羰基还原酶、编码该酶的核酸、以及利用它们的光学活性化合物的制造方法与流程

1.本发明涉及具有将含羰基化合物还原而转化为作为药品、农药等的中间体原料在产业上有用的化合物即光学活性化合物的活性的羰基还原酶、编码该羰基还原酶的核酸、含有该核酸的重组载体、含有该重组载体的转化体，还涉及使用该羰基还原酶等的光学活性化合物的制造方法。


背景技术：

2.瑞舒伐他汀、匹伐他汀、阿伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀等他汀类化合物或其盐为hmg-coa还原酶抑制剂，在高胆固醇血症、混合型高脂血症等的治疗中有用。近年来，由于仿制药已经上市，期望更价格低廉地工业化制造使用这些他汀类化合物或其盐的药品的方法
3.这些他汀类化合物为具有如下结构的光学活性醇类或其盐。
[0004][0005]
已知利用有机合成方法或生物化学方法来立体选择性地还原具有如下的羰基连续存在的结构的含羰基化合物而进行制造的方法。
[0006][0007]
例如，专利文献1中记载了通过使特定的羰基还原酶(以下有时称为“ocr1”)作用于含羰基化合物而以高光学纯度和高浓度制造光学活性醇等光学活性化合物的方法。专利文献2中记载了使用ocr1制造瑞舒伐他汀钙的方法，专利文献3中记载了使用ocr1制造匹伐他汀钙的方法。
[0008]
在此，ocrl的热稳定性差，反应时(加热时)酶的稳定性下降，因而需要使用大量的ocr1，因此，以提高ocr1的热稳定性为目的进行了突变体的研究(非专利文献1)。
[0009]
但是，为了以高纯度、高光学纯度并且价格低廉地工业化制造作为药品、农药等的中间体原料有用的光学活性化合物、特别是他汀类化合物，期望进一步提高ocr1的性能。
[0010]
现有技术文献
[0011]
专利文献
[0012]
专利文献1：日本专利第4270918号
[0013]
专利文献2：国际公开第2015/119261号
[0014]
专利文献3：国际公开第2017/022846号
[0015]
非专利文献
[0016]
非专利文献1：journal of bioscience and bioengineering，vol.123 no.6，673-678，2017


技术实现要素：

[0017]
发明所要解决的问题
[0018]
本发明要解决的问题在于，开发羰基还原活性、热稳定性、立体选择性、光学选择性等高于ocr1的羰基还原酶。另外，本发明要解决的问题在于，通过使用该羰基还原酶，以高纯度、高光学纯度并且价格低廉地工业化地得到光学活性化合物。
[0019]
用于解决问题的方法
[0020]
本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现，通过将ocr1的特定氨基酸置换为特定的其它氨基酸，能得到羰基还原活性、热稳定性、立体选择性、光学选择性等高的羰基还原酶，从而完成了本发明。还发现，通过使用该羰基还原酶，能够以高纯度、高光学纯度并且价格低廉地工业化地得到光学活性化合物，从而完成了本发明。
[0021]
即，本发明的主旨如下。
[0022]
[1]一种羰基还原酶，其具有由在序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的同源物中具有选自由以下的(a)～(f)组成的组中的至少1个突变的氨基酸序列构成的多肽，
[0023]
(a)序列号1的氨基酸序列中的第54位的天冬氨酸被置换为缬氨酸的突变，
[0024]
(b)序列号1的氨基酸序列中的第157位的甲硫氨酸被置换为缬氨酸的突变，
[0025]
(c)序列号1的氨基酸序列中的第170位的丙氨酸被置换为丝氨酸的突变，
[0026]
(d)序列号1的氨基酸序列中的第211位的异亮氨酸被置换为丙氨酸或天冬酰胺的突变，
[0027]
(e)序列号1的氨基酸序列中的第214位的甲硫氨酸被置换为亮氨酸的突变，
[0028]
(f)序列号1的氨基酸序列中的第249位的甲硫氨酸被置换为亮氨酸的突变。
[0029]
[2]根据[1]所述的羰基还原酶，其特征在于，具有选自由上述(a)～(f)组成的组中的至少2个突变。
[0030]
[3]根据[1]或[2]所述的羰基还原酶，其具有由在序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的同源物中进一步具有(g)序列号1的氨基酸序列中的第166位的缬氨酸被置换为亮氨酸的突变的氨基酸序列构成的多肽。
[0031]
[4]通式(iv)所示的光学活性化合物的制造方法，其特征在于，通过使选自由通式(i)、(ii)和(iii)所示的化合物组成的组中的含羰基化合物与[1]～[3]中任一项所述的羰基还原酶、具有生产上述酶的能力的微生物或细胞、上述微生物或细胞的处理物、和/或含有培养上述微生物或细胞而得到的上述酶的培养液接触，使含羰基化合物发生不对称还原，
[0032][0033]
(上述式(i)、(ii)和(iii)中，r表示氢原子、烷基或芳基，表示具有芳香族环和/或杂环的取代基)
[0034][0035]
(式(iv)中，r和与前述含义相同)。
[0036]
[5]根据[4]所述的制造方法，其特征在于，上述式(ii)和上述式(iii)所示的含羰基化合物分别为下述式(ii’)和下述式(iii’)所示的光学活性体，
[0037][0038]
(式中，r和与前述含义相同)
[0039]
[0040]
(式中，r和与上述含义相同)。
[0041]
[6]根据[4]或[5]所述的制造方法，其中，取代基为
[0042]
(式中，表示具有芳香族环和/或杂环的取代基)、
[0043][0044][0045]
[7]根据[6]所述的制造方法，其中，取代基为
[0046][0047]
[8]根据[4]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，上述微生物或细胞为用编码[1]～[3]中任一项所述的羰基还原酶的核酸进行了转化的微生物或细胞，所述核酸含有以
下的(p)、(q)或(r)所示的碱基序列，
[0048]
(p)具有在序列号2所示的碱基序列中置换、缺失和/或添加1个～多个碱基而成的碱基序列且编码具有羰基还原酶活性的多肽的碱基序列，
[0049]
(q)具有与序列号2所示的碱基序列具有90％以上的序列一致性的碱基序列且编码具有羰基还原酶活性的多肽的碱基序列，
[0050]
(r)具有与序列号2所示的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的碱基序列且编码具有羰基还原酶活性的多肽的碱基序列。
[0051]
需要说明的是，本说明书中，有时将取代基称为“取代基a”，将取代基称为“取代基b”。
[0052]
发明效果
[0053]
根据本发明，可以提供具有将含羰基化合物还原而转化为作为药品、农药等的中间体原料在产业上有用的化合物即光学活性化合物的活性的羰基还原酶、编码该羰基还原酶的核酸、含有该核酸的重组载体、含有该重组载体的转化体。而且，根据本发明，可以提供以高纯度、高光学纯度并且价格低廉地工业化地得到作为药物、农药等的中间体原料在产业上有用的光学活性化合物的制造方法。
具体实施方式
[0054]
以下详细说明本发明。
[0055]
1.本发明的羰基还原酶
[0056]
本发明的羰基还原酶具有由在序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的同源物中具有选自由以下的(a)～(f)组成的组中的至少1个突变的氨基酸序列构成的多肽、并且具有羰基还原酶活性。
[0057]
(a)序列号1的氨基酸序列中的第54位的天冬氨酸被置换为缬氨酸的突变
[0058]
(b)序列号1的氨基酸序列中的第157位的甲硫氨酸被置换为缬氨酸的突变
[0059]
(c)序列号1的氨基酸序列中的第170位的丙氨酸被置换为丝氨酸的突变
[0060]
(d)序列号1的氨基酸序列中的第211位的异亮氨酸被置换为丙氨酸或天冬酰胺的突变
[0061]
(e)序列号1的氨基酸序列中的第214位的甲硫氨酸被置换为亮氨酸的突变
[0062]
(f)序列号1的氨基酸序列中的第249位的甲硫氨酸被置换为亮氨酸的突变
[0063]
本发明中，羰基还原酶活性是指将含羰基化合物中的羰基不对称还原而转化为光学活性化合物的活性。是否具有羰基还原酶活性可以通过利用常规试验方法测定将含羰基化合物中的羰基不对称还原而转化为光学活性化合物的活性来判断。例如，使作为测定对象的羰基还原酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物、和/或含有培养该微生物或细胞而得到的上述酶的培养液作用于通式(i)、(ii)或(iii)所示的含羰基化合物，并且直接测定由这些含羰基化合物转化成的通式(iv)所示的化合物的量，由
此可以确认羰基还原酶活性。另外，在含有nadph作为辅酶的测定体系的情况下，可以通过测定nadph初始减少速度来确认羰基还原酶活性。
