嵌合抗原受体系统及其用途的制作方法

嵌合抗原受体系统及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年7月15日提交的美国临时申请62/705,780和2019年8月27日提交的美国临时申请62/892,225的优先权。每份公开的全文以引用方式并入本文。
技术领域
3.本公开涉及解决肿瘤细胞的免疫监视、异质性和抗原逃逸的分子设计策略。更具体地，本公开涉及锚定结合部分的模块化car-t细胞和有助于对肿瘤靶向具有可调的单/多特异性的双特异性抗体。
4.以电子方式提交的参考序列表
5.本技术包含序列表，该序列表作为ascii格式的序列表经由efs-web以电子方式递交，文件名为“065768.36wo1 sequence listing”，并且创建日期为2020年8月13日，并且大小为114kb。经由efs-web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。


背景技术：

6.免疫疗法为治疗实体瘤和其他癌症提供了新的方式(june等人，science 359:1361-5(2018)；mirzaei等人，front.immunol.8:1850(2017))。包括单克隆抗体、t细胞重定向双特异性抗体、检查点阻断和最近的嵌合抗原受体t细胞(car-t)在内的生物制剂已经极大地改善了肿瘤的治疗。目前，fda已经批准了两种car-t疗法，在临床上还有更多(anderson和mehta，expert.rev.hematol.12:551-61(2019))。然而，最近基于car-t的疗法的成功并不是没有其缺点(minutolo等人，front.oncol.9:176(2019)；kloss等人，nat.biotechnol.31:71-5(2013)；brudno和kochenderfer，blood 127:3321-30(2016)；以及porter等人，sci.transl.med.7:303ra139(2015))。通过从患者收集血液，提取t细胞并表达通常具有靶向肿瘤相关抗原(taa)的单链可变片段(scfv)的嵌合抗原受体，来生成car-t。这将对患者的t细胞重新编程以特异性地靶向肿瘤细胞并破坏它们(eshhar等人，proc.natl.acad.sci.usa 90:720-4(1993))。由于car-t细胞疗法成为常见的治疗方式和更多患者的选择，因此商品成本、制造过程的一致性和患者负担能力都成为讨论的主题。为此，通用/同种异体car-t将减少对制造供体特异性car-t细胞的需要(yang等人，curr.opin.hematol.22:509-15(2015)；eyquem等人，nature 543:113-7(2017))。
7.另外，目前批准的car-t仅靶向单一taa，该taa对具有不均一taa表达的肿瘤无效并且不能防止抗原丢失(brentjens,r.j.等人，cd19-targeted t cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.sci transl med 5,177ra138(2013))。各个研究小组已找到通过在car中包括两个抗原识别位点或经由通用免疫受体来靶向多个taa的方法(minutolo,n.g.、hollander,e.e.和powell,d.j.,jr.，the emergence of universal immune receptor t cell therapy for cancer.front oncol 9,176(2019)；cho,j.h.、collins,
j.j.和wong,w.w.，universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of t cell responses.cell 173,1426-1438e1411(2018)；zhao,j.、lin,q.、song,y.和liu,d.，universal cars,universal t cells,and universal car t cells.j hematol oncol 11,132(2018))。这种脱离方法允许用单一来源的通用t细胞靶向多个taa。为此，设计了通用car-衔接子对，其独立于工程化car组分，并且能够同时结合肿瘤细胞和car-t细胞。因此，本文提供了一种双特异性抗体，其可以靶向t细胞的car茎中的肽接头并且还靶向taa(coloma,m.j.和morrison,s.l.，design and production of novel tetravalent bispecific antibodies.nat biotechnol 15,159-163(1997))。该系统被称为conduit car-t，其以剂量依赖方式显示出肿瘤特异性细胞毒性。


技术实现要素：

8.在一个一般方面，本发明涉及一种嵌合抗原受体(car)系统，该car系统包含(1)car-t构建体，该car-t构建体包含连接到非抗原结合单链可变片段(scfv)的靶多肽接头肽，其中靶多肽接头肽位于car茎中，以及(2)双特异性抗体，该双特异性抗体包含(a)第一抗原结合位点，该第一抗原结合位点结合到靶多肽接头肽，以及(b)第二抗原结合位点，该第二抗原结合位点结合到癌细胞上的肿瘤相关抗原(taa)，使得car-t细胞和癌细胞通过双特异性抗体结合，该双特异性抗体桥接癌细胞和car-t细胞以杀死癌细胞。
9.在另一个一般方面，本发明涉及一种car系统，该car系统包含(1)car-t构建体，该car-t构建体包含单链可变片段(scfv)，该单链可变片段包含靶多肽接头肽的抗原结合位点，以及(2)双特异性抗体，该双特异性抗体包含(a)靶多肽接头肽，该靶多肽接头肽连接到非抗原结合scfv，以及(b)第二抗原结合位点，该第二抗原结合位点结合到癌细胞上的肿瘤相关抗原(taa)，使得car-t细胞和癌细胞通过双特异性抗体结合，该双特异性抗体桥接癌细胞和car-t细胞以杀死癌细胞。
10.本文提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合(g4s)n多肽接头，其中n为至少2。单克隆抗体或其抗原结合片段可包含分别具有seq id no:1、2、3、4、5和6的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3。在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与seq id no:7有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区，或者具有与seq id no:8有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。在某些实施方案中，重链可变区包含seq id no:7的多肽序列，并且轻链可变区包含seq id no:8的多肽序列。
11.在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段是单链可变片段(scfv)。scfv可以例如包含选自seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列。
12.本文还提供了分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，该分离的双特异性抗体或其抗原结合片段包含第一多肽组分和第二多肽组分，其中(a)第一多肽组分包含(i)特异性地结合(g4s)n多肽接头的第一抗原结合结构域，其中n为至少2，或者(ii)非抗原结合单链可变片段(scfv)和(g4s)n多肽接头，其中n为至少2；并且(b)第二多肽组分包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域特异性地结合肿瘤相关抗原(taa)，优选地人taa。
13.在某些实施方案中，第一抗原结合结构域包含分别具有seq id no:1、2、3、4、5和6的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和
lcdr3；并且第二抗原结合结构域包含重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3。
14.在某些实施方案中，第二抗原结合结构域特异性地结合前列腺特异性膜抗原(psma)，优选地人psma，或者具有egf样结构域和两个卵泡抑素样结构域2的跨膜蛋白(tmeff2)，优选地人tmeff2。第二抗原结合结构域可以例如包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区：(a)分别为seq id no:19、20、21、22、23和24，或者(b)分别为seq id no:92、93、94、95、96和97。
15.在某些实施方案中，第一抗原结合结构域包含具有与seq id no:7有至少95％同一性的多肽序列的第一重链可变区，以及具有与seq id no:8有至少95％同一性的多肽序列的第一轻链可变区；并且第二抗原结合结构域具有包含与seq id no:25或seq id no:90有至少95％同一性的多肽序列的第二重链可变区，以及具有与seq id no:26或seq id no:91有至少95％同一性的多肽序列的第二轻链可变区。第一抗原结合结构域可以例如包含具有seq id no:7的多肽序列的第一重链可变区，以及具有seq id no:8的多肽序列的第一轻链可变区；并且第二抗原结合结构域可以例如包含具有seq id no:25或seq id no:90的多肽序列的第二重链可变区，以及具有seq id no:26或seq id no:91的多肽序列的第二轻链可变区。
16.在某些实施方案中，分离的双特异性抗体或其抗原结合片段包含选自seq id no:35和seq id no:28、seq id no:36和seq id no:28、seq id no:37和seq id no:27、seq id no:38和seq id no:27、seq id no:101和seq id no:28、seq id no:102和seq id no:28、seq id no:103和seq id no:98、或者seq id no:104和seq id no:98的氨基酸序列。
17.在某些实施方案中，非抗原结合scfv包含分别具有seq id no:11、12、13、14、15和16的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1、lcdr2和lcdr3。在某些实施方案中，非抗原结合scfv包含具有与seq id no:17有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区，以及具有与seq id no:18有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。非抗原结合scfv可以例如包含具有seq id no:17的氨基酸序列的重链可变区，以及具有seq id no:18的氨基酸序列的轻链可变区。
18.在某些实施方案中，(g4s)n接头肽包含选自由seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53、seq id no:54和seq id no:55组成的组的氨基酸序列。
19.在某些实施方案中，单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段是嵌合的和/或人或人源化的。
20.还提供了编码如本文所公开的单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
21.还提供了包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸的分离的多核苷酸。car可以例如包含(a)胞外结构域，该胞外结构域包含(1)非抗原结合单链可变片段(scfv)和(g4s)n多肽接头，或者(2)特异性地结合(g4s)n多肽接头的抗原结合结构域；(b)跨膜区；以及(c)胞内信号结构域。
22.在某些实施方案中，非抗原结合scfv包含分别具有seq id no:11、12、13、14、15和16的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1、lcdr2和
lcdr3。在某些实施方案中，非抗原结合scfv包含具有与seq id no:17有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区，以及具有与seq id no:18有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。非抗原结合scfv可以例如包含具有seq id no:17的氨基酸序列的重链可变区，以及具有seq id no:18的氨基酸序列的轻链可变区。非抗原结合scfv可以例如包含选自seq id no:33或seq id no:34的氨基酸序列。
23.在某些实施方案中，(g4s)n接头肽包含选自由seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53、seq id no:54和seq id no:55组成的组的氨基酸序列。
24.在某些实施方案中，胞外结构域是cd8胞外结构域。cd8胞外结构域可以例如包含seq id no:41的氨基酸序列。在某些实施方案中，跨膜结构域是cd8跨膜结构域。cd8跨膜结构域可以例如包含seq id no:42的氨基酸序列。在某些实施方案中，胞内信号结构域包含cd137共刺激结构域和cd3ζ活化结构域。cd137共刺激结构域可以例如包含seq id no:43的氨基酸序列，并且cd3ζ活化结构域可包含seq id no:44的氨基酸序列。
25.在某些实施方案中，car可包含选自seq id no:39或seq id no:40的氨基酸序列。
26.在某些实施方案中，抗原结合结构域可包含分别具有seq id no:1、2、3、4、5和6的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3。在某些实施方案中，抗原结合结构域可包含具有与seq id no:7有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区，或者具有与seq id no:8有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。重链可变区可以例如包含seq id no:7的多肽序列，并且轻链可变区可以例如包含seq id no:8的多肽序列。
27.在某些实施方案中，抗原结合结构域是单链可变片段(scfv)。scfv可以例如包含选自seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列。
28.还提供了由如本文所公开的分离的多核苷酸编码的嵌合抗原受体(car)。
29.还提供了包含如本文所公开的分离的核酸或分离的多核苷酸的分离的载体。
30.还提供了包含如本文所公开的分离的载体的分离的宿主细胞。分离的宿主细胞可以例如包含t细胞或nk细胞，优选地人t细胞或人nk细胞。
31.还提供了制备嵌合抗原受体(car)-t细胞或car-nk细胞的方法。该方法可以例如包括在制备car-t细胞或car-nk细胞的条件下培养包含编码如本文所公开的car的分离的多核苷酸的t细胞或nk细胞，以及回收car-t细胞或car-nk细胞。
32.还提供了试剂盒，该试剂盒包括(a)分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码如本文所公开的嵌合抗原受体(car)的核酸，以及(b)如本文所公开的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段。
33.还提供了在有需要的受试者中治疗表达肿瘤相关抗原(taa)的癌症的方法。该方法包括向受试者施用如本文所公开的car-t或car-nk细胞以及包含如本文所公开的双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂的药物组合物。
附图说明
34.结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利申请的优选实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。
35.图1示出了导管car-t系统的作用机制的示意图。用通用car茎转染的t细胞含有在细胞表面上具有g4s接头的惰性scfv。肿瘤细胞在细胞表面上含有肿瘤特异性抗原。使用桥接双特异性抗体衔接子，通用car-t细胞通过结合桥接双特异性抗体和肿瘤特异性抗原两者而归巢在肿瘤细胞上。通过改变桥接双特异性抗体的肿瘤抗原靶向部分，可以使用不同的肿瘤抗原同时仍然使用相同的通用car-t细胞来治疗癌症和复发。
36.图2示出了提供酶联免疫吸附测定(elisa)结果的图，其示出cen-63c13抗g4s抗体与含有g4s接头(圆形)和非g4s接头(正方形)的固定化scfv的结合。cen-63c13抗g4s抗体表现出剂量依赖性结合和0.57nm的ec
50
。
37.图3示出了展示cen-63c13与具有g4s接头的细胞表面scfv结合而不与具有非g4s接头的scfv结合的图。使用荧光标记的抗人fc抗体评估cen-63c13抗体与用具有期望scfv结构域的car-t构建体转染的hek293t细胞的结合。cen-63-13以剂量依赖性方式结合细胞表面抗原，计算的ec
50
为0.78nm。
38.图4示出了提供cen-63c13抗体与wt(g4s)4肽接头和接头截短变体结合的kd值的图。cen-63c13结合所需的最小接头-1长度被确定为10个氨基酸。具有少于10个氨基酸的接头未观察到结合。将生物素化肽接头固定到链霉亲和素生物传感器上，并且使用生物层干涉测量法测量cen-63c13与全长和截短的接头的结合。
39.图5示出了示意图，其示出用于导管car-t平台中的双特异性抗体衔接子的设计。该表示出了用于验证导管car-t平台的四种双特异性抗体衔接子的肿瘤结合臂和接头结合臂。
40.图6a至图6d示出了导管car-t表达的验证。通过用编码所需car-t构建体的体外转录的mrna对活化的原代人t淋巴细胞进行电穿孔来制备导管(g4s)4car-t细胞。图6a示出了通过用或不用cen-63c13抗体对转染的t细胞进行染色来检测导管-car表达。图6b示出了具有或不具有双特异性抗体衔接子的导管-car表达的比较。衔接子的添加不影响导管car表达。图6c示出了通过抗-g4s cen-63-13抗体然后通过抗人pe二抗检测同种型car-转基因表达。在cd3+pan-t细胞的mrna转导后2天进行染色。图6d示出了具有含n-末端myc标记的(g4s)3接头的抗cd19car可在慢病毒转染的pan-t细胞上检测到。myc阳性car-t细胞具有增加的cen-63-13染色，而myc阴性细胞几乎没有cen-63-13染色。
