用于细胞转导的容器和方法与流程

用于细胞转导的容器和方法
1.相关专利申请的交叉引用
2.本技术要求2019年12月30日提交的美国临时专利申请号62/954,735的优先权权益，其全文据此以引用方式并入本文。
3.发明背景
技术领域
4.本公开整体涉及具有包含一个或多个适配体序列的表面的容器(例如袋)。更具体地，本公开涉及包含附接至对一种或多种生物制剂具有结合亲和力的适配体序列的含氟聚合物的容器例如袋，并且涉及使用此类容器的转导方法。


背景技术：

5.转导在许多应用中都很重要，(例如由病毒载体)通过转导这一过程将外源dna引入靶细胞。例如，car t细胞疗法是一种癌症治疗，其中通过转导将编码嵌合抗原受体(car)的基因引入从患者收集的t细胞。经修饰的细胞在扩增并重新引入患者体内后，可以与癌细胞结合并杀死癌细胞。此外，病毒转导经常用于基本遗传研究。
6.然而，对于某些细胞类型(诸如造血细胞和其他悬浮细胞)，来自病毒载体的基因转移可能效率低下。通常，此类系统的转导效率可以通过使用增强剂(诸如聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或重组人纤维连接蛋白)来进行改善。聚凝胺和硫酸鱼精蛋白通过修改靶细胞的表面特性来改善转导效率。然而，这些类型的增强剂可能对细胞活力产生负面影响。可替代地，重组人纤维连接蛋白——一种包括对病毒颗粒具有结合亲和力的肝素结合域和对vla-4和vla-5表面受体具有结合亲和力的两个细胞结合域的多肽——可以通过促进病毒载体和靶细胞的共定位来改善转导效率。
7.通常，在转导过程之前，必须将转导增强剂(例如重组人纤维连接蛋白)手动涂覆至容器上。因为经涂覆的容器需要特殊的冷藏并且保质期短，所以相对昂贵、耗时的涂覆过程通常必须由进行转导过程的用户在该过程前不久执行。
8.因此，仍然需要用于细胞转导的简单、经济有效和/或有时效性的系统。


技术实现要素：

9.在一方面，本公开提供了一种具有外表面和内表面的容器(例如以袋的形式)，内表面包含
10.含氟聚合物；
11.多个官能团，该多个官能团附接至含氟聚合物；以及
12.对病毒载体具有结合亲和力的第一适配体序列，该第一适配体序列附接至官能团的至少一部分中的每个官能团。
13.在另一方面，本公开提供了一种转导方法，该转导方法包括将病毒载体和靶细胞包括在如本文所述的容器中。
14.鉴于本文的公开内容，本公开的其他方面对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。
附图说明
15.图1为根据本公开的一个实施例的袋的示意性俯视图(顶部)和剖视图(底部)。
16.图2为根据本公开的某些实施例的袋的示意性俯视图。
具体实施方式
17.在各方面，本公开涉及具有内表面的容器，该内表面包含：含氟聚合物，该含氟聚合物具有附接至其上的多个官能团；以及第一适配体序列，该第一适配体序列附接至官能团的至少一部分中的每个官能团。本公开的容器能以多种形式提供。一种特别方便的形式是袋，例如由如本文所述的一片或多片含氟聚合物材料形成的袋。本领域普通技术人员将熟悉袋结构，诸如用于细胞培养的袋结构，并且将能够基于本文的描述调整常规袋结构以用于本公开所述的袋和方法。当然，本领域普通技术人员将理解，能以多种其他形式提供本公开的容器，例如烧瓶、管、平皿。
18.此类容器(以袋的形式)的一个实施例在图1的示意性俯视图(顶部)和剖视图(底部)中示出。图1的袋100包括袋壁110，该袋壁具有外表面112和内表面114；并且进一步包括孔口130和140，该孔口位于袋的相对端部，以用于向袋中添加培养基或从袋去除培养基。本领域普通技术人员将理解，孔口的数量和位置没有特别限制，并且可以例如为了便于使用或制造而相应地进行定位。袋100可以是将两个含有含氟聚合物的片材(例如，在其内表面上具有一层氟化乙烯丙烯片材的两个片材)在它们的边缘处粘合在一起(例如，通过激光焊接、电晕放电、辐射、加热或熔融层压、蚀刻、等离子体处理、润湿、粘合剂或它们的组合)以形成隔室120的产物。孔口130和140可以是可密封的以提供密封的隔室120。
19.袋壁110在其组成上可能是均匀的，或者可替代地可包括两个或更多个不同的域(例如，两层或更多层)。例如，将两个含氟聚合物片材粘合在一起，然后涂覆粘合的片材可以提供与内表面114在组成上不同的外表面112。类似地，将两个多层片材粘合在一起可以提供与内表面114在组成上不同的外表面112。多层片材可以由含氟聚合物材料和非氟化聚合物材料两者形成；在此类情况下，可以在多层片材中的一个或多个片材的内表面处提供含氟聚合物层。袋壁110的厚度、隔室120的容积以及袋100和/或隔室120的形状没有受到特别限制，并且可以为了便于使用或制造和/或适合特定应用而被选择。例如，在某些实施例中，容器壁的厚度可以在0.0003英寸至0.2英寸的范围内，而在某些实施例中，隔室的容积可以在100ml至100l的范围内。