[0064]
本发明中，序列号1所示的氨基酸序列为日本专利第4270918号中记载的甲醇诱导型酵母非发酵性变种(ogataea minuta var.nonfermentans)nbrc(原ifo)1473来源的氨基酸序列(ocrl)。
[0065]
本发明中，序列号1所示的氨基酸序列的同源物是指具有在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、置换和/或添加1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列并且具有羰基还原酶活性的多肽。
[0066]“1个～多个氨基酸”通常为1个～100个、优选为1个～50个、更优选为1个～20个、进一步优选为1个～10个、特别优选为1个～5个氨基酸。
[0067]
另外，本发明中，序列号1所示的氨基酸序列的同源物是指具有与序列号1所示的氨基酸序列全长具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列并且具有羰基还原酶活性的多肽。优选具有与序列号1所示的氨基酸序列全长具有95％以上、更优选98％以上、进一步优选99％以上的序列一致性的氨基酸序列并且具有羰基还原酶活性的多肽。
[0068]
本说明书中的氨基酸序列的同源性(也称为一致性或相似性)可以使用同源性计算算法ncbi blast(national center for biotechnology information basic local alignment search tool)例如在以下条件(期望值＝10；允许空位；矩阵＝blosum62；过滤＝关)下计算。作为用于确定氨基酸序列的同源性的其它算法，可列举例如karlin等，proc.natl.acad.sci.usa，90：5873-5877(1993)中记载的算法[该算法已整合到nblast和xblast程序(version 2.0)中(altschul等，nucleic acids res.，25：3389-3402(1997))]、needleman等，j.mol.biol.，48：444-453(1970)中记载的算法[该算法已整合到gcg软件包中的gap程序中]、myers和miller，cabios，4：11-17(1988)中记载的算法[该算法已整合到作为cgc序列比对软件包的一部分的align程序(version2.0)中]、pearson等，proc.natl.acad.sci.usa，85：2444-2448(1988)中记载的算法[该算法已整合到gcg软件包中的fasta程序中]等，也可以同样优选使用这些算法。
[0069]
上述序列号1所示的氨基酸序列和该氨基酸序列的同源物可以通过日本专利第4270918号中记载的方法获得。
[0070]
本发明的羰基还原酶由于在序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的同源物中具有(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)突变而具有优良的特性。以下按照(d)、(c)、(f)、(a)、(b)、(e)的顺序对各突变进行说明。
[0071]
(d)突变为序列号1的氨基酸序列中的第211位的异亮氨酸被置换为丙氨酸或天冬酰胺的突变。通过该突变，立体选择性和光学选择性提高。
[0072]
具体而言，选择性还原下述通式(i)或(ii)所示的含羰基化合物的3位羰基的性能提高。因此，能够由通式(i)或(ii)所示的含羰基化合物以高收率、高化学纯度得到通式(iv)所示的光学活性化合物。另外，(d)突变还提高光学选择性，因此，能够由通式(i)、(ii)或(iii)所示的含羰基化合物以高收率、高光学纯度得到通式(iv)所示的光学活性化合物。
[0073][0074]
特别是取代基a为时，选择性还原3位羰基的性能高。
[0075]
因此，例如可以通过下述反应以高收率、高化学纯度和高光学纯度得到下面所示的光学活性化合物。
[0076][0077]
(c)突变为序列号1的氨基酸序列中的第170位的丙氨酸被置换为丝氨酸的突变。通过该突变，热稳定性提高。
[0078]
另外，(f)突变为序列号1的氨基酸序列中的第249位的甲硫氨酸被置换为亮氨酸的突变。通过该突变，热稳定性提高。
[0079]
通过这些突变，即使在加热条件下的还原反应中，羰基还原酶的活性也不下降而
是维持高的酶活性，因此，能够由通式(i)、(ii)或(iii)所示的含羰基化合物以高收率、高化学纯度得到通式(iv)所示的光学活性化合物。另外，存在(c)突变和(f)突变这两个突变时，热稳定性进一步提高，因而优选。
[0080]
(a)突变为序列号1的氨基酸序列中的第54位的天冬氨酸被置换为缬氨酸的突变。通过该突变，立体选择性提高。
[0081]
具体而言，选择性还原上述通式(i)或(ii)所示的含羰基化合物的3位羰基的性能提高，因此，能够以高收率和高化学纯度得到上述通式(iv)所示的光学活性化合物。
[0082]
特别是取代基a为时，对含羰基化合物的反应速度、反应效率提高。
[0083]
因此，例如，通过下述反应，下面所示的光学活性化合物的生成速度、生成效率提高，能够以高收率、高化学纯度和高光学纯度得到该光学活性化合物。
[0084][0085]
(b)突变为序列号1的氨基酸序列中的第157位的甲硫氨酸被置换为缬氨酸的突变。通过该突变，立体选择性和光学选择性提高。
[0086]
另外，(e)突变为序列号1的氨基酸序列中的第214位的甲硫氨酸被置换为亮氨酸的突变。通过该突变，立体选择性和光学选择性提高。
[0087]
在此，使具有序列号1所示的氨基酸序列的羰基还原酶作用于下述通式(i)所示的含羰基化合物时，3位羰基与5位羰基相比优先被还原，因此，下述通式(iii)所示的化合物比下述通式(ii)所示的化合物更多地生成。另外，由所述通式(iii)所示的化合物向下述通式(iv)所示的化合物的反应速度比由所述通式(ii)所示的化合物向所述通式(iv)所示的光学活性化合物的反应速度慢，因此所述通式(iii)所示的化合物有可能会残留。
[0088][0089][0090]
使具有(b)突变和(e)突变的羰基还原酶作用于上述通式(i)所示的含羰基化合物时，3位羰基的还原得到抑制，3位羰基和5位羰基平衡良好地被还原。并且，由上述通式(ii)和(iii)所示的化合物转化为上述通式(iv)所示的光学活性化合物的反应速度、反应效率提高，因此，能够高效地以高收率、高化学纯度得到上述通式(iv)所示的光学活性化合物。
[0091]
特别是取代基a为时，由含羰基化合物转化为光学活性化合物的反应速度、反应效率进一步提高。
[0092]
因此，例如，通过下述反应，下面所示的光学活性化合物的生成速度、生成效率提高，能够以高收率、高化学纯度和高光学纯度得到该光学活性化合物。
[0093][0094]
另外，存在(b)突变和(e)突变这两个突变时，对含羰基化合物的反应效率也提高，因此更优选。
[0095]
本发明的羰基还原酶为具有由在序列号1所示的氨基酸序列或作为该氨基酸序列的同源物的具有羰基还原酶活性的氨基酸序列中具有选自由上述(a)～(f)组成的组中的
至少1个突变的氨基酸序列构成的多肽的羰基还原酶。(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)突变中，可以根据作为目标的上述式(iv)所示的光学活性化合物的种类来适当选择1个以上突变，优选具有选自由(a)～(f)组成的组中的至少2个突变，进一步优选具有至少3个突变。
[0096]
另外，本发明的羰基还原酶可以具有(g)突变。(g)突变为非专利文献1中记载的突变，是序列号1的氨基酸序列中的第166位的缬氨酸被置换为亮氨酸的突变。通过该突变，羰基还原酶的热稳定性提高。
[0097]
本发明的羰基还原酶可以由序列号1所示的氨基酸序列或作为该氨基酸序列的同源物的具有羰基还原酶活性的氨基酸序列通过本领域技术人员公知的方法、例如定点诱变法、pcr法等众所周知的技术来制造。
[0098]
另外，本发明的羰基还原酶也可以通过培养含有编码该酶的核酸的转化体、从得到的培养物中分离纯化该羰基还原酶来制造。编码本发明的羰基还原酶的核酸既可以是dna也可以是rna，或者可以为dna/rna嵌合体。优选列举dna。另外，该核酸既可以为双链也可以为单链。为双链时，可以为双链dna、双链rna或dna：rna的杂交体。为单链时，既可以为有义链(即，编码链)，也可以为反义链(即，非编码链)。
[0099]
作为编码本发明的羰基还原酶的dna，可以列举合成dna等。例如，可以将使用由甲醇诱导型酵母非发酵性变种nbrc1473株来源的细胞或组织制备的总rna或mrna级分作为模板、通过逆转录酶(reverse transcriptase)-pcr直接扩增而得到的全长羰基还原酶cdna用公知的试剂盒、例如mutan
