空间条形码化的制作方法

1.本发明涉及对给定位置进行空间条形码化的方法，并且进一步涉及为了分析组织中存在的分子特征的目的而对样品(例如生物组织样本)中存在的检测探针进行空间条形码化。此类分析可以包括例如以下一项或多项：i)一种或多种生物分子的特定空间表达；ii)转录组的空间分析和/或iii)蛋白质组的空间分析，包括翻译后蛋白质修饰。本发明进一步涉及用于执行此类方法的各种组件产品，包括试剂盒、仪器和软件。


背景技术：

2.生物分子表达的原位分析是近年来发展迅速的技术领域。特别是，原位转录组学和多重组织化学分析技术(其允许确定正在表达什么基因和/或可能存在什么生物标志物，以及在给定组织样品的任何给定位置达到什么水平)的发展已经越来越受欢迎，并启用了全新的生物学研究范围。
3.从历史上看，允许以高通量同时测量许多生物分子的方法提供了给定样品中平均表达水平的数据，但没有任何关于分子在哪儿表达的背景。最近，已开发出单细胞分析技术，其中对来自分解组织的细胞进行单独分析。虽然这些方法提供了有关样品中发生的生物过程的更详细信息，并允许识别对它们有贡献的稀有细胞群体，但缺乏真正的空间信息是研究的一个重大障碍。由于所有的生物学都发生在空间中，因此给定的生物分子在一个过程中的功能只能通过考虑分子本身作用的空间背景来完全理解。
4.该领域已经开始通过提供各种原位转录组学和蛋白质组学方法(包括基因或蛋白质表达的空间检测手段)来解决对空间信息的需求。还有一系列用于代谢物和其他生物分子的空间分析的方法。这些方法可以大致分为两组；基于图像的方法和无图像的方法。
5.在基于图像的基因表达测量方法中，包含在生物组织中的rna首先与互补序列的dna探针接触。在一些技术中，探针直接用于通过荧光来检测和鉴定每个rna分子，其使用多种检测方案，在一些情况下包括通过分支dna的信号放大、杂交链式反应或滚环扩增。在其他技术中，探针用作rna逆转录的引物，为每个rna转录物产生互补的dna分子，所述dna分子可以通过原位测序进行扩增和检测。此类方法包括merfish、seqfish、starmap、fisseq、iss和baristaseq。在所有这些方法中，多种类型的rna分子(对应于不同的基因)的识别是通过重复循环的荧光成像实现的，其中单个分子被检测为荧光点。这些方法在实现单分子成像的能力方面受到限制，因为图像信号可能具有低强度、难以区分并且受到自发荧光或背景噪声的影响。此外，这些方法不允许识别非常丰富的rna分子，因为这些产生在空间上重叠并且无法解码(拥挤)的信号。对于这些技术中的许多而言，重复成像循环的需求也是一个重要问题，因为每个循环的图像需要精确对齐到几纳米的精度，这在技术上具有挑战性。最后，这些方法非常耗时，因为它们需要非常高的放大倍率才能实现单分子分辨率，并且每次只能对非常小的组织区域进行成像。完整实验所需的时间与所分析的组织区域和检测到的特征(基因)数量成比例，这限制了可以恢复的信息量。
6.无图像基因表达测量方法避免了对组织样品进行成像的限制，并依靠测序技术来
确定给定rna分子的位置。这需要将空间dna条形码与要检测的分子融合，通过使用空间条形码作为逆转录的引物来实现，从而产生空间条形码化的cdna。这些方法要快得多，因为整体上相对较慢的成像时间被移除并且数据分析更加简单。此类方法包括：10x visium、slideseq和hdst。然而，这些方法的效率较低，并且由于逆转录步骤的限制，通常受限于捕获不超过10％的细胞rna含量。此外，它们都需要某种固体支持物，在添加样品之前在其上排列空间dna条形码。这种支持物生产成本高、易碎，并且通常导致空间分辨率低，这不允许从单细胞中捕获信息。此外，空间条形码化不遵循组织的结构，而是空间地址以规则的方形网格或随机排列。这导致部分组织未被分析，并且一些空间条形码与多个细胞重叠，产生不精确的信息。
7.原位蛋白质组学方法使用与探针缀合的抗体，所述探针可以是荧光分子、化学聚合物结合的重金属同位素或dna分子。组织与抗体库接触，从而使多个生物标志物(通常是蛋白质或蛋白质修饰)被抗体结合并与探针连接。这些方法包括codex、成像质谱流式(imaging mass cytometry)、mibi、4i和miltenyi macsima。然后通过质谱法或通过荧光成像(在后一种情况下，通过随后的如上所述用于基因表达测量的成像循环)检测探针。这些方法存在许多与上述基于成像的基因表达测量相同的问题。此外，原位蛋白质组学测量主要作为一类单独的技术存在，并且尚未以高通量方式成功地与基因表达测量相结合，从而允许在同一样品中同时测量数百个基因和蛋白质。相关的无抗体方法可以通过直接质谱成像来测量各种小分子和潜在的肽和蛋白质。
8.本发明旨在通过提供一种新的无图像原位空间条形码化方法来解决上述问题中的一个或多个，该方法通常可用于对分子信息进行空间条形码化，特别是用于组织样品的转录组或蛋白质组的空间分析，或者用于实际上可以被目的组织中的亲和试剂识别的任何分子或特征。
9.本发明的方法是基于一种利用光作为工具，引导空间条形码在分子上组装，从而通过高通量测序来识别每个分子的原始空间位置，从而将空间条形码编码到核酸分子的技术。
10.有利地，本发明的方法使用简单的常用仪器，例如光学显微镜和标准组织载玻片，以提供一种在空间上标记组织区域(小到单细胞或亚细胞区室)内的生物分子的方法，具有等于或低于紫外光的衍射极限的分辨率，效率高，并且没有许多与单分子成像相关的问题。该方法能够使用高通量测序单独或同时在同一样品中对基因、蛋白质和其他生物标志物进行定量和空间定位。该方法具有单分子灵敏度、高通量，并产生可以使用该领域可用技术轻松分析的数据，并且进一步结合了允许控制一些重要错误来源(例如脱靶探针结合和背景噪声)的特征。因此，本发明的方法比现有方法更便宜、更快和更强大(由于更高的灵敏度、同时分析基因表达和蛋白质/标志物表达的可能性以及易于分析)，同时仍然提取关于组织的分子构成的详细空间信息。


技术实现要素：

11.根据本发明的第一方面，提供了一种对基底的一个或多个位置进行空间条形码化的方法，其包括：
12.(a)将一个或多个根核酸分子(root nucleic acid molecule)与将在其上构建空
间条形码的所述或每个位置结合，其中所述或每个根分子可以包含光可裂解基团；
13.(b)任选地，如果所述或每个根分子不包含光可裂解基团，则向所述或每个根分子添加光可裂解基团；
14.(c)照射基底上待空间条形码化的目的位置，其中照射裂解或改变所述位置内存在的所述或每个根分子的光可裂解基团；
15.(d)将索引序列添加到步骤(b)中照射的位置内的所述或每个根分子，其中所述索引序列包含光可裂解基团；
16.(e)重复步骤(c)和(d)，直到添加所需的索引序列以形成连接到所述位置内的所述或每个根分子的空间条形码。
17.适当地，所述基底可以是任何表面。适当地，所述基底可以是惰性基底，例如玻璃、塑料等。适当地，所述基底可以是活性的，适当地，所述基底可以是样本或组织样品。
18.根据本发明的第二方面，提供了一种对一种或多种检测探针进行空间条形码化的方法，其包括：
19.(a)为组织提供与一种或多种目的生物分子结合的一种或多种检测探针，其中所述或每种检测探针可以包含光可裂解基团；
20.(b)任选地，如果所述或每种检测探针不包含光可裂解基团，则向所述或每种检测探针添加光可裂解基团；