20.图2示出了适用于本公开的袋和方法的培养袋的构型的几个示例性实施例。袋200a仅具有单个孔口230a，提供通向隔室220a的入口。袋200b处于所谓的“蛇形”构造，其中可以提供通过系统的更长的路径长度；孔口230b和240b通过由蛇形隔室220b形成的蛇形路径来连接，该蛇形隔室通过形成袋的片材的适当焊接而形成。并且袋200c具有非矩形形状，在孔口230c和240c之间具有对应的非矩形隔室220c。
21.容器的一个或多个壁可以是多孔的，并且可以例如对细胞培养物中产生和消耗的气体(例如o2、co2)可渗透但对液体(例如水)不可渗透。这可以允许气体跨过容器壁与大气
被动交换，以允许袋中细胞的呼吸。
22.本公开的容器理想地被形成，使得容器内基本上没有流体污染。因此，期望容器的内表面由不会将有机物浸出到流体中的材料形成。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，容器壁的内表面由具有小于0.1mg/cm2(例如，小于0.05mg/cm2，或小于0.05mg/cm2)的水中总有机碳(toc)含量的聚合物(例如含氟聚合物，诸如氟化乙烯丙烯)形成。此类容器例如在美国专利申请公开号2016/0178490和2016/0178491中描述，其各自据此通过引用整体并入本文；基于本文的描述，本领域普通技术人员可以将此类容器改造成用于本公开的容器和方法中。
23.如本文所用，测量本公开的系统中采用的容器的toc，该测量包括例如通过从容器的内表面面积提取来加以进行(其中结果反映为每平方厘米内部面积的toc，单位为mg/cm2)。根据美国药典(usp)643并且使用利用紫外线促进化学氧化的高温湿氧化反应的设备测量toc(超洁净技术手册：第1卷：ultra-pure water，ohmi，tadahiro；crc出版社，1993年，第497至517页)。例如以3cm2制品表面面积与1ml水的比例，将纯化水在70℃下放置成与聚合物接触24小时。移除与聚合物接触的水并在toc分析仪中进行测试。合适的设备为tekmar dohrmann型号phoenix 8000toc分析仪。
24.如上所述，容器的内表面包含附接至含氟聚合物的多个官能团。例如，内表面的含氟聚合物可以用羧基基团、羟基基团、醛基团、羰基基团、胺基团、亚胺基团、酰胺基团、酯基团、酸酐基团、硫醇基团、二硫化物基团、酚基团、胍基团、硫醚基团、吲哚基团、咪唑基团、氨基乙基酰胺基团、炔烃基团、烯烃基团、氮杂环丙烷基团、环氧基团、异腈化物基团、异氰化物基团、四嗪基团、重氮表面基团、炔烃基团、烯烃基团、氮杂环丙烷基团、环氧基团、异腈化物基团、异氰化物基团、四嗪基团、烷基基团、氨基乙基酰胺基团、酯基团或它们的任何混合物来进行官能化。例如，在某些此类实施例中，官能团包括醛基基团。在如本文另外描述的某些实施例中，官能团包括含氮基团。例如，在某些此类实施例中，容器的内表面包含多个胺基基团。本领域普通技术人员将理解，这些“官能团”被识别为与适配体序列附接的基团；例如，“胺”官能团可以附接至带有羧基的适配体序列，与适配体序列形成甲酰胺键。
25.本领域普通技术人员将理解，可以以许多方式在含氟聚合物表面处提供官能团。在如本文另外描述的某些实施例中，在容器的内表面处的官能团是蚀刻含氟聚合物的产物。例如，在某些此类实施例中，蚀刻包括化学蚀刻、物理-机械蚀刻或等离子体蚀刻。例如，在某些实施例中，构成内表面的官能团是化学蚀刻含氟聚合物的产物。在某些此类实施例中，化学蚀刻包括用氨钠或萘钠进行蚀刻。在另一个示例中，在某些实施例中，构成内表面的官能团是物理-机械蚀刻的产物。在某些此类实施例中，物理-机械蚀刻包括喷砂或用二氧化硅进行空气喷磨。在另一个示例中，构成内表面的官能团是等离子体蚀刻的产物。在某些此类实施例中，等离子体蚀刻包括用反应性等离子体(诸如氢气、氧气、乙炔、甲烷)及其与氮气、氩气和氦气的混合物进行蚀刻。
26.在如本文另外描述的某些实施例中，在容器的内表面处的官能团是在反应性物质的存在下活化含氟聚合物的产物。例如，在某些此类实施例中，活化是等离子体活化。在某些实施例中，等离子体活化包括通过用气体(诸如例如氩气、氢气、氮气、二氧化碳、氧气和它们的混合物)进行处理而在含氟聚合物上形成反应性物质。在某些实施例中，等离子体活化在含氟聚合物上生成自由基和/或过氧化物。在某些实施例中，等离子体活化可以在0.1
托至0.6托的范围内或在700托至760托的范围内的压力下执行。在另一个示例中，在某些此类实施例中，活化是电晕活化。在某些实施例中，电晕活化包括在气体(诸如例如氩气、氮气、氢气和它们的混合物)下活化含氟聚合物，以在含氟聚合物上形成活性位点(例如，易受反应性物质或随后的化学处理的影响)。在某些实施例中，活化(例如等离子体活化或电晕活化)包括反应性烃蒸气，诸如例如酮、醇、对氯苯乙烯、丙烯腈、丙二胺、无水氨、苯乙烯磺酸、四氯化碳、四乙烯五胺、环己胺、钛酸四异丙酯、癸胺、四氢呋喃、二乙基三胺、叔丁胺、乙二胺、甲苯-2,4-二异氰酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、三乙烯四胺、己烷、三乙胺、甲醇、乙酸乙烯酯、甲基异丙基胺、乙烯基丁基醚、甲基丙烯酸甲酯、2-乙烯基吡咯烷酮、甲基乙烯基酮、二甲苯或它们的混合物。在如本文另外描述的某些实施例中，包括选自例如丁烯、乙烯、戊二醛等的可聚合烃蒸气的活化(例如等离子体活化)提供涂覆至含氟聚合物上的聚合物(即包含如本文另外描述的官能团)。本领域普通技术人员将理解，在某些实施例中，包括可聚合烃蒸气的等离子体活化(即等离子体聚合)可提供相对无组织的、高度交联的聚合物涂层。