tm-super express km(takara bio inc.)、mutan
tm-k(takara bio inc.)等按照oda-la pcr法、gapped duplex法、kunkel法等本身公知的方法或基于这些的方法进行变换而获得。或者，由将上述总rna或mrna的片段插入适当的载体中而制备的cdna文库，通过菌落杂交法或噬菌斑杂交法或pcr法等进行克隆，将所得cdna按照上述方法变换，也可以获得。用于文库的载体可以为噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等中的任一者。
[0100]
作为编码具有序列号1所示的氨基酸序列的多肽的核酸，只要编码本发明的具有羰基还原酶活性的多肽则没有限定，特别是可以列举具有以下的(p)、(q)或(r)所示的碱基序列的核酸。
[0101]
(p)具有在序列号2所示的碱基序列中置换、缺失和/或添加1个～多个碱基而成的碱基序列且编码本发明的具有羰基还原酶活性的多肽的核酸
[0102]
(q)具有与序列号2所示的碱基序列具有90％以上的序列一致性的碱基序列且编码本发明的具有羰基还原酶活性的多肽的核酸
[0103]
(r)具有与序列号2所示的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的碱基序列且编码本发明的具有羰基还原酶活性的多肽的核酸
[0104]
作为上述(p)所示的核酸的同源物，可以列举含有在序列号2所示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加1个～多个碱基而成的碱基序列且编码本发明的具有羰基还原酶活性的多肽的核酸。置换、插入或添加的情况下，优选置换、插入或添加1个～多个碱基。在此，“1个～多个碱基”例如为1个～60个、优选1个～30个、更优选1个～15个、进一步优选1个～10个、特别优选1个～5个碱基。
[0105]
作为上述(q)所示的核酸的同源物，可以列举具有与序列号2所示的碱基序列具有90％以上的序列一致性的碱基序列且编码本发明的具有羰基还原酶活性的多肽的核酸。优选具有与序列号2所示的碱基序列具有95％以上、更优选98％以上、进一步优选99％以上的
同源性(也称为一致性)的碱基序列且编码本发明的具有羰基还原酶活性的多肽的核酸。
[0106]
本说明书中的碱基序列的同源性(也称为一致性)可以利用同源性计算算法ncbi blast(national center for biotechnology information basic local alignment search tool)例如在以下条件(期望值＝10；允许空位；过滤＝开；匹配分值＝1；错配分值＝-3)下计算。作为用于确定碱基序列的同源性的其它算法，可以与上述氨基酸序列的同源性计算算法同样地优选举例。
[0107]
作为上述(r)所示的核酸的同源物，只要编码本发明的具有羰基还原酶活性的多肽，则也可以为与序列号2的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交的核酸。在此，作为“严谨条件”，可以参考已报道的条件(例：current protocols in molecular biology，john wiley&sons，6.3.16.3.6，1999)来适当设定，具体而言，可以列举例如：在与通常的southern印迹杂交的洗涤条件、即60℃、1
×
ssc、0.1％sds、优选0.1
×
ssc、0.1％sds、进一步优选65℃、0.1
×
ssc、0.1％sds、68℃、0.1
×
ssc、0.1％sds等(高严谨条件)相当的盐浓度和温度下洗涤1次、更优选洗涤1～3次的条件等。
[0108]
对于本领域技术人员来说，通过使用定点诱变法(nucleic acids res.10，pp.6487(1982)、methods in enzymol.100，pp.448(1983)、molecular cloning、pcr a practical approach irl press pp.200(1991))等对序列号2所示的核酸适当进行置换、缺失、插入和/或添加而导入期望的突变，能够得到如上所述的核酸同源物。
[0109]
本发明的核酸可编码本发明的具有羰基还原酶活性的多肽。本发明的核酸具有序列号2所示的碱基序列或与序列号2所示的碱基序列具有高的一致性的碱基序列的情况下，含有由该核酸编码的多肽的羰基还原酶的羰基还原酶活性的程度与含有具有序列号1所示的氨基酸序列的多肽的羰基还原酶或含有具有该氨基酸序列的同源物的多肽的羰基还原酶可以在定量上同等，也可以在可接受的范围(例如约0.1～约5倍、优选约0.3～约3倍)内不同。
[0110]
另外，也可以基于序列号1的氨基酸序列中的氨基酸序列或其一部分、序列号2所示的碱基序列或其一部分对例如日本dna数据库(dna databank of japan，ddbj)等数据库进行同源检索，来获得具有羰基还原酶活性的多肽的氨基酸序列信息或编码其的dna的碱基序列信息。
[0111]
在后述的本发明的制造方法中，可以使用上述羰基还原酶与作为底物的含羰基化合物直接反应，但是优选使用具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物、和/或含有培养该微生物或细胞而得到的该酶的培养液。
[0112]
作为具有生产本发明的羰基还原酶的能力的微生物或细胞，既可以使用原本就具有生产该羰基还原酶的能力的微生物或细胞，也可以为通过育种而赋予了上述生产能力的微生物或细胞。作为微生物或细胞，死活均可，例如可以优选使用休眠菌体等。作为具有生产本发明的羰基还原酶的能力的微生物或细胞的种类，可以列举后述的“宿主微生物”或“宿主细胞”。
[0113]
作为通过育种赋予上述生产能力的手段，可以采用基因重组处理(转化)、突变处理等公知方法。作为转化的方法，可以列举导入目标dna的方法、在染色体上改造启动子等表达调控序列来增强目标dna的表达的方法等。
[0114]
这些中，优选使用用上述编码本发明的多肽的dna进行了转化的微生物或细胞。
[0115]
编码本发明的多肽(羰基还原酶)的核酸(dna)如上所述可以通过使用甲醇诱导型酵母非发酵性变种nbrc1473株来源的染色体dna作为模板、使用合适的引物进行pcr来克隆。
[0116]
另外，编码本发明的多肽(羰基还原酶)的核酸(dna)如上所述可以通过制备使用甲醇诱导型酵母非发酵性变种nbrc1473株来源的总rna或mrna作为模板、利用rt-pcr法直接扩增的全长羰基还原酶cdna后使用合适的引物进行pcr来克隆。
[0117]
例如，通过将如上得到的编码本发明的多肽的dna以能够表达的配置方式插入到公知的表达载体中，可以提供本发明的多肽基因表达载体。并且，通过用该表达载体转化宿主细胞，能够得到导入了编码本发明的多肽的dna的转化体。转化体也可以通过利用同源重组等方法将编码本发明的多肽的dna以能够表达的方式整合到宿主的染色体dna中来得到。
[0118]
本说明书中，“表达载体”是指用于通过将编码具有期望功能的蛋白质的多核苷酸整合并导入宿主生物而在上述宿主生物中复制和表达具有期望功能的蛋白质的遗传因子。可以列举例如质粒、病毒、噬菌体、粘粒等，但是不限于这些。表达载体优选为质粒。
[0119]
本说明书中，“转化体”是指使用上述表达载体等导入目标基因、从而能够表现出与具有期望功能的蛋白质有关的期望性状的微生物或细胞。
[0120]
作为转化体的制作方法，具体而言可以例示下述方法：向在宿主细胞中稳定存在的质粒载体、噬菌体载体、病毒载体中导入编码本发明的多肽的dna，将由此构建的表达载体导入该宿主细胞中的方法；直接向宿主基因组中导入该dna、并转录、翻译其遗传信息的方法。这种情况下，优选将适合于宿主的启动子连接到dna的5
’‑
侧上游，进而，更优选将终止子连接到3
’‑
侧下游。作为这样的启动子和终止子，只要是已知在用作宿主的细胞中起作用的启动子和终止子则没有特别限定，例如，可以使用“微生物学基础讲座8基因工程
·
共立出版”中详述的载体、启动子和终止子。
[0121]
作为用于表达本发明的羰基还原酶的、成为转化对象的宿主微生物，只要宿主本身不会对作为底物的含羰基化合物、作为目标物的光学活性化合物带来不良影响则没有特别限定，例如可以列举以下所示的微生物。
[0122]
属于埃希氏菌(escherichia)属、芽孢杆菌(bacillus)属、假单胞菌(pseudomonas)属、沙雷氏菌(serratia)属、短杆菌(brevibacterium)属、棒状杆菌(corynebacterium)属、链球菌(streptococcus)属、乳杆菌(lactobacillus)属等的已建立宿主载体系统的细菌。
[0123]
属于红球菌(rhodococcus)属、链霉菌(streptomyces)属等的已建立宿主载体系统的放线菌。
