转录调节元件
发明领域
1.本发明涉及转录调节元件(tre)，例如启动子，其可用于在细胞如哺乳动物细胞内表达转基因。本发明还涉及包含可与转基因可操作地连接的此类转录调节元件的多核苷酸和载体，以及基于使用此类载体的基因治疗方法。
2.发明背景
3.重组腺相关病毒(raav)载体由于其有希望的安全性和在体内转导许多组织的能力而具有相当大的基因治疗潜力。使用此类载体的早期临床试验已显示出巨大的前景，包括在接受治疗的患者中长期表达，几乎没有或没有持续毒性和最小的不良免疫反应。
4.然而，正如本领域一段时间以来已经认识到的(参见，例如，chao et al.(2000)blood,vol.95(5))，raav载体的一个特别的缺点是它们的限制性包装能力。具体而言，野生型(wt)aav的基因组约为4.6至4.7千碱基(kb)，并且有证据表明raav基因组大大超过此长度会导致具有次优效力和质量相关属性的异质颗粒群。当试图为更大的生物分子包含转基因时，这可能会导致问题：例如，全长因子viii(fviii)cdna超过7kb，这对于raav中的有效包装来说太大了。已知缺乏中央b结构域并保留其凝血功效的截短形式的因子viii(称为fviii-sq)用于例如在血友病a的治疗中有一段时间了(lind et al.1995.eur j biochem 232,19-27)。然而，即使是这种截短的b结构域缺失的因子viii cdna也约为4.4kb。
5.先前尝试将截短的因子viii(fviii)转基因整合到raav中的导致aav基因组比野生型更长(chao等人报告了两种构建体，它们都比野生型的4.6至4.7kb长)。问题部分在于功能性raav载体不仅需要转基因，还需要许多其他特征，例如转录调节元件(启动子/增强子)、反向末端重复序列(itr)和多腺苷酸化序列(多a)。包含所有这些所需要的特征几乎无一例外地导致了比野生型(wt)基因组长的raav载体质粒。
6.已知许多转录调节元件(启动子/增强子)可用于raav载体。一些已知的转录调节元件在以下参考文献中有更详细的描述：wo16/181122(hlp2)；nathwani et al.,blood.2006april 1,107(7):2653
–
2661(lp1)；miao et al.,mol ther.2000；1:522-532(hcr-haat)；okuyama et al.,human gene therapy,7,637-645(1996)(apoe-haat)；和wang et al.,proc natl acad sci u s a.1999march,96(7):3906
–
3910(lsp)。此类转录调节元件通常包含启动子、增强子和任选的其他核苷酸。
7.因此，raav载体基因组的大小(即长度)将——至少部分地——由转录调节元件、转基因等的大小定义，并且如上所述，这些特征的性质将部分或完全由待使用raav的应用定义。
8.希望能够产生更接近野生型aav基因组长度的raav载体，包括在包含长转基因的表达盒的情况下，而并入较小的转录调节元件将有助于实现这一目标。
9.发明概述
10.本发明涉及已知hlp2转录调节元件(tre)的缩短形式，其中如下文更详细描述的，hlp2 tre中存在的至少一些核苷酸序列被缺失、改变或截短。本发明的短转录调节元件优于已知的hlp2 tre，因为它们具有更短的大小，同时保留了至少某种程度的功能，以及潜在
地与下文详细描述的其他出乎意料的优点相关。
11.本发明人出乎意料地确定已知hlp2 tre内的大量区域可以被缺失、截短或修饰，而对tre的功效没有显著的不利影响。一些情况下，如下文所示例的，本发明人出乎意料地发现，可以制备尽管长度相当更短但具有与hlp2 tre相当的功效(即相比之下约50％或更好的活性)的截短形式的hlp2 tre(即具有更少的核苷酸的更短的形式)。在一些情况下，本发明的短转录调节元件可能比hlp2或其他已知的转录调节元件如hcr-haat具有更大的功效。
12.具体而言，本发明人已经确定了存在于hlp2 tre中并且对于本发明的所有转录调节元件是共有的“核心”区域(其也可以描述为“核心序列”或“核心核苷酸序列”或“共有区域”或“共有核苷酸序列”——所有这些术语都应被认为是同义词)。如下文详细阐述的，“核心”区域本身可以具有一些作为tre的最小功效，但是当通过包含其他核苷酸而略微延长时(例如，通过产生本文定义为“延伸核心”区域)功效出乎意料地显著增加。术语“延伸核心区域”或“延伸核心序列”或“延伸核心核苷酸序列”或“延伸共有区域”或“延伸共有核苷酸序列”应被认为是同义词。
13.因此，本发明人成功地获得了与hlp2 tre相比大小减小(即，更短)的转录调节元件。具有较短的转录调节元件是有利的，因为它可以减少raav基因组的整体大小(或长度)。这进而允许制造具有更接近野生型基因组长度的基因组并因此更有效地包装的raav载体。
14.毫无疑问，可能存在需要使用更短得多的转录调节元件的情况，并且关于所述转录调节元件的较低活性水平可以以其他方式补偿，例如，通过使用编码相对于野生型蛋白质具有更高活性水平的蛋白质的转基因。这样的一个例子是已知的“padua”因子ix突变体，其在338位具有亮氨酸而不是精氨酸(r338l)，如例如在wo 99/03496(stafford等人)中公开的。
15.因此应当理解，与hlp2相比具有更短长度的转录调节元件是有利的，只要它与hlp2相比保留至少一些活性。还应当理解，与hlp2相比，具有更短长度和更高活性水平的转录调节元件既出乎意料又非常有利。
16.因此，本发明提供了包含核心核苷酸序列的转录调节元件，核心核苷酸序列包含与seq id no:2具有至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列或由其组成，或者其与seq id no:2相差单个核苷酸，并且其中转录调节元件的长度为80至280个核苷酸；并且任选地其中转录调节元件的长度为80至225个核苷酸。任选地，如果多核苷酸和/或转录调节元件包含转录调节元件例如本发明的转录调节元件的全部或部分的多个拷贝，则在为了确定它的长度时所有拷贝都应被认为是转录调节元件的一部分。例如，在包含由seq id no:2的核心区域的两个拷贝组成的tre的多核苷酸中，tre将被认为具有两倍于核心核苷酸序列的长度(即2x 73或146个核苷酸)。
17.此外，本发明人已经鉴定了hlp2 tre的特定区域，这些特定区域可以被缺失、截短或修饰以产生本发明的转录调节元件，以最小化转录调节元件的大小并因此使raav基因组的总大小最小化。
18.因此，本发明提供了一种转录调节元件，其包含核心核苷酸序列，核心核苷酸序列包含与seq id no:2具有至少95％同一性或至少98％同一性的核苷酸序列或由其组成，或者其与seq id no:2相差单个核苷酸，其中：
19.a.转录调节元件不含seq id no:4所示的核苷酸序列；
20.和/或
21.b.转录调节元件不含seq id no:5所示的核苷酸序列；
22.并且其中转录调节元件的长度为80至280个核苷酸；并且任选地其中转录调节元件的长度为80至225个核苷酸。
23.本发明或者可以被定义为提供一种转录调节元件，其包含：
24.a.核心核苷酸序列，其包含与seq id no:2具有至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列或由其组成，或者其与seq id no:2相差单个核苷酸；和
25.b.核苷酸序列，其位于核心核苷酸序列的5'并且与包含seq id no:4的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或45个连续核苷酸的核苷酸序列具有小于60％的同一性；
26.其中转录调节元件的长度为80至280个核苷酸；并且任选地其中转录调节元件的长度为80至225个核苷酸。
27.如下文将显示的，与hlp2 tre相比，即使是80个核苷酸左右的转录调节元件也显示出出乎意料的功效水平。然而，本发明人已发现可以通过包含额外的核苷酸序列来提高本发明的转录调节元件的功效。此类转录调节元件的特征可能是包含位于核心核苷酸序列的5'或3'的来自hlp2 tre或来自其他tre(例如已知的f2启动子/增强子)的核苷酸序列。
28.因此，本发明的转录调节元件还可包含位于核心核苷酸序列3'的核苷酸序列。
29.位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列可包含一个或多个转录起始位点(tss)，其可包含以下的核苷酸序列或由其组成：
30.a.seq id no:6，或与seq id no:6相差单个核苷酸的核苷酸序列；
31.b.seq id no:7，或与seq id no:7相差单个核苷酸的核苷酸序列；和/或
32.c.seq id no:8，或与seq id no:8相差单个核苷酸的核苷酸序列。
33.位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列可包含：
34.a.seq id no:6所示的核苷酸序列，或与seq id no:6相差单个核苷酸的核苷酸序列；或
35.b.与seq id no:9具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:9相差单个核苷酸的核苷酸序列；或
36.c.与seq id no:10具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:10相差单个核苷酸的核苷酸序列。
37.位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列可包含或还可包含由seq id no:11定义的核苷酸序列，或与seq id no:11相差单个核苷酸的核苷酸序列。
38.位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列可包含长度短于50个核苷酸的核苷酸序列。它可短于40个核苷酸。它可短于30个核苷酸。
39.位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列可包含选自以下的核苷酸序列或由其组成：
40.a.与seq id no:10具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:10相差单个核苷酸的核苷酸序列；
41.b.与seq id no:12具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:12相差单
个核苷酸的核苷酸序列；和
42.c.与seq id no:13具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:13相差单个核苷酸的核苷酸序列。
43.本发明的转录调节元件还可包含位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列。
44.位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列可包含：
45.a.包含seq id no:14的至少10个、至少15个或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列；
46.b.与seq id no:14具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:14相差单个核苷酸的核苷酸序列；
47.c.包含seq id no:15的至少10个、至少15个或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列；
48.d.与seq id no:15具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:15相差单个核苷酸的核苷酸序列；
49.e.包含seq id no:16的至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个或至少90个连续核苷酸的核苷酸序列；
50.f.与seq id no:16具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:16相差单个核苷酸的核苷酸序列；
51.和/或
52.g.由seq id no:17定义的核苷酸序列，或与seq id no:17相差单个核苷酸的核苷酸序列。
53.位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列可包含可由seq id no:30定义的增强子序列或与seq id no:30相差单个核苷酸的核苷酸序列。增强子序列可以作为重复基序出现不止一次。它可能会出现两次、三次或更多次。一个增强子序列可以与另一个增强子序列直接相邻。
54.位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列可包含源自另一转录调节元件的核苷酸序列。该核苷酸序列可包含另一转录调节元件的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个或至少80个连续核苷酸。其它转录调节元件可以是人转录调节元件。其他转录调节元件可以选自f2(凝血酶原)、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、ambp、触珠蛋白和甲状腺素转运蛋白(ttr)。
55.优选位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列可与包含seq id no:4的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或45个连续核苷酸的核苷酸序列具有小于60％的同一性。它可与包含seq id no:4的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或45个连续核苷酸的核苷酸序列具有小于50％的同一性。它可以具有小于45％的同一性。它可以具有小于40％的同一性。它可以具有小于30％的同一性。
56.位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列可包含长度短于110个核苷酸的核苷酸序列。它可以短于100个核苷酸。它可以短于50个核苷酸。它可以短于10个核苷酸。它的长度可以为5至110个核苷酸。它的长度可以为至少7个核苷酸。它的长度可以为102个核苷酸或更短。
57.位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列可包含选自以下的核苷酸序列：
58.a.与seq id no:18具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:18相差单个核苷酸的核苷酸序列；
59.b.与seq id no:19具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:19相差单个核苷酸的核苷酸序列；
60.c.与seq id no:20具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:20相差单个核苷酸的核苷酸序列；
61.d.与seq id no:21具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:21相差单个核苷酸的核苷酸序列；
62.e.与seq id no:22具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:22相差单个核苷酸的核苷酸序列；和
63.f.seq id no:23所示的核苷酸序列，或与seq id no:23相差单个核苷酸的核苷酸序列。
64.优选本发明的转录调节序列不含：
65.a.seq id no:4所示的核苷酸序列，或不含seq id no:4的至少20个、至少30个或至少40个连续核苷酸；
66.和/或
67.b.seq id no:5所示的核苷酸序列，或不含seq id no:5的至少20个、至少30个或至少40个连续核苷酸。
68.具体而言，本发明的转录调节序列可不含：
69.a)与seq id no:4具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列；
70.和/或
71.b)与seq id no:5具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列
72.本发明的转录调节序列可短于200个核苷酸。它可以短于150个核苷酸。它可以短于125个核苷酸。
73.本发明的转录调节序列的长度可为至少85个或至少100个核苷酸。它的长度可以为至少110个核苷酸。
74.本发明的转录调节序列可终止于选自以下的十核苷酸序列：
75.a.acagtgaatc；或
76.b.ctcctcagct。
77.本发明人已鉴定的“核心核苷酸序列”的长度可以为73至80个核苷酸。“核心核苷酸序列”可以与seq id no:2具有至少95％的同一性，并且任选地具有至少98％的同一性。“核心核苷酸序列”可以与seq id no:2相同。
78.本发明人已经鉴定了本发明的转录调节元件的子集，其中“核心核苷酸序列”稍长(称为“延伸核心核苷酸序列”)。“延伸核心核苷酸序列”可以与seq id no:3具有至少95％的同一性，并且任选地具有至少98％的同一性。“延伸核心核苷酸序列”可以与seq id no:3相同。
79.本发明人已经鉴定了本发明特别优选的转录调节元件。这些转录调节元件在下文中进行示例和详细讨论。
80.本发明特别优选的转录调节元件可具有与选自以下的核苷酸序列具有至少90％
同一性、任选地至少95％同一性或任选地至少98％同一性的核苷酸序列：
81.a.seq id no:24；
82.b.seq id no:25；
83.c.seq id no:26；
84.d.seq id no:27；
85.e.seq id no:28；和
86.f.seq id no:29。
87.seq id no:24定义了本发明的转录调节元件(分配内部名称“fre43”)，其具有以下实例中详述的特性。它包含hlp2核苷酸170-242(如本文参考seq id no:1所定义)的“核心核苷酸序列”，而5'部分缺少hlp2的核苷酸99-169(并因此完全缺少hlp2的核苷酸118-162)并包括hlp2的核苷酸1-98。3'部分包括hlp2的核苷酸243-335。fre43的总长度为264个核苷酸。
88.因此，fre43提供了本发明的转录调节元件，其(尤其是)：
89.·
包含由seq id no:2定义的核心核苷酸序列；
90.·
