，多孔板和相关联的加热块和支撑结构（即板保持器222）可以被配置成相对于转子混合器102横向水平平移，从而消除了实现转子混合器和相关联部件的水平平移的需要。
22.现在结合图2-6和图14，对结合图7-13的多孔板使用图1的系统的非限制性示例性方法进行描述。根据实施例，并非所有步骤都需要按下述顺序实施，也不需要完全利用。首先，在步骤300中，提供诸如上文描述的多孔板，并将其放入板保持器222中。在步骤302中，将一种或多种洗涤缓冲液装载到洗涤孔中，将洗脱缓冲液装载到洗脱孔216中，并将裂解缓冲液装载到裂解孔204中。
23.如在步骤304中，也将磁珠402引入裂解孔204中。在一个示例中，磁珠的材料可以被优化用于从血液样品中提取基因组dna，但是其组成可以变化以适合其他类型的体液或组织或者用于提取其他类型的核酸，诸如rna。然后将生物样品装载到裂解孔中（步骤306），从而产生准备用于涡旋的裂解混合物。典型的样品包括血液、唾液、毛发和其他体液和组织，任选地例如通过冷冻、匀浆或研磨进行预处理。本领域技术人员将认识到，缓冲液和其他反应物的选择可以根据样品和磁珠的类型而变化，以提供用于核酸提取的最佳条件。虽然该图示的过程描绘了装载裂解孔以形成裂解混合物的特定顺序，但是可以采用其他顺序，诸如在添加磁珠之前将样品置于裂解孔中。
24.在步骤308中，通过连续地抑或间歇地旋转转子混合器102，使裂解混合物涡旋，如图2中所例示。对于涡旋步骤的至少一部分，转子混合器102以足以克服磁珠402和磁性尖端104之间的吸引力的速率旋转，从而释放磁珠以围绕裂解混合物起漩涡，并在细胞裂解后与分散在其中的核酸分子结合。在示例性实施例中，转子混合器以每分钟约5000至约10000转的速度旋转。
25.当涡旋停止时，磁珠402附着到磁性尖端104。在一些或所有磁珠未能附着并保持漂浮或吸附到孔壁的情况下，外部磁体116可以通过操作平移构件117（图3）平移到裂解孔204的侧壁。转子混合器102暂时向上移动到裂解混合物的更高水平，同时由外部磁体116在孔的外表面上施加的磁场将磁珠402形成粘附到孔壁的簇。仍然压靠裂解孔204的侧面上的外部磁体116被平移构件首先向下移动，然后远离孔壁（图4），从而移除其磁场并留下静置在孔204底部并准备收集的磁珠402（步骤310）。然后将转子混合器降低到裂解孔204中，由此磁珠402抵靠磁性尖端104聚集。
26.在磁珠洗涤步骤312中，竖直致动器112沿向上方向移动转子混合器102，如图5所示，从而从裂解孔204中提取尖端104和附着到其上的磁珠402。图6示出了将转子轴106与一个洗涤孔（例如洗涤孔206）对准的水平致动器（未示出）。外部磁体116也可以与转子102协调地水平移动。替代地，板保持器222可以相对于转子和外部磁体平移多孔板200。一旦正确对准，竖直致动器112沿向下方向移动转子混合器102，以将磁性尖端104和附着到其上的磁珠402浸入包含在洗涤孔206中的洗涤缓冲液中。然后可以进行类似于在裂解孔204内执行的过程，包括将外部磁体116移动到邻近洗涤孔的位置，旋转转子以将磁珠释放到洗涤缓冲液中并允许磁珠聚集在邻近外部磁体的洗涤孔壁上，移除外部磁体，再次旋转转子以将磁珠重新悬浮在洗涤缓冲液中，然后停止旋转以允许磁珠重新附着到转子磁性尖端104。该过程还可以包括在重新引入转子和磁性尖端之前，竖直地操纵外部磁体以将磁珠聚集在洗涤孔的底部。该程序可以在任何或所有其他洗涤孔208、210、212和214中重复。在完成所期望
次数的洗涤步骤后，竖直和水平致动器将磁性尖端104和磁珠402浸入洗脱孔216中，在此核酸从磁珠402洗脱到洗脱缓冲液中（步骤314）。
27.如所预期的，在所示的将外部磁场施加到裂解孔的外表面的步骤310之前，可加热裂解孔204的内容物。在移除磁珠402之后，裂解孔和洗涤孔中的液体残余物可以通过移液系统抽吸并分配到废物接收器中。类似地，洗脱孔216可以在移除最终核苷酸产物溶液之前的任何点处进行加热。
28.前述说明已涉及特定实施例。然而，可以对所描述的实施例进行其他变化和修改，同时获得它们的一些或全部优点。本领域普通技术人员将进一步理解，在不脱离本文公开的概念的情况下，可以对上述系统和方法进行修改。因此，本发明不应被视为受所公开的实施例的限制。此外，可以使用所描述的实施例的各种特征，而无需相应地使用其他特征。因此，该描述应该被理解为仅仅是对各种原理的说明，而不是对本发明的限制。
29.根据上文包含的教导，本领域技术人员可对本文描述和说明的部分和步骤的细节、材料和布置进行许多变更。应当理解，某些特征和子组合是有用的，并且可以在不参考其他特征和子组合的情况下使用，并且被认为在权利要求的范围内。因此，应当理解，以下权利要求不限于本文公开的实施例，并且可以包括除了那些具体描述的实践之外的实践，并且应当在法律允许的范围内被广义地解释。此外，并不是各个附图中列出的所有步骤都需要按照所描述的特定顺序来执行。