27.在如本文另外描述的某些实施例中，在容器的内表面处的官能团是化学处理活化的含氟聚合物的产物。例如，在某些此类实施例中，活化的含氟聚合物是含氟聚合物的等离子体活化或电晕活化的产物。在某些此类实施例中，化学处理是化学反应，诸如例如接枝聚合、偶联、点击化学、缩合或加成。在某些实施例中，化学处理是溶液中的接枝聚合，该接枝聚合包括经由自由基聚合(例如，由通过含氟聚合物的等离子体活化生成的自由基而引发)来聚合乙烯基单体。在某些此类实施例中，乙烯基单体选自例如丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸烷基酯、苯乙烯、二烯、α-烯烃、卤化烯烃、(甲基)丙烯腈、丙烯酰胺、n-乙烯基咔唑、n-乙烯基吡咯烷酮和马来酸酐。例如，在某些实施例中，在含氟聚合物上的丙烯酸单体的自由基聚合可以提供羧基基团的致密表面。在某些实施例中，此类聚合产物可以是相对有组织的(例如，与等离子体聚合的产物相比)。
28.在如本文另外描述的某些实施例中，在容器的内表面处的官能团是涂覆活化的含氟聚合物的产物。例如，在某些此类实施例中，活化的含氟聚合物是含氟聚合物的等离子体活化或电晕活化的产物。在某些此类实施例中，涂覆是湿法涂覆、粉末涂覆或化学气相沉积。在某些实施例中，涂覆是等离子体增强化学气相沉积或引发式化学气相沉积。
29.如上所述，容器的内表面包含对病毒载体具有结合亲和力的第一适配体序列，该序列附接至官能团的至少一部分中的每个官能团(即附接至含氟聚合物，如本文另外描述)。如本文所用，“适配体序列”包含可通过非共价相互作用(例如静电相互作用、疏水相互作用、形状互补作用)选择性地结合一个或多个靶位点(例如，在病毒衣壳、细胞表面等上)的核苷酸序列。在某些实施例中，适配体序列包含单独的寡核苷酸。在其他实施例中，适配体序列的两个或更多个重复包含多核苷酸。
30.如本文所用，“病毒载体”包括包含核苷酸序列并且能够将核苷酸序列引入靶细胞的病毒(例如慢病毒、逆转录病毒)。本领域普通技术人员将理解，此类病毒的表面可以包括适配体序列可以与其结合的一个或多个分子。在如本文另外描述的某些实施例中，第一适配体序列对至少0.1nm的病毒载体具有结合亲和力。例如，在某些此类实施例中，第一适配体序列对至少0.25nm、或至少0.5nm、0.75nm、或至少1nm、或至少2.5nm、或至少5nm，或至少10nm，或至少25nm，或至少50nm，或至少75nm或至少100nm的病毒载体具有结合亲和力。本领
域普通技术人员可以选择结合亲和力，该结合亲和力提供病毒载体与容器的内表面的期望结合程度。
31.在如本文另外描述的某些实施例中，容器的内表面进一步包含对选自vla-4和vla-5的细胞受体具有结合亲和力的第二适配体序列，该序列附接至官能团的一部分(即附接至含氟聚合物，如本文另外描述)。在如本文另外描述的某些实施例中，第二适配体序列对至少0.1nm的细胞受体具有结合亲和力。例如，在某些此类实施例中，第一适配体序列对至少0.25nm、或至少0.5nm、0.75nm、或至少1nm、或至少2.5nm、或至少5nm、或至少10nm、或至少25nm、或至少50nm、或至少75nm或至少100nm的细胞受体具有结合亲和力。
32.本领域普通技术人员将理解，此类适配体(即，用于病毒载体和靶标两者)可以根据众所周知的程序(诸如例如selex方法)来进行制备。本领域普通技术人员可以选择结合亲和力，该结合亲和力提供所需类型的细胞与容器的内表面的期望结合程度。
33.通过在容器的内表面处结合第一适配体序列和第二适配体序列两者，病毒载体和期望用病毒载体进行转导的细胞可以彼此靠近而共定位，从而简化转导。如下文更详细地描述，适配体序列可以在单独的适配体分子中单独地与表面结合，或者在其他实施例中可以在相同的适配体分子中一起提供。
34.在如本文另外描述的某些实施例中，第一适配体序列的长度为至少5个碱基对。例如，在某些此类实施例中，第一适配体序列的长度为至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个或至少30个碱基对。在如本文另外描述的某些实施例中，第二适配体序列的长度为至少5个碱基对。例如，在某些此类实施例中，第二适配体序列的长度为至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个或至少30个碱基对。