不含seq id no:4所示的核苷酸序列；
91.·
包含位于核心核苷酸序列的5'并且与seq id no:4具有小于60％同一性的核苷酸序列；
92.·
包含位于核心核苷酸序列的3'的能由seq id no:9或seq idno:10定义并且包括由seq id no:6、7和8定义的3个tss的核苷酸序列；并且
93.·
包含位于核心核苷酸序列的3'的还包括seq id no:11的核苷酸序列。
94.应当理解，由于fre43的3'部分包括hlp2的核苷酸243-335，它可以定义为包含seq id no:9或可以定义为包含seq id no:10。
95.fre43也可以定义为提供由seq id no:2定义的核心核苷酸序列；由seq id no:18定义的5'区域；以及由seq id no:12定义的3'区域。
96.seq id no:25定义了本发明的转录调节元件(分配内部名称“fre49”)，其具有以下实施例中详述的特性。它包含hlp2核苷酸163-242的“延伸核心核苷酸序列”，而5'部分缺少hlp2的核苷酸1-11和核苷酸42-162(并因此完全缺少hlp2的核苷酸118-162)并包括hlp2的核苷酸12-41。3'部分缺少hlp2的核苷酸243-296(并因此完全缺少hlp2的核苷酸243-283)并包括hlp2的核苷酸297-335。fre49的总长度为149个核苷酸。
97.因此，fre49提供了本发明的转录调节元件，其(尤其是)：
98.·
包含由seq id no:3定义的延伸核心核苷酸序列；
99.·
不含seq id no:4所示的核苷酸序列；
100.·
不含seq id no:5所示的核苷酸序列；
101.·
包含位于核心核苷酸序列的5'并且与seq id no:4具有小于60％同一性的核苷酸序列；并且
102.·
包含位于核心核苷酸序列的3'的由seq id no:10定义并且包括由seq id no:6、7和8定义的3个tss的核苷酸序列。
103.fre49也可定义为提供由seq id no:3定义的延伸核心核苷酸序列；由seq id no:19定义的5'区域；和由seq id no:10定义的3'区域。
104.seq id no:26定义了本发明的转录调节元件(分配内部名称“fre56”)，其具有以下实施例中详述的特性。它包含hlp2核苷酸170-242的“核心核苷酸序列”，而5'部分包含源自f2 tre的核苷酸序列。3'部分缺少hlp2的核苷酸243-264、核苷酸273-283和核苷酸303-335(并且因此不包括由hlp2的核苷酸243-283定义的核苷酸序列)并包括hlp2的核苷酸265-272和284-302。fre56的总长度为181个核苷酸。
105.因此，fre56提供了本发明的转录调节元件，其(尤其是)：
106.·
包含由seq id no:2定义的核心核苷酸序列；
107.·
不含seq id no:4所示的核苷酸序列；
108.·
不含seq id no:5所示的核苷酸序列；
109.·
包含位于核心核苷酸序列的5'并且与seq id no:4具有小于60％同一性的核苷酸序列；
110.·
包含位于核心核苷酸序列的3'的由seq id no:9定义并且包括由seq id no:6定义的tss的核苷酸序列；并且
111.·
包含位于核心核苷酸序列的3'的还包括seq id no:11的核苷酸序列。
112.fre56也可以定义为提供由seq id no:2定义的核心核苷酸序列；由seq id no:20定义的5'区域；以及由seq id no:13定义的3'区域。
113.seq id no:27定义了本发明的转录调节元件(分配内部名称“fre59”)，其具有以下实施例中详述的特性。它包含hlp2核苷酸163-242的“延伸核心核苷酸序列”，而5'部分缺少hlp2的核苷酸1-11、核苷酸71-92、核苷酸101-105和核苷酸113-133(并因此不包括hlp2的核苷酸118-162定义的核苷酸序列)并包括hlp2的核苷酸12-33。fre59的5'部分还包括至少部分对应于hlp2的核苷酸170-242的核苷酸序列(即，对应于“核心区域”的核苷酸序列)：fre59序列(seq id no:27)的核苷酸23-95与核心区域(seq id no:2)的核苷酸1-73相同。3'部分缺少hlp2的核苷酸243-264、核苷酸273-283和核苷酸303-335(并因此不包括由hlp2的核苷酸243-283定义的核苷酸序列)并包括hlp2的核苷酸265-272和284-302。fre59的总长度为202个核苷酸。
114.因此，fre59提供了本发明的转录调节元件，其(尤其是)：
115.·
包含由seq id no:3定义的延伸核心核苷酸序列；
116.·
不含seq id no:4所示的核苷酸序列；
117.·
不含seq id no:5所示的核苷酸序列；
118.·
包含位于核心核苷酸序列的5'并且与seq id no:4具有小于60％同一性的核苷酸序列；
119.·
包含位于核心核苷酸序列的3'的由seq id no:9定义并且包括由seq id no:6定义的tss的核苷酸序列；并且
120.·
包含位于核心核苷酸序列的3'的还包括seq id no:11的核苷酸序列。
121.fre59也可定义为提供由seq id no:3定义的延伸核心核苷酸序列；由seq id no:21定义的5'区域；以及由seq id no:13定义的3'区域。5'区域还可定义为包含核心区域(即seq id no:2)所示的核苷酸序列。
122.seq id no:28定义了本发明的转录调节元件(分配为内部名称“fre63”)，其具有以下实施例中详述的特性。它包含hlp2的核苷酸163-242的“延伸核心核苷酸序列”，而5'部
分缺少hlp2的核苷酸1-11、核苷酸36-72、核苷酸99-104和核苷酸121-125(并因此不包括由hlp2的核苷酸118-162定义的核苷酸序列)并且包括hlp2的核苷酸12-33。fre63的5'部分还包括至少部分对应于hlp2的核苷酸170-242的核苷酸序列(即，对应于“核心区域”的核苷酸序列)：序列比较(未显示)表明fre63序列的核苷酸29-100(seq id no:28)与核心区域(seq id no:2)的核苷酸2-73相同。3'部分缺少hlp2的核苷酸243-264、核苷酸273-283和核苷酸303-335(并因此不包括由hlp2的核苷酸243-283定义的核苷酸序列)并包括hlp2的核苷酸265-272和284-302。fre63的总长度为207个核苷酸。
123.因此，fre63提供了本发明的转录调节元件，其(尤其是)：
124.·
包含由seq id no:3定义的延伸核心核苷酸序列；
125.·
不含seq id no:4所示的核苷酸序列；
126.·
不含seq id no:5所示的核苷酸序列；
127.·
包含位于核心核苷酸序列的5'并且与seq id no:4具有小于60％同一性的核苷酸序列；
128.·
包含位于核心核苷酸序列的3'的由seq id no:9定义并且包括由seq id no:6定义的tss的核苷酸序列；并且
129.·
包含位于核心核苷酸序列的3'的还包括seq id no:11的核苷酸序列。
130.fre63也可定义为提供由seq id no:3定义的延伸核心核苷酸序列；由seq id no:22定义的5'区域；以及由seq id no:13定义的3'区域。5'区域还可定义为包含核心区域(即seq id no:2)的部分序列(核苷酸2-73)。
131.seq id no:29定义了本发明的转录调节元件(分配内部名称“fre72”)，其具有以下实施例中详述的特性。它包含hlp2核苷酸163-242的“延伸核心核苷酸序列”，而5'部分缺少hlp2的核苷酸1-162(并因此完全缺少hlp2的核苷酸118-162)。因此，fre72可以定义为不具有5'部分(即不具有位于“延伸核心核苷酸序列”的5'的核苷酸序列)。或者，如果fre72相反被认为具有hlp2的核苷酸170-242的核心核苷酸序列，那么它可以被认为具有由hlp2的核苷酸163-169组成的5'部分。3'部分缺少hlp2的核苷酸243-296(并因此完全缺少hlp2的核苷酸243-283)并包括hlp2的核苷酸297-335。fre72的总长度为119个核苷酸。
132.因此，fre72提供了本发明的转录调节元件，其(尤其是)：
133.·
包含由seq id no:3定义的延伸核心核苷酸序列；
134.·
不含seq id no:4所示的核苷酸序列；
135.·
不含seq id no:5所示的核苷酸序列；
136.·
包含位于核心核苷酸序列的5'并且与seq id no:4具有小于60％同一性的核苷酸序列；并且
137.·
包含位于核心核苷酸序列的3'的由seq id no:10定义并且包括由seq id no:6、7和8定义的3个tss的核苷酸序列。
138.fre72也可以定义为提供由seq id no:2定义的核心核苷酸序列；由seq id no:23定义的5'区域；以及由seq id no:10定义的3'区域。
139.或者，fre72可定义为提供由seq id no:3定义的延伸核心核苷酸序列；以及由seq id no:10定义的3'区域。
140.鉴于上述内容，应当理解，当本发明的转录调节元件包含由seq id no:3定义的“延伸核心”序列时，5'区域(其中存在5'区域的情况下)可包含具有由seq id no:2定义的“核心核苷酸序列”的至少60个、至少70个或至少71个或72个核苷酸的核苷酸序列。
141.因此，本发明提供本发明的转录调节元件，其包含：
142.(a)
‘
延伸核心’序列，其包含与seq id no:3具有至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列或由其组成；和
143.(b)位于延伸核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列，其包含与seq id no:2具有至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列；
144.其中转录调节元件的长度为80至280个核苷酸。
145.5'区域可包含如上列出的其他元件(例如，包含seq id no:14的至少10个、至少15个或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列)。
146.转录调节元件可以另外包含如上定义的3'区域。
147.完全考虑的是，基于本技术的总体教导，本领域技术人员将理解来自可以组合任何一种或多种以上定义的转录调节元件的单个元件，以获得一种或多种本发明的另外的转录调节元件。
148.因此，本发明提供由seq id no:1(hlp2 tre)定义的核苷酸序列所示或源自其的转录调节元件，其中转录调节元件包含：
149.(a)核心核苷酸序列，其包含与以下具有至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列或由其组成：
150.(i)根据seq id no:1编号的核苷酸170-242；
151.或
152.(ii)根据seq id no:1编号的核苷酸163-242；
153.(b)位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的一个或多个缺失，其中缺失选自：
154.(i)根据seq id no:1编号的核苷酸1-11；和/或
155.(ii)根据seq id no:1编号的核苷酸36-72；和/或
156.(iii)根据seq id no:1编号的核苷酸71-92；和/或
157.(iv)根据seq id no:1编号的核苷酸99-104；和/或
158.(v)根据seq id no:1编号的核苷酸101-105；和/或
159.(vi)根据seq id no:1编号的核苷酸121-125；和/或
160.(vii)根据seq id no:1编号的核苷酸42-162；和/或
161.(viii)根据seq id no:1编号的核苷酸113-133；和/或
162.(ix)根据seq id no:1编号的核苷酸1-162；
163.(c)任选地位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列的一个或多个缺失，其中缺失选自：
164.(i)根据seq id no:1编号的核苷酸243-296；和/或
165.(ii)根据seq id no:1编号的核苷酸243-264；和/或
166.(iii)根据seq id no:1编号的核苷酸273-283；和/或
167.(iv)根据seq id no:1编号的核苷酸303-335；
168.并且其中转录调节元件的长度为80至280个核苷酸。
169.在另一实施方案中，本发明提供由seq id no:1(hlp2 tre)定义的核苷酸序列所
示或源自其的转录调节元件，其中转录调节元件包含核心核苷酸序列并具有来自由seq id no:1的核苷酸1-162定义的核苷酸序列的一个或多个缺失，所述核心核苷酸序列包含与根据seq id no:1编号的核苷酸170-242或核苷酸163-242具有至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列或由其组成。
170.一个或多个缺失可以来自由seq id no:1的核苷酸1-162定义的核苷酸序列的5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160个或162个连续核苷酸。
171.转录调节元件还可包含来自由根据seq id no:1编号的核苷酸243-335定义的核苷酸序列的一个或多个缺失。
172.一个或多个缺失可以来自由seq id no:1的核苷酸243-335定义的核苷酸序列的5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85个或90个连续核苷酸。
173.一个或多个缺失可以来自由seq id no:1的核苷酸243-283定义的核苷酸序列的5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85个或90个连续核苷酸。
174.一个或多个缺失可以来自由seq id no:1的核苷酸243-296定义的核苷酸序列的5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85个或90个连续核苷酸。
175.一个或多个缺失可以来自由seq id no:1的核苷酸303-335定义的核苷酸序列的5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85个或90个连续核苷酸。
176.由seq id no:1(hlp2 tre)定义的核苷酸序列所示或源自其的转录调节元件可包括如上定义的5'和/或3'区域。
177.本发明的转录调节元件可包含或可为启动子。启动子可以是肝特异性启动子和/或还可包含增强子。任选地，转录调节元件是肝特异性的。在一些实施方案中，如果与来自至少一种其他器官或组织的细胞相比，转录调节元件或启动子在肝细胞中以更高水平促进蛋白质表达，则它是肝特异性的。
178.任选地，如果转录调节元件或启动子与来自至少一种其他器官或组织的细胞相比在肝细胞中促进更高水平的蛋白质表达并且转录调节元件或启动子以转录调节元件或启动子在肝细胞中促进蛋白质表达的水平的少于40％、少于30％、少于25％、少于15％、少于10％或少于5％的水平在来自至少一种其他器官或组织的细胞中促进蛋白质表达，则它是肝特异性的。
179.任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是以下中的至少一种：肾细胞、胰腺细胞、乳腺细胞、神经母细胞瘤细胞、肺细胞和早期b细胞。任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是肾细胞、胰腺细胞、乳腺细胞、神经母细胞瘤细胞、肺细胞和早期b细胞。任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是以下中的至少一种：hek293t细胞、panc1细胞、bxpc-3细胞、mcf7细胞、1643细胞、mrc-9细胞和697细胞。任选地，来自至少一种其他器官或组织的细胞是hek293t细胞、panc1细胞、bxpc-3细胞、mcf7细胞、1643细胞、mrc-9细胞和697细胞。
180.任选地，转录调节元件或启动子是否是肝特异性的可以通过用包含与转基因可操作地连接的转录调节元件或启动子的载体转导huh7细胞和比较细胞并比较表达转基因的huh7细胞的数量与表达转基因的比较细胞数量来确定。比较细胞可以是非肝细胞。例如，如果用户希望确定转录调节元件或启动子是否促进肝细胞中与乳腺细胞相比更高水平的表
达，则用户可以转导huh7细胞和作为乳腺细胞的比较细胞，例如mcf7细胞。如果表达转基因的huh7细胞的数量显著高于表达转基因的比较细胞的数量，则启动子或转录调节元件是肝特异性的。
181.转基因可以是gfp，在这种情况下，用户可以使用荧光显微镜来确定表达转基因的细胞数量(例如huh7细胞的数量或比较细胞的数量)并计算发出绿色荧光的细胞数量。
182.本发明还提供了包含本发明的转录调节元件或启动子的多核苷酸序列，其中所述转录调节元件或启动子与转基因可操作地连接，任选地其中所述转基因编码人蛋白质。
183.本发明的转录调节元件或启动子可以是包含转基因的载体的一部分。载体可以是病毒颗粒，例如aav载体或重组aav(raav)载体。
184.转基因可以编码蛋白质或非翻译rna，其可以是例如sirna或mirna或snrna或反义rna。转基因可能长于4,000(4k)个核苷酸或4,000个碱基对(4kbp)。转基因可能长于4.2k个核苷酸。转基因可能短于4.4k个核苷酸。
185.在一个实施方案中，转基因编码凝血因子，例如因子viii(其可以是如本文别处讨论的截短的fviii)或因子ix。转基因可替代地编码酶，该酶可以是溶酶体酶，例如α-半乳糖苷酶a或β-葡糖脑苷脂酶(gba)。
186.与hlp2 tre(由seq id no:1定义)或hcr-haat tre(由seq id no:33定义)相比，本发明的转录调节元件或启动子以及包含此类元件或启动子的多核苷酸和包括它们的载体，可以以50％或更好地表达与其可操作连接的转基因。
187.与hlp2 tre(由seq id no：1定义)或hcr-haat tre(由seq id no：33定义)相比，它可以以80％或更好地表达与其可操作连接的转基因。
188.本发明人出乎意料地发现，不仅可以制备保留其功能的hlp2tre的截短形式(通常是显著截短形式)，而且与hlp2相比，本发明的截短转录调节元件实际上可能与tre或hcr-haat tre相比具有优异的效果。