41.图7a至图7d示出了流式细胞术直方图，其示出表达通用car茎的cd8+ t细胞中的cd69活化量。图7a示出了在不存在靶肿瘤细胞的情况下单独的效应t细胞显示出cd69的基线表达。图7b示出了添加到效应t细胞的肿瘤细胞相对于仅效应t细胞增加cd69的表达。图7c示出了在肿瘤细胞和导管双特异性分子两者的存在下发生的效应t细胞上的cd69诱导的最大水平。图7d示出了当在双特异性抗体的存在下将通用car t细胞与肿瘤细胞共培养时发生的t细胞活化的最高水平的图。
42.图8a至图8b示出了导管car-t平台的验证。导管car细胞在双特异性抗体衔接子的存在下杀死肿瘤细胞。图8a示出了在将car-t细胞与肿瘤细胞温育4小时后的cd107a表达的分析。通过对cd8+car+和cd8+car-细胞进行设门来测量cd107a表达。双特异性分子显著活化cd107a表达。图8b示出了在不同e:t比率下双特异性分子的细胞溶解潜力，如通过xcelligence细胞毒性测定法测得。在5μm的最终浓度下，所有双特异性分子在较高e:t比率下显示出有效的细胞毒性。
43.图9a至图9c示出了双特异性细胞结合、增殖以及配体接合依赖性增殖和脱粒。图9a：单独的bsab的存在不改变car表面表达。将bsab分子(5μg/ml)添加到具有(g4s)4接头的同种型car-t细胞中并温育2天。cd3/cd4/cd8阳性t细胞中的car表面表达通过抗g4s抗体(此处示出为cd8
+ t细胞中的car)检测，并且在存在或不存在双特异性抗体的情况下保持相似。图9b：将使用来自两个不同供体的pant细胞生成的car-t细胞用cfse进行标记，在存在/不存在bsab的情况下与表达psma的肿瘤细胞共培养。在刺激后72小时时分析cfse染色强度。在不存在bsab的情况下的cfse染色以灰色直方图示出，而在存在bsab的情况下的cfse染色以绿色直方图示出。图9c：将含(g4s)4的car-t细胞与表达psma的肿瘤细胞在有和没有bsab1的情况下共培养。共培养5小时后，测定car-t细胞的cd107a检测。使用cen-63-13mab检测car表达。代表性图示出car阴性细胞在存在或不存在bsab1的情况下无cd107a表达。在car+群体中，只有与双特异性抗体一起温育的细胞显示出明显增加的cd107a表达，表明在肿瘤细胞的存在下，bsab对于cd107a表达是必需的。
44.图10a至图10d示出了car-t介导的细胞毒性和细胞因子谱的动态监测。使用xcelligence细胞毒性测定法在连续稀释的bsab的存在下测量car-t细胞的实时肿瘤细胞溶解。生成双特异性抗psma和抗g4s接头分子(bsab1和2)，并且在靶向表达psma的pc3细胞的xcelligence细胞毒性测定法中进一步测试(图10a)。在该97小时实验中，含同种型g4s的car-t细胞与pc3细胞的e:t比率为5:1。实验一式三份进行。图10b：还测定并示出bsab 1和2在不同e:t比率下72小时时的细胞溶解百分比。图10c：使用抗tmeff2和抗g4s接头双特异性抗体进行类似的xcelligence细胞毒性实验。仅在bsab的存在下观察到剂量依赖性细胞毒性。图10d：car-t和肿瘤细胞的共培养物中的上清液的细胞因子谱(e:t＝5:1)。在温育后72小时时评估infγ、gmcsf和il-6水平，并且在双特异性抗体的存在下升高。数据以平均值
±
sd示出。使用具有多重比较的单向anova(tukey检验)计算包含car-t细胞和pc3细胞两者的组之间的显著性，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
具体实施方式
45.背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
46.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。
47.应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
48.除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值
±
10％。例如，1mg/ml的浓度包括0.9mg/ml至1.1mg/ml。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
49.除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。
50.如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其他变型应被理解为是指包括指明的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确地指明相反，否则“或”是指包括性的或而不是指排他性的或。例如，条件a或b由以下任一项满足：a为真(或存在)而b为假(或不存在)，a为假(或不存在)而b为真(或存在)，以及a和b两者为真(或存在)。
51.如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
52.如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“由
……
组成”表示包括任何列举的整数或整数组，但不能将附加的整数或整数组添加到指定的方法、结构或组成中。
53.如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“基本上由
……
组成”表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新型特性的任何列举的整数或整数组。参见m.p.e.p.
§
2111.03。
54.如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选哺乳动物，最优选人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于奶牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人等，更优选地包括人。
55.字词“右”、“左”、“下”和“上”指定附图中的方向，以此作为参照。
56.还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，本文使用的“约”、“大约”、“大致”、“基本上”和类似的术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的这种参考将包括使用本领域已接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)的变化，不会改变最低有效数字。
57.在两个或更多个核酸或多肽序列(例如，嵌合抗原受体(car)和编码它们的分离的多核苷酸、分离的单克隆或双特异性抗体及其抗原结合片段和编码它们的核酸)的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性时，相同的或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的指定百分比的两条或更多条序列或子序列，如使用以下序列比较算法中的一种序列比较算法或通过目视检查所测得。
58.对于序列比对，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行对比。当使用序列比对算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果必要的话)，并指定序列算法的程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数来计算对于测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
59.用于比较的序列的最佳比对可例如通过smith&waterman的局部同源性算法进行，《高等应用数学》第2卷：第482页(1981年)(adv.appl.math.2:482(1981))，通过使用needleman&wunsch的同源比对算法进行，《分子生物学杂志》，第48卷：第443页(1970年)(j mol.biol.48：443(1970))，通过搜索pearson&lipman的相似性方法进行，《美国国家科学院院刊》，第85卷：第2444页(1988年)(proc.nat’l.acad.sci.usa 85：2444(1988))，通过这些算法(gap，bestfit，fasta和tfasta，在威斯康星州遗传学软件包，遗传学计算小组，威斯康辛州，麦迪逊，科学街区575号(575science dr.,madison,wi)计算机化实施，或通过目测(大体参见，《分子生物学实验室指南》(current protocols in molecular biology)，f.m.ausubel等人编辑，《实验室指南》，格林尼出版协会和约翰威利父子公司的合资企业(1995年增补版)(ausubel))。
60.适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的示例为blast和blast 2.0算法，其分别在altschul等人，(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschul等人，(1997)nucleic acids res.25:3389-3402中有所描述。用于执行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为w的短字词来识别高评分序列对(hsp)，当与数据库序列中相同长度的字词比对时，该短字词匹配或满足一些正值阈值分数t。t被称为邻近字词分数阈值(altschul等人，出处同上)。这些初始邻近字词命中充当用于发起搜索以找到包含它们的较长hsp的种子。然后将字词命中沿每个序列在两个方向上延伸，只要可增加累积的比对分数。
61.对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励分数；始终》0)和n(错配残基的处罚分数；始终《0)计算累积分数。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积分数。字词命中在每个方向上的延伸在以下情况下停止：累积比对分数从其最大实现值下降数量x；累积分数由于一个或多个负分数残基比对的累积而变为零或更低；或到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x确定比对的灵敏度和速度。blastn程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(w)11、期望值(e)10、m＝5、n＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，blastp程序默认使用字长(w)3、期望值(e)10以及blosum62评分矩阵(参见henikoff和henikoff,proc.natl.acad.sci.usa 89:10915(1989))。
62.除了计算序列同一性百分比之外，blast算法还对两条序列之间的相似性进行统计分析(参见例如karlin和altschul，proc.nat’l.acad.sci.usa 90:5873-5787(1993))。blast算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(p(n))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸类似于参考序列。
63.两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽免疫地交叉反应，如下所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅通过保守置换而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件下彼此杂交。
64.如本文所用，术语“分离的”意指生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已经与组分天然存在的生物体的其他生物组分(即其他染色体和染色体外的dna和rna以及蛋白质)基本上分离、分开得到或从其中纯化出来。因此，已经“分离的”核酸、肽和蛋白质包括通过标准
纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离的”核酸、肽和蛋白质可为组合物的一部分，并且如果该组合物不是核酸、肽或蛋白质自身环境的一部分，则仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。
65.如本文所用，同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的术语“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的rna或dna或者修饰的rna或dna。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的dna、为单链区和双链区的混合物的dna、单链和双链的rna以及为单链区和双链区的混合物的rna、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的dna和rna的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含rna或dna或rna和dna两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的dna或rna，以及具有出于稳定性或其他原因而被修饰的主链的dna或rna。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对dna和rna进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的dna和rna的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。
66.如本文所用，术语“载体”是复制子，其中可以可操作地插入另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。
67.如本文所用，术语“宿主细胞”是指包含本发明的核酸分子的细胞。“宿主细胞”可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在一个实施方案中，“宿主细胞”是用本发明的核酸分子转染或转导的细胞。在另一个实施方案中，“宿主细胞”是此类经转染或转导的细胞的后代或潜在后代。细胞的后代可以或不可与亲本细胞相同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。
68.如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到rna的转录。该术语还涵盖rna到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的car可处于宿主细胞的细胞质内，处于胞外环境诸如细胞培养物的生长培养基中，或锚定至细胞膜。
69.如本文所用，术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是指参与免疫应答，例如促进免疫效应应答的细胞。免疫细胞的示例包括t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、肥大细胞、以及来源于骨髓的吞噬细胞。根据特定实施方案，工程化免疫细胞是t细胞，并且称为car-t细胞，因为它们被工程化成用于表达本发明的car。
70.如本文所用，术语“工程化免疫细胞”是指通过将dna或rna形式的额外遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的免疫细胞，也称为免疫效应细胞。根据本文的实施方案，工程化免疫细胞已经过基因修饰以表达根据本发明的car构建体。
71.嵌合抗原受体(car)
72.如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(car)是指至少包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内t细胞受体活化信号结构域的多肽，该胞外结构域通过单特异性或多特异性抗体结合或特异性地结合单特异性或多特异性抗体上的靶标。胞外结构域可包含针对接头多肽的结合结构域、单独的接头多肽、或与重组多肽融合的接头多肽。car的胞外结构域与多特异性抗体的接合导致car聚簇并将激活刺激物递送至含有car的细胞，该多特异性抗体被工程化以结合癌细胞上的肿瘤相关抗原(taa)。car重定向免疫效应细胞的特异性，并且触发了增
殖、细胞因子产生、能够以不依赖主要组织相容性(mhc)的方式介导表达taa的细胞死亡的分子的吞噬作用和/或产生。
73.在一个方面，car包含：胞外结构域，该胞外结构域包含非抗原结合单链可变片段(scfv)和(g4s)n多肽接头，其中n为至少2；跨膜区；以及胞内信号结构域。在另一方面，car包含：胞外结构域，该胞外结构域包含特异性地结合(g4s)n多肽接头的抗原结合结构域，其中n为至少2；跨膜区；以及胞内信号结构域。
74.根据一个具体方面，非抗原结合scfv包含分别具有seq id no:11、12、13、14、15和16的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1、lcdr2和lcdr3。
75.根据另一具体方面，非抗原结合scfv可包含具有与seq id no:17有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变区，以及具有与seq id no:18有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
76.根据另一具体方面，非抗原结合scfv可以例如包含选自seq id no:33或seq id no:34的氨基酸序列。
77.根据一个具体方面，抗原结合结构域可包含分别具有seq id no:1、2、3、4、5和6的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3。