21.(c)照射组织内待空间条形码化的目的区域，其中照射裂解或改变所述区域内的所述或每种检测探针的光可裂解基团；
22.(d)将空间条形码的索引序列添加到步骤(b)中照射的区域内的所述或每种检测探针，其中所述索引序列包含光可裂解基团；
23.(e)重复步骤(c)和(d)直到添加所需的索引序列以形成连接到目的区域内的所述或每种检测探针的空间条形码。
24.在一个实施方案中，所述生物分子选自：核酸、蛋白质、翻译后蛋白质修饰、代谢物、生物活性小分子、核苷酸或药物。
25.在一个实施方案中，所述一种或多种检测探针与一种以上不同类型的生物分子结合。
26.在一个实施方案中，所述或每种检测探针包含结合区以与生物分子结合。在一个实施方案中，所述结合区可以是适体、核酸、核酸模拟物、蛋白质或其混合物。
27.在一个实施方案中，第二方面的方法可以包括在步骤(a)之前使组织与一种或多种检测探针接触以允许所述检测探针或每种检测探针与一种或多种目的生物分子结合的步骤。
28.根据本发明的第三方面，提供了一种分析组织中的一种或多种转录物的方法，其包括：
29.(a)使组织与一种或多种检测探针接触以允许所述或每种检测探针与目的转录物结合，其中所述或每种检测探针包含光可裂解基团；
30.(b)任选地，如果所述或每种检测探针不包含光可裂解基团，则向所述或每种检测探针添加光可裂解基团；
31.(c)照射组织内待空间条形码化的目的区域，其中照射裂解或改变所述区域内的
所述或每种检测探针的光可裂解基团；
32.(d)将空间条形码的索引序列添加到步骤(b)中照射的区域内的所述或每种检测探针，其中所述索引序列包含光可裂解基团；
33.(e)重复步骤(c)和(d)，直到添加所需的索引序列以形成连接到目的区域内的所述或每种检测探针的空间条形码；
34.(f)对步骤(d)的一种或多种空间条形码化的检测探针或其衍生物进行测序。
35.适当地，在所述方法中分析任何数量的目的转录物，适当地，在所述方法中分析一种或多种目的转录物。在一些情况下，可以分析组织中的整个转录组。在一个实施方案中，所述转录物是rna，适当地是mrna。
36.在一个实施方案中，第三方面的方法是一种分析组织的转录组的方法。因此，适当地，在步骤(a)中，所述或每种检测探针与目的转录物的polya区结合。适当地，所述或每种检测探针的结合区与所述或每种目的转录物的poly-a区结合。适当地，检测探针与组织中每种转录物的polya区结合。因此，适当地，组织中的每种转录物都被空间条形码化并随后被测序。
37.在这样的实施方案中，第三方面的方法可以进一步包括延长所述或每种检测探针的步骤。适当地在3’端延长所述或每种检测探针。适当地通过逆转录。适当地使用任何已知的逆转录酶。适当地，延长步骤产生一种或多种延长的检测探针，其中除了下文描述的元件之外，所述或每种修饰的检测探针包含与目的转录物互补的核酸序列，适当地在3’端。这样的序列可以称为“延长区域”。
38.适当地，该步骤发生在所述方法的测序步骤之前的任何步骤之间。适当地，它发生在上述步骤(a)和(b)之间。替代地，该步骤可以在上述步骤(e)和(f)之间进行。
39.此外，适当地，延长步骤可以进一步包括将测序元件添加到所述或每种检测探针的3’端。适当地添加3’引物或3’测序接头。适当地，通过逆转录的模板转换进行测序元件的添加。适当地，测序元件的添加也可以通过连接进行，任选地在延长的检测探针的片段化之后，或通过pcr。适当地，当所述元件是引物或接头时进行连接。适当地，当所述元件是引物(适当地是包含5’测序元件的随机六聚体引物)时进行pcr。
40.在一个实施方案中，所述或每种检测探针包含结合区，其中所述结合区是核酸或核酸模拟物。
41.根据本发明的第四方面，提供了一种分析组织中的一种或多种标志物的方法，其包括：
42.(a)使组织与一种或多种检测探针接触，以允许所述或每种检测探针与目的标志物结合，其中所述或每种检测探针包含光可裂解基团；
43.(b)任选地，如果所述或每种检测探针不包含光可裂解基团，则向所述或每种检测探针添加光可裂解基团；
44.(c)照射组织内待空间条形码化的目的区域，其中照射裂解或改变所述区域内的所述或每种检测探针的光可裂解基团；
45.(d)将空间条形码的索引序列添加到步骤(b)中照射的区域内的所述或每种检测探针，其中所述索引序列包含光可裂解基团；
46.(e)重复步骤(c)和(d)，直到添加所需的索引序列以形成连接到目的区域内的所
述或每种检测探针的空间条形码；
47.(f)对步骤(d)的一种或多种空间条形码化的检测探针或其衍生物进行测序。
48.在一个实施方案中，所述或每种标志物是生物分子。在一个实施方案中，所述或每种标志物选自：蛋白质、翻译后蛋白质修饰、代谢物、生物活性小分子、核苷酸或药物。在一个实施方案中，所述或每种标志物是蛋白质，在这样的实施方案中，所述方法可以是分析组织中的一种或多种蛋白质的方法。适当地，在所述方法中分析任何数量的目的蛋白质，适当地，在所述方法中分析一种或多种目的蛋白质。在一些情况下，可以分析组织中的整个蛋白质组。
49.在一个实施方案中，所述或每种检测探针包含结合区，其中所述结合区是蛋白质、适体、核酸、核酸模拟物或其混合物。在一个实施方案中，所述结合区是抗体或纳米抗体。
50.根据本发明的第五方面，提供了一种分析组织中的一种或多种转录物和一种或多种标志物的方法，其包括：
51.(a)使组织与多种检测探针接触以允许检测探针与组织中的核酸和目的标志物结合，其中所述或每种检测探针包含光可裂解基团；
52.(b)任选地，如果所述或每种检测探针不包含光可裂解基团，则向所述或每种检测探针添加光可裂解基团；
53.(c)照射组织内待空间条形码化的目的区域，其中照射裂解或改变所述区域内的所述或每种检测探针的光可裂解基团；
54.(d)将空间条形码的索引序列添加到步骤(b)中照射的区域内的所述或每种检测探针，其中所述索引序列包含光可裂解基团；
55.(e)重复步骤(c)和(d)，直到添加所需的索引序列以形成连接到目的区域内的所述或每种检测探针的空间条形码；
56.(f)对步骤(d)的一种或多种空间条形码化的检测探针或其衍生物进行测序。
57.在一个实施方案中，除了一种或多种转录物外，所分析的一种或多种标志物选自：蛋白质、翻译后蛋白质修饰、代谢物、生物活性小分子、核苷酸或药物。在一个实施方案中，所述一种或多种标志物是蛋白质。在一个实施方案中，所述方法可以包括分析组织中的转录组和蛋白质组的方法。
58.在一个实施方案中，所述多种检测探针包括：结合区为核酸、核酸模拟物或适体的一种或多种检测探针，以及结合区为蛋白质的一种或多种检测探针。在一个实施方案中，蛋白质结合区为抗体或纳米抗体。
59.在一个实施方案中，本发明的第一至第五方面中描述的任何方法可以进一步包括将独特的空间条形码分配给每个目的位置或区域的步骤。合适的位置或区域在本文别处定义。适当地，该步骤发生在步骤(c)之前。
60.在一个实施方案中，第三、第四或第五方面的方法可以进一步包括制备用于测序的所述或每种空间条形码化的检测探针的步骤。适当地，该步骤发生在步骤(f)之前。用于制备所述或每种空间条形码化的检测探针的合适步骤在本文别处定义。
61.在一个实施方案中，在其中生物分子是核酸的本发明的第一至第五方面的方法中，所述方法可以进一步包括预扩增步骤。适当地是目的核酸的预扩增步骤。因此，适当地，所述方法可以包括从组织中扩增一种或多种目的核酸的步骤(a)。这种扩增可以通过任何