189.因此，与hlp2 tre(由seq id no:1定义)或hcr-haat tre(由seq id no:33定义)相比，本发明的转录调节元件或启动子以及包含此类元件或启动子的多核苷酸和包括它们的载体，可以以100％或更好、110％或更好、120％或更好、140％或更好或150％或更好地表达与其可操作连接的转基因。
190.本领域技术人员可以通过比较在体外或体内系统中在本发明的转录调节元件控制下表达的转基因编码的多肽的水平与在hlp2 tre或hcr-haat tre控制下表达的转基因编码的多肽的水平，来比较使用本发明的转录调节元件与使用hlp2 tre(seq id no:1)或hcr-haat tre(seq id no:33)的转基因的表达。
191.例如，在比较由表达的转基因编码的多肽水平的体外试验(例如实施例2中所述)中，本领域技术人员可以用包含可操作地连接至转基因的本发明的tre的载体转导宿主细胞(测试细胞)，以及用包含可操作地连接至转基因的hlp2或hcr-haat的载体转导一些细胞(参考细胞)。可以在适合表达转基因的条件下培养细胞，并且可以比较在测试细胞和参考细胞中表达的转基因编码的多肽的水平。合适的宿主细胞包括培养的人肝细胞，例如huh7细胞。多肽水平应标准化以反映已使用萤光素酶测定转染的细胞数量。在萤光素酶测定中，还使用包含萤光素酶转基因的等效载体(除启动子和转基因外相同)转染测试细胞和参考细胞，并且被载体转染的细胞比例将与由包含萤光素酶转基因的载体表达的萤光素酶产生
的荧光信号成比例。
192.类似地，为了比较由在体内系统中表达的转基因编码的多肽的水平，本领域技术人员可以给一些小鼠(例如c57bl/6小鼠)注射包含与转基因可操作地连接的本发明的tre的病毒颗粒(测试小鼠)和给一些等效小鼠注射包含与转基因可操作连接的hlp2或hcr-haat的病毒颗粒(参考小鼠)。可以将小鼠选择性宰杀(cull)，并将测试小鼠血液中转基因编码的多肽水平与参考小鼠血液中转基因编码的多肽水平进行比较。转基因编码的多肽水平可以针对每个肝细胞的载体基因组数量进行标准化。
193.可以使用elisa来评估由转基因编码的多肽水平。在elisa测定的实例中，与转基因编码的多肽结合的抗体可以与平板结合。包含未知浓度的转基因编码的多肽的样品可以通过平板。可以将与转基因编码的多肽结合的第二种检测抗体施加到板上，并洗掉任何多余的检测抗体。剩余的检测抗体(即未被洗掉)将与转基因编码的多肽结合。检测抗体可以与酶如辣根过氧化物酶连接。可以通过测量检测抗体的量来测量与平板上转基因编码的多肽结合的检测抗体的水平。例如，如果检测抗体与辣根过氧化物酶连接，辣根过氧化物酶可以催化从底物如tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)产生蓝色反应产物，并且可通过450nm处的吸光度检测蓝色产物的水平。蓝色产物的水平与洗涤步骤后剩余的检测抗体的量成正比，这与样品中转基因编码的多肽的量成正比。或者，例如当使用纯化的蛋白质时，可通过分光光度法测定转基因编码的多肽的量或浓度。
194.例如，合适的elisa测定试剂盒是实施例中使用的由hyphen biomed制造的biophen fviii:c测定(ref:221406)。如果转基因编码具有因子viii活性的多肽，则可以使用biophen fviii:c测定测量具有因子viii活性的多肽的水平。
195.或者，本领域技术人员可以通过确定表达的转基因编码的多肽的活性来评估转基因编码的多肽的水平。
196.例如，如果转基因编码具有因子viii活性的多肽，则可以使用显色测定例如测量辅因子活性的显色测定来确定转基因编码的多肽的水平。例如，合适的显色测定如下。转基因编码的多肽与人因子x多肽和因子ixa多肽、凝血酶、磷脂和钙混合。凝血酶激活转基因编码的多肽(具有因子viii例如因子viii多肽的活性)以形成因子viiia多肽。具有因子viii活性的凝血酶激活多肽与因子ixa多肽、磷脂和钙形成酶复合物，该酶复合物可催化因子x多肽转化为因子xa多肽。xa因子多肽的活性可以催化显色底物(例如sxa-11)的切割以产生pna。生成的pna水平可以通过测定405nm的显色来测量(例如通过吸光度测量)。x因子多肽并且因此xa因子多肽被过量提供。因此限制因素是因子viiia多肽。因此，产生的pna水平与样品中具有因子viii活性的多肽产生的因子xa多肽的量成正比，其与样品中具有因子viii活性的多肽的活性成正比。样品中具有因子viii活性的多肽的活性是样品中具有因子viii活性的多肽的辅因子活性的量度。
197.例如，合适的显色测定是实施例中使用的由hyphen biomed制造的biophen fviii:c测定(ref:221406)。可以使用biophen fviii:c测定测量具有因子viii活性的多肽的活性。
198.用于比较的转基因可以编码因子viii，特别是可以编码截短的或修饰的因子viii，例如本领域众所周知的b-结构域缺失的缩短的因子viii(“sq”)。
199.本发明还提供了包含核苷酸序列的载体，该核苷酸序列包含：(i)本发明的转录调
节元件；和(ii)本文定义的转基因。
200.载体核苷酸序列还可包含编码信号肽的核苷酸序列。编码信号肽的核苷酸序列的长度可以为50至100个核苷酸。编码信号肽的核苷酸序列可以短于80个核苷酸。
201.载体可以是病毒颗粒，例如aav载体或重组aav(raav)载体。
202.本发明还提供了用于治疗方法的aav或raav载体，任选地，其中治疗方法是基因治疗方法。治疗方法或基因治疗可以治疗血友病a。
203.本发明还提供了一种治疗方法，包括施用有效量的aav或raav，任选地其中所述治疗方法是基因治疗方法和/或治疗血友病a的方法。
204.本发明还提供了aav或raav在治疗方法中的用途，任选地其中所述治疗方法是基因治疗方法和/或治疗血友病a的方法。
[0205]“基因治疗”涉及施用本发明的载体，该载体能够在其所施用的宿主中表达转基因(例如因子ix核苷酸序列)。
[0206]
任选地，治疗方法是治疗凝血病的方法，例如血友病(例如血友病a或b)或血管性血友病。优选地，凝血病的特征在于出血增加和/或凝血减少。任选地，治疗方法是治疗血友病例如血友病a的方法。在一些实施方案中，治疗方法包括将本发明的载体施用于患者。任选地，患者是患有血友病a的患者。任选地，患者具有针对因子ix的抗体或抑制剂。任选地，该载体是静脉内施用的。任选地，该载体仅用于向患者施用一次(即单次剂量)。
[0207]
当在上述方法中“治疗”血友病a时，这意味着血友病的一种或多种症状得到改善。这并不意味着血友病的症状得到完全治愈并因此它们不再存在于患者体内，但是在某些方法中可能会出现这种情况。治疗方法可能导致血友病a的一种或多种症状不像治疗前那样严重。任选地，相对于施用前的情况，治疗方法导致患者血液中循环因子viii的量/浓度增加，和/或在给定的患者血液体积内可检测到的因子viii活性的总体水平增加，和/或患者血液中因子viii的比活性(每一定量因子ix蛋白的活性)增加。
[0208]“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗结果的量，例如提高受试者中功能性因子ix的水平(以导致足以改善血友病b的症状的水平产生功能性因子viii)。
[0209]
任选地，以每公斤患者体重少于1x 10
11
、少于1x 10
12
、少于5x10
12
、少于2x 10
12
、少于1.5x 10
12
、少于3x 10
12
、少于1x 10
13
、少于2x 10
13
或少于3x 10
13
的载体基因组的剂量施用载体。任选地，选择施用的载体/病毒颗粒的剂量，使得受试者以非血友病健康受试者的因子viii活性的10％-90％、20％-80％、30％-70％、25％-50％、20％-150％、30％-140％、40％-130％、50％-120％、60％-110％或70％-100％的活性表达因子viii。
[0210]
详述
[0211]
一般定义
[0212]
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。
[0213]
一般而言，术语“包含”旨在表示包括但不限于。例如，短语“包含核心核苷酸序列的转录调节元件”应解释为表示转录调节元件至少具有核心核苷酸序列，但可以包含其他组分，例如额外的核苷酸序列。
[0214]
在本发明的一些实施方案中，词语“包含”被替换为短语“由
……
组成”或短语“基
本上由
……
组成”。术语“由
……
组成”旨在进行限制。例如，短语“由与seq id no:2具有至少95％同一性的核苷酸序列组成的核心核苷酸序列”应当理解为表示核心核苷酸序列是参考seq id no:2而没有更进一步参考其它而进行定义的。类似地，短语“基本上由seq id no:2组成的核心核苷酸序列”应当理解为是指核心核苷酸序列不含实质上影响转录调节元件功能的额外核苷酸序列。
[0215]
就本发明而言，为了确定两个序列(例如两个多核苷酸序列)的同一性百分比，为了最佳比较而比对序列(例如，可以在第一序列中引入空位以与第二序列进行最佳比对)。然后比较每个位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中相应位置相同的核苷酸占据时，则该位置的核苷酸是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置的数量/参考序列中的位置总数x 100)。
[0216]
通常，序列比较是在参考序列的长度上进行的。例如，如果用户希望确定给定(“测试”)序列是否与seq id no:1有95％相同，那么在这种情况下，seq id no:1将是参考序列。为了评估核苷酸序列是否与seq id no:1(参考序列的实例)至少80％相同，本领域技术人员将在seq id no:1的长度上进行比对，并确定测试序列中有多少个位置与seq id no:1相同。如果至少80％的位置相同，则测试序列与seq id no:1至少80％相同。如果序列短于seq id no:1，空位或缺失位置应视为不同位置。
[0217]
为避免疑义，应当理解提及“至少80％同一性”、“至少90％同一性”、“至少95％同一性”和/或“至少98％同一性”均应当理解为隐含地包括100％同一性。
[0218]
本领域技术人员知道可用于确定两个序列之间的同源性或同一性的不同计算机程序。例如，可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定。在一个实施方案中，两个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比是使用已并入accelrys gcg软件包中的gap程序(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/获得)的needleman和wunsch(1970)算法确定的，使用blosum 62矩阵或pam250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
[0219]
术语“核酸序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸序列”旨在彼此同义并指所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。核酸包括天然存在的、合成的和修饰的或改变的多核苷酸。术语“核苷酸序列”是指任何长度的核苷酸的聚合形式。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物。
[0220]
当“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”被称为具有长度时，这通常被称为给定数量的核苷酸，例如4,000(或4k)个核苷酸。或者，核苷酸序列长度可以定义为给定数量的碱基对(bp)，例如118bp。可以理解，“碱基对”术语通常是指双链核苷酸。然而，在本领域中通过例如当与其互补链对齐时其具有的碱基对数来指代单链(ss)核酸并不罕见。因此，仅通过碱基对提及长度不应被解释为将核苷酸限制为其双链形式，并且——就本技术而言——术语“4k bp”和“4k个核苷酸”应被认为是同义词。
[0221]
当提及可能的序列长度的范围时，术语“在
……
之间”应当理解为包括该范围的端点。因此，提及“在80和280个核苷酸之间”包括80个核苷酸长的核苷酸序列并且包括280个核苷酸长的核苷酸序列。类似地，对核苷酸序列的引用，例如“由seq id no:1的核苷酸303-335定义的序列”应当理解为包括在该序列内列举的核苷酸303和335。
[0222]
核酸分子(例如多核苷酸)在呈线性形式时具有“5'端”和“3'端”。“5'端”由其未与
戊糖环的3'氧相连的5'磷酸定义。“3'端”由其未与戊糖环的5'磷酸相连的3'氧定义。然而，术语“5'”和“3'”在本领域中也被理解为指核酸分子内的相对位置。因此，例如，当特定核酸或核酸序列(相对于给定序列)比给定序列更接近5'端时，可以说特定核酸或核酸序列位于给定序列的5'。以类似的方式，当特定核酸或核酸序列(相对于给定序列)比给定序列更接近3'端时，可以说特定核酸或核酸序列位于给定序列的3'或是给定序列的3'。“上游”或“下游”等术语也用于描述此类相对位置；在本技术中，术语“位于
……
的5'(5'to)”、“位于
……
的5'(located 5'to)”、
“……
的5'(5'of)”、“位于
……
的5'(located 5'of)”和“上游”都被视为同义词。同样，术语“位于
……
的3'(3'to)”、“位于
……
的3'(located 3'to)”、
“……
的3'(3'of)”、“位于
……
的3'(located 3'of)”和“下游”都应视为同义词。应当理解，被声明为位于另一个序列的3'或5'的核苷酸序列可能不直接相邻；也就是说，它们之间可能插入一个或多个额外的序列。
[0223]“转录调节元件”是指影响、控制或影响与转录调节元件可操作地连接的核酸(通常是基因)的表达的核酸序列。转录调节元件包括启动子和增强子。任选地，本发明的转录调节元件包含启动子和增强子。载体序列如aav或raav载体序列通常包括一个或多个“转录调节元件”以促进异源多核苷酸如转基因的转录。
[0224]
术语“可操作地连接”是指本发明的转录调节元件存在于相对于另一核酸序列(例如转基因)的适当位置以影响该核酸序列的表达。
[0225]
本发明的转录调节元件可以是组织特异性的，即它们可以比在其他组织类型中更大程度地指导/启动特定细胞类型中的转录。例如，本发明的转录调节元件可以是肝特异性的。
[0226]
本发明的转录调节元件可以包含在用于基因治疗的aav载体中。“基因治疗”涉及在其所施用的宿主中施用能够表达转基因(例如编码因子viii的核苷酸序列)的aav/病毒颗粒。在这种情况下，载体质粒通常包含表达盒。
[0227]
如本文所述，“表达盒”是指包含转基因和可操作地连接至转基因的本发明的转录调节元件的核酸核苷酸序。任选地，该盒还包含额外的转录调节元件，例如增强子、内含子、非翻译区、转录终止子等。
[0228]
表达盒可以包含至少一个itr。表达盒更通常会包含两个itr(通常在表达盒的任一端都有一个，即一个在5'端，一个在3'端)。在表达盒和一个或多个itr之间可能有插入序列。表达盒可以并入位于两个常规itr之间或位于工程改造带有两个d区域的itr任一侧的病毒颗粒中。任选地，表达盒包含源自aav1、aav2、aav4和/或aav6的itr序列。优选地，itr序列是aav2 itr序列。
[0229]
此处使用的“转基因”是指旨在引入(或已通过例如载体引入)到细胞中的核酸(通常是异源的)。转基因可以是编码特别感兴趣的多肽或蛋白质的基因，或者它可以编码例如非翻译的rna，其任选地是sirna或mirna或snrna或反义rna或其他抑制性核酸。如果转基因旨在在肝中表达，则转录调节元件可能是肝特异性的，即它在肝细胞中促进比在其他组织类型中更多的蛋白质表达。任选地，tre可以是肝特异性启动子，其可以是人肝特异性启动子。转基因可以是任何合适的基因。如果载体质粒用于基因治疗，则转基因可以是包含或编码可用于治疗疾病的蛋白质或核苷酸序列的任何基因。例如，转基因可以编码酶、代谢蛋白、信号蛋白、抗体、抗体片段、抗体样蛋白、抗原或非翻译rna，例如mirna、sirna、snrna或
反义rna。
[0230]
附图的说明
[0231]
现在将参考以下附图以非限制性示例的方式描述本发明，其中：
[0232]
图1显示了本发明的几个转录调节元件(分配内部名称fre43、fre49、fre56、fre59、fre63和fre72)的示意图，指示(阴影区域)hlp2 tre的保留的核苷酸区域。箭头表示核心区域的片段插入5'区域(*)和hlp2的核苷酸265-272在核苷酸243-283(**)缺失后的插入。
[0233]
出于比较目的，图2显示了源自hlp2 tre的各种转录调节元件的全局序列比对。指示了构成共有区域或核心区域的一部分的核苷酸(即hlp2的核苷酸170-242)(*)。
[0234]
图3显示了本发明的转录调节元件(tre)，其作为用于下述实验的整体因子viii表达盒的一部分。环状反向末端重复(itr)将盒括起来，所述盒包括本发明的转录调节元件(p)、编码信号肽(sp)的核苷酸序列、编码截短的因子viii(hfviii-sq)的核苷酸序列和合成多a序列(spa)。表达盒的总长度(l)显然取决于各种元件的长度。
[0235]
图4显示了在因子viii表达盒中使用本发明的示例性转录调节元件进行的两项(图4a-c的i和ii)体外研究的结果。用包含感兴趣的tre的fviii-sq构建体转染huh7细胞。在转染后第3天分析培养上清液中的fviii活性水平。图4a)i)和4a)ii)显示了fviii水平(％fviii:c，使用下文描述的fviii显色活性测定确定)；4b)i)和4b)ii)显示了来自相应转染孔的萤光素酶活性水平；图4c)i)和4c)ii)显示了来自4a)i)和4a)ii)的fviii水平针对萤光素酶表达水平进行标准化；从而显示转录调节元件的相对功效。提供hlp2用于比较目的。条形图代表三次实验的平均值。rlu＝相对发光单位。
[0236]
图5显示了在因子viii表达盒中使用本发明的示例性转录调节元件进行的体内研究的结果。6-8周大的雄性c57bl/6小鼠静脉注射2x10
12
vg/kg病毒载体。每个构建体注射六只小鼠。在注射后第28天，将小鼠选择性宰杀，并将血液收集到柠檬酸盐抗凝剂中。提供血液和鼠肝用于分析。血液用于进行fviii分析，而肝活检用于计算载体基因组。图5a)i)、5a)ii)、5a)iii)和5a)iv)显示了因子viii抗原水平(使用下述fviii夹心elisa抗原测定确定)；图5b)i)、5b)ii)、5b)iii)和5b)iv)显示了每个肝细胞的估计载体基因组；图5c)i)、5c)ii)、5c)iii)和5c)iv)显示了针对每个细胞的载体基因组标准化的fviii抗原水平，从而显示了转录调节元件的相对功效。条形图代表平均值(n＝6)。