35.在如本文另外描述的某些实施例中，官能团的至少一部分中的每个官能团直接附接(即，通过共价结合)至包含第一适配体序列和/或第二适配体序列的寡核苷酸。例如，在某些此类实施例中，内表面包含多个寡核苷酸，每个寡核苷酸均包含第一适配体序列和/或第二适配体序列，每个寡核苷酸均通过共价键附接至含氟聚合物的官能团(例如，附接至胺基团)。在某些此类实施例中，每个寡核苷酸包含第一适配体序列但不包含第二适配体序列、包含第二适配体序列但不包含第一适配体序列；或包含第一适配体序列和第二适配体序列两者。例如，在某些此类实施例中，内表面包含第一多个寡核苷酸，每个寡核苷酸均包含第一适配体序列，每个寡核苷酸均通过共价键附接至含氟聚合物的官能团(例如，附接至胺基团)，并且进一步包含第二多个寡核苷酸，每个寡核苷酸均包含第二适配体序列，每个寡核苷酸均通过共价键附接至含氟聚合物的官能团(例如，附接至胺基团)。当不同的寡核苷酸用于第一适配体序列和第二适配体序列时，它们可以使用相同的化学或使用不同的化学与含氟聚合物结合。在其他此类实施例中，内表面包含多个寡核苷酸，每个寡核苷酸均包含第一适配体序列和第二适配体序列，每个寡核苷酸均通过共价键附接至含氟聚合物的官能团(例如，附接至胺基团)。
36.在其他实施例中，非共价结合可以用于将适配体序列附接至容器的内表面(例如，使用非共价缔合，例如(链球菌)抗生物素蛋白/生物素)。
37.在如本文另外描述的某些实施例中，在容器的内表面处的寡核苷酸(例如，包含第一适配体序列和/或第二适配体序列)的平均浓度为每平方微米表面至少50个寡核苷酸。例如，在某些实施例中，寡核苷酸的平均浓度为每平方微米容器内表面至少60个、至少70个、
至少80个、至少90个、至少100个、至少250个、至少500个、至少750个或至少1,000个寡核苷酸。本领域普通技术人员将选择提供所需程度的病毒载体和细胞结合以允许所需程度的转导的寡核苷酸浓度。
38.在如本文另外描述的某些实施例中，官能团的至少一部分中的每个官能团均直接附接至包含第一适配体序列的两个或更多个重复的多核苷酸。例如，在某些此类实施例中，内表面包含多个多核苷酸，每个多核苷酸均包含第一适配体序列的两个或更多个重复，每个多核苷酸均通过共价键附接至含氟聚合物的官能团(例如，附接至胺基团)。在某些此类实施例中，每个多核苷酸均包含至少10个、或至少25个、或至少50个、或至少75个、或至少100个、或至少200个、或至少300个、或至少400个、或至少500个、或至少750个或至少1000个第一适配体序列的重复。
39.类似地，在如本文另外描述的某些实施例中，官能团的一部分中的每个官能团均直接附接至包含第二适配体序列的两个或更多个重复的多核苷酸。例如，在某些此类实施例中，内表面包含第一多个多核苷酸，每个多核苷酸均包含第一适配体序列的两个或更多个重复，每个多核苷酸均通过共价键附接至含氟聚合物的官能团(例如，附接至胺基团)，并且进一步包含第二多个多核苷酸，每个多核苷酸均包含第二适配体序列的两个或更多个重复，每个多核苷酸均通过共价键附接至含氟聚合物的官能团(例如，附接至胺基团)。在某些此类实施例中，每个多核苷酸包含至少10个、或至少25个、或至少50个、或至少75个、或至少100个、或至少200个、或至少300个、或至少400个、或至少500个、或至少750个或至少1000个第一适配体序列或第二适配体序列的重复。
40.可以经由对应于所需适配体序列的模板的滚环扩增(rca)来制备包含给定适配体序列的多个重复的多核苷酸，该过程从共价附接至含氟聚合物(例如，通过胺基团)的核苷酸引物开始。
41.在如本文另外描述的某些实施例中，官能团的至少一部分中的每个官能团均直接附接至多核苷酸，该多核苷酸包含第一适配体序列和第二适配体序列中的每一者的至少一个重复。例如，在某些此类实施例中，多核苷酸是与串联的第一适配体序列和第二适配体序列相对应的模板的滚环扩增(rca)的产物，该过程从共价附接至含氟聚合物(例如，通过胺基团)的核苷酸引物开始。在某些此类实施例中，每个多核苷酸包含至少10个、或至少25个、或至少50个、或至少75个、或至少100个、或至少200个、或至少300个、或至少400个、或至少500个、或至少750个或至少1000个第一适配体序列和第二适配体序列的总重复。在某些实施例中，多核苷酸包含第一适配体序列和第二适配体序列的交替系列的重复。当然，在其他实施例中，多核苷酸包含串联的第一适配体序列的两个或更多个重复的一个或多个嵌段，以及串联的第二适配体序列的两个或更多个重复的一个或多个嵌段。
42.在某些此类实施例中，构成容器的内表面的多核苷酸(例如，包含第一适配体序列和/或第二适配体序列的重复)的平均浓度为每平方微米表面至少50个多核苷酸。例如，在某些实施例中，多核苷酸的平均浓度为每平方微米容器内表面至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少250个、至少500个、至少750个或至少1,000个多核苷酸。
43.在如本文另外描述的某些实施例中，官能团的至少一部分中的每个官能团均通过接头附接至包含第一适配体序列的至少一个寡核苷酸。在某些此类实施例中，接头包含多肽或多核苷酸。例如，在某些实施例中，内表面包含通过共价键附接至含氟聚合物的官能团