78.根据另一具体方面，抗原结合结构域可包含具有与seq id no:7有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽序列的重链可变区，或者具有与seq id no:8有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽序列的轻链可变区。
79.根据另一具体方面，抗原结合结构域是单链可变片段(scfv)。scfv可以例如包含选自seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列。
80.根据另一具体方面，胞外结构域可包含连接到以下的cd8胞外结构域：(1)非抗原结合单链可变片段(scfv)和(g4s)n多肽接头，或者(2)特异性地结合(g4s)n多肽接头的抗原结合结构域。cd8胞外结构域可以例如包含seq id no:41的氨基酸序列。
81.根据另一具体方面，跨膜结构域是cd8跨膜结构域。cd8跨膜结构域可以例如包含seq id no:42的氨基酸序列。
82.根据另一具体方面，胞内信号结构域包含cd137共刺激结构域和cd3ζ活化结构域。cd137共刺激结构域可以例如包含seq id no:43的氨基酸序列。cd3ζ活化结构域可以例如包含seq id no:44的氨基酸序列。
83.根据另一具体方面，car可包含选自seq id no:39或seq id no:40的氨基酸序列。
84.根据另一具体方面，本文还提供了由如本文所公开的分离的多核苷酸编码的嵌合抗原受体(car)。
85.如本文所用，术语“信号肽”是指处于新生car蛋白的氨基末端(n-末端)的前导序列，其在翻译时或翻译后将新生蛋白引导到内质网和后续的表面表达。
86.如本文所用，术语“胞外抗原结合结构域”、“胞外结构域”或“胞外配体结合结构域”是指car的位于细胞膜外并且能够结合抗原、靶标或配体或者另选地能够通过特异性地
识别胞外结构域的一部分的抗原结合结构域结合的部分(例如，能够通过抗体或其抗原结合片段特异性地结合的多肽接头)。
87.如本文所用，术语“铰链区”是指连接car蛋白质的两个相邻结构域，例如胞外结构域和跨膜结构域的car的一部分。
88.如本文所用，术语“跨膜结构域”是指跨越细胞膜延伸并使car锚定于细胞膜的car的一部分。
89.如本文所用，术语“胞内信号结构域”是指car的位于细胞膜内的用于在接合car的胞外结构域时激活信号传导级联的部分。胞内信号结构域可以例如包含共刺激结构域和活化结构域。
90.共刺激结构域
91.如本文所用，嵌合抗原受体可包括共刺激(信号)结构域以增加其效能。共刺激(信号)结构域可以来源于共刺激分子。共刺激分子是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激结构域可以来源于共刺激分子，该共刺激分子可包括但不限于cd28、cd28t、ox40、4-1bb/cd137、cd2，cd3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、cd4、cd5、cd7、cd9、cd16、cd22、cd27、cd30、cd33、cd37、cd40、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、程序性死亡-1(pd-1)、可诱导t细胞共刺激因子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1；cd11a和cd18)、cd247、cd276(b7-h3)、light(肿瘤坏死因子超家族成员14；tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap10、fcγ受体、mhc i类分子、tnfr、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子、btla，toll配体受体、icam-1、cds、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、itga4、vla1、cd49a、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、itgae，cd103、itgal、cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、itgam、itgax、itgb1、cd29、itgb2(cd18)、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd 160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、cd83配体、细胞因子受体、活化nk细胞受体、或它们的片段或任何组合。在一个优选的实施方案中，共刺激结构域是cd137共刺激结构域。
92.活化结构域
93.如本文所用，嵌合抗原受体可包含活化结构域。活化结构域可包括但不限于cd3。cd3是天然t细胞上的t细胞受体的元件，并且已被证明是car中的重要胞内活化元件。在一个优选的实施方案中，cd3是cd3ζ(ζ)。
94.铰链区
95.如本文所述，嵌合抗原受体可包含铰链区。这是胞外结构域的一部分，有时称为“间隔区”。多种铰链可根据本发明使用，包括如上所述的共刺激分子、免疫球蛋白(ig)序列或用于实现与靶细胞的期望特定距离的其他合适分子。在一些实施方案中，整个胞外区包含铰链区。
96.在一些实施方案中，胞外结构域包含铰链区，其中铰链区是多肽接头序列。在某些实施方案中，铰链区包含(g4s)n接头肽。在某些实施方案中，(g4s)n接头肽可以可操作地连接至非抗原结合scfv。
1bb/cd137、cd2、cd3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、cd4、cd5、cd7、cd9、cd16、cd22、cd27、cd30、cd33、cd37、cd40、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、程序性死亡-1(pd-1)、可诱导t细胞共刺激因子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1；cd11a和cd18)、cd247、cd276(b7-h3)、light(肿瘤坏死因子超家族成员14；tnfsf14)、nkg2c、igα(cd79a)、dap10、fcγ受体、mhc i类分子、tnfr、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子、btla，toll配体受体、icam-1、cds、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd8α、cd8β、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、itga4、vla1、cd49a、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、itgae，cd103、itgal、cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、itgam、itgax、itgb1、cd29、itgb2(cd18)、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd 160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、cd83配体、细胞因子受体、活化nk细胞受体、免疫球蛋白、或它们的片段或任何组合。在一个优选的实施方案中，跨膜结构域是cd8跨膜结构域。
103.免疫细胞
104.根据具体方面，本发明提供了作为免疫细胞的细胞，该免疫细胞包含分离的多核苷酸或包含分离的多核苷酸的载体，该分离的多核苷酸包含编码本文提供的car的核苷酸序列。包含本发明的分离的多核苷酸和/或载体的免疫细胞可称为“工程化免疫细胞”。优选地，工程化免疫细胞来源于人(在重组制备前为人源的)。
105.工程化免疫细胞可以例如是淋巴系统的细胞。淋巴系统的细胞的非限制性示例可包括t细胞和自然杀伤(nk)细胞。t细胞表达t细胞受体(tcr)，大多数细胞表达α和β链，而较少群体表达γ和δ链。可用作本发明的工程化免疫细胞的t细胞可以是cd4
+
或cd8
+
，并且可包括但不限于辅助t细胞(cd4
+
)、细胞毒性t细胞(也称为细胞毒性t淋巴细胞，ctl；cd8
+
细胞)和记忆t细胞，包括中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞和效应记忆t细胞、自然杀伤t细胞，粘膜相关恒定t细胞和γδt细胞。其他示例性免疫细胞包括但不限于巨噬细胞、抗原递呈细胞(apc)或表达细胞介导的免疫应答的抑制剂(例如，免疫检查点抑制剂通路受体(例如，pd-1))的任何免疫细胞。可根据本发明使用的免疫细胞的前体细胞包括造血干细胞和/或祖细胞。造血干细胞和/或祖细胞可通过本领域已知的方法来源于骨髓、脐带血、细胞因子动员后的成人外周血等。免疫细胞被工程化以通过重组表达本发明的car。
106.免疫细胞及其前体细胞可通过本领域已知的方法分离，包括可商购获得的方法(参见例如rowland jones等人，lymphocytes:a practical approach,oxford university press,ny(1999))。免疫细胞或其前体的来源包括但不限于外周血、脐带血、骨髓或其他造血细胞来源。可采用各种技术分离细胞以分离或富集期望的免疫细胞。例如，可使用负选择方法除去不是期望免疫细胞的细胞。另外，可使用正选择方法分离或富集期望的免疫细胞或其前体，或者可采用正选择方法和负选择方法的组合。如果要分离特定类型的细胞，例如特定的t细胞，可使用各种细胞表面标志物或标志物的组合(例如，cd3、cd4、cd8、cd34)来分离细胞。
107.免疫细胞或其前体细胞对于在本发明的治疗方法中施用它们的受试者可以是自体的或非自体的。自体细胞从将要被施用通过重组表达car的工程化免疫细胞的受试者分
离。任选地，细胞可通过白细胞去除术获得，其中白细胞被选择性地从抽取的血液中去除，重组制备，然后再输注到供体中。另选地，可使用来自非受试者的非自体供体的同种异体细胞。就非自体供体而言，将细胞分型并与人白细胞抗原(hla)匹配以确定适当的相容性水平。对于自体细胞和非自体细胞两者，可任选地将细胞冷藏直至备用。
108.用于分离可用于重组表达本发明car的免疫细胞的各种方法已经在先前描述，并且可以使用，包括但不限于使用外周供体淋巴细胞(sadelain等人，nat.rev.cancer 3:35-45(2003)；morgan等人，science 314:126-9(2006))、使用来源于肿瘤活检中的肿瘤浸润淋巴细胞(til)的淋巴细胞培养物(panelli等人，j.immunol.164:495-504(2000)；panelli等人，j.immunol.164:4382-92(2000))以及使用采用人工抗原递呈细胞(aapc)或树突细胞选择性体外扩增的抗原特异性外周血白细胞(dupont等人，cancer res.65:5417-427(2005)；papanicolaou等人，blood 102:2498-505(2003))。就使用干细胞而言，可通过本领域众所周知的方法分离细胞(参见例如klug等人，hematopoietic stem cell protocols,humana press,nj(2002)；freshney等人，culture of human stem cells,john wiley&sons(2007))。
109.根据具体实施方案，制备工程化免疫细胞的方法包括转染或转导分离自个体的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达根据本发明的实施方案的一种或多种car。制备用于免疫疗法的免疫细胞的方法描述于例如wo2014/130635、wo2013/176916和wo2013/176915，这些专利以引用方式并入本文。公开了可用于制备工程化免疫细胞的单个步骤，例如wo2014/039523、wo2014/184741、wo2014/191128、wo2014/184744和wo2014/184143，这些专利以引用方式并入本文。
110.在一个具体实施方案中，将免疫效应细胞诸如t细胞用本发明的car进行基因修饰(例如，用包含编码car的核酸的病毒载体转导)，然后活化并在体外扩增。在各种实施方案中，可使用如例如us6352694,us6534055,us6905680,us6692964,us5858358,us6887466,us6905681,us7144575,us7067318,us7172869,us7232566,us7175843,us5883223,us6905874,us6797514,us6867041,us2006/121005(它们以引用方式并入本文)所述的方法，在基因修饰以表达car之前或之后，使t细胞活化并扩增。t细胞可在体外或体内扩增。一般来讲，本发明的t细胞可通过接触其上附着有刺激cd3/tcr复合物相关的信号的试剂以及刺激t细胞表面的共同刺激分子的配体的表面来扩增。作为非限制性示例，如本文所述，可诸如通过接触固定于表面上的抗cd3抗体或其抗原结合片段、或抗cd3抗体，或通过接触连有钙离子载体的蛋白激酶c活化剂(例如，苔藓虫素)，或通过活化car自身来刺激t细胞群。为共刺激t细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配基。例如，可在适于刺激t细胞增殖的条件下使t细胞群与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。适于t细胞培养的条件包括例如适当的培养基(例如最低必需培养基或rpmi培养基1640或x-vivo 5(lonza))，其中可包含增殖和存活所需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、细胞因子如il-2、il-7、il-15和/或il-21、胰岛素、ifn-γ、gm-csf、tgfβ和/或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。在其他实施方案中，可使用诸如us6040177、us5827642和wo2012129514(它们以引用方式并入本文)中所述的那些的方法，采用饲养细胞以及适当的抗体和细胞因子使t细胞活化和刺激以进行增殖。
111.抗体
112.在一个一般方面，本发明涉及特异性地结合多肽接头的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。多肽接头可以例如选自表1中提供的多肽接头。在某些实施方案中，多肽接头是(g4s)n接头，其中n为至少2。
113.在另一个一般方面，本发明涉及分离的双特异性抗体或其抗原结合片段。分离的双特异性抗体或其抗原结合片段可被工程化以靶向肿瘤相关抗原(taa)和多肽接头。多肽接头可以例如是(g4s)n接头，其中n为至少2。双特异性抗体或其抗原结合片段还可被工程化以靶向肿瘤相关抗原(taa)并且具有非抗原结合组分(例如，非抗原结合单链可变片段(scfv)，其包含多肽接头(例如，(g4s)n接头，其中n为至少2))。
114.还提供了制备抗体的方法，以及使用该抗体与car-t细胞协同治疗包括癌症的疾病的方法。本发明的抗体具有一种或多种期望的功能特性，包括但不限于对肿瘤相关抗原(taa)和/或(g4s)n肽接头的高亲和力，对肿瘤相关抗原(taa)和/或(g4s)n肽接头的高特异性，激活car-t细胞的t细胞信号传导的能力，诱导效应物介导的肿瘤细胞溶解的能力，刺激补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性吞噬作用(adpc)和/或针对表达肿瘤相关抗原的细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的能力，介导缀合药物的募集的能力，以及当单独施用或与其他抗癌疗法组合施用时在受试者和动物模型中抑制肿瘤生长的能力。
115.如本文所用，术语“抗体”广义地使用，并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括人抗体、人源化抗体、复合抗体和嵌合抗体以及单克隆或多克隆抗体片段。一般来讲，抗体是蛋白质或肽链，其对于特定抗原表现出结合特异性。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五大类(即，iga、igd、ige、igg和igm)。iga和igg进一步亚分类为同种型iga1、iga2、igg1、igg2、igg3和igg4。因此，本发明的抗体可为五种主要种类或对应的亚类中的任一种。优选地，本发明的抗体为igg1、igg2、igg3或igg4。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。因此，本发明的抗体可含有κ或λ轻链恒定域。根据具体实施方案，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除重链和轻链恒定结构域之外，抗体还包含由轻链可变区和重链可变区构成的抗原结合区，每个可变区包含三个结构域(即，互补决定区1-3；cdr1、cdr2和cdr3)。轻链可变区结构域替代性地被称为lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且重链可变区结构域替代性地被称为hcdr1、hcdr2和hcdr3。
116.如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性地结合(g4s)n肽接头或肿瘤相关抗原(taa)的分离的抗体基本上不含不结合(g4s)n肽接头或肿瘤相关抗原(taa)的抗体)。另外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
117.如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从一组基本上均质的抗体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成该组的各个抗体是相同的。本发明单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或通过重组dna方法制备。例如，单克隆抗体可以由包括获自转基因非人动物诸如转基因小鼠或大鼠的b细胞的杂交瘤产生，转基因非人动物具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
118.如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，诸如双抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv')、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scfv)、单结构域抗体(sdab)、scfv二聚体(二价双抗