[0237]
图6显示了对fre72的启动子保真度的体外研究结果。在来自一系列不同组织的细胞系中评估了fre72启动子的保真度；huh7：肝。hek293t：肾。panc1：胰腺。bxpc-3：胰腺。mcf7：乳腺。1643：神经母细胞瘤。mrc-9：肺。697：早期b细胞。以1x105的moi用对照载体aavs3.cag.gfp或aavs3.fre72.gfp转导细胞或未经处理。图6显示了每种细胞类型的三列；每种细胞类型的左列(灰色)与用aavs3.fre72.gfp转导的细胞有关；每种细胞类型的中列(黑色)与用对照载体转导的细胞有关；并且每种细胞类型的右列(白色)与未处理的细胞有关。对于hek293t和mcf-7细胞，左(“灰色”)列非常小，以至于在图6中不可见；类似地，对于hek293t、1643和697细胞，右(“白色”)列非常小，以至于在图6中不可见。
[0238]
图7显示了为确认fre72启动子的寿命而进行的体内研究的结果。制备包含在fre72启动子转录控制下的fviii-sq转基因的aav8构建体，并将其施用于野生型小鼠。通过尾部采血(在注射后第31、56和104天)和最后通过心脏穿刺(在注射后第230天)采集血液样
品。测量了每个样品中的fviii抗原水平，数据点显示在图上。条代表中值。
[0239]
图8显示了比较质粒转染后人蛋白质在huh7细胞中的表达的体外研究的结果。质粒使用fre72启动子或已知的hcr-haat或hlp2启动子。在转染后第3天使用elisa测量培养上清液中的蛋白质水平。cmv-萤光素酶对照质粒用作转染效率标准化的共转染载体。图8a显示了萤光素酶校正前的结果，图8b显示了萤光素酶校正后的结果。条代表中值。
实施例
[0240]
材料与方法
[0241]
fviii构建体
[0242]
将人fviii-sq的cdna(编码含有14个氨基酸的接头区域代替b结构域的fviii，如上所讨论的)克隆到肝特异性启动子驱动的腺相关病毒(aav)载体中。
[0243]
使用了两种不同的密码子优化的fviii变体(称为“co02”和“co19”)。如下所述，为了减少aav重组基因组的大小，设计了许多小的肝特异性启动子。
[0244]
生成aav载体
[0245]
通过用编码aav rep和cap功能；腺病毒辅助功能；以及含有侧翼为aav2 itr的fviii表达盒的重组基因组的质粒对hek293t细胞进行三质粒转染产生aav颗粒。转染后72小时收集细胞沉淀和上清液，并使用poros capture select和avb sepharose等树脂通过亲和层析纯化aav颗粒。然后将aav过夜透析到pbs中，储存在4℃并通过qpcr滴定(titre)。
[0246]
测定
[0247]
fviii显色活性测定
[0248]
biophen fviii:c显色测定法(hyphen biomed，ref 221406)测量fviii的辅因子活性fviii:c。
[0249]
通过凝血酶激活，fviii:c多肽与人因子ixa、磷脂和钙形成复合物。在这些条件下，在该测定中以特定浓度和过量提供的因子x被转化为因子xa(活化的)。产生的该因子xa与fviii:c成正比，其为限制因素。xa因子由显色底物sxa-11直接测量。xa因子切割显色底物并释放pna。pna的产生与因子xa活性成正比，后者与fviii:c活性直接相关。可以通过测量405nm的显色程度来确定释放的pna水平，这与样品中因子viii:c产生的因子xa多肽的量有关，与样品中fviii:c的活性成正比。
[0250]
根据制造商的说明进行该测定。简而言之，将50μl的校准血浆、稀释(在试剂r4中)测试血浆或细胞上清液/裂解物或对照添加到在37℃预孵育的微孔板孔中，然后添加各50μl的用6ml蒸馏水复溶并预热至37℃的试剂r1和r2。混合后，这些组分形成150μl反应液，使其在37℃下孵育5分钟。随后，向反应中补充其本身重悬浮于6ml蒸馏水中并预热至37℃的试剂r3，然后使200μl mix在37℃下再孵育5分钟。加入50μl 20％乙酸或柠檬酸(20g/l)终止反应，然后测量所得250μl混合物在405nm处的吸光度。
[0251]
试剂：
[0252]
r1-人因子x，在存在纤维蛋白聚合抑制剂的情况下冻干。
[0253]
r2
–
活化试剂-因子ixa(人)，浓度恒定且经过优化，含有人凝血酶、钙和合成磷脂，冻干。
[0254]
r3
–
sxa-11-显色底物，xa因子特异性，冻干，含有凝血酶抑制剂。
[0255]
r4-tris-bsa缓冲液。含有1％bsa、peg、fviii:c稳定剂和叠氮化钠(0.9g/l)。
[0256]
关于来自显色活性测定的读数，“％fviii活性”(也称为“％fviii:c”)是“％正常”，这意味着，例如在huh-7细胞中表达fviii表达盒的情况下，相对于具有100％fviii活性的人血浆样品，在huh-7细胞中表达fviii表达盒后在上清液中检测到的fviii活性是在具有100％fviii活性的所述人血浆样品中检测到的fviii活性的特定百分比。
[0257]
fviii夹心elisa抗原测定
[0258]
asserachrom viii:ag试剂盒(stago diagnostica,ref 00280)是一种通过酶联免疫吸附测定(elisa)定量血浆中fviii的抗原测定。检测样品中的fviii被预包被在塑料微孔板孔的壁上的小鼠单克隆抗人viii:ag抗体捕获。在充分孵育和洗涤以减少非特异性结合后，与过氧化物酶偶联的小鼠抗人fviii抗体与捕获的fviii的剩余游离抗原决定簇结合。然后通过tmb底物显示结合的过氧化物酶。tmb诱导的显色通过添加强酸而停止。显色强度与分析样品中的fviii浓度成正比，通过测量450nm处的吸光度确定。
[0259]
该测定的读数可以表示为“％正常”，这意味着，例如在小鼠中表达fviii构建体的情况下，相对于具有100％fviii活性的人血浆样品，在小鼠血浆样品中检测到的fviii分子(严格地说，表位)的数量是具有100％fviii活性的所述人血浆样品中检测到的fviii分子/表位的数量的特定百分比。
[0260]
在上述活性和抗原测定中，在小鼠或人细胞上清液样品中定量fviii(活性或抗原水平)，使用制造商推荐或包括已知fviii活性或抗原的冻干人血浆样品(视情况而定)针对世界卫生组织国际标准(nibsc代码07/316)进行校准。
[0261]
实施例1——小肝特异性转录调节元件的设计和选择
[0262]
基于hlp2 tre设计并根据总长度选择了许多不同的tre。基于观察各种脊椎动物中相关α-1-抗胰蛋白酶tre的保守区域，应用了对tre的缺失。出乎意料地发现，可以制造比hlp2 tre短得多但保留一定程度功能性的tre。在某些情况下，如以下实施例所示，活性水平至少与hlp2 tre相当。
[0263]
图1显示了hlp2 tre和本发明的许多转录调节元件的示意图。阴影区域代表本发明人已发现在源自hlp2的α-1-抗胰蛋白酶tre中高度保守的核苷酸序列。一旦确定了要缺失的区域，就使用已知技术进行缺失本身。可以根据本文公开的序列通过使用已知的dna合成技术制备转录调节元件。因此，本发明的转录调节元件可以通过使用缺失去除hlp2序列的所需部分而衍生自hlp2 tre；或者本发明的tre可以通过定点诱变合成。
[0264]
设计和测试了以下转录调节元件(hlp2用作比较器)：
[0265]
·
fre43(seq id no:24)
[0266]
·
fre49(seq id no:25)
[0267]
·
fre56(seq id no:26)
[0268]
·
fre59(seq id no:27)
[0269]
·
fre63(seq id no:28)
[0270]
·
fre72(seq id no:29)
[0271]
为了确定获得具有至少基本功能水平的转录调节元件所需的最小长度，设计并测试了三个另外的转录调节元件：
[0272]
·
fre46由“核心核苷酸序列”组成，所述核心核苷酸序列由seq id no:2定义。因
此，fre46对应于seq id no:1的核苷酸170-242并且长度为73个核苷酸。
[0273]
·
fre47由“核心核苷酸序列”和位于“核心核苷酸序列”的3'的由seq id no:6定义的tss序列组成，所述核心核苷酸序列由seq id no:2定义。因此，fre47对应于seq id no:1的核苷酸170-242加上核苷酸297-302并且长度为79个核苷酸。
[0274]
·
fre48由“延伸核心核苷酸序列”和位于“延伸核心核苷酸序列”的3'的由seq id no:6定义的tss序列组成，所述延伸核心核苷酸序列由seq id no:3定义。因此，fre48对应于seq id no:1的核苷酸163-242加上核苷酸297-302并且长度为86个核苷酸。
[0275]
图2显示了使用上述方法获得的上述转录调节元件的核苷酸序列。提供hlp2的核苷酸序列用于比较目的。
[0276]
实施例2
–
体外评估
[0277]
为了在体外评估设计的转录调节元件的活性，用候选质粒瞬时转染肝细胞衍生的细胞癌细胞系huh7，所述候选质粒包含位于人凝血因子viii变体的称为“co02”密码子优化转基因(fviii-sq；即含有14bp接头区域代替b结构域的fviii，如lind et al.1995同上中所述)的上游的各自tre(hlp2(用于比较目的)或上述实施例1中定义的那些tre之一)。“co02”序列提供为seq id no:31。转基因和转录调节元件的侧翼是来自aav2的itr。在dmem低葡萄糖+10％fbs+glutamax(d10培养基)中的12孔板的每孔中总共接种2.5x 105个huh7细胞。一式三份进行实验。
[0278]
对于质粒瞬时转染，按照hd转染方案，细胞接种后24小时，将1.8μg质粒(如上所述设计)和0.2μg cmv-萤光素酶质粒混合并添加到fugene hd试剂(8μl)。每次转染中都包括cmv-萤光素酶质粒(占总质粒的10％)以监测转染效率。
[0279]
转染后(约18小时后)，将培养基更换为500μl新鲜dmem低葡萄糖+10％fbs+glutamax(d10培养基)。24小时后，培养基更换为新鲜的dmem低葡萄糖+glutamax(d0培养基)。次日，即转染后第3天收获细胞和培养基。
[0280]
使用biophen fviii:c(6)(ref.221406)试剂盒评估fviii活性。在spectramax i3上测量吸光度。平行地，裂解细胞(promega e397a裂解缓冲液)并进行萤光素酶测定(promega e1501)以测量萤光素酶表达。萤光素酶表达用作内部对照以标准化fviii活性。使用软件graphpad prism v7进行分析。
[0281]
体外实验的结果如图4所示。最相关的图是图4(c i)和图4(c ii)，它们显示了当针对转染水平标准化时各种tre实现的相对平均fviii表达。
[0282]
实施例3
–
体内评估
[0283]
如上所述产生aav颗粒，其基因组包含编码由aav8衣壳包裹的人fviii-sq的密码子优化的核苷酸序列(称为“co19”)。“co19”序列提供为seq id no:32。如上所述产生aav颗粒。
[0284]
图3提供了显示使用上述方法获得的盒的示意图。元件p代表转录调节元件，例如启动子/增强子，其或者源自hlp2或者是hlp2(其用于比较目的以评估源自其的tre的效用)。将天然fviii信号肽替换为长度为72bp的异源信号肽(称为“sp8”)的野生型编码序列。
[0285]
给6-8周大的雄性c57bl/6小鼠静脉注射2x10
12 vg/kg病毒载体。每个构建体注射六只小鼠。在注射后第28天，将小鼠选择性宰杀，并将血液收集到柠檬酸盐抗凝剂中。提供血液和鼠肝用于分析。
[0286]
血液用于进行fviii分析，而肝活检用于计算载体基因组。
[0287]
为了确定注射aav后每个肝细胞的载体基因组数量，按照制造商的说明，使用qiagen dneasy blood and tissue kit(qiagen)从约40mg的冷冻肝样品中分离dna。根据制造商的说明，使用powerup sybr green master mix(applied biosystems)进行定量实时pcr(q-pcr)扩增。在quantstudio
tm
仪器(applied biosystems)上进行q-pcr。引物组设计用于定量转基因，从而可以估计aav拷贝数。从标准曲线并在针对通过qpcr定量的小鼠gapdh标准化后计算基因组拷贝数。
[0288]
为了确定aav注射后fviii蛋白的水平，按照制造商的说明书，通过asserachrom viii:ag elisa试剂盒(diagnostica stago)测量来自柠檬酸化血浆的fviii抗原水平。必要时进行进一步稀释。
[0289]
结果如图5所示。最相关的图在图5(c)(i)-5(c)(iv)中，显示了针对每个细胞的病毒基因组水平进行标准化的相对fviii水平。
[0290]
实施例4
–
评估fre72的组织特异性
[0291]
图6显示了对fre72的启动子保真度的体外研究结果。在来自一系列不同组织的细胞系中评估了fre72启动子的保真度；huh7：肝。hek293t：肾。panc1：胰腺。bxpc-3：胰腺。mcf7：乳腺。1643：神经母细胞瘤。mrc-9：肺。697：早期b细胞。以1x105的moi用对照载体aavs3.cag.gfp或aavs3.fre72.gfp转导细胞或未经处理。图6显示了每种细胞类型的三列；每种细胞类型的左列(灰色)与用aavs3.fre72.gfp转导的细胞有关；每种细胞类型的中列(黑色)与用对照载体转导的细胞有关；并且每种细胞类型的右列(白色)与未处理的细胞有关。对于hek293t和mcf-7细胞，左(“灰色”)列非常小，以至于在图6中不可见；类似地，对于hek293t、1643和697细胞，右(“白色”)列非常小，以至于在图6中不可见。
[0292]
实施例5
–
fre72启动子提供体内长期表达
[0293]
用aav8衣壳假型化包含在fre72启动子转录控制下的fviii-sq转基因(称为fviiico19-sq)的aav载体。包括itr、启动子和转基因的整个载体基因组的长度为4845bp(seq id no:34)。
[0294]
将所得aav8载体施用于6-8周大的c57bl6野生型小鼠的尾静脉。注射前将载体储存在4℃。原始病毒悬浮液在无菌x-vivo 10(lonza,be04-380q)中稀释以获得足够的接种物，产生2x10
12 vg/kg的剂量。
[0295]
在注射后第31、56和104天，从每只小鼠的侧尾静脉抽取100μl的血液样品。在注射后第230天，进行最终采血并通过心脏穿刺在血液采样后选择性宰杀的重度麻醉动物身上采集最大体积(约1ml)的血液样品。用柠檬酸盐抗凝剂(1:10稀释)稀释收集的血液，并以5000rpm的速度离心5分钟。
[0296]
如上文材料和方法中所述，使用fviii夹心elisa抗原测定分析血浆样品的fviii抗原水平。结果如图7所示。条代表中值。
[0297]
实施例6
–
fre72与已知hlp2和hcr-haat启动子的比较
[0298]
制备了三个分开的测试质粒dna构建体，其并入了在fre72启动子或已知的hlp2或hcr-haat启动子控制下的编码人蛋白质的密码子优化的转基因序列。
[0299]
为了比较每个启动子的表达水平，将huh7细胞(jcrb细胞库，编号jcrb0403)接种在96孔板(每孔30,000个细胞)中的dmem低葡萄糖、10％fbs+glutamax(d10培养基)中并在
37℃和5％co2培养(第1天)。次日(细胞接种后约24小时；第2天)，制备质粒dna-转染试剂混合物并转染到huh7细胞中。将0.225μg测试质粒dna和0.025μg cmv-萤光素酶对照质粒(flj-pl282)与fugene以4μl fugene/μg dna(或1μl fugene/0.25μg质粒dna)的比例混合。对于96孔转染实验，每孔加入1μl fugene mix。将质粒dna-转染试剂混合物在细胞上在37℃和5％co2孵育过夜。
[0300]
次日早上(第3天)，转染后约18小时，将培养基更换为新鲜的d10培养基，并且细胞在37℃和5％co2孵育过夜。次日早上(24小时后；第4天)，将培养基更换为新鲜的dmem低葡萄糖+glutamax+胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂(d0/its培养基)。次日(第5天)收获细胞和培养基。
[0301]
使用elisa试剂盒评估培养基中的蛋白质表达。与elisa平行，huh7细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次，并用100μl萤光素酶检测试剂盒(promega cat#e1501/e4530)的萤光素酶裂解缓冲液处理细胞。细胞裂解物储存在-80℃。在萤光素酶测定当天，将细胞裂解物解冻，并使用20μl样品在molecular devices spectramax i3x酶标仪上通过发光测量萤光素酶表达。详细方案公布在promega technical bullitin#tb281中。萤光素酶表达用作内部对照以使蛋白质水平标准化。使用软件graphpad prism v7进行分析。
[0302]
结果如图8a(萤光素酶校正前)和图8b(萤光素酶校正后)所示。
[0303]
序列表表格
[0304]
[0305][0306]
序列
[0307]
》seq id no:1-hlp2 tre
[0308]
ccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagacacctctctgggcccatgccacctccaactggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc
[0309]
》seq id no:2-核心核苷酸序列
[0310]
agtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccc
[0311]
》seq id no:3
–
延伸核心核苷酸序列
[0312]
cccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccc
[0313]
》seq id no:4-hlp2的5'部分(seq id 1的118-162)
[0314]
tggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagat
[0315]
》》seq id no:5-hlp2的3'部分(seq id 1的243-283)
[0316]
gttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggaca
[0317]