已知的方法进行，例如通过滚环扩增。例如，使用starmap、锁式探针、circligase和/或夹板连接产生的环化dna分子的滚环扩增。任选地，环化步骤之后可以是加工步骤，适当地是dna聚合步骤，适当地通过任何链置换dna聚合酶，例如phi29。适当地，在这样的实施方案中，在扩增产物上进行与多种检测探针接触以允许检测探针与所述目的核酸或每个目的核酸结合的步骤。适当地，这样的步骤可以包括使扩增步骤的产物与多种检测探针接触以允许所述或每种检测探针与扩增产物结合。适当地，扩增产物包括与每个目的核酸互补的核酸序列的多个拷贝，以及分配给每个目的核酸的独特dna序列的多个拷贝。适当地，所述独特dna序列被所述或每种检测探针靶向和结合。适当地，在扩增包括滚环扩增的实施方案中，扩增产物可以包括dna多联体。适当地，所述dna多联体包含与目的核酸互补的核酸序列的多个拷贝和独特dna序列的多个拷贝，所述或每种检测探针结合到其上。
62.在一个实施方案中，在其中生物分子是核酸的本发明的第一至第五方面的方法中，所述方法可以包括使用分裂检测探针(split detection probe)。适当地，每种分裂检测探针包含第一部分和第二部分。适当地，第一部分和第二部分都与给定的目的核酸序列结合。适当地，第一部分和第二部分在与目的核酸序列结合并彼此退火时形成完整的检测探针。适当地，第一部分和第二部分在与彼此退火距离内的目的核酸序列结合时形成完整的检测探针。合适的退火距离可以在1-100个核苷酸之间。适当地，第一部分和第二部分在通过彼此退火结合到目的核酸序列时形成完整的检测探针。适当地，探针的第一部分和第二部分都必须在彼此退火距离内与目的核酸序列结合，以形成完整的检测探针，并成功添加索引序列。适当地，包括添加索引序列的步骤(d)取决于步骤(a)中完整的检测探针的形成。
63.因此，适当地，所述方法的步骤(a)可以包括使组织与一种或多种分裂检测探针接触以允许所述或每种分裂检测探针与目的核酸结合并形成完整的检测探针，其中所述完整的检测探针包含光可裂解基团。适当地，其中使组织与分裂检测探针接触包括使组织与每种检测探针的第一部分和第二部分接触。适当地，其中每种分裂检测探针的第一部分和第二部分与目的核酸结合。适当地在彼此退火距离内，适当地彼此相距最多100个核苷酸。适当地，其中形成完整的检测探针包括使检测探针的第一部分和第二部分退火。
64.适当地，预扩增步骤和分裂检测探针可以单独使用或在相同方法中一起使用。这些实施方案中的每一个通过降低来自检测探针的非特异性结合的背景噪声来增加本发明方法的特异性。
65.在一个实施方案中，在第一至第五方面的方法中使用的所述或每个索引序列选自如第八方面所定义的索引序列文库。
66.根据本发明的第六方面，提供了通过第二、第三、第四或第五方面的方法产生的组织，其中所述组织包括空间条形码化的检测探针。
67.根据本发明的第七方面，提供了一种检测探针，其包含：
68.结合区；
69.种类条形码；和
70.光可裂解基团。
71.在一个实施方案中，所述检测探针进一步包含唯一分子标识符(umi)。
72.在一个实施方案中，所述检测探针进一步包含扩增区。
73.在一个实施方案中，所述检测探针适合与组织内存在的靶标生物分子结合。
74.在一个实施方案中，所述生物分子选自：rna转录物、基因组dna分子、蛋白质、转录后蛋白质修饰、代谢物、生物活性小分子、核苷酸或药物。在一个实施方案中，所述生物分子是rna转录物的polya区。
75.在一个实施方案中，所述结合区适合于与组织内的靶标生物分子结合。在一个实施方案中，所述结合区是核酸、核酸模拟物、适体或蛋白质。
76.在一个实施方案中，所述结合区是核酸，适当地是dna分子，适当地是与给定rna转录物或其他靶dna分子具有互补序列的dna分子。在一个实施方案中，所述结合区是与rna转录物中的polya区具有互补序列的dna分子。
77.在一个实施方案中，所述结合区是蛋白质，适当地是对靶标志物具有特异性的抗体或纳米抗体，适当地是选自以下的标志物：蛋白质、蛋白质修饰代谢物、生物活性分子、核苷酸或目的药物。
78.在一个实施方案中，所述检测探针包含结合区和包含种类条形码的核酸序列，以及光可裂解基团。在一个实施方案中，所述检测探针包含与包含种类条形码的核酸序列连接并与光可裂解基团连接的结合区。适当地，核酸可以进一步包含umi和/或扩增区。
79.在一个实施方案中，所述检测探针包含与rna转录物中的polya区互补的结合区、包含种类条形码的核酸序列和光可裂解基团。任选的元件包括唯一分子标识符(随机dna区域)、用于扩增的聚合酶启动子如t7启动子和如上所述的测序元件。
80.适当地，在这样的实施方案中，所述检测探针可以是修饰的检测探针。适当地，所述修饰的检测探针用于第三方面的方法中。适当地用于分析组织的转录组的方法。
81.在一个实施方案中，所述修饰的检测探针可以在本发明的方法中被延长，然后可以进一步包含与目的转录物互补的核酸序列，适当地在3’端。适当地，该另外的核酸序列可以被称为延长区域，并且在延长步骤之后存在于检测探针结合区的3’端。
82.根据本发明的第八方面，提供了一种索引序列文库，其中每个索引序列包括：
83.·
在5到50个核苷酸之间的总长度；和
84.·
与分子的5’或3’端之一或两者结合的光可裂解基团。
85.在一个实施方案中，每个索引序列包含平末端。在替代实施方案中，每个索引序列在其5’和3’端包含突出端。合适的突出端在本文别处定义。
86.在一个实施方案中，所述索引序列是核酸序列。适当地包含5’和3’端。适当地，所述索引序列可以是rna、dna或修饰的主链核酸序列，由规范或非规范碱基组成。在一个实施方案中，所述索引序列是dna。适当地，dna是双链的，如果存在突出端则除外。
87.根据本发明的第九方面，提供了一种空间条形码，其包含多个索引序列，其中所述索引序列选自第七方面的文库。
88.在一个实施方案中，所述空间条形码包含1至50个索引序列。在一个实施方案中，所述空间条形码的长度在10个核苷酸和250个核苷酸之间。在一个实施方案中，所述索引序列彼此连接，适当地通过化学键，适当地化学键与dna和rna聚合酶的加工相容。在一个实施方案中，所述多个索引序列通过磷酸二酯键连接在一起。
89.根据本发明的第十方面，提供了一种空间条形码化的检测探针，其包括连接到如第九方面所定义的空间条形码的检测探针。
90.在一个实施方案中，所述检测探针如第七方面所定义。
91.根据本发明的第十一方面，提供了一种试剂盒，其包含如第八方面所定义的索引序列文库、如第七方面所定义的一种或多种检测探针、任选的连接酶和任选的一种或多种试剂。
92.在一个实施方案中，所述一种或多种试剂包括：一种或多种缓冲液、一种或多种测序试剂、一种或多种水凝胶单体。
93.根据本发明的第十二方面，提供了一种用于空间条形码化的系统，所述系统包含：
94.·
用于观察基底的仪器；
95.·
用于照射基底的一个或多个位置的光源；
96.·
用于将一个或多个索引序列和试剂递送到基底的微流体回路
97.·
用于执行可操作软件以控制所述仪器、光源和微流体回路的处理器。
98.在一个实施方案中，所述基底是组织，如上所述。在一个实施方案中，所述系统用于对一种或多种检测探针进行空间条形码化，和/或对一种或多种标志物进行空间条形码化。适当地在一个或多个目的区域中。适当地在组织的一个或多个目的区域中。