体)、由包含一个或多个cdr的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合至抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体或亲本抗体片段结合的抗原相同的抗原。根据具体实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和重链的fd区段。根据其他具体实施方案，抗原结合片段包含fab和f(ab’)。
119.如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域中的常规单链抗体，其包含通过约5个至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域中的常规单域抗体，这种单域抗体包含重链可变区和重链恒定区或者仅包含重链可变区。
120.如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的人产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体、其片段以及/或者包含至少一种人重链多肽和/或轻链多肽的抗体。
121.如本文所用，术语“人源化抗体”是指被修饰成提高与人抗体的序列同源性的非人抗体，使得抗体的抗原结合特性得以保留，但其在人体内的抗原性下降。
122.如本文所用，术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。轻链和重链两者的可变区通常对应于来源于一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有期望的特异性，亲和力和能力的抗原结合结构域的可变区，而恒定区对应于来源于另一个哺乳动物物种(例如，人)的抗原结合结构域的序列，以避免在该物种中引发免疫应答。
123.如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位不重叠或基本上不重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原例如不同蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变域。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
124.如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两个抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原例如不同蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位(例如，肿瘤相关抗原(taa))具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，以及对第二表位(例如，(g4s)n接头肽)具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位(例如，肿瘤相关抗原(taa))具有结合特异性的scfv或其片段，以及对第二表位(例如，(g4s)n接头肽)具有结合特异性的scfv或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对
第一表位(例如，肿瘤相关抗原(taa))具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，以及对第二抗原(例如，非抗原结合单链可变片段(scfv))不具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位(例如，肿瘤相关抗原(taa))具有结合特异性的scfv或其片段，以及对第二表位(例如，非抗原结合单链可变片段(scfv))具有结合特异性的scfv或其片段。
125.如本文所用，术语“肿瘤相关抗原(taa)”是指由能够结合taa的抗体表达并能够识别的任何抗原。肿瘤相关抗原(taa)的示例可包括但不限于前列腺特异性膜抗原(psma)、tmeff2、klk2、cd70、pd-1、pd-l1、ctla-4、egfr、her-2、cd19、cd20、cd3、间皮素(msln)、前列腺干细胞抗原(pcsa)、b细胞成熟抗原(bcma或bcm)、g蛋白偶联受体c家族5组成员d(gprc5d)、白介素-1受体辅助蛋白(il1rap)、δ样3(dll3)、碳酸酐酶ix(caix)、癌胚抗原(cea)、cd5、cd7、cd10、cd22、cd30、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd49f、cd56、cd74、cd123、cd133、cd138、上皮糖蛋白-2(egp 2)、上皮糖蛋白-40(egp-40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、叶酸结合蛋白(fbp)、胎儿型乙酰胆碱受体(achr)、叶酸受体a和b(fra和b)、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体viii(egfrviii)、erb3、erb4、人端粒酶逆转录酶(htert)、白介素-13受体亚基α-2(il-13ra2)、k-轻链、激酶插入结构域受体(kdr)、lewis a(ca19.9)、lewis y(ley)、l1细胞粘附分子(licam)、黑素瘤相关抗原1(黑素瘤抗原家族a1，mage-a1)、粘蛋白-16(muc-16)、粘蛋白1(muc-1)、nkg2d配体、癌症-睾丸抗原ny-eso-1、癌胚抗原(h5t4)、肿瘤相关糖蛋白72(tag-72)、血管内皮生长因子受体(vegfr)、血管内皮生长因子r2(vegf-r2)、wilms肿瘤蛋白(wt-1)、1型酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ror1)、b7-h3(cd276)、b7-h6(nkp30)、硫酸软骨素蛋白多糖-4(cspg4)、dnax辅助分子(dnam-1)、肝配蛋白a型受体2(epha2)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、gp100/hla-a2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)、ha-1h、herk-v、il-11ra、潜伏膜蛋白(lmp1)、神经细胞粘附分子(n-cam/cd56)和trail受体(trail r)。
126.如本文所用、“特异性地结合肿瘤相关抗原(taa)”的抗原结合结构域是指以1
×
10-7
m或更小，优选地1
×
10-8
m或更小，更优选地5
×
10-9
m或更小、1
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10-9
m或更小、5
×
10-10
m或更小、或者1
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10-10
m或更小的kd结合taa，优选地人taa的抗原结合结构域。术语“kd”是指从kd对ka的比(即kd/ka)获得并且表示为摩尔浓度(m)的解离常数。根据本公开，抗体的kd值可以使用本领域中的方法确定。例如，抗体的kd可通过使用表面等离振子共振，诸如通过使用生物传感器系统(例如系统)，或者通过使用生物层干涉测量技术(诸如octet red96系统)来确定。
127.如本文所用，术语“(g4s)n接头肽”是指具有ggggs(seq id no:89)氨基酸基序的肽，其中“n”为ggggs基序重复片段的数目。(g4s)n接头肽可具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个重复片段、或其间的任何值。在某些实施方案中，(g4s)n接头肽具有至少2个重复片段。(g4s)n接头肽可以例如包含选自由seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53、seq id no:54和seq id no:55组成的组的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，(g4s)n接头肽包含seq id no:45的氨基酸序列。
128.如本文所用，“特异性地结合(g4s)n接头肽”的抗原结合结构域是指以1
×
10-7
m或更小，优选地1
×
10-8
m或更小，更优选地5
×
10-9
m或更小、1
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10-9
m或更小、5
×
10-10
m或更小、
或者1
×
10-10
m或更小的kd结合(g4s)n接头肽，优选地(g4s)4接头肽的抗原结合结构域。
129.如本文所用，“非抗原结合单链可变片段(scfv)”是指不特异性地结合抗原的scfv。scfv被设计成不以1
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10-7
m或更小，优选地1
×
10-8
m或更小，更优选地5
×
10-9
m或更小、1
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10-9
m或更小、5
×
10-10
m或更小、或者1
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10-10
m或更小的kd结合任何潜在抗原。scfv对抗原的非特异性结合可以发生，但一般来讲，抗原的非特异性结合以1
×
10-3
m或更大的kd发生。
130.抗体kd的值越小，抗体与靶抗原结合的亲和力越高。
131.根据一个具体方面，本文提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合(g4s)n多肽接头，其中n为至少2。单克隆抗体或其抗原结合片段可包含分别具有seq id no:1、2、3、4、5和6的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3。
132.根据另一具体方面，特异性地结合(g4s)n多肽接头的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与seq id no:7有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽序列的重链可变区，或者具有与seq id no:8有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽序列的轻链可变区。
133.根据另一具体方面，特异性地结合(g4s)n多肽接头的单克隆抗体或其抗原结合片段是单链可变片段(scfv)。scfv可以例如包含选自seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列。
134.根据一个具体方面，本文提供了分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，该分离的双特异性抗体或其抗原结合片段包含第一多肽组分和第二多肽组分，其中(a)第一多肽组分包含(i)特异性地结合(g4s)n多肽接头的第一抗原结合结构域，其中n为至少2，或者(ii)非抗原结合单链可变片段(scfv)和(g4s)n多肽接头，其中n为至少2；并且(b)第二多肽组分包含第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域特异性地结合肿瘤相关抗原(taa)，优选地人taa。
135.根据另一具体方面，第一抗原结合结构域包含分别具有seq id no:1、2、3、4、5和6的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3；并且第二抗原结合结构域包含重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3。
136.根据另一具体方面，第二抗原结合结构域特异性地结合前列腺特异性膜抗原(psma)，优选地人psma，或者具有egf样结构域和两个卵泡抑素样结构域2的跨膜蛋白(tmeff2)，优选地人tmeff2。第二抗原结合结构域可以例如包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区：(a)分别为seq id no:19、20、21、22、23和24；或者(b)分别为seq id no:92、93、94、95、96和97。
137.根据另一具体方面，第一抗原结合结构域包含具有与seq id no:7有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽序列的第一重链可变区，以及具有与seq id no:8有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽序列的第一轻链可变区；并且第二抗原结合结构域具有包含与seq id no:25或seq id no:90有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽序列的第二重链可变区，以及具有与seq id no:26或seq id no:91有至少95％、至少96％、至少
97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽序列的第二轻链可变区。
138.根据另一具体方面，分离的双特异性抗体或其抗原结合片段包含选自seq id no:35和seq id no:28、seq id no:36和seq id no:28、seq id no:37和seq id no:27、seq id no:38和seq id no:27、seq id no:101和seq id no:28、seq id no:102和seq id no:28、seq id no:103和seq id no:98、或者seq id no:104和seq id no:98的氨基酸序列。
139.根据另一具体方面，非抗原结合scfv包含分别具有seq id no:11、12、13、14、15和16的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1、lcdr2和lcdr3。
140.根据另一具体方面，非抗原结合scfv包含具有与seq id no:17有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变区，以及具有与seq id no:18有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
141.在另一个一般方面，本发明涉及分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码如本文所公开的嵌合抗原受体(car)的核酸，以及编码如本文所公开的单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。本领域的技术人员将理解，可以改变(例如置换、缺失、插入等)蛋白质的编码序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，本领域的技术人员将理解，可以改变编码本发明的car、单克隆抗体或其抗原结合片段、和/或双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸序列，而不改变蛋白质的氨基酸序列。
142.在另一个一般方面，本发明涉及包含含有编码如本文所公开的car的核酸的分离的多核苷酸的载体，以及包含编码如本文所公开的单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的载体。根据本公开，可使用本领域的技术人员已知的任何载体，诸如质粒、粘端质粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体，诸如质粒。载体可包括建立表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可为组成型、诱导型或阻抑型启动子。能够向细胞递送核酸的多种表达载体在本领域中是已知的，并且在本文可用于在细胞中产生其抗原结合结构域。常规克隆技术或人工基因合成可用于根据本发明的实施方案生成重组表达载体。
143.在另一个一般方面，本发明涉及一种用包含分离的多核苷酸的载体转导的细胞，该分离的多核苷酸包含编码如本文所公开的car的核酸。术语“转导的”或“转导”是指外源核酸被转移或引入宿主细胞中的过程。“转导的”细胞是已用外源核酸转导的细胞。该细胞包括原代受试细胞及其后代。在某些实施方案中，该细胞是人car-t细胞，其中t细胞被工程化以表达本发明的car来治疗疾病诸如癌症。在某些实施方案中，细胞是人car-nk细胞，其中被工程化以表达本发明的car的nk细胞用于治疗疾病诸如癌症。
144.在另一个一般方面，本发明涉及一种通过用包含编码如本文所公开的car的分离的核酸的载体转导t细胞来制备car-t细胞的方法。
145.在另一个一般方面，本发明涉及一种制备如本文所公开的car-t细胞的方法。该方法包括在制备car-t细胞的条件下培养包含编码如本文所公开的嵌合抗原受体(car)的核酸的t细胞，以及回收car-t细胞。
146.在另一个一般方面，本发明涉及一种通过用包含编码如本文所公开的car的分离
的核酸的载体转导nk细胞来制备car-nk细胞的方法。
147.在另一个一般方面，本发明涉及一种制备如本文所公开的car-nk细胞的方法。该方法包括在制备car-nk细胞的条件下培养包含编码如本文所公开的嵌合抗原受体(car)的核酸的nk细胞，以及回收car-nk细胞。
148.在另一个一般方面，本发明涉及一种宿主细胞，该宿主细胞包含编码如本文所公开的单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开，本领域的技术人员已知的任何宿主细胞可用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌tg1或bl21细胞(用于表达例如scfv或fab抗体)、cho-dg44或cho-k1细胞或hek293细胞(用于表达例如全长igg抗体)。根据具体实施方案，通过常规方法诸如化学转染、热休克或电穿孔将重组表达载体转化到宿主细胞中，其中将该重组表达载体稳定整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸有效表达。