[0124]
属于酵母菌(saccharomyces)属、克鲁维酵母(kluyveromyces)属、裂殖酵母(schizosaccharomyces)属、接合酵母(zygosaccharomyces)属、耶氏酵母(yarrowia)属、毛孢菌(trichosporon)属、红孢子菌(rhodosporidium)属、汉逊酵母(hansenula)属、毕赤酵母(pichia)属、念珠菌(candida)属等的已建立宿主载体系统的酵母。
[0125]
属于脉孢菌(neurospora)属、曲霉(aspergillus)属、头孢菌(cephalosporium)属、木霉(trichoderma)属等的已建立宿主载体系统的霉菌。
[0126]
用于制作转化体的步骤、适合于宿主的重组载体的构建和宿主的培养方法可以按照分子生物学、生物工程、基因工程领域中常用的技术来进行(例如green et al.，
molecular cloning：a laboratory manual(4
th
ed.)cold spring harbor press，cold spring harbor，ny(2012)中记载的方法)。
[0127]
以下具体列举优选的宿主微生物、各微生物情况下的优选的转化方法、载体、启动子、终止子等的例子，但是本发明不受这些例子限定。
[0128]
在埃希氏菌属、特别是大肠埃希氏菌(escherichia coli)的情况下，作为质粒载体，可以列举pbr、puc系质粒等，可以列举lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac、trp的融合)、λ噬菌体pl、pr等来源的启动子等。另外，作为终止子，可以列举trpa来源、噬菌体来源、rrnb核糖体rna来源的终止子等。
[0129]
芽孢杆菌属的情况下，作为载体，可以列举pub110系质粒、pc194系质粒等，另外也可以与染色体整合。作为启动子和终止子，可以利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等酶基因的启动子、终止子等。
[0130]
假单胞菌属的情况下，作为载体，可以列举恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、洋葱假单胞菌(pseudomonas cepacia)等已建立的常见宿主载体系统、参与甲苯化合物的分解的质粒、以tol质粒为基础的广泛宿主载体(含有rsf1010等来源的自主复制所需的基因)pkt240(gene，26，273-82(1983))等。
[0131]
在短杆菌属、特别是乳糖发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)的情况下，作为载体，可以列举paj43(gene 39，281(1985))等质粒载体。作为启动子和终止子，可以利用大肠杆菌中使用的各种启动子和终止子。
[0132]
在棒状杆菌属、特别是谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)的情况下，作为载体，可以列举pcs11(日本特开昭57-183799号公报)、pcb101(mol.gen.genet.196，175(1984))等质粒载体。
[0133]
在酵母菌(saccharomyces)属、特别是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的情况下，作为载体，可以列举yrp系、yep系、ycp系、yip系质粒等。另外，可以利用醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、酸性磷酸酶、b-半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶之类的各种酶基因的启动子、终止子。
[0134]
在裂殖酵母(schizosaccharomyces)属的情况下，作为载体，可以列举mol.cell.biol.6，80(1986)中记载的粟酒裂殖酵母来源的质粒载体等。特别是，paur224已由宝生物株式会社销售，易于利用。
[0135]
在曲霉(aspergillus)属的情况下，黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)等是曲霉中研究得最多的，可以与质粒、染色体整合而利用，可以利用菌体外蛋白酶、淀粉酶来源的启动子(trendsin biotechnology 7，283-287(1989))。
[0136]
另外，除了上述以外，也建立了与各种微生物相应的宿主载体系统，这些也可以适当使用。
[0137]
另外，除了微生物以外，也建立了植物、动物的各种宿主/载体系统，特别是，已建立了在昆虫(例如蚕)等动物中(nature 315，592-594(1985))、油菜、玉米、马铃薯等植物中大量表达异源蛋白的系统、以及使用大肠杆菌无细胞提取液、小麦胚芽等的无细胞蛋白质合成系统的体系，也可以适当利用。
[0138]
作为具有生产本发明的羰基还原酶的能力的微生物或细胞的处理物，可以列举例如：将该微生物或细胞用丙酮、二甲基亚砜(dmso)、甲苯等有机溶剂、表面活性剂处理而得
到的处理物、冷冻干燥处理而得到的处理物、经物理破碎或酶破碎等而得到的物质等细胞制备物、以粗制物或纯化物形式提取微生物或细胞中的酶级分而得到的处理物、以及将这些物质固定化于以聚丙烯酰胺凝胶、角叉菜胶等为代表的载体而得到的物质等。
[0139]
作为含有培养具有生产本发明的羰基还原酶的能力的微生物或细胞而得到的该酶的培养液，可以列举例如：该细胞与液体培养基的悬浮液、在该细胞为分泌表达型细胞时通过离心分离等除去该细胞而得到的上清液、其浓缩物。
[0140]
2.本发明的组合物
[0141]
本发明的组合物(酶剂)含有本发明的羰基还原酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物、和/或含有培养该微生物或细胞而得到的上述酶的培养液，是催化以通式(i)、(ii)或(iii)所示的含羰基化合物为底物来生成通式(iv)所示的光学活性化合物的反应的物质。本发明的组合物通过作为催化剂使用，能够以高纯度、高光学纯度并且价格低廉地工业化制造作为药物、农药等的中间体原料在产业上有用的该光学活性化合物，因此是有用的。
[0142][0143][0144]
本发明的组合物除了含有有效成分(酶等)以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、助悬剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨糖醇、d-甘露醇、蔗糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
[0145]
3.本发明的光学活性化合物的制造方法
[0146]
根据本发明，可以提供下述通式(iv)所示的光学活性化合物的制造方法，其包括使本发明的羰基还原酶作用于选自由下述通式(i)、(ii)和(iii)所示的化合物组成的组中的含羰基化合物来制造下述通式(iv)所示的光学活性化合物的步骤。
[0147][0148][0149]
另外，上述式(ii)和上述式(iii)所示的含羰基化合物分别优选为下述式(ii’)和下述式(iii’)所示的光学活性体。
[0150][0151]
需要说明的是，本说明书中，r表示氢原子、烷基或芳基。作为烷基，优选碳原子数1～8的直链或支链烷基，进一步优选碳原子数1～4的直链烷基，特别优选乙基或正丙基。
[0152]
另外，取代基a表示具有芳香族环和/或杂环的取代基。具体而言，作为取代基a，优选具有含有氟原子作为取代基的芳香族环的取代基、具有含有氮原子的杂环的取代基和/或具有萘环的取代基，其中，优选
[0153]
特别优选
[0154]
在此，取代基b表示具有芳香族环和/或杂环的取代基。具体而言，作为取代基b，优选具有含有氮原子的杂环的取代基，特别优选
[0155][0156]
本发明中，取代基a特别优选
[0157]
使本发明的羰基还原酶与上述通式(i)、(ii)或(iii)所示的含羰基化合物接触时，通过使纯化或粗纯化后的本发明的羰基还原酶、具有生产本发明的羰基还原酶的能力的微生物或细胞(例如具有编码本发明的多肽的dna的转化体等)、该微生物或细胞的处理物、和/或含有培养该微生物或细胞而得到的该酶的培养液与上述通式(i)、(ii)或(iii)所示的含羰基化合物接触，能够制造上述通式(iv)所示的光学活性化合物。
[0158]
本发明的羰基还原酶可以直接用于反应，但是优选使用具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物、和/或含有培养该微生物或细胞而得到的该酶的培养液，其中，优选使用具有编码本发明的多肽的dna的转化体。