具体实施方式
99.现在将在以下部分中定义以上方面的进一步特征和实施方案。每个特征可以以任何顺序或以与上述方面中的任一个的任何组合组合。
100.如本文所用，术语“核酸”是指由多个核苷酸碱基形成的任何聚合物，其中碱基可以由规范或非规范碱基组成，并且其中主链可以被修饰或未被修饰，并且其中核苷酸可以通过常规的磷酸二酯键或非常规的键如硫代磷酸酯键或化学键连接。如本文所用，术语“核酸模拟物”是指以某种方式为非天然的核酸，例如，其中一个或多个核苷酸碱基是非规范的，或其中主链被修饰，或其中碱基是非常规连接的。“核酸”和“核酸模拟物”可以包括：例如，桥接核酸、锁定核酸、肽核酸、传统dna和rna。
101.如本文所用，术语“一种”或“一个”可以以单数或复数形式指代相关特征，并且应理解为指相关特征中的至少一个，并且可以指代相关特征中的一个或多个。
102.组织
103.本发明的一些方面涉及生物组织内基因表达或蛋白质/标志物丰度的原位分析。本发明方法的第一步是标记或提供具有检测探针的标记的组织，所述检测探针与组织内的目的生物分子结合或预结合。
104.适当地，所述组织可以来自任何活性的来源。
105.适当地，所述组织可以来自人或动物来源。
106.适当地，所述组织可以是患病的或健康的组织。
107.适当地，所述组织是组织样品。适当地，所述组织样品是切片。适当地，所述切片可以通过任何已知的方式，例如通过切片机、低温恒温器、低温切片机或振动切片机获得。
108.适当地，组织切片的厚度范围为3μm至100μm。在其他实施方案中，组织切片可以更厚，这取决于在目的区域或位置中递送所需照射量的能力，以裂解或改变其中的光可裂解基团。
109.适当地，所述组织可以是单层细胞。
110.适当地，所述组织可以用一种或多种染色剂染色。适当地，所述染色剂可以是制备组织样品领域中已知的任何染色剂。合适的染色剂可以包括核染色剂和/或膜染色剂。例如：曙红、dapi、苏木精、鬼笔环肽(phalloidin)、wga等。
111.适当地，可以根据本领域已知的任何方法对组织进行一轮免疫组织化学或原位杂交，以便使用荧光成像对某些蛋白质标志物的分布进行可视化。适当地，所述方法可以包括对组织进行染色的步骤。适当地，所述方法可以包括对组织进行免疫染色的步骤。适当地，可以在本发明方法的步骤(a)之前进行一轮免疫组织化学。
112.适当地，在本发明的方法之前，组织或基底被成像。因此，适当地，所述方法可以包括对组织或基底进行成像的步骤。适当地，组织由照相机成像。适当地，照相机捕获组织的一幅或多幅图像。可选地，照相机可以是用于对组织进行成像的仪器(适当地是显微镜)的一部分。
113.适当地，使用软件来分析组织的一幅或多幅图像。适当地，本发明第十二方面中描述的软件可操作以分析组织的一幅或多幅图像。适当地，所述软件可操作以进行图像分析。适当地，所述软件可操作以进行马赛克成像分析。因此，适当地，所述方法可以包括对组织或基底的一幅或多幅图像进行马赛克成像分析的步骤。适当地，所述软件可操作以识别所述或每个图像内的单细胞或亚细胞区域，适当地通过自动对象识别。因此，适当地，所述方法可以包括识别组织的一幅或多幅图像中的单细胞或亚细胞区域。适当地，所述软件允许用户选择任何数量的目的位置或区域用于随后的空间条形码化。因此，适当地，所述方法可以包括适当地从一个或多个图像中选择一个或多个目的位置或区域用于空间条形码化的步骤。
114.在本发明的一些方面，所述方法涉及对一个或多个位置进行空间条形码化。在一个实施方案中，所述一个或多个位置在基底上。适当地，所述基底可以是惰性基底，例如玻璃、塑料等。适当地，所述惰性基底可以是载玻片、板、底座、管或用于进行测定的其他物品。替代地，所述基底可以是活性的，适当地，所述基底可以是组织。适当地，所述组织可以如本文所定义。本文定义的与组织区域相关的任何特征可以同样适用于基底上的位置。
115.目的区域或位置
116.本发明的方法包括选择和照射一个或多个目的位置或区域，其中位置或区域检测探针或根分子将被空间条形码化。
117.适当地，本文提及的“区域”或“位置”可以指二维区域或三维区域。适当地指任何尺寸的区域。适当地，所述区域的最大尺寸可以由照射的性质和/或所述方法中使用的特定组织或基底来确定。
118.适当地，目的位置可以是任何区域，适当地是基底上的任何区域。适当地，目的位置是二维区域。
119.适当地，目的位置的尺寸可以在1μm
2-150mm2之间，适当地在1μm
2-1mm2之间，适当地在1μm
2-1,000,000μm2之间，适当地在1μm
2-200,000μm2之间，适当地在1μm
2-20,000μm2之间，适当地在1μm
2-1000μm2之间。
120.适当地，目的区域可以是组织内的任何区域。适当地，目的区域是组织内的三维区域。
121.适当地，目的区域的尺寸可以在1μm
3-150mm3之间，适当地在1μm
3-1mm3之间，适当
地在1μm
3-1,000,000μm3之间，适当地在1μm
3-200,000μm3之间，适当地在1μm
3-20,000μm3之间，合适的尺寸在1μm
3-1000μm3之间。
122.适当地，目的区域或位置可以是细胞的集合，适当地，目的区域或位置可以包括从1到100,000,000个细胞、1,000,000个细胞、1000个细胞、100个细胞、10个细胞。适当地，目的区域或位置可以包括单细胞。适当地，目的区域或位置可以包括亚细胞区域或隔室。
123.适当地，在本发明的方法之前适当地预先选择一个或多个目的位置或区域。适当地，用户从组织的图像中适当地选择目的位置或区域。适当地，可以基于像素或基于图像的特征或两者来选择区域或位置。适当地，图像处理有助于从图像中选择区域或位置。
124.适当地，软件然后将独特的空间条形码分配给每个选定的目的位置或区域。因此，适当地，本发明的方法可以包括选择基底的一个或多个目的位置或选择组织的一个或多个目的区域的步骤。因此，适当地，本发明的方法可以包括将空间条形码分配给每个选定的目的位置或区域的步骤。
125.适当地，可以选择多个目的位置或区域。适当地，目的位置或区域不必是连续的。
126.适当地，可以选择的位置或区域的数量取决于可能的独特空间条形码序列的数量。独特空间条形码序列的数量又取决于所使用的不同索引序列的数量以及每个空间条形码中包含的索引序列的数量。
127.适当地，基于使用4个不同索引序列和每个空间条形码10个索引序列的方法，可以选择多达100万个目的位置或区域。
128.检测探针
129.本发明使用与组织中的生物分子结合的检测探针。所述检测探针可以预先与组织中的生物分子结合，或者它们可以作为空间条形码化方法的一部分与组织接触。
130.在包括使组织与一种或多种检测探针接触以允许所述或每种检测探针与生物分子结合的步骤的方法中，适当地，接触在足以允许所述或每种检测探针与生物分子结合的条件下进行。
131.合适的条件可以包括使组织与所述或每种检测探针接触足够长的时间以允许与生物分子结合。适当地，取决于组织样品的尺寸，足够时间在1小时和1周之间。
132.合适的条件可以包括使组织与足够浓度的所述或每种检测探针接触以允许与生物分子结合。适当地，取决于生物分子的丰度和检测探针的数量，足够浓度在1pm和1μm之间。
133.允许给定检测探针与给定目的生物分子结合的合适条件将由技术人员已知或确定。