149.在另一个一般方面，本发明涉及一种制备如本文所公开的单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在制备如本文所公开的单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，以及从细胞或细胞培养物(例如，从上清液)回收抗体或其抗原结合片段。可从细胞收获表达的抗体或其抗原结合片段并且根据本领域已知以及如本文所述的常规技术进行纯化。
150.药物组合物
151.在另一个一般方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含如本文所公开的分离的多核苷酸或核酸(例如，编码car的分离的多核苷酸，或编码单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸)、如本文所公开的分离的多肽(例如，分离的单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段，或car)、如本文所公开的宿主细胞、和/或如本文所公开的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载剂。如本文所用的术语“药物组合物”意指包含如本文所公开的分离的多核苷酸或核酸、如本文所公开的分离的多肽、如本文所公开的宿主细胞、和/或如本文所公开的工程化免疫细胞以及药学上可接受的载剂的产品。本发明的多核苷酸，多肽，宿主细胞和/或工程化免疫细胞以及包含它们的组合物还可用于制造用于本文提及的治疗应用的药物。
152.如本文所用，术语“载剂”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于在药物制剂中使用的其他材料。应当理解，载剂、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。根据具体实施方案，根据本公开，适用于多核苷酸、多肽、宿主细胞和/或工程化免疫细胞药物组合物的任何药学上可接受的载剂均可用于本发明。
153.药物活性成分与药学上可接受的载剂的制剂为本领域中已知的，例如remington:the science and practice of pharmacy(例如第21版(2005)以及任何后续版本)。附加成分的非限制性示例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张度调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载剂可用于配制本发明的药物组合物。
154.在本发明的一个实施方案中，药物组合物为液体制剂。液体制剂的一个优选示例
为水性制剂，即包含水的制剂。液体制剂可包含溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等等。水性制剂通常包含至少50％w/w的水，或至少60％w/w、70％w/w、75％w/w、80％w/w、85％w/w、90％w/w或至少95％w/w的水。
155.在一个实施方案中，药物组合物可被配制为可例如经由注射装置(例如，注射器或输液泵)注射的注射剂。注射可以例如皮下、肌内、腹膜内、玻璃体内或静脉内递送。
156.在另一个实施方案中，药物组合物为固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可按原样使用，或在使用前由医师或患者添加溶剂和/或稀释剂。固体剂型可包括片剂，诸如压片和/或包衣片，以及胶囊剂(例如硬明胶胶囊或软明胶胶囊)。药物组合物也可为例如用于重构的小药囊、糖衣丸、粉末、颗粒剂、锭剂或粉末的形式。
157.剂型可以是速释型，在这种情况下它们可包含水溶性或水分散性载剂，或者它们可被延迟释放、缓释或改变释放，在这种情况下它们可包含在胃肠道中或在皮下调节剂型的溶解速率的水不溶性聚合物。
158.在其他实施方案中，药物组合物可以鼻内、颊内或舌下递送。
159.水性制剂中的ph可介于ph 3和ph 10之间。在本发明的一个实施方案中，制剂的ph为约7.0至约9.5。在本发明的另一个实施方案中，制剂的ph为约3.0至约7.0。
160.在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的非限制性示例包括：精氨酸、天冬氨酸、二羟乙基甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、富马酸、甘氨酸、双甘氨肽、组氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸盐、酒石酸、三嗪和三(羟甲基)氨基甲烷、以及它们的混合物。缓冲剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定缓冲剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
161.在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含防腐剂。防腐剂的非限制性示例包括：苄索氯铵、苯甲酸、苄醇、溴代硝基丙二醇、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己啶、氯苯甘油醚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、咪脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯基乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫柳汞以及它们的混合物。防腐剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定防腐剂中的每一种的药物组合物构成本发明可供选择的实施方案。
162.在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含等渗剂。该实施方案的非限制性示例包括盐(诸如氯化钠)、氨基酸(诸如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、糖醇(诸如甘油、1,2-丙二醇、丙二醇)、1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如，peg400)以及它们的混合物。等渗剂的另一个示例包括糖。糖的非限制性示例可以是单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β-hpcd、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一个示例是糖醇，其中术语“糖醇”被定义为具有至少一个-oh基团的c(4-8)烃。糖醇的非限制性示例包括甘露糖醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、己六醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。等渗剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定等渗剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
163.在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含螯合剂。螯合剂的非限制性示例包括柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(edta)的盐、以及它们的混合物。螯合剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定螯合剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
164.在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性示例包括一种或多种聚集抑制剂、一种或多种氧化抑制剂、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。
165.在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含稳定剂，其中所述稳定剂为羧基-/羟基纤维素及其衍生物(诸如hpc、hpc-sl、hpc-l和hpmc)、环糊精、2-甲基硫基乙醇、聚乙二醇(诸如peg 3350)、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯基吡咯烷酮、盐(诸如氯化钠)、含硫的物质，诸如硫代甘油或巯基乙酸。稳定剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定稳定剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
166.在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种表面活性剂，优选一种表面活性剂、至少一种表面活性剂或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指任何由水溶性部分(亲水性)和脂溶性和部分(亲脂性)组成的分子或离子。例如，表面活性剂可选自由阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂组成的组。表面活性剂可单独存在或在聚集体中以约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定表面活性剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
167.在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，诸如例如edta和/或苯甲脒盐酸盐(hcl)。蛋白酶抑制剂可单独存在或在聚集体中以约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
168.在另一个一般方面，本发明涉及一种制备包含如本文所公开的单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，该方法包括将单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载剂组合以获得药物组合物。
169.在另一个一般方面，本发明涉及一种制备包含如本文所公开的car-t或car-nk细胞的药物组合物的方法，该方法包括将car-t或car-nk细胞与药学上可接受的载剂组合以获得药物组合物。
170.使用方法
171.在另一个一般方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用包含具有如本文所公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的car-t细胞和/或car-nk细胞的药物组合物。
172.癌症可以例如选自但不限于前列腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、胆道癌、胆管癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿道上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤、以及非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓细胞性白血病(aml)和其他液体肿瘤。
173.根据本发明的实施方案，包含car-t细胞或car-nk细胞和/或双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物包含治疗有效量的如本文所公开的表达的car和双特异性抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物学或药物学响应的活性成分或组分的量。治疗有效量可相对于指定目的根据经验并以常规方式进行确定。
174.如本文相对于car和双特异性抗体所用，治疗有效量意指在转导的t细胞或nk细胞中结合双特异性抗体或其抗原结合片段表达的car分子的量，其在有需要的受试者中调节免疫应答。另外，如本文相对于car所用，治疗有效量意指在转导的t细胞或nk细胞中结合双特异性抗体或其抗原结合片段表达的car分子的量，其导致疾病、障碍或病症的治疗；预防或减缓疾病、障碍或病症的发展；或者减轻或完全缓解与疾病、障碍或病症相关联的症状。
175.根据具体实施方案，待治疗的疾病、障碍或病症为癌症，优选地为选自由以下组成的组的癌症：前列腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、胆道癌、胆管癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿道上皮癌、转移性黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤、以及非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、急性淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)、急性髓细胞性白血病(aml)和其他液体肿瘤。
176.根据具体实施方案，治疗有效量是指足以实现以下作用中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减小或改善所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的严重性；(ii)减少所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的持续时间；(iii)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展；(iv)引起所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状消退；(v)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状发展或发作；(vi)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状复发；(vii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的住院时间；(ix)提高患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中所治疗疾病、障碍或病症或与之相关联的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
177.治疗有效量或剂量可根据各种因素，诸如欲被治疗的疾病、障碍或病症、施用方式、目标部位、受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)而变化，不论受试者是人或动物、施用的其他药物，以及是否为预防性或治疗性治疗。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
178.根据特定实施方案，本文所述的组合物被配制成适于施用于受试者的预期途径。例如，本文所述组合物可被配制成适于静脉内、皮下或肌内注射施用。
179.本发明的细胞可以本领域的技术人员已知的任何便利的方式施用。例如，本发明的细胞可通过气溶胶吸入、注射、摄取、输注、植入和/或移植而施用于受试者。包含本发明的细胞的组合物可以经动脉、皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、胸膜内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内施用。在某些实施方案中，本发明的细胞可以与或不与受试者的淋巴细胞清除(lymphodepletion)一起施用。
180.包含表达如本文所公开的car的细胞的药物组合物可以无菌液体制剂(通常是具有细胞悬浮液的等渗水溶液)或者任选地作为乳液、分散体等(其通常被缓冲至选定的ph)
提供。组合物可包含适合于细胞的完整性和活力以及适合于细胞组合物的施用的载剂，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水等。
181.无菌可注射溶液可通过根据需要将本发明的细胞与各种其他成分一起掺入合适量的适当溶剂中来制备。此类组合物可包含适合与细胞组合物一起使用并施用于受试者诸如人的药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂，诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等。用于提供细胞组合物的合适缓冲剂是本领域众所周知的。所用的任何媒介物、稀释剂或添加剂与保存本发明的细胞的完整性和活力相容。
182.本发明的细胞可以在任何生理上可接受的媒介物中施用。包含本发明的细胞的细胞群可包括纯化的细胞群。本领域的技术人员可以使用各种众所周知的方法容易地确定细胞群中的细胞。包含本发明的经基因修饰的细胞的细胞群的纯度范围可为约50％至约55％、约55％至约60％、约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、或约95％至约100％。本领域的技术人员可以容易地调节剂量，例如，纯度的降低可能需要增加剂量。
183.本发明的细胞通常以基于施用细胞的受试者的每千克体重的细胞数(细胞/kg)的剂量施用。一般来讲，细胞剂量在约104个细胞/kg体重至约10
10
个细胞/kg体重，例如约105个细胞/kg体重至约109个细胞/kg体重、约105个细胞/kg体重至约108个细胞/kg体重、约105个细胞/kg体重至约107个细胞/kg体重、或约105个细胞/kg体重至约106个细胞/kg体重的范围内，具体取决于施用的模式和位置。一般来讲，就全身施用而言，使用比区域施用更高的剂量，其中本发明的免疫细胞施用于肿瘤和/或癌症区域中。示例性剂量范围包括但不限于1
×
104个细胞/kg至1
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108个细胞/kg、2
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104个细胞/kg至1
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108个细胞/kg、3
