在微流控装置中进行扩增反应的方法
1.本发明涉及一种用于在微流控装置中进行扩增反应的方法，其中该反应使用以荧光团和猝灭剂标记的起始物质以及用于通过能量转移激发荧光团的化学能量载体来进行。此外，本发明涉及用于进行这种扩增反应的试剂盒和微流控设备。
现有技术
2.聚合酶链反应（pcr）是20世纪80年代发展起来的一种快速且极为灵敏的dna分析方法。在特异性引物的帮助下，进行dna的限定的酶促体外复制，其中目标序列在多个周期内扩增。在最初应用放射性标记反应产物之后，期间又应用荧光来进行反应产物的检测。为此，可以使用以荧光团和猝灭剂标记的起始物质进行反应。为产生荧光，对具有相应激发波长的荧光团或荧光染料进行光学激发。如果荧光团附近有猝灭剂，则荧光被无辐射钝化。如果使荧光团和猝灭剂在进行扩增反应时彼此空间分离，则可以测量荧光。
3.例如，以荧光团标记的引物链或所谓的taqman探针可以用于所述反应，其含有空间上邻近的荧光团和猝灭剂。在聚合酶链式反应期间，掺入和/或水解这些链或探针，使得荧光团和猝灭剂之间的空间邻近被破坏，并且可以在光学激发后从反应产物中检测到荧光。激发光和荧光发射通常具有不同的波长（吸收和发射最大值之间的所谓“斯托克斯位移”）。这些波长可以借助检测装置中的滤光器彼此分离，从而在理想情况下检测器或检测照相机仅检测具有荧光发射波长的光。
4.发明公开本发明的优点本发明方法涉及用于在微流控装置中，例如在所谓硅微阵列细胞内的芯片实验室上，进行扩增反应。这种微流控装置已经例如用于医学诊断。使用荧光团和猝灭剂标记的起始物质进行扩增反应。在扩增反应中，荧光团和猝灭剂被分离，从而可以通过可检测的荧光发射来检测反应产物或者评估已经发生的扩增。根据所提出的方法，借助荧光发射通过添加至少一种能量转移物质并评估荧光团所发生的荧光发射来进行检测。与传统方法所不同的是，所提出的方法不需要对样品体积进行光学激发以便能够读出荧光。相反，荧光团的激发是通过在能量转移物质的帮助下转移化学能而发生的。
5.能量转移物质优选为一种或多种发光物质。发光的原因在于可以使相应的发光物质以光学、电学或化学方式处于激发能态。所提到的发光物质的激发能态通常是长寿命的，即其通常是禁止例如由于偶极子选择规则而由其光学变迁到基态的能态。例如，激发能态可以是所谓的三重态（t1），禁止由其光学变迁到单重基态（s0）。本发明利用发光物质的相对长寿命的化学激发性，因为来自长寿命激发态的能量可以特别容易地转移到其他分子，以便例如通过能量转移激发所提到的荧光团以进行荧光发射。通常通过化学反应，例如有或没有催化剂的氧化反应，来激发发光物质本身。所提出的方法的关键点因此在于荧光不是光学激发的，而是借助能量转移物质将能量转移到荧光团上，从而可以在邻近没有猝灭剂的情况下评估荧光团的荧光发射。因此，激发能量在扩增反应之后通过化学能量载体 ，特别是通过发光物质，而提供给猝灭的或未猝灭的荧光团。原则上，其他可化学激发的物质
也适合作为用于本发明目的的能量载体。其先决条件是激发态的寿命相对较长，以便能够安全且高效地将能量转移到荧光团。此外，用作能量载体的物质应该方便地是水溶性的，以便它们可以用于例如这类反应用的缓冲液体系中。
6.通过携带化学能的分子与合适的荧光团的这种新型组合可以省去光学激发。用于产生荧光的光学激发特别是在微流控装置的情况下通常是有问题的或昂贵的，因为特定强度和波长的尽可能均匀的光入射必须发生在微流控装置的最大可能区域上。这需要复杂且昂贵的光学器件，由于成本原因，这在微流控装置中是不可取的，特别是对于护理点装置和/或具有高通量的装置而言。通过使用根据本发明方法用于激发荧光团的能量传输物质，可以在进行扩增反应时省去这种复杂且昂贵的光学器件。因此，所提出的方法允许用于微流控装置中的扩增反应例如pcr反应和/或等温扩增反应的光学读出方法，而不需要用于激发光发射的光源和相应的光学装置。