[0159]
添加到反应液中的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物、和/或含有培养该微生物或细胞而得到的该酶的培养液的量可以根据作为底物的含羰基化合物来适当选择。例如，在添加微生物或细胞的情况下，以反应液中该微生物或细胞的浓度通常按湿菌体重计达到0.1w/v％～50w/v％左右、优选1w/v％～20w/v％的方式添加，在使用处理物、培养液的情况下，求出酶的比活性，在添加时，添加达到上述细胞浓度的量。在此，w/v％表示重量(weight)/体积(volume)％。
[0160]
另外，从处理性优良、并且易于向反应液中添加的角度出发，添加到反应液中的羰基还原酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物、和/或含有培养该微生物或细胞而得到的该酶的培养液也可以在冷冻状态下使用。在冷冻状态下使用时，其形状没有特别限制，例如可以为棱柱状、圆柱状、块状、球状等。
[0161]
反应的方法没有特别限定，可以向含有本发明的羰基还原酶的液体中加入作为反应底物的含羰基化合物，在适当的温度、压力(例如大气压程度)下进行反应。由此，可以制造上述通式(iv)所示的光学活性化合物。
[0162]
作为反应底物的含羰基化合物的量可以根据该化合物的种类来适当选择。例如，作为反应底物的含羰基化合物可以以底物浓度为0.01w/v％～90w/v％、优选0.1w/v％～30w/v％的范围来使用。
[0163]
反应底物可以在反应开始时一次性添加，但从降低存在酶的底物抑制时的影响方面、提高生成物的累积浓度的观点出发，优选连续地添加或间歇地添加。
[0164]
反应介质可以根据作为反应底物的含羰基化合物的种类来适当选择。例如，可以使用水性介质或水性介质与有机溶剂的混合物。作为水性介质，可以列举例如水或缓冲液。作为有机溶剂，可以使用甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜等作为反应底物的含羰基化合物的溶解度高的有机溶剂。另外，作为有机溶剂，也可以使用具有除去反应副产物等效果的乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等。
[0165]
反应温度、反应时的ph、反应时间可以根据作为反应底物的含羰基化合物的种类来适当选择。例如，反应温度为4℃～80℃、优选为10℃～70℃，反应时的ph为ph311、优选为ph4～8，反应时间为0.5小时～72小时左右。
[0166]
就通过本发明的制造方法生成的上述通式(iv)所示的光学活性化合物而言，可以在反应结束后利用离心分离、膜处理等本领域技术人员公知的分离或纯化方法分离出反应液中的菌体、蛋白质等，然后通过将利用有机溶剂的萃取、蒸馏、使用离子交换树脂或硅胶等的柱色谱、等电点下的结晶、利用一盐酸盐、二盐酸盐、钙盐等的析晶等适当组合来进行纯化。
[0167]
另外，本发明涉及制造光学活性化合物的方法，其中，通过使利用上述方法等得到的本发明的转化体细胞、该转化体细胞的培养物、该转化体细胞的处理物作用于作为反应底物的下述通式(i)、(ii)或(iii)所示的含羰基化合物，使该化合物的羰基发生不对称还原，从而制造光学活性化合物。转化体细胞、该转化体细胞的培养物、该转化体细胞的处理物可以单独使用任一种，也可以组合使用。
[0168]
特别是，本发明的制造方法可以优选用于尤其是取代基a为的情况、即匹伐他汀或瑞舒伐他汀的制造。
[0169]
(1)匹伐他汀的情况
[0170]
作为匹伐他汀的制造方法，可以列举例如日本专利第4270918号公报、国际公开第2017/022846号等中记载的方法。
[0171]
作为反应底物的下述通式(i
′
)、(ii
″
)或(iii
″
)所示的含羰基化合物可以通过将
日本特开平1-279866号公报、日本特开平8-127585号公报、日本特开平5-178841号公报、国际公开第2017/022846号等中记载的方法与公知方法组合来任意地制造。这些化合物可以使用1种或2种以上的组合作为原料。
[0172][0173]
在使用通式(i
′
)所示的化合物作为反应底物时，存在经由通式(ii
″
)所示的化合物作为其制造中间体的情况和经由通式(iii
″
)所示的化合物作为其制造中间体的情况。因此，既可以由式(i
′
)所示的化合物预先制造式(ii
″
)所示的化合物和式(iii
″
)所示的化合物、将它们单离并进一步衍生为通式(iv
′
)所示的光学活性化合物，也可以不将式(ii
″
)所示的化合物和式(iii
″
)所示的化合物单离而直接制造通式(iv
′
)所示的化合物。
[0174][0175]
作为反应底物的通式(i
′
)、(ii
″
)或(iii
″
)所示的含羰基化合物通常以底物浓度为0.01w/v％～20w/v％、优选0.1w/v％～10w/v的％范围来使用。反应底物既可以预先存在于反应体系中，也可以在反应开始时一次性添加。另外，从存在酶的底物抑制时降低其影响、以及提高生成物的累积浓度的观点出发，也可以从反应开始时连续地或间歇地添加。
[0176]
另外，反应优选在辅酶nad(p)+或nad(p)h存在下进行，这种情况下，优选以达到通常0.001mmol/l～100mmol/l、优选0.01mmol/l～10mmol/l的浓度的方式添加上述辅酶。
[0177]
添加上述辅酶时，为了提高生产效率，优选在反应体系内使由nad(p)h生成的nad
(p)
+
再生为nad(p)h。作为再生方法，可以列举：
[0178]
1)利用本发明的微生物或细胞本身的由nad(p)
+
生成nad(p)h的能力、即nad(p)
+
还原能力的方法；
[0179]
2)向反应体系中添加具有由nad(p)
+
生成nad(p)h的能力的微生物、其处理物、或者葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等能够用于nad(p)h再生的酶(以下称为“再生酶”)中的一种以上的方法；
[0180]
3)在制作本发明的微生物或细胞时，将一种以上上述再生酶的基因一起导入到宿主生物或宿主细胞中的方法；等。
[0181]
上述1)方法中，从反应效率方面出发，优选向反应体系中添加葡萄糖、乙醇、2-丙醇或甲酸等。
[0182]
另外，上述2)方法中，可以使用具有生产上述再生酶的能力的微生物、该微生物的丙酮处理物、戊二醛处理物、冷冻干燥处理物、物理破碎物或酶破碎物等微生物处理物、以粗制物或纯化物形式取出该酶级分而得到的物质、以及将这些固定化于聚丙烯酰胺凝胶、角叉菜胶等载体而得到的物质等，另外也可以使用市售的酶。
[0183]
作为上述再生酶的使用量，可以以如下方式添加：相对于本发明的具有能够立体选择性地还原羰基的能力的酶的羰基还原活性，以酶活性计通常为0.01倍～100倍、优选为0.5倍～20倍左右。
[0184]
另外，还需要添加作为上述再生酶的底物的化合物，例如利用葡萄糖脱氢酶时的葡萄糖、利用甲酸脱氢酶时的甲酸、利用醇脱氢酶时的乙醇或异丙醇等，作为其添加量，相对于作为反应底物的含羰基化合物1mol，通常为0.1mol～20mol，优选为1mol～10mol。
[0185]
另外，上述3)方法中，可以使用使上述再生酶的dna与编码用于步骤(i)的酶的dna一起整合到染色体中的方法、向一种表达载体中导入两种dna并转化宿主生物或细胞的方法、或者在将两种dna分别导入不同的表达载体中后转化宿主生物或宿主细胞的方法等。在将两种dna分别导入不同的表达载体后转化宿主生物或宿主细胞的方法的情况下，选择表达载体时需要考虑两表达载体彼此的不相容性。
[0186]
向一种表达载体中导入多个基因的情况下，也可以是将启动子和终止子等参与表达调控的区域与各基因连接的方法、以乳糖操纵子之类含有多个顺反子的操纵子形式表达的方法。
[0187]
反应在水性介质中或水性介质与有机溶剂的混合物中进行。水性介质或水性介质与有机溶剂的混合物含有作为反应底物的含羰基化合物以及上述酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物、和/或含有培养该微生物或细胞而得到的该酶的培养液。另外，可以根据需要含有各种辅酶。含有辅酶时，更优选形成其再生系统、即能够使辅酶再生。
[0188]
需要说明的是，作为反应底物的含羰基化合物也可以通过后述方法来制造。
[0189]
作为水性介质，可以列举水或磷酸钾缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、tris盐酸缓冲液等ph缓冲液。
[0190]
作为有机溶剂，可以使用乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷、正庚烷、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇等作为反应底物的含羰基化合物的溶解度高的有机溶剂。其中，作为有机溶剂，从作为反应底物的含羰基化合物的溶解度高的角度出