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104个细胞/kg至1
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104个细胞/kg至1
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108个细胞/kg、5
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108个细胞/kg、7
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104个细胞/kg至1
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108个细胞/kg、8
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108个细胞/kg、9
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104个细胞/kg至1
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108个细胞/kg、1
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105个细胞/kg至1
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108个细胞/kg、1
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105个细胞/kg至9
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107个细胞/kg、1
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105个细胞/kg至8
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107个细胞/kg、1
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105个细胞/kg至7
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107个细胞/kg、1
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105个细胞/kg至6
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105个细胞/kg至5
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107个细胞/kg、1
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107个细胞/kg、1
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105个细胞/kg至4
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105个细胞/kg至3
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105个细胞/kg至9
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105个细胞/kg至7
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106个细胞/kg、1
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105个细胞/kg至6
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106个细胞/kg、1
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106个细胞/kg、1
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105个细胞/kg至4
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107个细胞/kg、2
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107个细胞/kg、2
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105个细胞/kg至1
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107个细胞/kg、2
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106个细胞/kg、2
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105个细胞/kg至8
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106个细胞/kg、2
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105个细胞/kg至7
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106个细胞/kg、2
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105个细胞/kg至6
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106个细胞/kg、2
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105个细胞/kg至5
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105个细胞/kg至4
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106个细胞/kg、2
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105个细胞/kg至4
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106个细胞/kg、2
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105个细胞/kg至3
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106个细胞/kg、2
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105个细
胞/kg至2
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106个细胞/kg、2
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105个细胞/kg至1
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106个细胞/kg、3
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105个细胞/kg至3
×
106个细胞/kg等。另外，可调节剂量以说明是施用单剂量还是施用多剂量。被认为是有效剂量的精确确定可以基于每个受试者的个体因素。
184.如本文所用，术语“处理”和“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)均旨在是指与癌症有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受试者中可识别的，但能够在受试者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与疾病、障碍或病症(诸如肿瘤或更优选癌症)相关的一种或多种症状的持续时间。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活提高。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受试者中疾病、障碍或病症的消除。
185.根据具体实施方案，提供了用于治疗癌症的组合物。对于癌症疗法，所提供的组合物可以与另一种治疗组合使用，该另一种治疗包括但不限于化学疗法、抗cd20 mab、抗tim-3mab、抗lag-3mab、抗egfr mab、抗her-2mab、抗cd19 mab、抗cd33 mab、抗cd47 mab、抗cd73 mab、抗dll-3mab、抗apelin mab、抗tip-1mab、抗folr1mab、抗ctla-4mab、抗pd-l1 mab、抗pd-1mab、其他免疫-肿瘤学药物、抗血管生成剂、放射疗法、抗体-药物缀合物(adc)、靶向疗法或其他抗癌药物。
186.根据具体实施方案，在有需要的受试者中治疗癌症的方法包括向受试者施用本发明的car-t细胞和/或car-nk细胞与如本文所公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的组合。
187.如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受试者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受试者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，与此同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。
188.试剂盒
189.在另一个一般方面，本文提供了试剂盒、单位剂量和制品，其包含以下中的任一种：包含编码如本文所述的car的核酸的分离的多核苷酸、如本文所公开的car、如本文所公开的工程化car-t和/或car-nk细胞、如本文所公开的单克隆和/或双特异性抗体或其抗原结合片段、编码如本文所公开的单克隆和/或双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸、包含如本文所公开的分离的多核苷酸或核酸的载体、以及如本文所公开的药物组合物。在某些实施方案中，试剂盒优选地提供其使用说明。
190.在一个具体方面，本文提供了试剂盒，该试剂盒包含(1)包含编码如本文所公开的car的核酸的分离的多核苷酸，以及(2)如本文所公开的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段。
191.在另一个具体方面，本文提供了试剂盒，该试剂盒包含(1)如本文所公开的分离的car-t和/或car-nk细胞，以及(2)如本文所公开的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段。
192.在另一个具体方面，本文提供了试剂盒，该试剂盒包含(1)包含编码如本文所公开的car的核酸的分离的多核苷酸，以及(2)编码如本文所公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
193.在另一个具体方面，本文提供了试剂盒，该试剂盒包含(1)如本文所公开的分离的car-t和/或car-nk细胞，以及(2)编码如本文所公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
194.在另一个具体方面，本文提供了包含药物组合物的试剂盒，该药物组合物包含药学上可接受的载剂以及(1)包含编码如本文所公开的car的核酸的分离的多核苷酸，或如本文所公开的分离的car-t和/或car-nk细胞；以及(2)分离的双特异性抗体或其抗原结合片段或者编码该双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
195.实施方案
196.本发明还提供了以下非限制性实施方案。
197.实施方案1是一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3：
198.a.分别为seq id no:1、2、3、4、5和6；
199.其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合(g4s)n多肽接头，其中n为至少2。
200.实施方案2是根据实施方案1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与seq id no:7有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区，或者具有与seq id no:8有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
201.实施方案3是根据实施方案1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
202.a.具有seq id no:7的多肽序列的重链可变区，以及具有seq id no:8的多肽序列的轻链可变区。
203.实施方案4是根据实施方案1至3中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的和/或人或人源化的。
204.实施方案5是根据实施方案1至4中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段是单链可变片段(scfv)。
205.实施方案6是根据实施方案5所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述scfv包含选自seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列。
206.实施方案7是一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
207.实施方案8是一种分离的载体，所述分离的载体包含根据实施方案7所述的分离的核酸。
208.实施方案9是一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含根据实施方案8所述的载体。
209.实施方案10是一种分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，所述分离的双特异性抗体或其抗原结合片段包含第一多肽组分和第二多肽组分，其中
id no:27、seq id no:101和seq id no:28、seq id no:102和seq id no:28、seq id no:103和seq id no:98、或者seq id no:104和seq id no:98的氨基酸序列。
227.实施方案18是根据实施方案10所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述非抗原结合scfv包含分别具有seq id no:11、12、13、14、15和16的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1、lcdr2和lcdr3。
228.实施方案19是根据实施方案18所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述非抗原结合scfv包含具有与seq id no:17有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区，以及具有与seq id no:18有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
229.实施方案20是根据实施方案18或19所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述非抗原结合scfv包含具有seq id no:17的氨基酸序列的重链可变区，以及具有seq id no:18的氨基酸序列的轻链可变区。
230.实施方案21是根据实施方案10或18至20中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述(g4s)n接头肽包含选自由seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53、seq id no:54和seq id no:55组成的组的氨基酸序列。
231.实施方案22是根据实施方案21所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述(g4s)n接头肽包含seq id no:45的氨基酸序列。
232.实施方案23是一种分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码根据实施方案10至22中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段。
233.实施方案24是一种分离的载体，所述分离的载体包含根据实施方案23所述的分离的核酸序列。
234.实施方案25是一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含根据实施方案24所述的分离的载体。
235.实施方案26是一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸，其中所述car包含：
236.a.胞外结构域，所述胞外结构域包含(1)非抗原结合单链可变片段(scfv)和(g4s)n多肽接头，或者(2)特异性地结合(g4s)n多肽接头的抗原结合结构域；
237.b.跨膜区；以及
238.c.胞内信号结构域。
239.实施方案27是根据实施方案26所述的分离的多核苷酸，其中所述非抗原结合scfv包含分别具有seq id no:11、12、13、14、15和16的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1、lcdr2和lcdr3。
240.实施方案28是根据实施方案26或27所述的分离的多核苷酸，其中所述非抗原结合scfv包含具有与seq id no:17有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区，以及具有与seq id no:18有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