》》seq id no:6-tss
[0318]
tcagct
[0319]
》》seq id no:7-tss
[0320]
tcaggc
[0321]
》seq id no:8-tss
[0322]
cactga
[0323]
》seq id no:9-3'部分(seq id no:1的284-302)
[0324]
gggccctgtc tcctcagct
[0325]
》seq id no:10-fre49、fre72和fre75的3'部分(seq id no:1的297-335)
[0326]
tcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc
[0327]
》seq id no:11-3'部分seq id no:1的265-272
[0328]
ttaaatac
[0329]
》seq id no:12-fre43的3'部分
[0330]
gttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc
[0331]
》seq id no:13-fre56、fre59和fre63的3'部分
[0332]
ttaaatacgg gccctgtctc ctcagct
[0333]
》seq id no:14-hlp2 5'部分(seq id no:1的12-33)
[0334]
gcaaacattg caagcagcaa ac
[0335]
》seq id no:15-hlp2 5'部分(seq id no:1的12-41)
[0336]
gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca
[0337]
》seq id no:16-hlp2 5'部分(seq id no:1的1-98)
[0338]
ccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagacacctctctg
[0339]
》seq id no:17-hlp2 5'部分(seq id no:1的163-169)
[0340]
cccagcc
[0341]
》seq id no:18-fre43 5'部分
[0342]
ccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagacacctctctg
[0343]
》seq id no:19-fre49 5'部分
[0344]
gcaaacattgcaagcagcaaacagcaaaca
[0345]
》seq id no:20-fre56 5'部分
[0346]
cgtgttcctgctctttgtccctctgtcctacttagactaatatttgccttgggtactgcaaacaggaaatgggggagggac
[0347]
》seq id no:21-fre59 5'部分
[0348]
gcaaacattgcaagcagcaaacagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccc
[0349]
》seq id no:22-fre63 5'部分
[0350]
gcaaacattgcaagcagcaaacagtggcgtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccc
[0351]
》seq id no:23-fre72 5'部分
[0352]
cccagcc
[0353]
》seq id no:24-fre43 tre
[0354]
ccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagacacctctctgagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc
[0355]
》seq id no:25-fre49 tre
[0356]
gcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc
[0357]
》seq id no:26-fre56 tre
[0358]
cgtgttcctgctctttgtccctctgtcctacttagactaatatttgccttgggtactgcaaacaggaaatgggggagggacagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccttaaatacgggccctgtctcctcagct
[0359]
》seq id no:27-fre59 tre
[0360]
gcaaacattgcaagcagcaaacagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccccccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccttaaatacgggccctgtctcctcagct
[0361]
》seq id no:28-fre63 tre
[0362]
gcaaacattgcaagcagcaaacagtggcgtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccccccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccttaaatacgggccctgtctcctcagct
[0363]
》seq id no:29-fre72 tre
[0364]
cccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc
[0365]
》seq id no:30-apoe增强子,hnf5
[0366]
gcaaaca
[0367]
》seq id no:31-co02 codop fviii-sq
[0368]
atgcagattgagctgtctacctgcttctttctgtgcctgctgagattctgctttagtgctacaaggcgttactatctgggagctgtggagctgtcttgggattacatgcagtcagacctgggagagctgccagtggatgccagatttccccctcgagtgcccaagagcttcccttttaatacctctgtggtgtataagaaaaccctgtttgtggagtttaccgatcacctgttcaacattgctaagccaaggccaccctggatgggcctgctgggaccaacaatccaggctgaggtgtatgatacagtggtcatcaccctgaagaacatggcttcccaccctgtgtcactgcatgctgtgggagtgagctactggaaggccagtgagggagctgagtatgatgatcagaccagccagagagagaaggaggatgacaaggtgtttcctggaggctctcatacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggcccaatggctagtgatcccctgtgcctgacctacagctatctgtctcatgtggacctggtgaaggatctgaacagtggcctgattggagccctgcttgtgtgtcgtgaaggctctctggccaaggaaaagacccagacactgcataagttcatcctgctttttgctgtgtttgatgagggcaagtcctggcacagtgagacaaagaactccctgatgcaggacagggatgctgccagtgccagggcctggcccaagatgcatacagtgaatggctatgtgaataggtccctgcctggcctgattggatgtcacagaaagagtgtgtattggcatgtgattggcatgggcaccacacctgaggttcactccatcttcctggagggccatacctttcttgtgagaaaccacaggcaggccagtctggagatcagtcctatcaccttcctgacagcccagaccctgcttatggatctgggccagttcctgcttttttgccacatctccagtcaccagcatgatggcatggaggcttatgtgaaggtggactcctgtcctgaggaacctcagctgagaatgaagaacaatgaggaagctgaggactatgatgatgacctgacagactctgagatggatgtggttagatttgatgatgacaactctccttcctttattcaaatccgatcagtggccaagaaacacccaaagacatgggtgcattacattgctgcagaggaggaggactgggattatgctcctctggtgctggcccctgatgacaggtcctacaagtcccagtatctgaacaatggccctcagaggattggcagaaagtacaagaaagtgaggttcatggcttatacagatgagacattcaagacaagggaggccatccagcatgagagtggcatcctgggaccactgctttatggagaagtgggagacaccctgcttatcatttttaaaaaccaggcttccaggccctacaatatctatcctcatggcatcacggatgtgagacccctgtacagtaggagactgcctaagggagtgaagcacctgaaggacttcccaatcctgcctggagagattttcaagtataagtggacagtgacagtggaggatggcccaaccaagagtgaccccaggtgcctgacaagatactattcttcctttgtgaatatggagagggacctggcctctggcctgattggacctctgcttatctgttacaaggagtctgtggatcagagaggcaaccagatcatgagtgacaagaggaatgtgatcctgttcagtgtgtttgatgagaacaggtcttggtatctgacagagaacatccagagattcctgcccaatcctgctggagtgcaactggaggaccctgagtttcaggcctccaacatcatgcatagcatcaatggctatgtgtttgactccctccaactgagtgtgtgcctgcatgaggtggcttattggtacattctgagcattggagcccagacagatttcctgagtgtgttctttagtggctacaccttcaagcataagatggtgtatgaggacaccctgacactgttccccttttctggagagacagtgttcatgtccatggagaatcctggcctgtggattctgggctgccacaactctgatttccgtaatcgtggcatgacagcccttctgaaggtgtcttcctgtgacaagaacacaggagactactatgaggattcttatgaggacatcagtgcttatctgcttagcaagaacaatgccattgagccaaggagcttttctcagaatcctccagtgctgaagagacaccagagagagatcacgcgtaccacactccagagtgatcaggaggaaattgactatgatgacacaatcagtgtggagatgaaaaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaaccagagccccaggtctttccagaagaaaaccagacattactttattgctgcagtggagagactgtgggatt
atggcatgtccagctctccacatgtgctgagaaatagagcccagagtggcagtgtgccccagttcaagaaagtggttttccaggagtttacagatggatcatttacacagcctctgtacagaggagagctgaatgagcatctgggcctgcttggcccatatatcagagctgaggtggaggataacatcatggtgaccttccgtaatcaggccagcaggccctactccttttattcatccctgatctcctatgaggaagaccagagacagggagctgagccaagaaagaactttgtgaagcccaatgagacaaagacctacttttggaaggtgcagcaccatatggcccctaccaaggatgagtttgattgcaaggcttgggcttacttcagtgatgtggatctggagaaggatgtgcattctggcctgattggaccactgcttgtgtgccataccaacacactgaatcctgctcatggcagacaagtgacagtgcaggagtttgccctgttctttaccatctttgatgagacaaagagctggtacttcacagagaacatggagaggaattgcagggctccttgtaacatccagatggaggacccaaccttcaaggagaactacagatttcatgctatcaatggctatatcatggatacactgcctggcctggtcatggctcaggaccagaggatcaggtggtatctgcttagcatgggctccaatgagaatatccacagcatccatttctctggccatgtgtttaccgtgagaaaaaaggaggaatataagatggccctgtacaacctgtatcctggagtgtttgagacagtggagatgctgccatctaaggctggcatctggagggtggagtgcctgattggagagcacctgcatgctggcatgtctaccctgtttctggtgtactccaataagtgtcagacaccactgggcatggccagtggccatatcagagatttccagatcacagcctctggacagtatggacagtgggctccaaagctggctagactgcactattctggctccatcaatgcctggtccaccaaggagcccttctcctggatcaaggtggacctgcttgctcccatgatcattcatggcatcaagacacagggagccaggcagaagttctcttccctgtacatcagccagtttatcatcatgtattctctggatggcaagaaatggcagacctacagaggcaattctacaggcacactgatggtgttctttggcaatgtggacagctctggcatcaagcacaacatcttcaatccccctatcattgctagatacatcagactgcaccctacccattattctatccgatccacactgagaatggagctgatgggctgtgatctgaacagctgttctatgccactgggcatggagtccaaggccatcagtgatgctcagatcacagcctccagctacttcaccaatatgtttgctacatggtcccctagcaaggccaggctgcacctccagggcagatccaatgcttggagacctcaagttaacaatccaaaggagtggctccaggtggattttcagaaaaccatgaaggtgacaggagtgaccacccagggagtgaagtctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatctcttcgagtcaagatggacaccagtggacactgttctttcagaatggcaaggtgaaggtgttccagggcaatcaggattcctttaccccagtggtgaacagcctggacccaccactgcttacaagatacctgagaatccaccctcagtcctgggtgcatcagattgctctgaggatggaggtgctgggatgtgaggctcaggacctgtattga
[0369]
》seq id no:32-co19 codop fviii-sq
[0370]
atgcagattgagctctccacctgcttcttcctctgcctcttgagattctgtttctctgctactagaagatattatcttggggcagtggagctgagctgggactacatgcagtctgacctgggagaactgcctgtggatgccagatttccccctcgagtgcccaagagcttcccctttaacacctcagtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagtttacagaccatctcttcaacattgctaagcccagacctccctggatgggcctgctgggccctaccatccaagctgaagtgtatgacactgttgtgatcacactcaagaacatggcctcccatcctgtgtccctgcatgcagtgggagtctcctactggaaggcctcagaaggagcagagtatgatgaccagaccagccagagagagaaggaggatgacaaggtgtttcctggagggagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggacctatggccagtgaccctctgtgtcttacctattcctacctgtcacatgtggatctggtgaaggacctgaacagtggcctgattggggctctgctggtttgcagagaaggcagcttggccaaggagaagacccaaaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgaggggaaatcatggcactcagagaccaagaacagcctcatgcaggatagggatgctgccagtgccagggcttggcccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaatagaagcctgcctgggctgataggctgtcacagaaaatctgtgtactggcatgtgattggcatgggcaccacacctgaggtgcactccattttcctggagggccacaccttccttgtgagaaaccacagacaagcttccctggagatcagcccaatcacctttctgactgctcaaaccctcctgatggatctgggccagttcctgct