发，优选二甲基亚砜、甲醇、乙醇。另外，从转化率高的角度出发，更优选二甲基亚砜。
[0191]
反应在通常4℃～70℃、优选30℃～60℃的反应温度、通常ph3～11、优选ph4～8下进行。反应时间通常为0.5小时～48小时、优选为0.5小时～24小时。
[0192]
就所得到的通式(iv
′
)所示的化合物而言，可以在通过离心分离、过滤等分离出菌体、多肽等之后调节至适当的ph，将利用己烷、乙酸乙酯、甲苯等有机溶剂的萃取、利用柱色谱的纯化、结晶化等适当组合来进行纯化。
[0193]
例如，在下述式的反应中，可以优选使用在序列号1所示的氨基酸序列或作为该氨基酸序列的同源物的具有羰基还原酶活性的氨基酸序列中具有(d)、(c)或(f)突变中的1个以上、优选2个以上的羰基还原酶。另外，可以进一步具有(g)突变。特别是，在下述式的反应中，优选至少具有(d)突变的羰基还原酶。
[0194][0195]
另外，例如，在下述式的反应中，可以优选使用在序列号1所示的氨基酸序列或作为该氨基酸序列的同源物的具有羰基还原酶活性的氨基酸序列中具有(a)、(b)、(c)、(e)或(f)突变中的1个以上、优选2个以上、特别优选3个以上的羰基还原酶。另外，可以进一步具有(g)突变。特别是，在下述式的反应中，优选具有(b)、(e)和(f)突变的羰基还原酶。
[0196][0197]
(2)瑞舒伐他汀的情况
[0198]
作为瑞舒伐他汀的制造方法，可以列举例如国际公开第2015/119261号等中记载的方法。
[0199]
作为反应底物，可以使用例如下述通式(i
″
)所示的含羰基化合物。
[0200]
[0201]
作为反应底物的通式(i
″
)所示的含羰基化合物通常以底物浓度成为0.01w/v％～20w/v％、优选0.1w/v％～10w/v％的范围来使用。反应底物可以在反应开始时一次性添加。另外，从存在酶的底物抑制时降低其影响、以及提高生成物的累积浓度的观点出发，也可以连续地或间歇地添加。
[0202]
反应优选在辅酶nad(p)
+
或nad(p)h存在下进行，这种情况下，以达到通常0.001mmol/l～100mmol/l、优选0.01mmol/l～10mmol/l的浓度的方式添加上述辅酶。
[0203]
添加上述辅酶时，为了提高生产效率，优选在反应体系内使由nad(p)h生成的nad(p)
+
再生为nad(p)h。作为再生方法，可以列举：
[0204]
1)利用本发明的微生物或细胞本身的由nad(p)
+
生成nad(p)h的能力、即nad(p)
+
还原能力的方法；
[0205]
2)向反应体系中添加具有由nad(p)
+
生成nad(p)h的能力的微生物、其处理物、或者葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等能够用于nad(p)h再生的酶(以下称为“再生酶”)中的一种以上的方法；
[0206]
3)在制作本发明的微生物或细胞时，将一种以上上述再生酶的基因一起导入到宿主生物或宿主细胞中的方法；等。
[0207]
上述1)方法中，优选向反应体系中添加葡萄糖、乙醇、2-丙醇或甲酸等。
[0208]
另外，上述2)方法中，可以使用具有生产上述再生酶的能力的微生物、该微生物的丙酮处理物、冷冻干燥处理物、物理破碎物或酶破碎物等微生物处理物、以粗制物或纯化物形式取出该酶级分而得到的物质、以及将这些固定化于聚丙烯酰胺凝胶、角叉菜胶等载体而得到的物质等，另外也可以使用市售的酶。
[0209]
该情况下，作为上述再生酶的使用量，以如下方式添加：相对于本发明的具有能够立体选择性地还原羰基的能力的酶的羰基还原活性，以酶活性计通常为0.01倍～100倍、优选为0.5倍～20倍左右。
[0210]
另外，还需要添加作为上述再生酶的底物的化合物，例如利用葡萄糖脱氢酶时的葡萄糖、利用甲酸脱氢酶时的甲酸、利用醇脱氢酶时的乙醇或异丙醇等，作为其添加量，相对于作为反应底物的通式(i
″
)所示的含羰基化合物，添加通常0.1当量～20当量、优选1当量～10当量。
[0211]
另外，上述3)方法中，可以使用使上述再生酶的dna与编码本发明的羰基还原酶的dna一起整合到染色体中的方法、向一种表达载体中导入两种dna并转化宿主生物或细胞的方法、或者在将两种dna分别导入不同的表达载体中后转化宿主生物或宿主细胞的方法。在将两种dna分别导入不同的表达载体后转化宿主生物或宿主细胞的方法的情况下，选择表达载体时需要考虑两表达载体彼此的不相容性。
[0212]
向一种表达载体中导入多个基因的情况下，也可以是将启动子和终止子等参与表达调控的区域与各基因连接的方法、以乳糖操纵子之类含有多个顺反子的操纵子形式表达的方式。
[0213]
反应在含有通式(i
″
)所示的含羰基化合物和上述酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物、和/或含有培养该微生物或细胞而得到的该酶的培养液、以及根据需要含有的各种辅酶(更优选形成其再生系统、即能够使辅酶再生)的水性介质中或该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。需要说明的是，通式(i
″
)所示的含羰基化
合物可以通过国际公开第2015/119261号等中记载的方法等来制造。
[0214]
作为水性介质，可以列举水或磷酸钾缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、tris盐酸缓冲液等缓冲液。
[0215]
作为有机溶剂，可以使用乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷、正庚烷、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇等通式(i
″
)所示的含羰基化合物的溶解度高的有机溶剂。其中，作为有机溶剂，从通式(i
″
)所示的化合物的溶解度高的角度出发，优选二甲基亚砜、甲醇、乙醇。另外，从转化率高的角度出发，更优选二甲基亚砜。
[0216]
另外，反应可以在甘油、乙二醇、丙二醇、赤藓糖醇、肌醇、山梨糖醇、木糖醇等多元醇类存在下进行。上述多元醇类可以为聚合物、衍生物，并且既可以使用一种也可以将两种以上混合使用。若在多元醇类存在下进行反应，则有转化率提高的倾向。其中，甘油由于被认为能够通过保持酶的高级结构而维持酶活性、而且容易获得而优选。
[0217]
反应在通常4℃～70℃、优选20℃～60℃的反应温度、通常ph3～11、优选ph4～8下进行。反应时间通常为0.5小时～48小时、优选为0.5小时～24小时。另外，也可以利用膜反应器等进行。
[0218]
就所得到的通式(vi
″
)所示的光学活性化合物而言，可以在通过离心分离、过滤等分离出菌体、多肽等之后调节至适当的ph，将利用己烷、乙酸乙酯、甲苯等有机溶剂的萃取、利用柱色谱的纯化、结晶化等适当组合来进行纯化。
[0219][0220]
在通过结晶化来纯化通式(vi
″
)所示的光学活性化合物时，作为能够使用的有机溶剂，可以使用环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等烃溶剂、氯苯、二氯苯等卤素溶剂、叔丁基甲基醚、四氢呋喃(thf)、环戊基甲基醚(cpme)等醚溶剂、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等醇溶剂、n-甲基-2-吡咯烷酮、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜等极性溶剂等通式(vi
″
)所示的光学活性化合物的溶解度高的溶剂。这些有机溶剂可以单独使用，也可以使用这些有机溶剂与水的混合溶剂。
[0221]
在通过结晶化来纯化通式(vi
″
)所示的光学活性化合物时，优选：在使(vi
″
)所示的光学活性化合物溶解于有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶剂后以15℃/小时以下的冷却速度进行冷却，由此使上述通式(vi
″
)所示的光学活性化合物的晶体析出(以下将该进行冷却而使晶体析出的步骤称为“冷却步骤”)。
[0222]
冷却步骤中，开始冷却的温度优选为15℃～60℃、更优选为20℃～55℃。
[0223]
冷却步骤中的冷却速度优选为15℃/小时以下，更优选为9℃/小时以下，进一步优选为6℃/小时以下，特别优选为5℃/小时以下。这是为了提高所得到的通式(vi
″
)所示的光
学活性化合物的纯度。
[0224]
需要说明的是，冷却步骤中，可以在中途改变冷却速度。特别是，优选的是，在优选45℃以下、更优选40℃以下的温度范围内缓慢地进行冷却。具体而言，更优选将冷却速度设为9℃/小时，进一步优选设为6℃/小时以下，特别优选设为5℃/小时以下。