134.适当地，用于本发明方法的检测探针可以是适合原位杂交方法的任何探针。适当地，所述或每种检测探针可以包含例如结合区、种类条形码、任选地唯一分子标识符(umi)和任选地任何以下元件：与目的转录物互补的核酸序列、光可裂解基团和扩增区。因此，适当地，可以使用本领域已知的任何检测探针，只要它包含结合区和种类条形码，以及任选地，任何以下元件：与目的转录物互补的核酸序列、umi、光可裂解基团和/或扩增区。在一些实施方案中，所述或每种检测探针可以包含含有种类条形码的结合区，或替代地也用作种类条形码的结合区。
135.适当地，用于本发明方法的检测探针可以是适用于免疫组织化学方法的任何探
针，其进一步包含结合区和种类条形码，任选地唯一分子标识符(umi)，以及任选地，任何以下元件：与目的转录物互补的核酸序列、光可裂解基团和扩增区。因此，适当地，可以使用本领域已知的任何免疫组织化学检测探针，只要它包含结合区和种类条形码，以及任选地，任何以下元件：唯一分子标识符(umi)、与目的转录物互补的核酸序列、光可裂解基团和/或扩增区。
136.适当地，检测探针可以不包含光可裂解基团，在这种情况下，所述方法包括向所述或每种检测探针添加光可裂解基团的步骤(b)。
137.在一个实施方案中，本发明的一种或多种检测探针用于本发明的方法中。
138.本发明的检测探针包含：
139.·
结合区；
140.·
种类条形码；和
141.·
光可裂解基团。
142.在一个实施方案中，所述检测探针进一步包含唯一分子标识符(umi)。
143.在一个实施方案中，所述检测探针进一步包含扩增区。
144.在一个实施方案中，所述检测探针进一步包含测序元件。
145.适当地，所述结合区允许检测探针与生物分子结合。适当地，其中所述生物分子存在于组织中。适当地，所述结合区允许检测探针与核酸或蛋白质、翻译后蛋白质修饰、代谢物、生物活性小分子、核苷酸或药物结合。适当地，所述结合区包含核酸、核酸模拟物、适体或蛋白质。
146.在生物分子是核酸，即目的rna转录物或dna分子的实施方案中，适当地，所述结合区是核酸或核酸模拟物。适当地，核酸能够与目的核酸杂交。适当地，所述结合区是dna。适当地，所述结合区是能够与目的rna转录物杂交的dna。在一个实施方案中，生物分子可以是rna转录物。在一个实施方案中，生物分子是rna转录物的polya区。在这样的实施方案中，所述结合区是能够与目的rna转录物的polya区杂交的核酸，适当地是dna。
147.在一个实施方案中，所述检测探针可以是分裂的。适当地，每个分裂检测探针包含第一部分和第二部分。适当地，第一部分和第二部分都与给定的目的核酸序列结合。适当地，第一部分和第二部分在与目的核酸序列结合并彼此退火时形成完整的检测探针。适当地，探针的第一部分和第二部分都必须与目的核酸序列结合并一起退火，以形成完整的检测探针，并成功添加索引序列。适当地，第一部分和第二部分一起包括上述检测探针的特征。
148.适当地，分裂检测探针的第一部分包括：结合区、种类条形码、与第二部分退火的区域和光可裂解基团。适当地，分裂检测探针的第一部分还可以任选地包括唯一分子标识符(随机dna区域)、用于扩增的聚合酶启动子如t7启动子和测序元件。适当地，分裂检测探针的第二部分包括：结合区，和用于与第一部分退火的区域。
149.在一个实施方案中，提供了一种分裂检测探针，其包含第一部分和第二部分，其中所述第一部分包含：
150.结合区；
151.种类条形码；
152.能够与第二部分退火的区域；和
153.光可裂解基团；
154.其中所述第二部分包含：
155.结合区；和
156.能够与第一部分退火的区域。
157.在一个实施方案中，所述第一部分进一步包含唯一分子标识符(umi)。
158.在一个实施方案中，所述第一部分进一步包含扩增区。
159.在一个实施方案中，所述第一部分进一步包含测序元件。
160.适当地，所述分裂检测探针的其他特征与本文针对典型检测探针描述的相同。
161.适当地，第一部分和第二部分的结合区能够与目的核酸，适当地与相同的目的核酸结合。适当地，第一部分的结合区能够在第二部分的退火距离内与目的核酸结合。合适的退火距离可以小于100个核苷酸，适当地小于50个核苷酸，适当地小于20个核苷酸，适当地小于10个核苷酸，适当地小于5个核苷酸。
162.适当地，当第一部分和第二部分在退火距离内与目的核酸序列结合时，第一部分的能够与第二部分退火的区域与第二部分的能够与第一部分退火的区域退火。适当地，形成索引序列可以结合的完整的检测探针。
163.适当地，所述结合区通过共价键与检测探针的其余组分连接。
164.在生物分子是标志物(例如目的蛋白质、翻译后蛋白质修饰、代谢物、生物活性小分子、核苷酸或药物)的实施方案中，适当地，所述结合区是蛋白质或适体。适当地，蛋白质或适体能够与目的标志物特异性结合。适当地，所述结合区是抗体、fab、单链抗体、纳米抗体等。
165.适当地，所述结合区通过共价键与探针的其余组分连接。
166.在一个实施方案中，检测探针包含结合区和至少包含种类条形码的核酸序列和光可裂解基团。在一个实施方案中，检测探针包含与包含至少一个种类条形码的核酸序列连接的结合区和光可裂解基团。适当地，核酸可以进一步包含umi和/或扩增区。
167.在一个实施方案中，检测探针包含结合区和与其连接的核酸序列，其中核酸序列包含：种类条形码、umi、扩增区和光可裂解基团。
168.在一个实施方案中，检测探针包含与rna转录物中的polya区互补的结合区、包含种类条形码的核酸序列和光可裂解基团。任选元件包括唯一分子标识符(随机dna区域)、用于扩增的聚合酶启动子如t7启动子和如上所述的测序元件。
169.适当地，在这样的实施方案中，检测探针可以是修饰的检测探针。适当地，修饰的检测探针用于第三方面的方法中。适当地，用于分析组织的转录组的方法中。
170.在一个实施方案中，修饰的检测探针可以在本发明的方法中被延长，然后可以进一步包含与目的转录物互补的核酸序列，适当地在3’端。适当地，该另外的核酸序列可以被称为延长区域，并且在延长步骤之后存在于检测探针的结合区的3’端。
171.适当地，结合区可以通过共价键连接到可以包含核酸序列的其余组分。适当地，当结合区包含核酸本身时，它通过磷酸二酯键连接到可以包含核酸序列的其余组分。适当地，当结合区包含蛋白质时，它通过化学键连接到可以包含核酸序列的其余组分。
172.用于连接蛋白质(例如结合区蛋白质)与核酸序列以形成检测探针的合适方法在本领域中是已知的。适当地，可以使用接头。
173.适当地，扩增区是核酸或核酸模拟物。适当地，扩增区是dna。
174.适当地，扩增区包含聚合酶的启动子。适当地，启动子用于rna聚合酶。在一个实施方案中，启动子是t7 rna聚合酶启动子或另一种单亚基聚合酶的启动子。
175.适当地，种类条形码也是核酸或核酸模拟物。适当地，种类条形码是dna。适当地，种类条形码与本发明的空间条形码是分开的。适当地，种类条形码允许识别检测探针结合的生物分子。适当地，在测序期间，种类条形码识别检测探针在组织中结合的生物分子。
176.适当地，umi也是核酸或核酸模拟物。适当地，umi是dna。适当地，umi对于每种检测探针都是独特的。适当地，单个umi和每种检测探针分子的组合是独特的。因此，适当地，umi允许通过计算不同umi序列的数量来对检测探针进行定量。适当地，umi由此促进探针结合的生物分子的定量。适当地，在测序期间，umi识别检测探针并允许表示检测探针与其靶标生物分子结合的单个事件的读段的折叠。适当地，与生物分子结合的不同检测探针分子的数量给出了该生物分子的表达的指示。