241.实施方案29是根据实施方案26至28中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述非抗原结合scfv包含具有seq id no:17的氨基酸序列的重链可变区，以及具有seq id no:18的氨基酸序列的轻链可变区。
242.实施方案30是根据实施方案26至29中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述非
抗原结合scfv包含选自seq id no:33或seq id no:34的氨基酸序列。
243.实施方案31是根据实施方案26至30中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述(g4s)n接头肽包含选自由seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53、seq id no:54和seq id no:55组成的组的氨基酸序列。
244.实施方案32是根据实施方案31所述的分离的多核苷酸，其中所述(g4s)n接头肽包含seq id no:45的氨基酸序列。
245.实施方案33是根据实施方案26至32中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述胞外结构域是cd8胞外结构域。
246.实施方案34是根据实施方案33所述的分离的多核苷酸，其中所述cd8胞外结构域包含seq id no:41的氨基酸序列。
247.实施方案35是根据实施方案26至34中任一项所述的分离的多核苷酸，其中跨膜结构域是cd8跨膜结构域。
248.实施方案36是根据实施方案35所述的分离的多核苷酸，其中所述cd8跨膜结构域包含seq id no:42的氨基酸序列。
249.实施方案37是根据实施方案26至36中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述胞内信号结构域包含cd137共刺激结构域和cd3ζ活化结构域。
250.实施方案38是根据实施方案37所述的分离的多核苷酸，其中所述cd137共刺激结构域包含seq id no:43的氨基酸序列，并且所述cd3ζ活化结构域δ包含seq id no:44的氨基酸序列。
251.实施方案39是根据实施方案26至38中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述car包含选自seq id no:39或seq id no:40的氨基酸序列。
252.实施方案40是根据实施方案26所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3：
253.a.分别为seq id no:1、2、3、4、5和6；
254.其中所述抗原结合结构域特异性地结合(g4s)n多肽接头，其中n为至少2。
255.实施方案41是根据实施方案40所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含具有与seq id no:7有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区，或者具有与seq id no:8有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
256.实施方案42是根据实施方案40或41所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域包含：
257.a.具有seq id no:7的多肽序列的重链可变区，以及具有seq id no:8的多肽序列的轻链可变区。
258.实施方案43是根据实施方案40至42中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域是嵌合的和/或人或人源化的。
259.实施方案44是根据实施方案40至43中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scfv)。
260.实施方案45是根据实施方案44所述的分离的多核苷酸，其中所述scfv包含选自
seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列。
261.实施方案46是一种嵌合抗原受体(car)，所述car由根据实施方案26至45中任一项所述的分离的多核苷酸编码。
262.实施方案47是一种分离的载体，所述分离的载体包含根据实施方案26至45中任一项所述的分离的多核苷酸。
263.实施方案48是一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含根据实施方案47所述的分离的载体。
264.实施方案49是根据实施方案48所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是t细胞，优选地人t细胞。
265.实施方案50是根据实施方案48所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是nk细胞，优选地人nk细胞。
266.实施方案51是一种制备嵌合抗原受体(car)-t细胞的方法，所述方法包括在制备car-t细胞的条件下培养包含根据实施方案26至45中任一项所述的分离的多核苷酸的t细胞，以及回收所述car-t细胞。
267.实施方案52是一种制备嵌合抗原受体(car)-nk细胞的方法，所述方法包括在制备car-nk细胞的条件下培养包含根据实施方案26至45中任一项所述的分离的多核苷酸的nk细胞，以及回收所述car-nk细胞。
268.实施方案53是一种制备表达嵌合抗原受体(car)的宿主细胞的方法，所述方法包括用根据实施方案47所述的载体转导t细胞或nk细胞。
269.实施方案54是一种试剂盒，所述试剂盒包含：
270.a.分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸，其中所述car包含：
271.i.胞外结构域，所述胞外结构域包含(1)非抗原结合单链可变片段(scfv)和(g4s)n多肽接头，或者(2)特异性地结合(g4s)n多肽接头的抗原结合结构域；
272.ii.跨膜区；以及
273.iii.胞内信号结构域；以及
274.b.根据实施方案10至22中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段。
275.实施方案55是根据实施方案54所述的试剂盒，其中所述非抗原结合scfv包含分别具有seq id no:11、12、13、14、15和16的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1、lcdr2和lcdr3。
276.实施方案56是根据实施方案54或55所述的试剂盒，其中所述非抗原结合scfv包含具有与seq id no:17有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区，以及具有与seq id no:18有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
277.实施方案57是根据实施方案54至56中任一项所述的试剂盒，其中所述非抗原结合scfv包含具有seq id no:17的氨基酸序列的重链可变区，以及具有seq id no:18的氨基酸序列的轻链可变区。
278.实施方案58是根据实施方案54至57中任一项所述的试剂盒，其中所述非抗原结合scfv包含选自seq id no:33或seq id no:34的氨基酸序列。
279.实施方案59是根据实施方案54至58中任一项所述的试剂盒，其中所述(g4s)n接头
肽包含选自由seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53、seq id no:54和seq id no:55组成的组的氨基酸序列。
280.实施方案60是根据实施方案59所述的试剂盒，其中所述(g4s)n接头肽包含seq id no:45的氨基酸序列。
281.实施方案61是根据实施方案54至60中任一项所述的试剂盒，其中所述car包含选自seq id no:39或seq id no:40的氨基酸序列。
282.实施方案62是根据实施方案54所述的试剂盒，其中所述抗原结合结构域包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3：
283.a.分别为seq id no:1、2、3、4、5和6；
284.其中所述抗原结合结构域特异性地结合(g4s)n多肽接头，其中n为至少2。
285.实施方案63是根据实施方案62所述的试剂盒，其中所述抗原结合结构域包含具有与seq id no:7有至少95％同一性的多肽序列的重链可变区，或者具有与seq id no:8有至少95％同一性的多肽序列的轻链可变区。
286.实施方案64是根据实施方案62或63所述的试剂盒，其中所述抗原结合结构域包含：
287.a.具有seq id no:7的多肽序列的重链可变区，以及具有seq id no:8的多肽序列的轻链可变区。
288.实施方案65是根据实施方案62至64中任一项所述的试剂盒，其中所述抗原结合结构域是嵌合的和/或人或人源化的。
289.实施方案66是根据实施方案62至65中任一项所述的试剂盒，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scfv)。
290.实施方案67是根据实施方案66所述的试剂盒，其中所述scfv包含选自seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列。
291.实施方案68是一种在有需要的受试者中治疗表达肿瘤相关抗原(taa)的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案48所述的分离的宿主细胞以及包含双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂的药物组合物，
292.其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含第一多肽组分和第二多肽组分，其中
293.a.所述第一多肽组分包含(i)特异性地结合(g4s)n多肽接头的第一抗原结合结构域，其中n为至少2，或者(ii)非抗原结合单链可变片段(scfv)和(g4s)n多肽接头，其中n为至少2；并且
294.b.所述第二多肽组分包含第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域特异性地结合肿瘤相关抗原(taa)，优选地人taa。
295.实施方案69是根据实施方案68所述的方法，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段，其中：
296.a.所述第一抗原结合结构域包含分别具有seq id no:1、2、3、4、5和6的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3；并且
297.b.所述第二抗原结合结构域包含重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3。
298.实施方案70是根据实施方案68或69所述的方法，其中所述第二抗原结合结构域特异性地结合前列腺特异性膜抗原(psma)，优选地人psma，或者具有egf样结构域和两个卵泡抑素样结构域2的跨膜蛋白(tmeff2)，优选地人tmeff2。
299.实施方案71是根据实施方案68至70中任一项所述的方法，其中所述第二抗原结合结构域包含具有以下多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区：
300.a.分别为seq id no:19、20、21、22、23和24；或者
301.b.分别为seq id no:92、93、94、95、96和97。
302.实施方案72是根据实施方案68至71中任一项所述的方法，其中：
303.a.所述第一抗原结合结构域包含具有与seq id no:7有至少95％同一性的多肽序列的第一重链可变区，以及具有与seq id no:8有至少95％同一性的多肽序列的第一轻链可变区；并且
304.b.所述第二抗原结合结构域包含具有与seq id no:25或seq idno:90有至少95％同一性的多肽序列的第二重链可变区，以及具有与seq id no:26或seq id no:91有至少95％同一性的多肽序列的第二轻链可变区。
305.实施方案73是根据实施方案68至72中任一项所述的方法，其中：
306.a.所述第一抗原结合结构域包含具有seq id no:7的多肽序列的第一重链可变区，以及具有seq id no:8的多肽序列的第一轻链可变区；并且
307.b.所述第二抗原结合结构域包含具有seq id no:25或seq idno:90的多肽序列的第二重链可变区，以及具有seq id no:26或seq id no:91的多肽序列的第二轻链可变区。
308.实施方案74是根据实施方案68至73所述的方法，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段是嵌合的和/或人或人源化的。
309.实施方案75是根据实施方案68至74中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含选自seq id no:35和seq id no:28、seq id no:36和seq id no:28、seq id no:37和seq id no:27、seq id no:38和seq id no:27、seq id no:101和seq id no:28、seq id no:102和seq id no:28、seq id no:103和seq id no:98、或者seq id no:104和seq id no:98的氨基酸序列。
310.实施方案76是根据实施方案68所述的方法，其中所述非抗原结合scfv包含分别具有seq id no:11、12、13、14、15和16的多肽序列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1、lcdr2和lcdr3。
311.实施方案77是根据实施方案76所述的方法，其中所述非抗原结合scfv包含具有与seq id no:17有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区，以及具有与seq id no:18有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
312.实施方案78是根据实施方案76或77所述的方法，其中所述非抗原结合scfv包含具有seq id no:17的氨基酸序列的重链可变区，以及具有seq id no:18的氨基酸序列的轻链可变区。
313.实施方案79是根据实施方案68或76至78所述的方法，其中所述(g4s)n接头肽包含
选自由seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53、seq id no:54和seq id no:55组成的组的氨基酸序列。
314.实施方案80是根据实施方案79所述的方法，其中所述(g4s)n接头肽包含seq id no:45的氨基酸序列。
315.实施例
316.实施例1：普遍识别的嵌合抗原受体(car)结构域的开发
317.材料和方法
318.双特异性克隆
319.生成靶向两种不同前列腺癌抗原的双特异性单抗：(a)抗g4s x抗psma，以及(b)抗g4s x抗tmeff2。合成含有抗g4s scfv或抗psma scfv或抗tmeff2 scfv序列的dna gblock。使用infusion方法(clontech(takara)；mountain view,ca)将设计的重链分子合成为在5'和3'末端包含15bp重叠的gblock(idt；coralville,ia)以用于连接独立克隆。将所有轻链构建体插入含有bswii和hindiii限制性位点的plonza载体中以用于框内连接到人κ恒定结构域。编码人cd4信号肽以允许mab有效分泌到培养上清液中。根据制造商方案，将所有gblock在无菌水中重构并在50℃处温育10分钟。将plonza载体(lonza；basel,switzerland)使用ecori和hindiii线性化，之后进行凝胶提取和纯化。使用2:1质量比的线性化载体与插入序列，之后在50℃处热脉冲15分钟。将infusion反应物转化到stellar感受态细胞(clontech)中，并将所得菌落刮下以用于小量制备。使用无内毒素大量提取制备试剂盒(qiagen；hilden,germany)对所有构建体进行序列验证和放大。
320.car-t克隆、慢病毒产生和car-t生成
321.用于car-t构建体的h3-23/l1-39(一种种系scfv(teplyakov等人，mabs 8:1045-63(2016)))被设计成包含对应于慢病毒载体中的ecori和spei限制性位点的5'和3'重叠。将所设计的dna插入序列针对人类进行密码子优化并在idt处合成。使用上述infusion方法进行构建体的克隆。在转染前对所有构建体进行序列确认。
322.生成抗g4s接头的scfv。将包含cd8α链信号序列、scfv序列、cd8α铰链和跨膜结构域、4-1bb和cd3ξ结构域的经人密码子优化的dna克隆到慢病毒载体中。为了制备高滴度复制缺陷型慢病毒载体，使用脂质体2000(invitrogen；carlsbad,ca)用pvsv-g、prsv.rev、pmdlg和含car的慢病毒载体转染293t人胚肾细胞。在转染后24小时和48小时时收获病毒上清液。使用lenti-x浓缩器(takara；mountain view,ca)浓缩病毒颗粒。将浓缩的病毒颗粒重悬于pbs中，并在-80℃处冷冻储存。原代人cd4+和cd8+ t细胞是在白细胞去除术后通过负选择从健康志愿者供体分离的，并且购自hemacare。将t细胞在完全培养基(补充有10％热灭活胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素、10mm hepes的rpmi 1640)中培养，用抗-cd3和抗-cd28 mab包被的珠粒(invitrogen)刺激。活化24小时后，用慢病毒载体以约5-10的moi转导t细胞。每隔一天添加一次人重组白介素-2(il-2；peprotech；rocky hill,nj)至最终浓度为50iu/ml，并且维持0.5-1
×
106个细胞/ml的细胞密度。使用抗g4s接头的mab作为初级染色，pe标记的抗人fc抗体作为次级染色，通过流式细胞术验证car表面表达。
323.表达