7.所述发光物质可以是例如3-氨基邻苯二甲酰肼（5-氨基-2,3-二氢酞嗪-1,4-二酮；称为鲁米诺）和/或3-硝基邻苯二甲酰肼。这种发光物质的特征在于，它们通过提供的能量，特别是通过氧化反应，而进入激发态并在此过程中发光。由于这些是长寿命的激发能态，因此所提到的物质的发光相对较弱。在所提出的方法的范围内使用对应于光发射（发光辐射）的波长或相应量的能量值，以便无辐射地转移到荧光团上，从而激发与猝灭剂分离的荧光团的荧光。原则上，能量转移独立于发光辐射而发生。
8.导致分子激发并随后导致能量转移的反应优选基于化学反应，特别是基于氧化反应。在这方面，能量转移物质特别是从（催化的）氧化反应获得其化学激发能。特别地，过氧化氢或过氧化脲（即过氧化氢-尿素）可以用作氧化剂，因此在所提出的方法的范围内的检测优选在过氧化氢的存在下进行。特别优选的能量传输物质鲁米诺作为化学能量载体通过用过氧化氢氧化而转化为长寿命激发（三重态）状态。然后可以将这种存储的激发能量转移到其他荧光团，特别是发射更长波长的荧光团，从而使荧光能够作为扩增反应的证据。这种从仅为弱发光的鲁米诺或相关分子到强荧光分子（如若丹明或亚基马黄（亚基马黄））的能量转移总体导致光发射增加，因此也被称为“化学敏化”。
9.导致发光物质激发的氧化反应在此是由过氧化氢的分解驱动的。过氧化氢可以例如以过氧化脲的形式存在，即作为过氧化氢和脲（尿素）的混合物存在。 此外，可以附加地或替代地设置碱性条件用于检测，其中例如在含有发光物质的反应液中含有至少一种碱性物质。例如，可以提供稀氢氧化钠溶液或碳酸氢钠溶液，这些溶液增加发光物质如鲁米诺的溶解度，同时加速过氧化氢的分解。或者，可以使用适当的缓冲液。
10.在至少一种催化能量转移过程所基于的化学反应的催化剂的存在下进行检测是特别有利的。因此，催化剂优选催化氧化反应。 催化剂可以优选是六氰基高铁（iii）酸钾和/或过氧化锰和/或氢醌或相关物质，例如邻苯二酚或间苯二酚。 由于一些催化剂不与实际的扩增反应相互作用，因此在特别优选的实施方案中可以设计使这样的pcr（或扩增）相容的催化剂已经存在于微阵列细胞的微流控装置中。 例如，氢醌在这方面特别合适。 在其他配置中，可以例如使用酶促催化剂，例如辣根过氧化物酶 （hrp）。
11.优选通过用反应液体覆盖微流控装置（例如硅微阵列芯片）来添加至少一种能量传输物质，所述反应液体中包括至少一种能量传输物质和任选的其他组分，例如过氧化氢和任选的催化剂。覆盖微流控装置在此意味着将反应液体特别是在扩增反应结束之后引入
到微流控装置中，从而在微流控装置的反应空间上方进行覆盖。此处的反应液体是指其中发生能量传输物质的激发，即特别是发光物质的激发的液体。这优选是激发发光物质的氧化反应，然后发光物质可以将它们的化学能转移到荧光团。覆盖所具有的特殊优点在于，氧化反应和向荧光团的能量转移原则上仅发生在液体界面，在液体界面不同成分通过扩散混合，因此可以在时间上更好地利用用于评估的反应，并且可以在更长的时间段内检测产生的荧光。
12.在所提出方法的该实施方案中是利用化学激发的发光反应来激发荧光，其用作扩增反应的读出或检测反应。这一组合对于微流控装置是非常有利的，因为可以省略对于微流控装置而言通常难以实现的光学激发，并且可以代之以添加用于发光反应的适当试剂。就终点反应而言，这可以通过在扩增反应结束后用适当的反应液覆盖而以简单的方式进行。这种覆盖以简单的方式适用于自动化，因此该方法在具有高通量和低设备成本的微流控装置例如在医学诊断中的应用方面具有特别的优势。
13.在比优选使用的发光物质更长的波长范围内发射的荧光染料通常适合作为荧光团。其优点是干扰性发光辐射和实际评估感兴趣的荧光辐射可以很容易地通过滤光器彼此分离，从而可以在一定程度上屏蔽干扰性发光背景辐射以进行评估，以进行评估。若丹明b和/或其他若丹明和/或亚基马黄和/或cy-5特别适合作为荧光团，其中特别优选亚基马黄。 亚基马黄 的最大发射是在 550 nm，并延伸到 600 nm 以上。亚基马黄 的最大吸收是在 525 nm。鲁米诺的最大发光发射是在 425 nm 及更长波长，因此可以容易地进行向亚基马黄的非辐射能量转移。然而，亚基马黄的荧光发射波长（550 nm 或更高）和鲁米诺的“干扰”发光波长（425 nm 或更高）有明显差异，因此可以很容易地通过滤光片将它们分开，从而可以屏蔽鲁米诺的发光发射以进行评估。