(例如，附接至胺基团)的多个接头(例如，多肽或多核苷酸)，每个接头均附接至包含第一适配体序列的至少一个寡核苷酸。在如本文另外描述的某些实施例中，官能团的一部分中的每个官能团均通过接头附接至包含第二适配体序列的至少一个寡核苷酸。例如，在某些此类实施例中，内表面包含通过共价键附接至含氟聚合物(例如，附接至胺基团)的第一多个接头(例如，多肽或多核苷酸)，每个接头均附接至包含第一适配体序列的至少一个寡核苷酸，并且进一步包含通过共价键附接至含氟聚合物的官能团(例如附接至胺基团)的第二多个接头(例如，多肽或多核苷酸)，每个接头均附接至包含第二适配体序列的至少一个寡核苷酸。在另一个示例中，在某些此类实施例中，内表面包含通过共价键附接至含氟聚合物的官能团(例如，附接至胺基团)的多个接头(例如，多肽或多核苷酸)，每个接头均附接至包含第一适配体序列的至少一个寡核苷酸和包含第二适配体序列的至少一个寡核苷酸。也可以以非共价相互作用(例如，通过(链球菌)抗生物素蛋白/生物素相互作用)来使用接头。
44.在某些此类实施例中，至少2个寡核苷酸(例如，包含第一适配体序列和/或第二适配体序列)附接至接头的至少一部分中的每个接头。例如，在某些实施例中，至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个或至少50个寡核苷酸附接至接头的至少一部分中的每个接头。
45.在某些此类实施例中，构成容器的内表面的接头(例如，包含附接至其上的第一适配体序列和/或第二适配体序列)的平均浓度为每平方微米表面至少50个接头。例如，在某些实施例中，接头的平均浓度为每平方微米容器内表面至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少250个、至少500个、至少750个或至少1,000个接头。
46.如本文所述，多种含氟聚合物可以在容器的内表面处使用。在如本文另外描述的某些实施例中，容器的内表面包含选自以下项的含氟聚合物：聚四氟乙烯(ptfe)、全氟烷氧基(pfa)、乙烯四氟乙烯(etfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、乙烯氟化乙烯丙烯(efep)、全氟聚醚(pfpe)、改性聚四氟乙烯(tfm)、聚氟乙烯(pvf)或其任何混合物。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，容器的内表面包含氟化乙烯丙烯。在如本文另外描述的某些实施例中，容器的内表面基本上由含氟聚合物(例如，氟化乙烯丙烯)以及附接至其上的官能团和适配体序列组成。在如本文另外描述的某些实施例中，在容器的内表面处的含氟聚合物材料具有至少0.0003英寸、至少0.0004英寸、至少0.0005英寸、至少0.0006英寸、至少0.001英寸或至少0.10英寸的厚度。例如，在某些此类实施例中，构成容器的内表面的材料具有0.0003英寸至0.2英寸、或0.0003英寸至0.1英寸、或0.0005英寸至0.08英寸、或0.001英寸至0.07英寸、或0.001英寸至0.05英寸、或0.001英寸至0.03英寸、或0.001英寸至0.018英寸、或0.001英寸至0.016英寸、或0.001英寸至0.014英寸、或0.001英寸至0.012英寸的范围内的厚度。
47.在如本文中另外描述的某些实施例中，构成容器壁的材料是多层材料，在其内表面具有一层含氟聚合物，并且在其外表面具有一层另一聚合物材料(含氟聚合物的或其他)。在如本文另外描述的某些实施例中，容器的外表面处的材料具有至少0.0005英寸、或至少0.001英寸、或至少0.005英寸、或至少0.0075英寸、或至少0.01英寸、或至少0.02英寸、或至少0.03英寸、或至少0.04英寸、或至少0.05英寸、或至少0.06英寸、或至少0.07英寸、或至少0.08英寸、或至少0.09英寸、或至少0.1英寸、或至少0.11英寸的厚度。例如，在某些此类实施例中，容器的外表面处的材料具有0.0005英寸至0.2英寸、或0.005英寸至0.18英寸、
或0.01英寸至0.16英寸、或0.01英寸至0.14英寸、或0.01英寸至0.12英寸、或0.06英寸至0.13英寸、或0.09英寸至0.126英寸范围内的厚度。
48.在如本文另外描述的某些实施例中，容器的外表面包括除含氟聚合物之外的材料。例如，在某些此类实施例中，在容器的外表面处的材料包括热塑性聚合物、热塑性弹性体、硅、橡胶或它们的任意组合。可替代地，在如本文另外描述的某些实施例中，容器的外表面可包含含氟聚合物，诸如例如内表面的含氟聚合物，或不同的含氟聚合物。在某些此类实施例中，在内表面和外表面(即容器壁)处的材料基本上由含氟聚合物(例如氟化乙烯丙烯)组成，其中官能团和适配体序列在内表面处进行附接。
49.在如本文另外描述的某些实施例中，容器进一步包括水性介质。水性介质可以是例如细胞培养基，该水性介质包含病毒载体(例如，如本文另外描述的)和任选的靶细胞。如本文所用，“靶细胞”包括易受由病毒载体进行的转导的影响的细胞。在某些实施例中，靶细胞包含vla-4和vla-5表面受体中的一者或多者。因此，在如本文另外描述的某些实施例中，容器包括病毒载体(例如，包含慢病毒或逆转录病毒)。在如本文另外描述的某些实施例中，容器包括靶细胞(例如，包含vla-4和vla-5表面受体中的一者或多者)。