[0225]
另外，例如，在下述式的反应中，可以优选使用在序列号1所示的氨基酸序列或作为该氨基酸序列的同源物的具有羰基还原酶活性的氨基酸序列中具有(a)、(b)、(c)、(e)或(f)突变中的1个以上、优选2个以上、特别优选3个以上的羰基还原酶。另外，可以进一步具有(g)突变。特别是，在下述式的反应中，优选具有(b)、(e)和(f)突变的羰基还原酶。
[0226][0227]
实施例
[0228]
以下列举实施例进一步详细地说明本发明，但是本发明不因这些实施例而受到限制。
[0229]
本实施例中的定量分析使用高效液相色谱(hplc)在以下条件下进行测定。
[0230]
《测定条件1》
[0231]
柱：nacalai公司制cosmosil 3c18ms-ii(4.6
×
75mm、3μm)
[0232]
流动相：甲醇/乙腈/水/磷酸＝300/150/450/1
[0233]
流速：0.5ml/分钟柱温：50℃
[0234]
检测波长：uv245nm
[0235]
进样量：5μl
[0236]
《测定条件2》
[0237]
柱：资生堂公司制capcell pak c18 mgiii(4.6
×
75mm、3μm)
[0238]
流动相：a：100mm hcoonh4 b：乙醇
[0239]
梯度程序(b浓度)：45％(0分钟)
→
45％(20分钟)
→
80％(30分钟)
→
80％(35分钟)
[0240]
流速：0.55ml/分钟柱温：40℃
[0241]
检测波长：uv245nm
[0242]
进样量：5μl
[0243]
《测定条件3》
[0244]
柱：acquity uplc beh c18(2.1
×
100mm、1.7μm)
[0245]
流动相：a：0.1％甲酸水溶液b：含有0.1％甲酸的乙腈溶液
[0246]
梯度程序(b浓度)：40％(0分钟)
→
95％(12分钟)
→
64％(14分钟)
→
40％(17分钟)
[0247]
流速：0.3ml/分钟柱温：40℃
[0248]
检测波长：uv245nm
[0249]
进样量：5μl
[0250]
《测定条件4》
[0251]
柱：资生堂公司制capcell pak c18 mgs-iii(4.6
×
75mm、3μm)
[0252]
流动相：水/乙酸/乙酸铵＝1000/100/7.7(体积/体积/重量)
[0253]
流速：1ml/分钟柱温：40℃
[0254]
检测波长：uv254nm
[0255]
进样量：5μl
[0256]
参考例1(菌体的制备)
[0257]
(1)基因的克隆
[0258]
参考专利文献1(日本专利第4270918号公报)进行基因的克隆。以编码甲醇诱导型酵母非发酵性变种(ogataea minuta var.nonfermentans)nbrc 1473来源的ocr1(序列号1)的基因序列ocrl(序列号2)为基础，按照常规方法进行pcr，得到在ocrl基因的上游含有限制酶位点ecori且在下游含有限制酶位点xbai的全长约0.8kbp的dna片段。
[0259]
然后，参考专利文献2(国际公开第2015/119261号)，以编码枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)来源的基因(genebank accession no.al009126.3)所编码的葡萄糖-1-脱氢酶中第96位的氨基酸残基即谷氨酸被置换为丙氨酸而成的gdh(序列号3)的基因序列(以下记作gdh(序列号4)为基础，按照常规方法进行pcr，得到在gdh基因的上游含有限制酶位点ecori且在下游含有限制酶位点xbai的全长约0.8kbp的dna片段。
[0260]
(2)表达用质粒的制备
[0261]
将上述(1)中得到的ocrl的dna片段用限制酶ecori和xbai消化，使用ligation-convenience kit(
ニッポンジーン
公司制)导入到经muni和xbai消化后的日本特开2005-34025号公报中记载的质粒pkv32中的trc启动子的下游，得到pkv32ocr1。
[0262]
然后，将上述(1)中得到的gdh的dna片段用限制酶ecori和xbai消化，使用ligation-convenience kit(
ニッポンジ
一
ン
公司制)导入到经muni和xbai消化后的质粒pkv32中的trc启动子的下游，得到pkv32gdh。
[0263]
进而，以pkv32gdh为模板按照常规方法进行pcr，获得在上游和下游添加了限制酶位点hindiii的全长约0.8kbp的dna片段，将所得到的dna片段用限制酶hindiii消化，然后插入到预先用限制酶hindiii消化后的质粒pkv32ocr1的下游，得到pkv32ocr1-gdh。通过pcr确认了所得质粒中的gdh基因的方向。
[0264]
(3)ocr1突变体表达用质粒的制备
[0265]
以上述(2)中得到的质粒pkv32ocr1-gdh为模板，使用例如quikchange site-directed mutagenesis kit(安捷伦科技公司制)之类的定点诱变法按照常规方法制作能够表达下述表1所示的突变体的突变体质粒。
[0266]
需要说明的是，在以下所示的表中，a表示丙氨酸，n表示天冬酰胺，d表示天冬氨酸，i表示异亮氨酸，l表示亮氨酸，m表示甲硫氨酸，s表示丝氨酸，v表示缬氨酸。另外，例如i211a表示在序列号1的氨基酸序列中第211位的异亮氨酸被置换为丙氨酸的突变。
[0267]
[表1]
[0268][0269]
在此，d54v为(a)突变，m157v为(b)突变，a170s为(c)突变，i211a和i211n为(d)突变，m214l为(e)突变，m249l为(f)突变，v166a为(g)突变。
[0270]
实施例1(表达株的制备)
[0271]
使用上述参考例1的(2)和(3)中得到的质粒pkv32ocr1-gdh及其突变体质粒，按照常规方法转化大肠杆菌(escherichia coli)jm109(宝生物公司制)，得到各转化体。
[0272]
实施例2
[0273]
使实施例1中得到的转化体作用于5s-mole而进行还原，制造dole。测定所得到的dole的syn体和anti体的比率，对光学选择性进行评价。
[0274]
在此，5s-mole、syn-dole、anti-dole分别为具有以下结构的化合物。
[0275][0276]
对于ocr1和具有表2所示的突变的转化体，分别实施以下的反应和评价。
[0277]
将转化体接种到含有浓度25mg/l的卡那霉素和浓度0.2mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(以下称为“iptg”)的lb液体培养基中，在37℃下振荡培养一夜。从得到的培养液中回收菌体，添加浓度100mmol/l的磷酸钾缓冲液(ph6)200μl、浓度2g/l的nadp
+
30μl、甲苯1μl，剧烈振荡5分钟后，添加浓度50重量％的葡萄糖10μl和浓度5g/l的5s-mole 10μl，在45℃下振荡1小时使其反应。
[0278]
向得到的反应液中添加乙腈750μl，离心分离后，将得到的离心上清液在测定条件2和测定条件1下进行hplc分析。将各转化体的anti体比示于表2。
[0279]
anti体比由通过hplc分析得到的syn-dole和anti-dole的比率按照下述计算式计算。
[0280]
anti体比(％)＝anti-dole生成量/syn-dole生成量
×
100
[0281]
[表2]
[0282]
序列号突变anti体比1无(ocr1)1.1％8i211a0.5％9i211n0.4％
[0283]
由表2可知，具有i211a或i211n突变的突变体与ocr1相比，anti体比降低。即，明确了：由于(d)突变(i211a或i211n)，光学选择性提高。
[0284]
实施例3
[0285]
使实施例1中得到的转化体作用于doxe而进行还原，由得到的3r-mole、5s-mole和dole生成量来对反应活性和立体选择性进行评价。
[0286]
在此，doxe、3r-mole、5s-mole和dole分别为具有以下结构的化合物。
[0287][0288]
对于ocr1和具有表3所示的突变的转化体，分别实施以下的反应和评价。
[0289]
将转化体接种到含有浓度25mg/l的卡那霉素和浓度0.2mmol/l的iptg的lb液体培养基中，在37℃下振荡培养一夜。从得到的培养液中回收菌体，悬浮于浓度100mmol/l的磷酸钾缓冲液中，将装有悬浮液的容器浸入冰水中进行超声波破碎处理。对得到的菌体裂解液进行离心分离，得到菌体破碎物上清液。
[0290]
向得到的菌体破碎物上清液100μl中添加浓度0.2mol/l的磷酸钾缓冲液(ph7)100μl、浓度20g/l的葡萄糖100μl、浓度0.2g/l的nadp
+