14.在该方法的特别优选的实施方式中，通过使用至少一个用于将干扰的发光辐射与荧光辐射分离的滤光器来进行评估。滤光器适宜地与所使用的物质和它们的发射波长，即特别是发光发射波长和荧光发射波长相适配，从而在发光物质的情况下，发光发射波长被滤掉。例如，可以使用具有例如570nm的透射波长的光学带通滤光片和/或具有例如570nm起或更长的透射波长的光学截止滤光片来进行滤波，以便在使用鲁米诺和亚基马黄的情况下，可以以特别高的效率分离本示例中的两种发射。
15.在一个特别优选的实施方式中，扩增反应是终点反应，即特别是终点pcr或等温扩增反应的终点反应。当该方法在“终点”进行时，在扩增反应过程中没有读数，而是等待扩增反应结束，直到通过添加适当的物质或用适当的物质覆盖它们来开始检测反应，所述适当的物质特别是发光物质和引发发光反应所需的物质。在扩增反应过程之后，即当扩增反应在微流控装置的反应室中达到其终点时，可以用反应液覆盖微流控装置，该反应液包含能量转移物质和任选的其他物质，例如催化剂和作为氧化剂的过氧化氢。在 pcr 化学中已经有催化剂也是可能的和有利的。对于后一种情况，必须选择与 pcr 相容的催化剂，即不会对 pcr 产生负面影响的物质。例如，对苯二酚适用于此。由此产生能量转移物质，从而将其化学能转移给荧光团。如果由于已发生的扩增反应，荧光团与其猝灭剂在空间上分离，则可以检测到荧光作为已发生扩增反应的证据。因此，总的来说，荧光的光发射与无猝灭剂的荧光团的量成正比，而后者又与发生的扩增反应成正比。因此，荧光发射与形成的产物量成正比，因此可以借助荧光来评估扩增反应。
16.本发明还包括用于在微流控装置中进行扩增反应的试剂盒。该试剂盒优选包含两种反应混合物，其中第一反应混合物含有用于进行扩增反应的组分，第二反应混合物含有用于进行检测反应的组分。
17.第一反应混合物主要包含适合于反应的荧光读数并且特别是用一种或多种荧光团和猝灭剂标记的起始物质，例如适当标记的引物或探针。此外，第一反应混合物可以包含用于进行扩增反应的常规物质，例如用于常规pcr反应或等温扩增反应，例如缓冲液、核苷酸、引物和/或dna聚合酶。这些用于进行扩增反应的常规物质可以任选地包括在内，或者根据应用情形可以由用户提供和添加。此外，第一反应混合物还可以包含用于后续氧化反应（检测反应）的pcr相容催化剂。为了进行反应，还可以规定用户将pcr 相容催化剂添加到标准 pcr 试剂盒中，用于以后的氧化反应。此外，第一反应混合物可以已经包含至少一种能量转移物质，借助其根据所提出的方法进行检测反应。优选使用发光物质，特别是鲁米诺，作为能量传输物质。氧化剂，例如过氧化氢或过氧化脲，单独提供或在试剂盒的第二反应混合物中提供，因为它会干扰扩增反应。
18.试剂盒的第二反应混合物提供优选还包含引起反应的物质的组分，与该反应发生能量转移物质的激发。这些特别是用于氧化反应的物质，例如作为氧化剂的过氧化氢或过氧化脲和任选的一种或多种用于氧化反应的催化剂和/或合适的缓冲物质，例如用于设定合适的碱性条件。如已经提到的，催化剂也可以已经是试剂盒的上述第一反应混合物的组分，只要它是pcr相容的。使用试剂盒的反应混合物，可以以上述方式进行和评估扩增反应，其中在能量转移物质的帮助下，特别是在发光物质的帮助下，化学能转移到荧光团，其因此可以发射光（荧光），前提是相邻没有猝灭剂。关于用于进行扩增反应的试剂盒的其他特征，参见上述描述。