177.适当地，光可裂解基团在本文别处定义。
178.适当地，所述或每种检测探针可以进一步包含稳定剂。适当地，稳定剂是核酸或核酸模拟物。适当地是双链核酸。适当地，稳定剂产生与dsdna连接酶相容的双链区。适当地，稳定剂的长度在4到50个核苷酸之间。适当地，在使用分裂检测探针的一些实施方案中，存在稳定剂。适当地，稳定剂通过在检测探针的第一部分和第二部分之间退火以形成双链区而形成。适当地，如果检测探针的第一部分和第二部分都与目的核酸序列结合，则它们退火以形成稳定剂。适当地，第一部分和第二部分的这种退火形成如上所述的完整的检测探针。适当地，检测探针的第一部分和第二部分必须在彼此的退火距离内与核酸序列结合以发生这种情况。适当地在1个核苷酸和100个核苷酸之间，适当地在1和50之间，适当地在1和20个彼此的核苷酸之间。
179.适当地，所述或每种检测探针可以进一步包含一种或多种测序元件。适当地，所述或每种测序元件有助于检测探针的后续测序。适当地，至少一种测序元件是引物。适当地是用于测序文库扩增的引物。适当地，所述引物是正向引物，适当地是用于测序文库扩增的正向引物。
180.在一个实施方案中，检测探针可以包含以下结构：
[0181]3’‑
[结合区]-[核酸序列]-[光可裂解基团]-5’[0182]
其中核酸序列至少包含种类条形码，和任选地，扩增区、umi、测序元件和稳定剂。
[0183]
因此，在一个实施方案中，检测探针可以包含以下结构：
[0184]3’‑
[结合区]-[扩增区]-[种类条形码]-[umi]-[稳定剂]-[光可裂解基团]-5’[0185]
在一个实施方案中，检测探针可以是修饰的检测探针，并且可以包含以下结构：
[0186]3’‑
[与转录物中的polya区互补的结合区]-[核酸序列]-[光可裂解基团]-5’[0187]
其中核酸序列至少包含种类条形码，和任选地，扩增区、umi、测序元件和稳定剂。
[0188]
适当地，其中结合区是核酸。
[0189]
根分子
[0190]
在本发明的第一方面，列举了一种对基底的一个或多个位置进行空间条形码化的方法，其中第一步包括将一种或多种根核酸分子结合到将在其上构建空间条形码的所述或每个位置。
[0191]
适当地，根分子是核酸或核酸模拟物，适当地，根分子是dna。适当地，根分子包含第一端和第二端。适当地，根分子的第一端能够与基底结合。适当地，根分子的第二端能够与桥分子或索引序列结合。
[0192]
适当地，根分子可以包含光可裂解基团，适当地在其非结合端，适当地在其第二端。适当地，当根分子包含光可裂解基团时，它能够与索引序列结合并且不需要所述方法的步骤(b)。
[0193]
适当地，所述或每个根分子可以包含与检测探针相同的特征，但是结合区适合于与基底结合。
[0194]
桥分子
[0195]
本发明的方法需要在与接受所述方法的样本结合的根核酸分子或检测探针中的每一个上存在光可裂解基团。光可裂解基团允许控制哪些根核酸分子或哪些检测探针，以及随后哪些索引序列可用于添加进一步的索引序列。通过这种方式，光可裂解基团可以控制空间条形码在何时何地形成。
[0196]
适当地，光可裂解基团可以是所述根分子或检测探针或每个根分子或检测探针的组分，或者它可以添加到所述根分子或检测探针或每个根分子或检测探针中。
[0197]
适当地，可通过添加定义为桥的分子将光可裂解基团添加到所述根分子或检测探针或每种根分子或检测探针中。桥分子的使用是有利的，因为它允许在样本上使用大量不同的根分子或检测探针，而无需在化学合成过程中用光可裂解基团修饰每个不同的分子。这降低了生产可用于本发明方法的检测探针或根分子的文库的成本和复杂性。
[0198]
适当地，桥分子是核酸或模拟物。适当地，桥分子是dna。适当地，dna桥分子是双链dna分子。适当地，桥分子的长度在5到40个核苷酸之间，并且在分子的5’端或3’端或两者处包含光可裂解基团。
[0199]
适当地，在根分子或检测探针上不存在光可裂解基团的情况下，在所述方法的步骤(b)中将光可裂解基团添加到所述根分子或检测探针或每个根分子或检测探针中。
[0200]
适当地，可以将光可裂解基团添加到检测探针文库或根分子文库中，然后再将它们用于本发明的方法。适当地在所述文库与基底或组织样品接触之前。
[0201]
替代地，在本发明方法的步骤(b)中，可以将桥分子添加到所述或每个根分子或所述或每个检测探针中。适当地，通过连接将桥分子添加到所述或每个根分子或所述或每个检测探针中。适当地，桥分子的连接通过与索引序列相同的连接方法进行。适当地通过连接酶。合适的连接酶在本文别处描述。
[0202]
适当地，桥分子可以进一步包含一个或多个测序元件，或纯化元件以帮助纯化所述检测探针或根分子或每个检测探针或根分子。适当地，所述或每个测序元件有助于随后对所述或每种根分子或检测探针进行测序。适当地，至少一种测序元件是引物。适当地，引物是用于测序文库扩增的正向引物。
[0203]
生物分子
[0204]
本发明的方法允许对组织中标志物或生物分子的表达进行原位分析。特别地，这些方法允许对组织中标志物或生物分子的表达进行空间分析。
[0205]
在一个实施方案中，所述或每种标志物是生物分子。
[0206]
适当地，一个或多个生物分子可以是指示基因表达的任何分子。
[0207]
适当地，所述或每个生物分子可以选自：核酸、蛋白质、共价修饰的核酸、共价修饰的蛋白质、转录后蛋白质修饰、代谢物、生物活性小分子、核苷酸和药物。
[0208]
适当地，所述或每个生物分子可以是转录物，适当地是mrna分子、大的或小的非编码rna、环状rna或其他表达的转录物，包括替代的加香形式(spiced form)的mrna。适当地，所述或每个生物分子可以是带有修饰化学基团的共价修饰的转录物。
[0209]
在一个实施方案中，所述或每个生物分子是rna转录物。
[0210]
适当地，所述或每个生物分子可以是dna分子，适当地是基因组dna分子或异源dna分子。适当地，所述或每个生物分子可以是环状dna分子或dna多联体。适当地，所述生物分子或每个生物分子可以是共价修饰的dna分子，其带有修饰化学基团，适当地是甲基、羟甲基或甲酰基。
[0211]
适当地，所述或每个生物分子可以是蛋白质，适当地是多肽。
[0212]
适当地，所述或每个生物分子可以是翻译后修饰的蛋白质，其带有本领域已知的转录后修饰，例如糖基化、磷酸化、乙酰化等。
[0213]
适当地，所述或每个生物分子可以是代谢物、生物活性小分子、核苷酸或核苷、化学修饰的核苷酸或核苷、或药物。
[0214]
适当地，本发明的方法可以允许分析组织中的一种或多种转录物，适当地，在所述方法中分析任何数量的目的转录物，适当地在所述方法中分析一种或多种目的转录物。在一些情况下，可以分析组织中的整个转录组。适当地，在所述或每个生物分子是核酸的此类方法中，适当地是转录物，适当地是mrna。
[0215]
适当地，本发明的方法可以允许分析组织中的一种或多种蛋白质，适当地在所述方法中分析任何数量的目的蛋白质，适当地在所述方法中分析一种或多种目的蛋白质。在一些情况下，可以分析组织中的整个蛋白质组。适当地，在所述或每个生物分子是蛋白质或翻译后修饰的蛋白质的此类方法中，适当地是多肽或共价修饰的多肽。