50.有利地，本发明人已经确定本文所述的容器可以促进转导过程中涉及的病毒载体和靶细胞的共定位、理想地提高其效率，而无需用户在进行转导前不久执行手动涂覆过程。因此，本公开的另一方面是转导方法，该转导方法包括将病毒载体和靶细胞包括在如本文另外描述的容器中。在某些此类实施例中，容器包含水性介质(例如，细胞培养基)。在某些此类实施例中，病毒载体包含慢病毒或逆转录病毒。在某些此类实施例中，靶细胞包含vla-4和vla-5表面受体中的一者或多者。
51.在如本文另外描述的某些实施例中，转导方法包括将病毒载体在第一水性介质中的悬浮液(例如，病毒载体上清液)包括在容器中；以及然后将包含病毒载体的容器孵育第一时间段。第一时间段可以是足以允许病毒载体的至少一部分与容器的内表面的第一适配体序列缔合的任何长度。例如，在某些实施例中，将包含病毒载体的容器例如在32℃至37℃的范围内的温度下温育至少1小时、或至少2小时、或至少3小时、或至少4小时或至少5小时。在孵育第一时间段后，该方法包括将靶细胞(例如，作为在第二水性介质中的悬浮液)添加至容器；以及然后将包含靶细胞和病毒载体的容器孵育第二时间段。第二时间段可以是足以允许靶细胞的至少一部分转导的任何长度。例如，在某些实施例中，将包含病毒载体和靶细胞的容器例如在35℃至39℃的范围内的温度下孵育至少6小时、或至少12小时、或至少18小时、或至少1天、或至少1.5天、或至少2天或至少2.5天。在孵育第二时间段后，该方法包括从容器中收集经转导的细胞。
52.在某些此类实施例中，该方法进一步包括，在将容器孵育第一时间段之后，去除第一水性介质的至少一部分；然后将洗涤介质添加至容器；以及然后从容器中去除洗涤介质的至少一部分(即，在将靶细胞添加至容器之前)。
53.在其他实施例中，转导方法包括将病毒载体和靶细胞在第一水性介质中的悬浮液(例如，病毒载体上清液和靶细胞的混合物)包括至容器，以及然后将包含靶细胞和病毒载体的容器孵育第一时间段。第一时间段可以是足以允许靶细胞的至少一部分转导的任何长度。例如，在某些实施例中，将包含病毒载体和靶细胞的容器例如在35℃至39℃的范围内的温度下孵育至少6小时、或至少12小时、或至少18小时、或至少1天、或至少1.5天、或至少2天
或至少2.5天。在孵育第一时间段后，该方法包括从容器中收集经转导的细胞。
54.在如本文另外描述的某些实施例中，收集经转导的细胞包括从容器中去除经转导的细胞的悬浮液。在某些实施例中，收集经转导的细胞包括将细胞解离介质添加至容器(例如，在从容器中去除转导介质的至少一部分后)，以及然后从容器中去除细胞解离介质中的经转导的细胞的悬浮液.细胞解离可以包括能够从容器的内表面中释放靶细胞的一种或多种解离剂。例如，在某些此类实施例中，细胞解离介质包含盐和螯合剂中的一者或多者(例如，该盐和螯合剂可以破坏第二适配体序列与靶细胞的结合)。在另一个示例中，在某些此类实施例中，细胞解离介质包含一种或多种限制酶(例如，该一种或多种限制酶可以降解包含第二适配体序列的寡核苷酸或多核苷酸)。在另一个示例中，在某些此类实施例中，细胞解离介质包含寡核苷酸或多核苷酸，该寡核苷酸或多核苷酸包含与第二适配体序列互补的核苷酸序列(例如，该核苷酸序列可以从第二适配体序列置换结合的靶细胞)。
55.下文枚举的实施例的列表提供了本公开的各个方面和实施例，这些实施例可以任意数量并且以逻辑上或科学上不矛盾的任意方式组合。
56.实施例1.一种容器(例如，袋)，其具有外表面和内表面，内表面包含
57.含氟聚合物；
58.多个官能团，该多个官能团附接至含氟聚合物；以及
59.对病毒载体具有结合亲和力的第一适配体序列，该第一适配体序列附接至官能团的至少一部分中的每个官能团。
60.实施例2.根据实施例1所述的容器，其中内表面进一步包含对选自vla-4和vla-5的细胞受体具有结合亲和力的第二适配体序列，该第二适配体序列附接至官能团的一部分。
61.实施例3.根据实施例1或2所述的容器，其中官能团的至少一部分中的每个官能团直接附接至包含第一适配体序列和/或第二适配体序列的寡核苷酸。
62.实施例4.根据实施例1或2所述的容器，其中官能团的至少一部分中的每个官能团直接附接至包含第一适配体序列或第二适配体序列的两个或更多个重复的多核苷酸。
63.实施例5.根据实施例4所述的容器，其中多核苷酸包含第一适配体序列和第二适配体序列中的每一者的至少一个重复。
64.实施例6.根据实施例4或5所述的容器，其中多核苷酸包含第一适配体序列或第二适配体序列的至少10个、至少100个或至少500个重复。
65.实施例7.根据实施例1或2所述的容器，其中官能团的至少一部分中的每个官能团通过接头附接至包含第一适配体序列和/或第二适配体序列的至少一个寡核苷酸。
66.实施例8.根据实施例7所述的容器，其中官能团的至少一部分中的每个官能团通过接头附接至包含第一适配体序列的至少一个寡核苷酸和包含第二适配体序列的至少一个寡核苷酸。
67.实施例9.根据实施例7或8所述的容器，其中至少2个、至少5个、至少10个或至少50个寡核苷酸附接至接头的至少一部分中的每个接头。
68.实施例10.根据实施例7或8所述的容器，其中接头包含多肽或多核苷酸。
69.实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的容器，其中官能团为蚀刻含氟聚合物的产物。