19.最后，本发明包括用于进行扩增反应的微流控装置。该装置的特征在于它被设置为进行所提出的方法。该设备尤其可以是芯片实验室，其包含具有大量微阵列细胞的硅芯片，如已知其用于进行小型化反应，例如医学诊断中的分子诊断反应。该微流控装置配置有荧光读数以进行扩增反应，其中反应中使用的起始物质用一种或多种荧光团和猝灭剂标记。在这种情况下，荧光不是像在传统方法中那样通过光学激发来激发，而是通过化学激发的分子，特别是发光分子的能量转移反应来激发，因此化学能被转移到荧光团上，导致发射荧光辐射，如果荧光团附近没有猝灭剂的话。为进行这种组合反应而设置的微流控装置的特征尤其在于例如提供用于激发能量转移物质的反应所需的催化剂和/或氧化剂。此外也可以提供适当的缓冲液。通常在终点反应意义上的扩增反应结束后才添加能量转移物质，例如通过用含有相应物质的相应反应液进行覆盖来添加。关于该微流控装置的进一步特征，参考以上描述。
20.本发明的其他特征和优点由以下结合附图对实施例的描述得出。各个特征可以分别单独地或相互组合地实现。
21.附图说明：图 1 荧光团亚基马黄的吸收和发射光谱，和图 2 鲁米诺的发射光谱。
22.实施例描述所提出的方法提供了一种用于在微流控装置中进行扩增反应的新方法，其中基于
荧光染料的扩增反应的已知检测方法与化学激发，特别是通过来自激发的分子的能量转移对荧光团的非辐射激发相结合。在与扩增反应结合使用的本身已知的荧光方法中，在扩增反应期间掺入或杂交或水解用荧光团标记的起始物质，例如荧光团标记的引物链或taqman探针。这些引物或探针含有一种或多种荧光团和一种直接相邻的猝灭剂。只要这一组合由荧光团和紧邻的猝灭剂组成，就不会发生荧光发射。特别是，只要这些带有荧光团和猝灭剂的引物链或探针在溶液中处于游离态，就不会由其发生荧光发射。通过将此类引物链或探针掺入扩增产物中，荧光团和猝灭剂才会被分裂并在空间上分离，或者猝灭剂从携带荧光团的分子中分离出来。这种荧光团现在可以在激发后发射荧光辐射，并代表形成的扩增产物的量的量度。使用这种方法，通过基于化学反应将能量转移到荧光团可以省去复杂和昂贵的光学器件，这些光学器件在荧光检测反应中传统上对于光学激发是必需的。
23.所提出的方法可以特别用于在硅微阵列或另一个微流控装置中的单重或多重的终点pcr反应或等温终点扩增反应，其中所述掺入由猝灭剂和荧光团组成的分子对发生在扩增反应过程中和/或这种起始物质的水解发生在扩增产物的形成过程中。在扩增反应结束后，即一旦阵列细胞中的扩增反应基本达到其终点，可以用含有能量转移物质，特别是发光物质的反应液覆盖微流控装置。激发后，这些物质可以在较长时间内携带化学能（不管它们是否发光），因此这种能量可以在没有辐射的情况下转移到荧光团上。
24.能量转移物质的激发所基于的反应，特别是氧化反应，可以通过催化剂来加速。赤血盐（六氰基高铁（iii）酸钾）或对苯二酚或其他氧化催化剂特别适用于此。该催化剂可以添混到过氧化氢、鲁米诺和合适的缓冲剂的反应混合物中。一些催化剂也可以直接预置在微流控装置的阵列细胞中，只要它们不干扰实际的扩增反应即可，例如，许多氢醌就是这种情况。合适催化剂的其他可能性是例如二氧化锰（褐石），其同样可以预置在阵列细胞中，特别是以悬浮液的形式。二氧化锰不溶于水，因此不会干扰扩增反应。当与过氧化氢接触时，二氧化锰催化过氧化氢分子的分解和能量转移物质（如鲁米诺）的氧化，变成长寿命的激发态。此外，二氧化锰是一种非常便宜且无害的化合物，因此特别适合作为过氧化氢分解和引发鲁米诺后续氧化的固体催化剂。
25.原则上，所有发射波长比所用能量传输或发光物质更长的荧光染料都适合作为荧光团。例如，可以与鲁米诺组合用作发光物质的合适的荧光团是若丹明b、其他若丹明、亚基马黄或cy-5。图 1 显示了亚基马黄的吸收和发射光谱。其中最大吸收位于 525 nm，最大发射是在550 nm，且发射延伸到明显更长的波长，直至超过 600 nm。鲁米诺的发射光谱如图 2 所示：发射最大值在 425 nm 处，并且发射延伸到明显更长的波长。因此，鲁米诺的激发能量可以导致亚基马黄的激发。为了评价亚基马黄的荧光发射，有利的是，两种发射，即鲁米诺的干扰发光和亚基马黄的荧光发射，可以很容易地通过滤光片相互分离，从而使鲁米诺的发光发射不干扰评价检测反应相关的荧光发射或与之叠加。
26.具有荧光团亚基马黄和猝灭剂的常规探针原则上基于使猝灭剂耦合到荧光团的桥结构。 当以这种方式标记的探针退火或连接到 dna链时，桥打开，从而猝灭剂在空间上与荧光团亚基马黄分离。