[0216]
适当地，本发明的方法还可以允许分析组织中的一种或多种转录物和一种或多种标志物。在一个实施方案中，除一种或多种转录物外，检测和定量的一种或多种标志物选自：蛋白质、翻译后蛋白质修饰、代谢物、生物活性小分子、核苷酸或药物。在一个实施方案中，所述一种或多种标志物是蛋白质。适当地，在多个生物分子被检测探针结合的此类方法中，适当地，所述多个生物分子包含核酸和一种或多种其他类型的标志物。
[0217]
适当地，本发明的方法还可以允许分析组织的转录组和蛋白质组，适当地在多个生物分子被检测探针结合的此类方法中，适当地，所述多个生物分子包括核酸和蛋白质，适当地包括转录物和多肽，或共价修饰的转录物和多肽。
[0218]
适当地，本发明的方法还可以允许检测dna分子、它们的拷贝数以及单核苷酸变体的存在或不存在或简单重复序列的长度。
[0219]
光可裂解基团
[0220]
本发明利用根核酸分子、桥分子、检测探针和索引序列，每个都可以包含光可裂解基团。光可裂解基团允许控制哪些根分子、哪些检测探针以及随后哪些索引序列可用于添加进一步的索引序列。通过这种方式，光可裂解基团可以控制空间条形码在何时何地形成。
[0221]
适当地，所述或每个根分子可以包含光可裂解基团。适当地，所述或每个检测探针可以包含光可裂解基团。适当地，所述或每个桥分子包含光可裂解基团。适当地，每个索引
序列包含光可裂解基团。在一个实施方案中，所述或每个检测探针包含光可裂解基团。在一个实施方案中，所述或每个根分子包含光可裂解基团。
[0222]
替代地，可以通过使用如本文别处所述的桥分子将光可裂解基团添加到所述或每个根分子或所述或每个检测分子。
[0223]
适当地，光可裂解基团可以位于所述根分子、桥分子、检测探针或索引序列或每个根分子、桥分子、检测探针或索引序列的5’端。适当地，光可裂解基团可替代地位于所述根分子、桥分子、检测探针和索引序列或每个根分子、检测探针和索引序列的3’端。
[0224]
适当地，光可裂解基团可以与所述根分子、桥分子、检测探针和索引序列或每个根分子、桥分子、检测探针和索引序列的5’磷酸结合。
[0225]
适当地，光可裂解基团可以与所述根分子、桥分子、检测探针和索引序列或每个根分子、桥分子、检测探针和索引序列的3’羟基结合。
[0226]
适当地，光可裂解基团是保护核酸序列的5’或3’端的光敏基团。适当地，光可裂解基团保护核酸序列的5’或3’端免于添加另外的核酸序列，适当地在本发明的上下文中，光可裂解基团防止添加索引序列。
[0227]
在本发明的一个实施方案中，光可裂解基团在存在时防止反应发生，并且当被去除或改变时允许反应发生。
[0228]
适当地，光可裂解基团防止核酸与根分子、桥分子、检测探针或索引序列的任何杂交或连接。适当地，在根分子、桥分子或检测探针的情况下，光可裂解基团防止索引序列与其连接。适当地，在索引序列的情况下，光可裂解基团防止另外的索引序列与其杂交或连接。
[0229]
适当地，光可裂解基团包括笼(cage)。适当地，所述笼保护核酸的5’磷酸或3’羟基。
[0230]
适当地，光可裂解基团进一步连接到荧光部分。适当地，所述荧光部分允许检测光可裂解基团并且在去除或改变光可裂解基团之后被适当地去除。
[0231]
适当地，光可裂解基团可以包括硝基苄基、二甲氧基-硝基苄基、硝基苯基或硝基藜芦基。
[0232]
适当地，光可裂解基团可以是pc-间隔物或光可裂解间隔物。适当地，所述光可裂解间隔物可以包含根据式i的结构，如实施例中所述。
[0233]
适当地，光可裂解基团可以通过照射而裂解或改变。适当地，响应于照射的光可裂解基团的裂解或改变暴露了相关核酸的5’或3’端。适当地，光可裂解基团的裂解或改变允许将另外的核酸序列(适当地索引序列)添加到核酸的暴露的5’或3’端；其可以是根分子、检测探针、桥分子或索引序列。
[0234]
适当地，可以通过响应于照射而改变构象，适当地通过响应于照射而改变三维构象，来改变光可裂解基团。
[0235]
替代地，光可裂解基团可以响应于照射而裂解。
[0236]
适当地，光可裂解基团可以通过单光子或双光子机制而裂解。适当地，在单光子机制中，光的一个单光子平均被每个光可裂解分子吸收，从而导致光释放。适当地，该反应所需的照射在300nm至600nm的范围内。适当地，在双光子机制中，光的两个不同光子平均被每个光可裂解分子吸收，从而导致光释放。适当地，光的两个光子在飞秒时间段内被吸收。适
当地，该反应所需的照射在680nm至900nm的范围内。
[0237]
将用于裂解所述光可裂解基团的合适照射在本文别处讨论。
[0238]
照射
[0239]
本发明的方法依赖于以顺序方式照射选定的目的位置或区域来控制将索引序列添加到结合在那些区域中的检测探针的顺序。将索引序列添加到检测探针的顺序形成了与每个目的位置或区域相对应的独特空间条形码。
[0240]
适当地，照射目的位置或区域包括照射已经由用户选择的目的位置或区域。适当地，用户使用软件选择所述目的位置或区域或每个目的位置或区域。适当地，这种位置或区域的选择发生在照射步骤(c)之前。
[0241]
适当地，照射裂解或改变光可裂解基团。适当地，照射目的位置或区域会裂解或改变存在于该位置或区域中的光可裂解基团。适当地，照射目的位置或区域会裂解或改变该位置或区域中的根分子、检测探针和/或索引序列上的光可裂解基团。适当地，在所述方法的第一个循环中，照射目的位置或区域会裂解或改变来自该位置或区域中的每个根分子或检测探针的光可裂解基团。适当地，在所述方法的后续循环中，照射目的位置或区域会裂解或改变来自该位置或区域中的每个结合的索引序列的光可裂解基团。
[0242]
适当地，照射会裂解或改变来自根分子、桥分子、检测探针和/或索引序列的光可裂解基团，使得5’端或3’端暴露，并且任选地可用于反应。适当地，照射裂解或改变来自根分子、桥分子、检测探针和/或索引序列的光可裂解基团，使得5’磷酸或3’羟基暴露，并且任选地可用于反应。适当地，照射允许将索引序列添加到根分子、桥分子、检测探针和/或索引序列的5’端或3’端。
[0243]
适当地，照射目的区域允许将索引序列添加到该位置或区域中的根分子、桥分子、检测探针和/或结合的索引序列。适当地，在所述方法的第一个循环中，照射目的位置或区域允许将索引序列添加到该位置或区域中的每个根分子、桥分子或检测探针。适当地，在所述方法的后续循环中，照射目的位置或区域允许将另外的索引序列添加到该位置或区域中的每个结合的索引序列。
[0244]
适当地，照射确定将在哪些目的位置或区域中添加给定的索引序列。
[0245]
适当地，可以一次照射多个目的位置或区域。适当地，步骤(c)可以包括照射多个目的位置或区域。
[0246]
因此，适当地，步骤(c)可以包括产生照射图案。因此，适当地，步骤(c)可以包括在基底或组织上产生照射图案，其中所述照射图案包括多个目的位置或区域。适当地，相同的索引序列被添加到给定的照射图案内的每个目的位置或区域。
[0247]
适当地，在步骤(c)中被照射的目的位置或区域在每一轮的步骤(c)和(d)中改变。因此，适当地，照射图案在每一轮的步骤(c)和(d)中改变。
[0248]
适当地，在每一“轮”的步骤(c)和(d)中，对于该位置具有相同索引序列的所有目的区域/位置都被照射，并且相关索引序列被接触并且适当地被添加。
[0249]