324.使用expicho哺乳动物表达系统进行蛋白质表达(invitrogen；carlsbad,ca)。为
了确保成熟蛋白质中正确的轻链负载，使用3:1的轻链:重链dna比率。使细胞生长至6x106个细胞/ml的密度并在转染前分裂。双特异性和单特异性抗体通过轻链和重链的共转染来表达和产生(如表2所示)。将dna混合物与expifectamine一起温育并立即添加到培养物中。通过以3000g离心10分钟收集expicho悬浮培养物以沉淀细胞。使用0.22μm膜过滤上清液以去除残留的细胞颗粒。将roche complete蛋白酶抑制剂添加到上清液中以使蛋白降解最小化。将上清液储存在4℃处，直至纯化。
325.表2：制备双特异性和单特异性抗体所需的序列
[0326][0327]
重组蛋白的纯化
[0328]
将5ml hitrap mabselect sure(ge healthcare；chicago,il)柱在pbs ph 7.4中平衡。将上清液以1ml/min的流速施加到柱上以进行最大捕获。使用20倍柱体积的pbs洗涤柱，直到获得如通过uv a
280
监测的清洁基线。用10倍柱体积的100mm柠檬酸钠(ph 3.5)进行等度洗脱。将洗脱的蛋白质分级分离并使用a
280
处的吸光度确定浓度。使用非变性和变性sds page凝胶(biorad；hercules,ca)测试级分中重组蛋白的存在并合并。通过sds page分析认为以这种方式纯化的蛋白质纯度》95％，并将其储存在4℃处，直至使用。
[0329]
人t细胞培养和电穿孔
[0330]
从健康供体的外周血单核细胞(pbmc)中分离人pant细胞，并在含有10％fcs、2mm glutamax、1mm丙酮酸钠、55μmβ-巯基乙醇和100u青霉素/链霉素的完全t细胞培养基/rpmi培养基中进行培养。
[0331]
按照制造商方案(thermofisher；waltham,ma)，使用抗-cd3/cd28的磁性dynabead离体扩增pant细胞约12-14天。将这些细胞以1
×
106个细胞/小瓶冷冻并储存在液氮中。
[0332]
在电穿孔之前，用10ng/ml重组人il-2通过dynabead预活化t细胞24小时。将5-10
×
106个t细胞重悬于20μl原代细胞核转染溶液(p3原代细胞4d-nucleofector试剂盒)中。将t细胞与10μg ivt rna混合并转移到nucleofection比色杯。使用用于活化的人t细胞的程序eo105，使用4dnucleofector(lonza)对细胞进行电穿孔。电穿孔后，使用制备的t细胞培养基将转染的细胞转移到96孔板中并继续培养3-4天。
[0333]
t细胞活化和细胞因子谱分析
[0334]
使用t细胞活化细胞和细胞因子谱分析试剂盒进行tca的高通量测定(t细胞活化测定)以鉴定t细胞亚群并测量t细胞活化和细胞因子分泌。简言之，将肿瘤细胞系pc3 m11在96孔板中进行培养(1x104个细胞/孔)。次日以5x104个细胞的浓度添加car-t细胞(e:t＝5:1)。将双特异性分子添加到共培养孔中，最终浓度为5μm。将细胞共培养32小时。共培养结束时，将细胞洗涤一次，并且用抗cd69和cd25以及hla-dr的抗体染色。另外，定量分泌的细
胞因子的水平，包括ifn-γ、tnfα、il-2、il-6、il-17、il-13、il-10和gm-csf。在intellicyt ique plus上获得数据，并且使用t细胞活化试剂盒数据模板用forecyt软件进行分析。
[0335]
elisa
[0336]
将maxisorb 96板(nunc；roskilde,denmark)用0.1μg/ml浓度的抗原包被并在4℃处温育过夜。将板用pbs洗涤3次，并用pbs加5％奶粉在室温处封闭1小时。用pbs洗涤板3次。在pbs中制备起始浓度为100nm的cen-63-13mab和对照mab的连续稀释液(1:3)，并添加到板的孔中，室温温育90分钟。用pbs洗涤板3次。在洗涤步骤后，添加100μl1:10000山羊抗人fc辣根过氧化物酶检测抗体并在室温处温育1小时。用pbs洗涤板3次，并且以1:100稀释度添加100μl tmb底物(1步tmb，thermo fisher)。在(spectramax m5，molecular devices；san jose,ca)上测量450nm处的光密度。在graphpad prism软件(graphpad)中分析数据。
[0337]
含g4s肽的scfv的流式细胞术荧光检测
[0338]
将hek293-t细胞在含有(杜尔贝科改良伊格尔培养基组分，包括葡萄糖、l-谷氨酰胺、nahco3和酚红)的标准dmem中进行培养。按照制造商方案(messengermax，invitrogen)用含有scfv蛋白构建体的接头的mrna转染细胞。将5μg ivt合成的mrna以1
×
106个细胞/ml的密度转染到hek293-t细胞中，并且在流式细胞术分析之前温育24小时。将细胞以100,000个细胞/孔的浓度添加到96孔u形底板中。将板以300g离心3分钟，弃去上清液。将sytox green(invitrogen)live/dead染色剂添加到细胞中，并在室温处在暗室中温育10分钟。用pbs洗涤细胞两次，弃去上清液。制备起始浓度为100nm的一抗的12点1:3连续稀释液。将稀释系列添加到细胞中并在4℃处在黑暗中温育1小时。将板以300g离心3分钟，弃去上清液，并且用facs运行缓冲液(becton dickinson(bd),franklin lakes,nj)洗涤细胞两次。根据制造商方案，将二抗(抗人fc，biolegend；san diego,ca)在facs缓冲液中进行稀释。将50μl二抗添加到细胞中并在4℃处在黑暗中温育30分钟。然后用facs缓冲液洗涤细胞两次，弃去上清液，然后在50μl facs缓冲液中重构。使用intellicyt ique screener plus(sartorius)检测抗g4s抗体的细胞表面结合。使用forecyt软件(sartorius；gottingen,germany)进行数据处理。使用graphpad prism7软件(graphpad)生成剂量反应结合曲线。
[0339]
通过生物层干涉测量法测定结合表位
[0340]
使用fortebiooctet red384系统(pall corporation；port washington,ny)测量生物素化g4s肽与兔抗-(g4s)4接头抗体之间的结合动力学。将生物素化g4s肽(wt，对照或截短肽)固定在链霉亲和素传感器上，并根据制造商的说明测试兔抗-(g4s)4接头抗体与传感器固定的g4s肽的结合。通过波长(nm)的偏移测量缔合和解离速率，并且通过将数据拟合至1:1结合模型来获得kd(平衡解离常数)。所有反应均在25℃处在1x动力学缓冲液(fortebio；fremont,ca)中进行。用octet数据采集程序(fortebio)收集数据，并使用octet数据分析程序(fortebio)进行分析。
[0341]
car-t细胞cd107a测定和增殖测定
[0342]
对于cd107a测定，将car-t细胞与pc3前列腺肿瘤细胞在96孔板中以等于5:1的效应物与靶标比率(e:t)在存在或不存在抗psma x抗g4s bsab(5mg/ml)的情况下进行共培养。在添加golgi stop(bd bioscience；san jose,ca)前1小时添加藻红蛋白标记的抗cd107a抗体，并且将平板温育3小时。添加抗cd8抗体并在37℃处温育30分钟。温育后，将样品洗涤一次并进行流式细胞术分析。通过flowjo软件分析数据。对于t细胞增殖测定，根据
制造商方案用5mm cfse(invitrogen)预标记car-t细胞。将car-t细胞与pc3前列腺肿瘤细胞以1:1的效应细胞与靶细胞比率(e:t比率)在96孔圆底板中在200μl rpmi完全培养基中共培养。添加抗-psma x抗g4s的bsab(5mg/ml)。温育3天后，将t细胞用抗cd3 mab染色并分析cfse分布。
[0343]
通过xcelligence测定细胞毒性
[0344]
在实时细胞分析仪xcelligence(roche；basel,swizterland)中使用贴壁肿瘤细胞系作为靶细胞测量细胞毒性。所有实验均使用相应的靶细胞培养基进行。将50μl培养基添加到e-plates 96(roche,grenzach-wyhlen,germany)中以测量背景值。实验中使用的靶细胞包括pc3m11和c4-2b和lncap肿瘤细胞系。将靶细胞以约10,000个细胞/孔的密度接种在另外的100μl培养基中。通过先前的滴定实验确定合适的细胞密度。使用rtca sp(roche)仪器和rtca软件1.1版(roche)监测细胞附着，直至达到平台期。
[0345]
以20:1至1:1范围内的不同效应物与靶标比率(e:t)添加car-t细胞，或者以0.2mg/ml至20mg/ml范围内的浓度添加各种剂量的bsab。添加效应细胞后，每15分钟进行一次阻抗测量，持续长达81小时。所有实验一式三份进行。电阻抗的变化表示为无量纲细胞指数(ci)值，其由对应于电极传感器的细胞覆盖的相对阻抗变化得到，归一化为仅具有培养基的基线阻抗值。为了分析所获得的数据，导出ci值，并计算与缺乏任何效应t细胞的对照细胞相关的溶解百分比。使用简单的公式容易地计算细胞溶解的百分比：细胞溶解百分比＝((细胞指数-细胞指数)/细胞指数)
×
100。
[0346]
还通过使用incucyte缩放活细胞成像系统测试表达car的t细胞的细胞毒性。共培养与上述xcelligence测定的设置相同。每30分钟获取一次图像并定量死细胞的数目。
[0347]
细胞因子测定(intellicyt ique)
[0348]
将intellicyt人t细胞活化和细胞因子谱分析试剂盒用于t细胞活化和细胞因子谱。简言之，将car-t细胞与pc3前列腺肿瘤细胞以1:1的效应细胞与靶细胞比率(e:t比率)在96孔圆底板中在200μl rpmi完全培养基中共培养。添加抗-psma x抗g4s的bsab(5mg/ml)。使用不含bsab的共培养物作为对照。24小时后，按照方案用tca试剂盒由30μl细胞/上清液混合物样品评估t细胞活化。在intellicyt ique screener plus上采集样品。使用标准曲线定量分泌的细胞因子的水平。用forecyt软件分析数据。
[0349]
结果
[0350]
为了开发模块化t细胞疗法，设计了含有将被抗体普遍识别的肽的car茎。选择(g4s)4(seq id no:45)接头肽是因为其相对良好的生物物理特性。为了获得抗g4s的单克隆抗体，用g4s肽使兔免疫。产生免疫应答后，收集这些兔的脾。进行重链和轻链可变区的v基因回收。在具有人κ轻链的人igg1主链上表达v区后进行1步亲和色谱法。elisa和流式细胞术测定证实了一种单克隆抗体cen-63-13，其以0.57nm的解离常数免疫特异性地结合g4s接头(图2和图3)。
[0351]
将cen-63-13可变区重新格式化为可变重链/接头/可变轻链(hl)(seq id no:29)取向和可变轻链/接头/可变重链(lh)(seq id no:30)取向两者的单链可变片段(scfv)。使用先前发现的针对psma的可变区序列(克隆id：ps3b35)(chang等人，cancer res.59(13):3192-8(1999))，设计了四(4)种不同的morrison骨架双特异性抗体构建体(图5)(表2)。为了测试重新格式化的scfv的表达和稳定性，设计了具有抗psma fab结构域的morrison构建
体，其中hl和lh scfv(分别为seq id no:31和32)两者与huigg1的c末端融合。使用9个氨基酸的接头(gag)3(seq id no:56)作为scfv与fc区之间的连接物。接着，设计了cen-63-13可变区fab，其中抗psma scfv在hl取向和lh取向两者上与人igg1的c末端融合。这些构建体中的每一者在悬浮cho表达系统中表达，并通过1步亲和色谱法纯化。cen-63-13和ps3b35抗体的互补决定区(cdr)提供于表4中。利用如上所述的类似策略，类似的双特异性导管抗体来源于作为另一种前列腺癌taa的肿瘤相关抗原(taa)，即具有egf样结构域和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白(tmeff2)。
[0352]
利用g4s肽的构建体确定cen-63-13可变区的最佳结合表位。通过生物层干涉测量法测定一组截短的肽。从wt g4s接头(seq id no:45)缺失多达8个氨基酸(seq id no:46-53)的肽仅显示结合亲和力降低2倍。与wt相比结合亲和力降低6倍的10聚体肽(seq id no:55)代表可通过cen-63-13检测到的最小接头(图4)。表3示出了使用生物层干涉测量法测定的cen-63-13与蛋白质和肽抗原结合的kd值。
[0353]
表3：cen-63-13与(g4s)4肽和具有(g4s)4肽接头的非抗原结合h3-23/l1-39 scfv结合的kd值。
[0354]
抗接头ab抗原kdcen-63-13具有(g4s)4肽接头的h3-23/l1-39 scfv8.1nmcen-63-13(g4s)4肽3.6nm
[0355]
为了使用导管双特异性抗体将t细胞引导到肿瘤细胞，将g4s肽接头(seq id no:45)工程化到第2代car茎(seq id no:39和seq id no:40)中的“惰性”scfv(seq id no:33和34)中。
[0356]
生成经慢病毒转染的pan-t细胞以及用编码car的mrna转染的pan-t细胞两者。胞外(g4s)4scfv接头可利用人cen-63-13抗体和pe标记的抗人二抗经由流式细胞仪分析来检测(图6c)。除了结合含有(g4s)4的同种型car之外，还证实了与pan-t细胞的结合，所述pan-t细胞已通过表达具有(g4s)3接头和n-末端myc标记的抗-cd19 car的慢病毒进行转导。将cen-63-13与myc阳性car-t细胞共染色(图6d)。
[0357]
t细胞也用编码car茎的dna进行转染。与仅t细胞相比，观察到cd69表达增加3倍，表明car-t细胞的活化(图7a至图7d)。
[0358]
随后检测双特异性抗体(bsab)的存在是否影响表达同种型scfv的car-t细胞中的car表面表达。分离培养的car-t细胞，向培养的car-t细胞中添加bsab(5μg/ml)，而对照孔中不添加抗体。然后充分洗涤细胞并在24小时时观察car表面表达。如图9a所示，与bsab一起温育未改变car的表面表达水平。
[0359]
由于与单独的bsab一起温育未改变car增殖或表面表达，接下来检测除双特异性分子外添加肿瘤细胞是否可诱导增殖。比较在存在或不存在bsab的情况下cfse-标记的t细胞与表达psma的肿瘤细胞的增殖。当将双特异性抗体添加到共培养物中时，证实了t细胞的增殖(在两个供体中观察到)(图9b)。值得注意的是，在不存在bsab的情况下观察到一些增殖，但这可能是由于与肿瘤细胞的同种异体反应。
[0360]
cd107a是cd8+活化、脱粒和细胞溶解功能的有效生物标志物。使用同种型car-t细胞，确定靶向g4s接头和psma的双特异性抗体的存在是否可在psma+肿瘤细胞的存在下活化car-t细胞。将同种型car-t细胞与表达psma的肿瘤细胞在存在或不存在bsab(5μg/ml)的情
况下共培养。共培养5小时后，仅在bsab的存在下在总细胞群中观察到cd107a表达增加，表明脱粒响应于bsab的添加而发生(图9c)。使用cen-63-13抗体检测含g4s的car-t细胞(洗涤后)。对于两个cd8+细胞群体(car+cd8+和car-cd8+)，比较cd107a表达。如图9c所示，在bsab的存在下，car+cd8+细胞富集了cd107a表达(高达全部的21.2％)，而在不存在bsab的情况下，在两个car+群体(无bsab)中观察到cd107a的水平低得多。此外，在存在和不存在bsab的情况下，在cd8+car-细胞群中检测不到cd107a表达。这些结果证明在bsab的存在下cd107a表达的增加主要由cd8+car+细胞引起。
[0361]
接着在bsab的存在下检测携带同种型scfv的car-t细胞溶解肿瘤细胞的能力。首先，利用靶向psma和g4s的双特异性抗体作为导管或衔接分子。抗psma bsab1含有cen-63-13fab臂，其中抗psma scfv附于重链c-末端。抗psma bsab2使用反向取向，具有抗psma fab臂和c-末端cen-63-13scfv。当在同种型car-t细胞和psma+pc3细胞(e:t比率＝5:1)的存在下滴定这些抗psma x抗g4s bsab时，使用xcelligence监测在97小时的时间过程中观察到肿瘤细胞溶解(图10a)。在缺乏bsab的孔中，肿瘤生长持续不减弱。同种型car-t细胞在任一bsab的存在下介导肿瘤特异性溶解。
[0362]
在单独的实验中，car-t:pc3细胞的e:t比率在固定的bsab浓度(5μg/ml)下变化。这些结果表明同种型car-t bsab特异性杀伤随e:t比率而变化，类似于传统car-t测定(图10b)。使用含有抗tmeff2fab臂的抗tmeff2双特异性抗体观察到类似的结果，其中cen-63-13scfv附于重链c-末端。在这种情况下，同种型car-t细胞被证明在bsab的存在下杀死源自lncap前列腺的肿瘤细胞(图10c)。
[0363]
已证明导管car-t细胞在双特异性抗体的存在下的细胞毒性潜力，接下来定量通常在car-t活化时观察到的细胞因子是否也在bsab的存在下产生。通过intellicyt ique测量定量car-t细胞产生的ifnγ、il-6和gm-csf水平。将car-t细胞与肿瘤细胞以5:1的e:t比率进行共培养，并且双特异性分子以5μm的最终浓度添加。双特异性分子的添加显著增加了在靶细胞的存在下car-t细胞的细胞因子产生(图10d)。观察到干扰素γ(ifnγ)水平在bsab1的存在下约为两倍，在bsab2的存在下约为三倍。粒细胞集落刺激因子(gm-csf)水平类似地增加(与单独的car-t和pc3相比)。白介素-6(il-6)水平在bsab2的存在下显著增加，但在bsab1的存在下未显著增加。
[0364]
与对照相比，细胞因子表达的这些增加表明导管双特异性能够将t细胞特异性地引导到肿瘤细胞，导致t细胞活化。惰性scfv、h3-23/l1-39的cdr提供于表4中。
[0365]
表4：cdr序列
[0366]
[0367]
导管双特异性方法的肿瘤特异性细胞毒性使用基于阻抗的细胞活力测定来证明。将肿瘤细胞粘附到导电板并随时间推移测量阻抗。当未添加t细胞时，肿瘤细胞群呈指数增加。在t细胞和导管双特异性抗体两者的存在下，观察到各种效应t细胞与靶标比率的有效t细胞介导的细胞毒性。
[0368]
这些结果一起表明，导管双特异性方法可以将car-t细胞引导到表达肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞。这些car-t细胞显示出典型细胞表面活化标志物和细胞因子表达的增加。
[0369]
本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖在本发明实质和范围内的修改，如本说明书所定义。