27.终点pcr或等温终点扩增反应的读出方式可以在技术上以低成本实现。单个反应不允许定量报告，但在可能的高多重度时，一般不再要求“定量”特征。由于所提出的方法的特殊优点，其中避免了样品体积的光激发，例如具有非常多阵列细胞和不同检测反应的大
面积硅微阵列可以被并行处理和读取。
28.在进行该方法时，可以首先使用适合荧光读出的引物和/或探针进行自身已知的扩增反应。在达到扩增反应的终点后，用于根据本发明的检测反应的反应混合物，其例如由水、鲁米诺、过氧化氢/尿素（过氧化脲）和赤血盐（六氰基高铁（iii）酸钾）作为导致激发能量转移物质的反应的催化剂构成，可以在微流控装置中缓慢进给pcr多阵列芯片，以便缓慢掩盖扩增反应的反应物料。为了支持检测反应，特别是为了使过氧化氢去稳定和增加鲁米诺的溶解度，例如可以添加少量氢氧化钠溶液或碱性缓冲液（例如碳酸氢钠），其中可以在微流控装置中预先存储适当的缓冲液。
29.用于激发能量转移物质的反应的物质可以在检测反应开始时直接添加，或者可以部分预置在阵列细胞中或芯片实验室系统的其他部位。这种芯片实验室系统的特殊优势是，其中所有必需的试剂都可以在适当的位置并以适当的方式预置。特别是，与pcr相容的催化剂（如对苯二酚）适合预置在硅芯片的阵列细胞中，因为对苯二酚不干扰扩增反应。另一个特别合适的可能性是在阵列细胞中预置作为水不溶性固体催化剂的二氧化锰（褐石）。作为水不溶性物质的二氧化锰通常也不会干扰水溶液中发生的扩增反应。由于二氧化锰是过氧化氢的非常有效的分解催化剂并因此用于鲁米诺的氧化，二氧化锰也以特别的方式适合作为发光物质特别是鲁米诺的化学激发的起点。激发的鲁米诺将其能量转移到荧光团，例如亚基玛黄。如果荧光团亚基马黄在空间上与其猝灭剂分离，即特别是如果亚基马黄引物或亚基马黄探针与dna链结合并从而分离猝灭剂，则亚基马黄可以发出荧光。为了读出荧光辐射，可以优选的方式任选地与阻止小于580 nm的短波长发射的附加边缘滤波器相组合使用光学滤波器（例如570
–
580 nm），以抑制干扰评估的鲁米诺发光辐射。
30.例如，本身非本发明主题的来自制造商的市售专有pcr试剂盒被用作在阵列细胞中进行pcr的反应物料。所选pcr试剂盒可任选地通过适当的pcr相容催化剂和额外的缓冲物质进行补充，以使其最佳地适配硅片中阵列细胞的环境。此外，pcr试剂盒优选应使用亚基马黄或合适的若丹明作为本说明书意义内的检测荧光团。
31.用于在阵列细胞中完成pcr后覆盖pcr试剂盒以触发检测反应的示例性反应物料可包括以下组分和浓度：
•ꢀ
超纯水
•ꢀ
过氧化氢0.1至10%（相应于30毫摩尔浓度
–
3摩尔浓度），优选0.5至5%（相应于150 毫摩尔浓度
–
1.5摩尔浓度）
•ꢀ
或者，过氧化脲（过氧化氢-尿素）30毫摩尔浓度
–
3摩尔浓度，优选150毫摩尔浓度
–
1.5摩尔浓度
•ꢀ
氢氧化钠10毫摩尔浓度
–
1摩尔浓度，优选50
–
500毫摩尔浓度，尤其优选100-150毫摩尔浓度
•ꢀ
或者，碳酸氢钠50毫摩尔浓度
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1摩尔浓度，优选100-500毫摩尔浓度
•ꢀ
鲁米诺10毫摩尔浓度
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150毫摩尔浓度，尤其优选50
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100毫摩尔浓度
•ꢀ
催化剂（对苯二酚、辣根过氧化物酶hrp、二氧化锰、六氰基高铁（iii）酸钾）10毫摩尔浓度
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1摩尔浓度，优选50毫摩尔浓度
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500毫摩尔浓度，尤其优选100毫摩尔浓度。