70.实施例12.根据实施例11所述的容器，其中蚀刻为化学蚀刻、物理-机械蚀刻或等离子体蚀刻。
71.实施例13.根据实施例1至10中任一项所述的容器，其中官能团为在反应性物质的存在下活化含氟聚合物的产物。
72.实施例14.根据实施例13所述的容器，其中
73.活化为等离子体活化或电晕活化；
74.并且反应性物质包含一种或多种反应性烃蒸气。
75.实施例15.根据实施例13所述的容器，其中
76.活化为等离子体活化；并且
77.反应性物质包含一种或多种可聚合烃蒸气(例如，选自丁烯、乙烯和戊二醛)。
78.实施例16.根据实施例1至10中任一项所述的容器，其中官能团为化学处理活化的含氟聚合物的产物。
79.实施例17.根据实施例16所述的容器，其中
80.活化的含氟聚合物为等离子体活化或电晕活化的产物；并且
81.化学处理为接枝聚合、偶联、点击化学、缩合或加成。
82.实施例18.根据实施例1至10中任一项所述的容器，其中官能团为涂覆活化的含氟聚合物的产物。
83.实施例19.根据实施例18所述的容器，其中
84.活化的含氟聚合物为等离子体活化或电晕活化的产物；并且
85.涂覆是湿法涂覆、粉末涂覆或化学气相沉积。
86.实施例20.根据实施例1至19中任一项所述的容器，其中官能团包括羧基基团、羟基基团、醛基团、羰基基团、胺基团、亚胺基团、酰胺基团、酯基团、酸酐基团、硫醇基团、二硫化物基团、酚基团、胍基团、硫醚基团、吲哚基团、咪唑基团、氨基乙基酰胺基团、炔烃基团、烯烃基团、氮杂环丙烷基团、环氧基团、异腈化物基团、异氰化物基团、四嗪基团、重氮表面基团、炔烃基团、烯烃基团、氮杂环丙烷基团、环氧基团、异腈化物基团、异氰化物基团、四嗪基团、烷基基团、氨基乙基酰胺基团或酯基团中的一者或多者。
87.实施例21.根据实施例1至19中任一项所述的容器，其中官能团包括羧基基团、羟基基团、醛基团、胺基团、亚胺基团、酰胺基团和酯基团中的一者或多者。
88.实施例22.根据实施例1至19中任一项所述的容器，其中官能团包括胺基团。
89.实施例23.根据实施例1至22中任一项所述的容器，其中官能团的附接(例如，与低聚物、多核苷酸或接头)为共价的。
90.实施例24.根据实施例1至23中任一项所述的容器，其中含氟聚合物为聚四氟乙烯(ptfe)、全氟烷氧基(pfa)、乙烯四氟乙烯(etfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、乙烯氟化乙烯丙烯(efep)、全氟聚醚(pfpe)、改性聚四氟乙烯(tfm)、聚氟乙烯(pvf)或它们的任何混合物。
91.实施例25.根据实施例1至23中任一项所述的容器，其中含氟聚合物为氟化乙烯丙烯。
92.实施例26.根据实施例1至25中任一项所述的容器，其中含氟聚合物具有小于0.1mg/cm2的水中toc。
93.实施例27.根据实施例1至26中任一项所述的容器，其中病毒载体包含慢病毒或逆转录病毒。
94.实施例28.根据实施例1至27中任一项所述的容器，该容器含有水性介质。
95.实施例29.根据实施例28所述的容器，该容器包含病毒载体(例如，包含慢病毒或逆转录病毒)。
96.实施例30.根据实施例28或29所述的容器，该容器包括靶细胞(例如，包含vla-4和vla-5表面受体中的一者或多者)。
97.实施例31.一种转导方法，该转导方法包括将病毒载体和靶细胞包括至根据实施例1至29中任一项所述的容器中。
98.实施例32.根据实施例31所述的转导方法，其中病毒载体包含慢病毒或逆转录病毒。
99.实施例33.根据实施例31或32所述的转导方法，其中靶细胞包含vla-4和vla-5表面受体中的一者或多者。
100.实施例34.根据实施例31至33中任一项所述的转导方法，该转导方法包括
101.将病毒载体在第一水性介质中的悬浮液包括至容器；
102.将包含病毒载体的容器孵育第一时间段；
103.将靶细胞(例如，作为在第二水性介质中的悬浮液)添加至容器；
104.将包含靶细胞和病毒载体的容器孵育第二时间段；以及然后
105.从容器中收集经转导的细胞。
106.实施例35.根据实施例34所述的转导方法，该转导方法进一步包括，在将容器孵育第一时间段后
107.去除第一水性介质的至少一部分；然后
108.将洗涤介质添加至容器；然后
109.从容器中去除洗涤介质的至少一部分；以及然后
110.将靶细胞添加至容器。
111.实施例36.根据实施例31至33中任一项所述的转导方法，该转导方法包括
112.将病毒载体和靶细胞在第一水性介质中的悬浮液包括至容器；
113.将包含靶细胞和病毒载体的容器孵育第一时间段；以及然后
114.从容器中收集经转导的细胞。
115.实施例37.根据实施例31至36中任一项所述的转导方法，其中从容器中收集经转导的细胞包括
116.将细胞解离介质添加至容器；以及然后
117.从容器中去除经转导的细胞的悬浮液。
118.实施例38.根据实施例37所述的转导方法，其中细胞解离介质包含盐和螯合剂中的一者或多者。
119.实施例39.根据实施例37所述的转导方法，其中细胞解离介质包含一种或多种限制酶。