gttctgtcatatctcctcacaccagcatgatggaatggaagcttatgtcaaggtggactcctgcccagaggaaccacagctcagaatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgacctgacagactctgaaatggatgtggtcagatttgatgatgacaacagcccttcattcatccaaatcagatctgtggccaagaagcatcccaagacctgggtgcactacatagctgctgaggaggaggactgggactatgcccctctggtcctggcccctgatgacagaagctataaaagccagtacctgaataatggcccccagagaattggcagaaagtacaagaaagtcagattcatggcttacactgatgagaccttcaaaaccagggaagccatccagcatgagtcaggcatcctgggccccctgctgtatggggaggttggagataccctgctgattatcttcaaaaaccaggcaagcaggccctacaatatctaccctcatggcatcactgatgtcaggccactgtattccagaagactgcctaagggggtgaagcacctgaaggacttcccaatcctgccaggggagattttcaaatacaagtggacagtgactgtggaggatggaccaaccaagtcagatcctagatgtctgaccagatactactccagctttgtgaacatggagagagacctggcctctggcctgattggccctctgctgatctgctataaagagtcagtggaccagagaggcaaccagatcatgagtgacaaaagaaatgtgatcttgttctcagtgtttgatgagaatagatcttggtacctcacagaaaacatccagaggttcctgcccaatccagctggggtgcagctggaagatccagaattccaggccagcaacatcatgcatagcatcaatggttatgtctttgacagcctgcagctgtcagtgtgtctgcatgaagttgcttactggtatattctgtccattggagcccagacagacttcctgtctgtcttcttctctggctacacctttaaacacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttccctttctctggggaaacagtgttcatgtccatggaaaaccctggactgtggatcctgggctgccataacagtgacttcagaaacagaggcatgacagccctgctcaaggtgtccagctgtgataagaacacaggagactactatgaggatagctatgaggacatcagtgcttacctgctgagcaagaataatgccattgaacccaggtcattttcccaaaatccccctgtgctgaaaaggcaccagagggagatcacgcgtaccaccctgcagagtgaccaggaggaaattgattatgatgacaccatctctgtggaaatgaaaaaggaggattttgacatctatgatgaggatgagaaccagagccctagaagcttccagaaaaagactagacactacttcattgctgcagtggagagactctgggattatggcatgagctccagcccccatgtgctgagaaatagagctcagagtggcagtgtgccacagttcaagaaggtggtgtttcaggagttcactgatggctccttcacacaaccactttacagaggagaactgaatgagcacctgggcctcctgggcccctacatcagggctgaagtggaggataacattatggtcacatttaggaatcaggcttccagaccctactccttttattcctcactcatttcctatgaggaggaccagaggcagggagctgagcccagaaaaaattttgtgaaacccaatgaaaccaagacctacttctggaaggtgcagcaccatatggcccctaccaaggatgaatttgactgcaaggcttgggcttacttttctgatgtggaccttgagaaagatgtgcattcaggcctcattgggccactgctggtgtgccacaccaatacactgaaccctgctcatgggagacaggtcacagtgcaggagtttgcactcttctttaccatctttgatgagaccaagtcctggtatttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccttgtaacatccagatggaggatcccaccttcaaggaaaactacagattccatgccatcaatggctacatcatggacaccctgccaggcctggtgatggcccaggaccagaggatcaggtggtacctcctgtctatgggcagcaatgaaaatatccacagcattcacttctctggacatgtgtttactgtgaggaagaaggaggaatacaagatggctctgtacaacctctaccctggggtgtttgaaacagtggagatgctgccctccaaggctggcatctggagagtggaatgtctgattggggagcatctgcatgctggcatgagcacactgttcctggtgtattccaacaagtgccagaccccactgggcatggcctcaggacatatcagggacttccagatcactgctagtggacaatatggacagtgggcacccaagctggccagactgcactactcaggctccatcaatgcctggagtaccaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgattatacatggcatcaagacccagggagctagacagaagttcagctccctgtacatctcccaattcatcatcatgtactctctggatggcaagaaatggcagacctacagaggcaatagcactggcaccctgatggtgttttttggaaatgttgactcttctggcatcaagcacaacatcttcaacccccccatcattgccagatatatcaggctccaccccacccactactccataaggagcaccctgagaatggagctgatgggctgtgacctgaattcctgctccatgcccctgggcatggaatccaaggcaatctctgatgcacagat
cacagcctcctcctacttcaccaacatgtttgcaacctggagcccctccaaggccagactgcacctgcagggcaggtccaatgcttggagaccacaagtgaacaacccaaaggagtggctgcaggtggacttccagaagaccatgaaagtgactggagtgaccacccagggagtgaaatccctgctcactagcatgtatgtgaaggaattcctgatcagtagctctcaagatggccaccagtggaccctgttcttccagaatggcaaggtgaaggtgtttcagggcaaccaggattccttcacccctgtggtgaatagcctggatcccccactgctgaccagatacctgagaatccacccccagtcctgggttcaccagattgccctgagaatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtactga
[0371]
》seq id no:33-已知的haat tre
[0372]
aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagaggggtacccggggatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacaatgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatgatccccctgatctgcggcc
[0373]
》seq id no:34-fviiico19sq aav构建体序列
[0374]
ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctttaattaacccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatcgcgccaccatgaagctgctcgcagcaactgtgctactcctcaccatctgcagccttgaaggagctactagaagatattatcttggggcagtggagctgagctgggactacatgcagtctgacctgggagaactgcctgtggatgccagatttccccctcgagtgcccaagagcttcccctttaacacctcagtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagtttacagaccatctcttcaacattgctaagcccagacctccctggatgggcctgctgggccctaccatccaagctgaagtgtatgacactgttgtgatcacactcaagaacatggcctcccatcctgtgtccctgcatgcagtgggagtctcctactggaaggcctcagaaggagcagagtatgatgaccagaccagccagagagagaaggaggatgacaaggtgtttcctggagggagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggacctatggccagtgaccctctgtgtcttacctattcctacctgtcacatgtggatctggtgaaggacctgaacagtggcctgattggggctctgctggtttgcagagaaggcagcttggccaaggagaagacccaaaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgaggggaaatcatggcactcagagaccaagaacagcctcatgcaggatagggatgctgccagtgccagggcttggcccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaatagaagcctgcctgggctgataggctgtcacagaaaatctgtgtactggcatgtgattggcatgggcaccacacctgaggtgcactccattttcctggagggccacaccttccttgtgagaaaccacagacaagcttccctggagatcagcccaatcacctttctgactgctcaaaccctcctgatggatctgggccagttcctgctgttctgtcatatctcctcacaccagcatgatggaatggaagcttatgtcaaggtggactcctgcccagaggaaccacagctcagaatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgacctgacagactctgaaatggatgtggtcagatttgatgatgacaacagcccttcattcatccaaatcagatctgtggccaagaagcatcccaagacctgggtgcactacatagctgctgaggaggaggactgggactatgcccctctggtcctggcccctgatgacagaagctataaaagccagtacctgaataatggcccccagaga
attggcagaaagtacaagaaagtcagattcatggcttacactgatgagaccttcaaaaccagggaagccatccagcatgagtcaggcatcctgggccccctgctgtatggggaggttggagataccctgctgattatcttcaaaaaccaggcaagcaggccctacaatatctaccctcatggcatcactgatgtcaggccactgtattccagaagactgcctaagggggtgaagcacctgaaggacttcccaatcctgccaggggagattttcaaatacaagtggacagtgactgtggaggatggaccaaccaagtcagatcctagatgtctgaccagatactactccagctttgtgaacatggagagagacctggcctctggcctgattggccctctgctgatctgctataaagagtcagtggaccagagaggcaaccagatcatgagtgacaaaagaaatgtgatcttgttctcagtgtttgatgagaatagatcttggtacctcacagaaaacatccagaggttcctgcccaatccagctggggtgcagctggaagatccagaattccaggccagcaacatcatgcatagcatcaatggttatgtctttgacagcctgcagctgtcagtgtgtctgcatgaagttgcttactggtatattctgtccattggagcccagacagacttcctgtctgtcttcttctctggctacacctttaaacacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttccctttctctggggaaacagtgttcatgtccatggaaaaccctggactgtggatcctgggctgccataacagtgacttcagaaacagaggcatgacagccctgctcaaggtgtccagctgtgataagaacacaggagactactatgaggatagctatgaggacatcagtgcttacctgctgagcaagaataatgccattgaacccaggtcattttcccaaaatccccctgtgctgaaaaggcaccagagggagatcacgcgtaccaccctgcagagtgaccaggaggaaattgattatgatgacaccatctctgtggaaatgaaaaaggaggattttgacatctatgatgaggatgagaaccagagccctagaagcttccagaaaaagactagacactacttcattgctgcagtggagagactctgggattatggcatgagctccagcccccatgtgctgagaaatagagctcagagtggcagtgtgccacagttcaagaaggtggtgtttcaggagttcactgatggctccttcacacaaccactttacagaggagaactgaatgagcacctgggcctcctgggcccctacatcagggctgaagtggaggataacattatggtcacatttaggaatcaggcttccagaccctactccttttattcctcactcatttcctatgaggaggaccagaggcagggagctgagcccagaaaaaattttgtgaaacccaatgaaaccaagacctacttctggaaggtgcagcaccatatggcccctaccaaggatgaatttgactgcaaggcttgggcttacttttctgatgtggaccttgagaaagatgtgcattcaggcctcattgggccactgctggtgtgccacaccaatacactgaaccctgctcatgggagacaggtcacagtgcaggagtttgcactcttctttaccatctttgatgagaccaagtcctggtatttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccttgtaacatccagatggaggatcccaccttcaaggaaaactacagattccatgccatcaatggctacatcatggacaccctgccaggcctggtgatggcccaggaccagaggatcaggtggtacctcctgtctatgggcagcaatgaaaatatccacagcattcacttctctggacatgtgtttactgtgaggaagaaggaggaatacaagatggctctgtacaacctctaccctggggtgtttgaaacagtggagatgctgccctccaaggctggcatctggagagtggaatgtctgattggggagcatctgcatgctggcatgagcacactgttcctggtgtattccaacaagtgccagaccccactgggcatggcctcaggacatatcagggacttccagatcactgctagtggacaatatggacagtgggcacccaagctggccagactgcactactcaggctccatcaatgcctggagtaccaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgattatacatggcatcaagacccagggagctagacagaagttcagctccctgtacatctcccaattcatcatcatgtactctctggatggcaagaaatggcagacctacagaggcaatagcactggcaccctgatggtgttttttggaaatgttgactcttctggcatcaagcacaacatcttcaacccccccatcattgccagatatatcaggctccaccccacccactactccataaggagcaccctgagaatggagctgatgggctgtgacctgaattcctgctccatgcccctgggcatggaatccaaggcaatctctgatgcacagatcacagcctcctcctacttcaccaacatgtttgcaacctggagcccctccaaggccagactgcacctgcagggcaggtccaatgcttggagaccacaagtgaacaacccaaaggagtggctgcaggtggacttccagaagaccatgaaagtgactggagtgaccacccagggagtgaaatccctgctcactagcatgtatgtgaaggaattcctgatcagtagctctcaagatggccaccagtggaccctgttcttccagaatggcaaggtgaaggtgtttcagggcaaccaggattccttcacccctgtggtgaatagcctggatcccccactg