10μl、浓度1g/l的doxe的dmso溶液100μl和水90μl，使用thermomixer r mixer(艾本德公司制)，在50℃、1000rpm下反应15分钟。反应后添加乙腈1ml并进行混合，然后进行离心分离。将得到的上清液在测定条件3下进行hplc分析。将各转化体的反应活性和3r-mole比示于表3。
[0291]
反应活性和3r-mole比由通过hplc分析得到的各峰面积值通过下述计算式来计算。
[0292]
反应活性＝5s-mole峰面积+3r-mole峰面积
[0293]
3r-mole比＝3r-mole峰面积/5s-mole峰面积
[0294]
需要说明的是，关于反应活性，以ocr1为基准，0.9倍以下时评价为
“‑”
，1.0倍时评价为“+”，1.1倍时评价为“++”，1.2倍以上时评价为“+++”。
[0295]
另外，关于3r-mole比，以ocr1为基准，0.9～1.0倍时评价为“+”，0.7～0.8倍时评价为“++”，0.6倍以下时评价为“+++”。
[0296]
[表3]
[0297]
序列号突变反应活性3r-mole比1无(ocr1)++11a170s/m249l-+13m157v/a170s/m249l-++15v166a/m214l/m249l++++17a170s/m214l/m249l-++18m157v/v166a/m214l/m249l+++++19m157v/a170s/m214l/m249l++++++20v166a/a170s/m214l/m249l-++22m157v/v166a/a170s/m214l/m249l+++++
[0298]
由表3可知，具有m157v或m214l突变的突变体与ocr1相比，3r-mole比降低。特别是，具有m157v和m214l这两个突变的突变体，不仅3r-mole比降低，而且反应活性也提高。即，明确了：由于m157v((b)突变)、m214l((e)突变)，立体选择性、反应活性提高。
[0299]
实施例4
[0300]
对于ocr1和具有表4所示的突变的转化体，分别实施以下的反应和评价。
[0301]
将转化体接种到含有浓度25mg/l的卡那霉素和浓度0.2mmol/l的iptg的lb液体培养基中，在37℃下振荡培养一夜。从得到的培养液中回收菌体，悬浮于浓度100mmol/l的磷酸钾缓冲液中，将装有悬浮液的容器浸入冰水中进行超声波破碎处理。对得到的菌体裂解液进行离心分离，得到菌体破碎物上清液。
[0302]
对于得到的菌体破碎物上清液，使用quick start bradford蛋白测定试剂盒(bio-rad
ラボラトリーズ
公司制)按照常规方法测定蛋白质浓度。
[0303]
另外，将得到的菌体破碎物上清液分成2份，1份在4℃～10℃下冷藏保存，另一份使用thermomixer r mixer(艾本德公司制)在50℃、200rpm下进行1小时加热处理。
[0304]
对于进行了冷藏保存或加热处理的各菌体破碎物上清液，将菌体破碎物上清液10μl、浓度1mol/l的磷酸钾缓冲液(ph7)25μl、浓度8mmol/l的nadph 10μl、水200μl和浓度0.1mol/l的2，2，2-三氟苯乙酮(tfap)的dmso溶液5μl混合。将混合物加入到96孔板(康宁公司制)中，使用酶标仪(美谷分子仪器公司制)测定2分钟内的340nm的吸光度变化。计算每单位时间的吸光度变化的平均值(mod/分钟)，由吸光度变化的斜率通过下述式计算每单位时间/每单位蛋白质的活性值。
[0305]
另外，对于进行了冷藏保存或加热处理的各菌体破碎物上清液，使用quick start bradford蛋白测定试剂盒(bio-rad
ラボラトリ
一
ズ
公司制)按照常规方法测定蛋白质浓度。
[0306]
需要说明的是，将nadph的摩尔吸光系数设为6.3ml/μmol
·
cm来进行计算。
[0307]
活性值(μmol/分钟/mg-蛋白质)＝(-1)
×
吸光度变化的斜率
×
250μl/10μl/6300/0.55/蛋白质浓度
[0308]
通过将如上得到的活性值代入下述式中来计算热处理前后的活性比，对热稳定性进行评价。将各转化体的热稳定性示于表4。
[0309]
热稳定性(％)＝加热处理时的活性值/冷藏保存时的活性值
×
100
[0310]
将热稳定性的值小于20％的情况评价为
“‑”
，将热稳定性的值为20％～70％范围
的情况评价为“+”，将热稳定性的值大于70％的情况评价为“++”。
[0311]
[表4]
[0312]
序列号突变热稳定性1无(ocr1)-6v166a+7a170s+10m249l+11a170s/m249l++12v166a/m249l++14v166a/a170s/m249l++
[0313]
由表4可知，具有a170s或m249l突变的突变体的热稳定性提高。特别是，具有a170s和m249l这两个突变的突变体的热稳定性进一步提高。即，明确了：由于a170s((c)突变)、m249l((f)突变)，热稳定性提高。
[0314]
另外，明确了：具有a170s、m249l和v166a突变中的2个以上的突变体的热稳定性提高。
[0315]
实施例5
[0316]
对于与实施例3同样地得到的ocr1和具有表6所示的突变的菌体破碎物上清液，测定酶活性。
[0317]
酶活性通过在表5所示组成的反应液中在反应温度30℃下以340nm的波长测定添加tfap时的nadph的减少量来确认。酶活性的单位u表示每1分钟的转化量(μmol)。
[0318]
[表5]
[0319][0320]
在以下的反应中，基于上述酶活性(单位：u)来称量羰基还原酶的量。
[0321]
另外，doxe和dole分别为具有以下结构的化合物。
[0322][0323]
制备含有浓度10g/l的doxe、浓度100mmol/l的磷酸缓冲液(ph6.0)、浓度120mmol/l的葡萄糖、浓度2mol％的nadp
+
、浓度20重量％的dmso、10u的羰基还原酶和5u～10u的葡萄糖脱氢酶的2ml反应液。边振荡反应液边在50℃下反应4小时。将得到的dole在测定条件3下进行hlpc分析。将结果示于表6。
[0324]
[表6]
[0325]
序列号突变dole转化率1无(ocr1)14.6％5d54v70.1％19m157v/a170s/m214l/m249l84.3％21d54v/m157v/a170s/m214l/m249l90.5％
[0326]
由表6可知，具有上述突变的突变体的dole转化率大幅提高。即，明确了：具有这些突变的突变体的羰基还原活性、反应效率大大提高。
[0327]
参考例2
[0328]
本参考例为国际公开第2015/119261号的实施例4-4中记载的方法。
[0329]
向1l的发酵罐(
エイブル
公司制、型号bmj-01)中加入离子交换水385.9ml、葡萄糖48.3g(268.1mmol)、nadp+(
オリエンタル
酵母公司制)138mg(0.18mmol)、磷酸氢二钾8.29g(47.6mmol)和磷酸二氢钾3.97g(29.2mmol)，使其溶解。向其中添加重组大肠杆菌jm109/pkv32ocr1-gdh的冷冻菌体50.60g、以及在dmso 124.20g(1589.7mmol)中溶解doxp 14.4g(27.7mmol)而制备的底物溶液的全部量，在内部温度50℃下搅拌5小时。反应中滴加25重量％氢氧化钠水溶液，使ph保持于6。通过hplc的保留时间(retention time)确认得到了dolp，此时的转化率为90.25％。
[0330]
在此，doxp和dolp分别为具有以下结构的化合物。
[0331][0332]
实施例6
[0333]
将实施例1中得到的转化体jm109/pkv32ocr1(具有a170s/i211a/m249l的突变的突变体(序列号16))-gdh接种到含有浓度25mg/l卡那霉素和浓度0.2mmol/l的iptg的lb液体培养基中，在37℃下振荡培养一夜。从得到的培养液中回收菌体，通过与参考例2同样的方法进行反应，得到dolp。
[0334]
将得到的dolp在测定条件4下进行hplc分析，结果，转化率为95.98％，与参考例2相比，转化率提高。
[0335]
明确了：由于具有a170s((c)突变)、i211a((d)突变)和m249l((f)突变)突变，反应效率提高。
[0336]
产业上的可利用性
[0337]
根据本发明，可以提供具有将含羰基化合物还原而转化为作为药品、农药等的中间体原料在产业上有用的化合物即光学活性化合物的活性的羰基还原酶、编码该羰基还原酶的核酸、含有该核酸的重组载体、含有该重组载体的转化体。而且，根据本发明，可以提供以高纯度、高光学纯度并且价格低廉地工业化地得到作为药物、农药等的中间体原料在产业上有用的光学活性化合物的制造方法，可以提高该药品、农药等的生产效率、增加其产量。
[0338]
本技术以在日本提出申请的日本特愿2019-211797(申请日：2019年11月22日)为基础，其内容全部包含在本说明书中。