120.实施例40.根据实施例37所述的转导方法，其中细胞解离介质包含寡核苷酸或多核苷酸，该寡核苷酸或多核苷酸包含与第二适配体序列互补的核苷酸序列。
121.实施例41.根据实施例1至39中任一项所述的容器或方法，其中容器是以袋的形式。
122.本文所述的细节仅以举例方式示出，并且仅用于例示性地讨论本发明的优选实施例，其目的在于提供据信为本发明的各种实施例的原理和概念方面的最有用并且最容易理解的描述。就这一点而言，并未试图以超出对本发明的基本理解所必需的程度示出本发明的结构细节，其中结合附图和/或实例进行的描述使得如何在实践中实施本发明的多种形式对于本领域的技术人员而言显而易见。因此，在描述本发明所公开的工艺和设备之前，应当理解，本文所述的方面不限于特定的实施例、装置或构造，并因此当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定方面的目的，并且除非本文中特别定义，否则并非旨在进行限制。
123.除非本文另外指明或与上下文明显相冲突，否则描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)的术语“一”和“一个”和“所述”及类似的指代物应被理解为涵盖单数和复数两者。本文中数值范围的表述仅仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的缩略方法。除非本文另外指明，否则将每个单独的值结合到本说明书中，如同在本文中单独列举的那样。还应当理解，每个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。
124.除非本文另外指明或以其他方式与上下文明显相冲突，否则本文所述的所有方法均可按任何合适的步骤顺序执行。本文所提供的任何及所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)仅仅旨在是为了更好地示出本发明，并且除非另外要求，否则对本发明的范围不构成限制。本说明书中的语言不应理解为指示任何非要求保护的元素是实践本发明所必不可少的。
125.除非上下文明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，字词“包括”和“包含”等应被理解为具有包含性的含义，而不应被理解为具有排他性或穷举性的含义；也就是说，在“包括但不限于”的意义上使用。使用单数或复数的字词也分别包括复数和单数。此外，在本专利申请中使用的字词“本文”、“上文”、“下文”以及类似意义的字词应当是指整个专利申请，而不是指本专利申请的任何特定部分。
126.如本领域的普通技术人员将理解的，本文所公开的每个实施例可包括其中具体所述的要素、步骤、成分或部件，基本上由所述要素、步骤、成分或部件组成，或由所述要素、步骤、成分或部件组成。如本文所用，过渡术语“包括”或“包含”意指包括但不限于并且允许甚至大量包括未指定的要素、步骤、成分或部件。过渡短语“由
……
组成”不包括未指定的任何要素、步骤、成分或部件。过渡短语“基本上由
……
组成”将实施例的范围限制为指定的要素、步骤、成分或部件以及对实施例无实质性影响的那些要素、步骤、成分或部件。
127.除非指明是相反情况，否则说明书和所附权利要求中提出的数值参数是可能根据通过本发明寻求获得的所需特性而改变的近似值。至少，而且并非试图将等同原则的适用范围限制在权利要求书的范围内，每个数值参数至少应该根据所报告有效数字的数量，通过应用普通舍入技术来解释。
128.虽然在本发明的广泛范围内所示的数字范围和参数为近似值，但具体实施例中所示的数值会尽可能准确地报告。但是，任何数值固有地含有某些必然产生自它们各自测量值范围内的标准偏差的误差。
129.本文所公开的发明的替代要素或实施例的分组不应理解为限制性的。每个组成员可以单独引用和受权利要求书保护或与组中的其他成员或其中发现的其他要素以任何组合方式引用和受权利要求书保护。预期组的一个或更多个组员可以由于方便和/或专利性的原因包含在组中或从组中删除。当任何此类添加或删除发生时，说明书被视为包含修改的组，从而实现对所附权利要求书中使用的所有markush形式的组的书面说明。
130.本文描述了本发明的一些实施例，包括本发明人已知的实施本发明的最佳模式。当然，这些所述的实施例的变型形式对于本领域的普通技术人员将变得显而易见。本发明人期望技术人员在适当的情况下使用此类变型形式，并且本发明人打算以不同于本文具体描述的方式实践本发明。因此，本发明包括适用法律允许的随附权利要求书中所述主题的所有修改和等同形式。此外，除非另外指明或以其他方式与上下文明显相冲突，否则本发明涵盖上述元素在其所有可能变型形式中的任意组合。
131.在整个说明书中，对专利和印刷出版物进行了大量引用。每篇引用的参考文献和印刷出版物全文分别以引用方式并入本文中。
132.此外，应当理解，本文所公开的发明的实施例是对本发明原理的例示性说明。可以采用的其他修改处于本发明的范围内。因此，以举例方式但并非限制性地，可根据本文的教导来利用本发明的替代构造。因此，本发明不限于所显示和描述的内容。