ctgaccagatacctgagaatccacccccagtcctgggttcaccagattgccctgagaatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtactgaaataaaagatctttattttcattagatctgtgtgttggttttttgtgtgaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa
[0375]
》seq id no:35 fre75 tre
[0376]
gcaaacattgcaagcagcaaacagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccccccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc
[0377]
》seq id no:36 fre46 tre
[0378]
agtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccc
[0379]
》seq id no:37 fre47 tre
[0380]
agtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccctcagct
[0381]
本发明编号的方面
[0382]
1.一种转录调节元件，其包含核心核苷酸序列，核心核苷酸序列包含与seq id no:2具有至少95％同一性的核苷酸序列或与seq id no:2相差单个核苷酸的核苷酸序列或由其组成；并且其中转录调节元件的长度为80至280个核苷酸；任选地其中转录调节元件的长度为80至225个核苷酸。
[0383]
2.根据方面1所述的转录调节元件，还包含位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列。
[0384]
3.根据方面2所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列包含一个或多个转录起始位点(tss)。
[0385]
4.根据方面3所述的转录调节元件，其中一个或多个tss包含以下的核苷酸序列或由其组成：
[0386]
a.seq id no:6，或与seq id no:6相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0387]
b.seq id no:7，或与seq id no:7相差单个核苷酸的核苷酸序列；和/或
[0388]
c.seq id no:8，或与seq id no:8相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0389]
5.根据方面2至4中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列包含：
[0390]
a.seq id no:6所示的核苷酸序列，或与seq id no:6相差单个核苷酸的核苷酸序列；或
[0391]
b.与seq id no:9具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:9相差单个核苷酸的核苷酸序列；或
[0392]
c.与seq id no:10具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:10相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0393]
6.根据方面2至5中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列还包含由seq id no:11定义的核苷酸序列，或与seq id no:11相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0394]
7.根据方面2至6中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列的长度短于50个核苷酸；任选地短于40个核苷酸；并且任选地短于30个核苷酸。
[0395]
8.根据方面2至7中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列或由其组成：
[0396]
a.与seq id no:10具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:10相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0397]
b.与seq id no:12具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:12相差单个核苷酸的核苷酸序列；和
[0398]
c.与seq id no:13具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:13相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0399]
9.根据前述方面中任一项所述的转录调节元件，还包含位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列。
[0400]
10.根据方面9所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列包含：
[0401]
a.包含seq id no:14的至少10个、至少15个或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列；
[0402]
b.与seq id no:14具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:14相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0403]
c.包含seq id no:15的至少10个、至少15个或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列；
[0404]
d.与seq id no:15具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:15相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0405]
e.包含seq id no:16的至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个或至少90个连续核苷酸的核苷酸序列；
[0406]
f.与seq id no:16具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:16相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0407]
和/或
[0408]
g.由seq id no:17定义的核苷酸序列，或与seq id no:17相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0409]
11.根据方面9或方面10所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列与包含seq id no:4的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或45个连续核苷酸的核苷酸序列具有小于60％的同一性。
[0410]
12.根据方面11所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列与包含seq id no:4的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或45个连续核苷酸的核苷酸序列具有小于50％的同一性；任选地其中它具有小于45％的同一性；任选地其中它具有小于40％的同一性；并且任选地其中它具有小于30％的同一性。
[0411]
13.根据方面9至12中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度短于110个核苷酸；任选地短于100个核苷酸；任选地短于50个核苷酸；并且任选地短于10个核苷酸。
[0412]
14.根据方面9至13中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度为5至110个核苷酸。
[0413]
15.根据方面9至14中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度为至少7个核苷酸。
[0414]
16.根据方面9至15中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度为102个核苷酸或更短。
[0415]
17.根据方面9至16中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：
[0416]
a.与seq id no:18具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:18相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0417]
b.与seq id no:19具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:19相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0418]
c.与seq id no:20具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:20相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0419]
d.与seq id no:21具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:21相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0420]
e.与seq id no:22具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:22相差单个核苷酸的核苷酸序列；和
[0421]
f.seq id no:23所示的核苷酸序列，或与seq id no:23相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0422]
18.根据前述方面中任一项所述的转录调节元件，其中：
[0423]
a.转录调节元件不含seq id no:4所示的核苷酸序列，或不含seq id no:4的至少20个、至少30个或至少40个连续核苷酸；
[0424]
和/或
[0425]
b.转录调节元件不含seq id no:5所示的核苷酸序列，或不含seq id no:5的至少20个、至少30个或至少40个连续核苷酸。
[0426]
19.根据方面18所述的转录调节元件，其：
[0427]
a.不含与seq id no:4具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列；
[0428]
和/或
[0429]
b.不含与seq id no:5具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列。
[0430]
20.根据前述方面中任一项所述的转录调节元件，其长度短于200个核苷酸；任选地其长度短于150个核苷酸；并且任选地其长度短于125个核苷酸。
[0431]
21.根据前述方面中任一项所述的转录调节元件，其长度为至少85个核苷酸，任选地其长度为至少100个核苷酸，并且任选地其长度为至少110个核苷酸。
[0432]
22.一种转录调节元件，其包含核心核苷酸序列，核心核苷酸序列包含与seq id no:2具有至少95％同一性的核苷酸序列或与seq id no:2相差单个核苷酸的核苷酸序列或由其组成，其中：
[0433]
a.转录调节元件不含seq id no:4的至少20个、至少30个或至少40个连续核苷酸；
[0434]
和/或
[0435]
b.转录调节元件不含seq id no:5的至少20个、至少30个或至少40个连续核苷酸；
[0436]
并且其中转录调节元件的长度为80至280个核苷酸。
[0437]
23.根据方面22所述的转录调节元件，其：
[0438]
a.不含与seq id no:4具有至少90％或至少95％或100％同一性的核苷酸序列；
[0439]
和/或
[0440]
b.不含与seq id no:5具有至少90％或至少95％或100％同一性的核苷酸序列。
[0441]
24.根据方面22或方面23所述的转录调节元件，还包含位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列。
[0442]
25.根据方面24所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列包含一个或多个转录起始位点(tss)。
[0443]
26.根据方面25所述的转录调节元件，其中一个或多个tss包含以下的核苷酸序列或由其组成：
[0444]
a.seq id no:6，或与seq id no:6相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0445]
b.seq id no:7，或与seq id no:7相差单个核苷酸的核苷酸序列；和/或
[0446]
c.seq id no:8，或与seq id no:8相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0447]
27.根据方面24、方面25或方面26所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列包含：
[0448]
a.seq id no:6所示的核苷酸序列，或与seq id no:6相差单个核苷酸的核苷酸序列；或
[0449]
b.与seq id no:9具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:9相差单个核苷酸的核苷酸序列；或
[0450]
c.与seq id no:10具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:10相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0451]
28.根据方面24至27中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列还包含由seq id no:11定义的核苷酸序列，或与seq id no:11相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0452]
29.根据方面24至28中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列的长度短于50个核苷酸；任选地短于40个核苷酸；并且任选地短于30个核苷酸。
[0453]
30.根据方面24至29中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列或由其组成：
[0454]
a.与seq id no:10具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:10相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0455]
b.与seq id no:12具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:12相差单个核苷酸的核苷酸序列；和
[0456]
c.与seq id no:13具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:13相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0457]
31.根据方面22至30中任一项所述的转录调节元件，其还包含位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列。
[0458]
32.根据方面31所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列包含：
[0459]
a.包含seq id no:14的至少10个、至少15个或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列；
[0460]
b.与seq id no:14具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:14相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0461]
c.包含seq id no:15的至少10个、至少15个或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列；
[0462]
d.与seq id no:15具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:15相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0463]
e.包含seq id no:16的至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个或至少90个连续核苷酸的核苷酸序列；
[0464]
f.与seq id no:16具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:16相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0465]
和/或
[0466]
g.由seq id no:17定义的核苷酸序列，或与seq id no:17相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0467]
33.根据方面31或32所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列与包含seq id no:4的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或45个连续核苷酸的核苷酸序列具有小于60％的同一性。
[0468]
34.根据方面33所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列与包含seq id no:4的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或45个连续核苷酸的核苷酸序列具有小于50％的同一性；任选地其中它具有小于45％的同一性；任选地其中它具有小于40％的同一性；并且任选地其中它具有小于30％的同一性。
[0469]
35.根据方面31至34中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度短于110个核苷酸；任选地短于100个核苷酸；任选地短于50个核苷酸；并且任选地短于10个核苷酸。
[0470]
36.根据方面31至35中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度为5至110个核苷酸。
[0471]
37.根据方面31至36中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度为至少7个核苷酸。
[0472]
38.根据方面31至37中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度为102个核苷酸或更短。
[0473]
39.根据方面31至38中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：
[0474]
a.与seq id no:18具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:18相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0475]
b.与seq id no:19具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:19相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0476]
c.与seq id no:20具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:20相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0477]
d.与seq id no:21具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:21相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0478]
e.与seq id no:22具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:22相差单个核苷酸的核苷酸序列；和
[0479]
f.seq id no:23所示的核苷酸序列，或与seq id no:23相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0480]
40.根据方面22至39中任一项所述的转录调节元件，其长度短于200个核苷酸；任选地其长度短于150个核苷酸；并且任选地其长度短于125个核苷酸。
[0481]
41.根据方面22至40中任一项所述的转录调节元件，其长度为至少85个核苷酸，任选地其长度为至少100个核苷酸，并且任选地其长度为至少110个核苷酸。
[0482]
42.一种转录调节元件，其包含：
[0483]
a.核心核苷酸序列，核心核苷酸序列包含与seq id no:2具有至少95％同一性的核苷酸序列或与seq id no:2相差单个核苷酸的核苷酸序列或由其组成；并且
[0484]
b.位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列，并且其与包含seq id no:4的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或45个连续核苷酸的核苷酸序列具有小于60％的同一性；
[0485]
其中转录调节元件的长度为80至280个核苷酸。
[0486]
43.根据方面42所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列包含：
[0487]
a.包含seq id no:14的至少10个、至少15个或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列；
[0488]
b.与seq id no:14具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:14相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0489]
c.包含seq id no:15的至少10个、至少15个或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列；
[0490]
d.与seq id no:15具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:15相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0491]
e.包含seq id no:16的至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个或至少90个连续核苷酸的核苷酸序列；
[0492]
f.与seq id no:16具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:16相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0493]
和/或
[0494]
g.由seq id no:17定义的核苷酸序列，或与seq id no:17相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0495]
44.根据方面42或方面43所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列与包含seq id no:4的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或45个连续核苷酸的核苷酸序列具有小于50％的同一性；任选地其中它具有小于45％的同一
性；任选地其中它具有小于40％的同一性；并且任选地其中它具有小于30％的同一性。
[0496]
45.根据方面42至44中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度短于110个核苷酸；任选地短于100个核苷酸；任选地短于50个核苷酸；并且任选地短于10个核苷酸。
[0497]
46.根据方面42至45中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度为5至110个核苷酸。
[0498]
47.根据方面42至46中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度为至少7个核苷酸。
[0499]
48.根据方面42至47中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列的长度为102个核苷酸或更短。
[0500]
49.根据方面42至48中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的5'的核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：
[0501]
a.与seq id no:18具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:18相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0502]
b.与seq id no:19具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:19相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0503]
c.与seq id no:20具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:20相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0504]
d.与seq id no:21具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:21相差单个核苷酸的核苷酸序列；
[0505]
e.与seq id no:22具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:22相差单个核苷酸的核苷酸序列；和
[0506]
f.seq id no:23所示的核苷酸序列，或与seq id no:23相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0507]
50.根据方面42至49中任一项所述的转录调节元件，还包含位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列。
[0508]
51.根据方面50所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列包含seq id no:6所示的核苷酸序列，或与seq id no:6相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0509]
52.根据方面51所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列包含：
[0510]
a.seq id no:6所示的核苷酸序列，或与seq id no:6相差单个核苷酸的核苷酸序列；或
[0511]
b.与seq id no:9具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:9相差单个核苷酸的核苷酸序列；或
[0512]
c.与seq id no:10具有至少90％同一性的核苷酸序列，或与seq id no:10相差单个核苷酸的核苷酸序列。
[0513]
53.根据方面50至52中任一项所述的转录调节元件，其中位于核心核苷酸序列的3'的核苷酸序列还包含由seq id no:11定义的核苷酸序列，或与seq id no:11相差单个核苷酸的核苷酸序列。
id no:2具有至少95％同一性并且任选地至少98％同一性的核苷酸序列或由其组成。
[0539]
65.根据前述方面中任一项所述的转录调节元件，其中核心核苷酸序列与seq id no:2相同。
[0540]
66.根据方面1至65中任一项所述的转录调节元件，其中核心核苷酸序列包含与seq id no:3具有至少95％同一性并且任选地至少98％同一性的核苷酸序列或由其组成。
[0541]
67.根据方面66所述的转录调节元件，其中核心核苷酸序列与seq id no:3具有至少95％的同一性并且任选地至少98％的同一性。
[0542]
68.根据方面67所述的转录调节元件，其中核心核苷酸序列与seq id no:3相同。
[0543]
69.根据方面1至68中任一项所述的转录调节元件，其具有与选自以下的核苷酸序列具有至少90％同一性、任选地至少95％同一性或任选地至少98％同一性的核苷酸序列：
[0544]
a.seq id no:24；
[0545]
b.seq id no:25；
[0546]
c.seq id no:26；
[0547]
d.seq id no:27；
[0548]
e.seq id no:28；和
[0549]
f.seq id no:29。
[0550]
70.根据方面1至63中任一项所述的转录调节元件，其具有选自以下的核苷酸序列：
[0551]
a.seq id no:24；
[0552]
b.seq id no:25；
[0553]
c.seq id no:26；
[0554]
d.seq id no:27；
[0555]
e.seq id no:28；和
[0556]
f.seq id no:29。
[0557]
71.根据前述方面中任一项所述的转录调节元件，其中转录调节元件包含启动子；任选地其中转录调节元件还包含增强子。
[0558]
72.根据方面71所述的转录调节元件，其中启动子是肝特异性的。
[0559]
73.一种多核苷酸，其包含前述方面中任一项所述的转录调节元件，其中转录调节元件可操作地连接至转基因，任选地其中转基因编码人蛋白质。
[0560]
74.根据方面1至72中任一项所述的转录调节元件，其中转录调节元件是包含转基因的载体的一部分，任选地其中载体是病毒颗粒如aav载体。
[0561]
75.根据方面73所述的多核苷酸或方面74所述的转录调节元件，其中该转录调节元件以与由seq id no:1或seq id no:33定义的转录调节元件相比的50％或更好地表达转基因。
[0562]
76.根据方面73所述的多核苷酸或方面74所述的转录调节元件，其中该转录调节元件以与由seq id no:1或seq id no:33定义的转录调节元件相比的80％或更好地表达转基因。
[0563]
77.根据方面73所述的多核苷酸或方面74所述的转录调节元件，其中该转录调节元件以与由seq id no:1或seq id no:33定义的转录调节元件相比的100％或更好地表达
转基因；任选地其中该转录调节元件以与由seq id no:1或seq id no:33定义的转录调节元件相比的110％或更好、120％或更好、140％或更好或150％或更好地表达转基因。
[0564]
78.根据方面75至77中任一项所述的转录调节元件，其中在huh7细胞中体外测定转基因的表达。
[0565]
79.根据方面73至78中任一项所述的转录调节元件，其中转基因编码蛋白质或非翻译的rna，所述非翻译的rna任选地是sirna或mirna或snrna或反义rna。
[0566]
80.根据方面73至79中任一项所述的转录调节元件，其中转基因的长度长于4k个核苷酸；并且任选地其中转基因的长度长于4.2k个核苷酸。
[0567]
81.根据方面80所述的转录调节元件，其中转基因的长度短于4.5k个核苷酸，任选地其中转基因的长度短于4.4k个核苷酸。
[0568]
82.根据方面73至81中任一项所述的转录调节元件，其中转基因编码fviii；任选地其中转基因编码截短或修饰的fviii；任选地其中转基因编码b-结构域缺失的fviii。
[0569]
83.一种载体，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含：(i)方面1至72中任一项所述的转录调节元件；和(ii)转基因。
[0570]
84.根据方面83所述的载体，其中载体的核苷酸序列还包含编码信号肽的核苷酸序列。
[0571]
85.根据方面84所述的载体，其中编码信号肽的核苷酸序列的长度为50至100个核苷酸。
[0572]
86.根据方面85所述的载体，其中编码信号肽的核苷酸序列的长度短于80个核苷酸。
[0573]
87.根据方面83至86中任一项所述的载体，其为病毒颗粒如aav载体。
[0574]
88.根据方面83至87中任一项所述的载体，其中该转录调节元件以与由seq id no:1或seq id no:33定义的转录调节元件相比的50％或更好地表达转基因。
[0575]
89.根据方面83至87中任一项所述的载体，其中该转录调节元件以与由seq id no:1或seq id no:33定义的转录调节元件相比的80％或更好地表达转基因。
[0576]
90.根据方面83至87中任一项所述的载体，其中该转录调节元件以与由seq id no:1或seq id no:33定义的转录调节元件相比的100％或更好地表达转基因；并且任选地其中该转录调节元件以与由seq id no:1或seq id no:33定义的转录调节元件相比的110％或更好、120％或更好、140％或更好或150％或更好地表达转基因。
[0577]
91.根据方面89至90中任一项所述的载体，其中在huh7细胞中体外测定转基因的表达。
[0578]
92.根据方面83至91中任一项所述的载体，其中转基因编码蛋白质或非翻译的rna，所述非翻译的rna任选地是sirna或mirna或snrna或反义rna。
[0579]
93.根据方面83至92中任一项所述的载体，其中转基因的长度长于4k个核苷酸；并且任选地其中转基因的长度长于4.2个核苷酸。
[0580]
94.根据方面93所述的载体，其中转基因的长度短于4.5k个核苷酸，任选地其中转基因的长度短于4.4k个核苷酸。
[0581]
95.根据方面83至94中任一项所述的载体，其中转基因编码fviii；任选地其中转基因编码截短或修饰的fviii；任选地其中转基因编码b-结构域缺失的fviii。
[0582]
96.根据方面83至95中任一项所述的载体，其中载体基因组的长度短于4.9k个核苷酸，并且任选地其中载体基因组的长度不短于4.5k个核苷酸。
[0583]
97.根据方面96所述的载体，其中载体基因组的长度约4.7k个核苷酸。
[0584]
98.根据方面83至97中任一项所述的载体，其用于治疗方法，任选地其中治疗方法是基因治疗方法和/或治疗血友病a的方法。
[0585]
99.一种治疗方法，包括给患者施用有效量的方面83至97中任一项所述的载体，任选地其中治疗方法是基因治疗方法和/或治疗血友病a的方法。
[0586]
100.方面83至97中任一项所述的载体在治疗方法中的用途，任选地其中治疗方法是基因治疗方法和/或治疗血友病a的方法。