适当地，所述方法包括多轮步骤(c)和(d)，直到每个不同的索引序列与目的区域/位置接触，适当地添加到所述区域/位置，以实现空间条形码的相关位置。
[0250]
适当地，在对空间条形码中使用的不同索引序列中的每一个执行一轮之后，一个循环就完成了。适当地，使用4个不同索引序列的方法的每个循环将具有4轮。
[0251]
因此，适当地，“循环”对应于完成每个目的区域/位置的空间条形码位置。适当地，“循环”对应于将所述位置/区域与要在所述方法中使用的每个索引序列接触。
[0252]
适当地，第一个循环包括多轮步骤(c)和(d)以将对应于空间条形码中的第一位置的相关索引序列与选定的位置/区域中的结合的根分子、桥分子和/或检测探针接触，适当地将对应于空间条形码中的第一位置的相关索引序列添加到选定的位置/区域中的结合的根分子、桥分子和/或检测探针。
[0253]
适当地，在第一个循环之后，分配的空间条形码的第一位置中的所有索引序列都已被接触，适当地被添加。
[0254]
适当地，第二循环包括多轮步骤(c)和(d)，以将对应于空间条形码中的第二位置的相关索引序列与选定的位置/区域中的结合的索引序列接触，适当地将对应于空间条形码中的第二位置的相关索引序列添加到选定的位置/区域中的结合的索引序列。
[0255]
适当地，在第二个循环之后，空间条形码的第二位置中的所有索引序列都已被接触，适当地被添加。
[0256]
适当地，取决于要使用的不同索引序列的数量，每个循环可以发生任何数量的轮次。适当地，取决于要添加的空间条形码的长度以及因此包含在每个空间条形码中的索引序列的数量，可以发生任何数量的循环。
[0257]
例如，每个空间条形码可以包括10个位置，因此有10个索引序列，并且在所述方法中可以使用4个不同的索引序列。因此，本发明的方法的每个循环将包括4轮并包括10个循环，以形成完整的空间条形码。
[0258]
适当地，当提及在每个循环中添加“所有”索引序列时，以及在一轮中添加不同索引序列中的“每一个”时，应理解并非每个索引序列将总是被添加到每个结合的根分子、桥分子和/或检测探针，或每个结合的索引序列。由于所述方法中预期的低效率，例如连接酶不是100％有效的，因此可能不会添加一些索引序列。
[0259]
适当地，在一些情况下，仅添加一些索引序列。适当地，仅将一些索引序列添加到结合的根分子、桥分子和/或检测探针，或结合的索引序列。适当地，索引序列至少与相关区域/位置接触以进行添加。适当地，当所有需要的索引序列已经与相关区域/位置接触时，一轮或循环被视为完成。
[0260]
适当地，照射不限于可见光，适当地，本文中使用术语“照射”是指任何波长的光，其为可见光或不可见光。
[0261]
适当地，通过使用光源，适当地是恒定波长的光源，适当地通过使用led或激光器来实现对所述目的位置或区域或每个目的位置或区域的照射。
[0262]
适当地，照射可以指向每个目的位置或区域。适当地通过使用折射或反射光学系统。适当地，折射或反射光学系统可以具有200nm或更高的分辨率。适当地，光学系统可以包含在显微镜中，例如本领域中描述的任何显微镜。适当地，光源也可以包含在显微镜中。适当地，光学系统包括将照射引导至所述目的位置或区域或每个目的位置或区域的元件。适当地，光学系统包括将来自光源的照射引导至所述目的位置或区域或每个目的位置或区域的元件。
[0263]
在一些实施方案中，所述元件是可移动反射镜，例如电流计反射镜。在一些实施方案中，所述元件是数字微镜器件(dmd芯片)。在一些实施方案中，所述元件是空间光调制器。
[0264]
适当地，所述目的位置或区域或每个目的位置或区域可以被具有300-600nm之间、适当地在310nm-570nm之间、适当地在320nm-550nm之间、适当地在330nm-520nm之间、适当地在340nm-480nm之间、适当地在350nm-450nm之间，适当地在360nm-420nm之间的波长的光照射。适当地，这些波长的光导致单光子光释放过程。
[0265]
替代地，可以用波长在680nm和900nm之间、适当地在700nm和850nm之间、适当地在720nm和800nm之间的光照射所述目的位置或区域或每个目的位置或区域。适当地，这些波长的光导致双光子光释放过程。
[0266]
适当地，光可以是紫外光或紫光或红外光。
[0267]
在一个实施方案中，所述目的位置或区域或每个目的位置或区域被具有350nm-410nm之间的波长的光照射，用于单光子过程，或被具有710至800nm的波长的光照射，用于双光子过程。在一个实施方案中，用相同波长的光照射所述目的位置或区域或每个位置或区域。适当地，在本发明的整个方法中使用相同波长的光。
[0268]
替代地，可以用第一波长的光照射第一目的位置/区域，并且可以用第二波长的光照射第二目的位置/区域。适当地，在这种情况下，一种波长的光在300nm-450nm范围内，而第二种波长的光在500-600nm范围内，使用单光子光释放过程。适当地，第一和第二位置/区域可以同时被不同波长的光照射。适当地，这可以应用于多个目的位置/区域，这些位置/区域可以同时被不同波长的光照射。
[0269]
适当地，每个目的位置/区域用具有足够功率的光照射以裂解或改变给定位置或区域中的光可裂解基团。适当地，每个目的位置/区域用平均功率范围为10mw/cm2至30w/cm2、适当地从20mw/cm2至20w/cm2、适当地从50mw/cm2至10w/cm2、适当地从100mw/cm2至5w/cm2、适当地从200mw/cm2至1w/cm2的光照射。适当地，每个目的位置/区域被照射一段足够的时间，以裂解或改变该位置/区域中的光可裂解基团。适当地，每个目的位置/区域被照射1秒至10分钟，适当地5秒至5分钟，适当地10秒至3分钟，适当地30秒至2分钟。照射时间取决于照射强度。技术人员将知道如何调整照射时间以实现光可裂解基团的充分裂解或改变。
[0270]
在一个实施方案中，每个目的位置/区域被照射5分钟。因此，适当地，步骤(c)包括照射目的位置/区域5分钟。
[0271]
在一个实施方案中，每个目的位置/区域被照射30秒。因此，适当地，步骤(c)包括照射目的位置/区域30秒。
[0272]
添加索引序列
[0273]
本发明的方法包括添加索引序列以形成连接到根分子、桥分子或检测探针或每个根分子、桥分子或检测探针的空间条形码。索引序列被添加到已被照射的位置或区域，并且因此其包括具有暴露的5’或3’端的根分子、检测探针、桥分子或结合的索引序列。适当地，暴露的5’或3’端是反应性的。
[0274]
适当地，将索引序列添加到步骤(c)中照射的位置或区域中存在的任何暴露的或反应性的5’或3’端。适当地，在所述方法的第一个循环中，将索引序列添加到步骤(c)中照射的位置或区域中存在的根分子、桥分子或检测探针的任何暴露的或反应性的5’或3’端。适当地，在所述方法的后续循环中，将索引序列添加到步骤(c)中照射的位置或区域中存在的结合的索引序列的任何暴露的或反应性的5’或3’端。
[0275]
适当地，所述或每个索引序列通过连接添加，所述连接可以是化学连接或酶促连
接。适当地通过连接到步骤(c)中照射的位置或区域中存在的根分子、桥分子或检测探针的5’或3’端。适当地在所述方法的第一个循环中。适当地通过连接到步骤(c)中照射的位置或区域中存在的结合的索引序列的5’或3’端。适当地在所述方法的后续循环中。适当地，所述或每个索引序列通过连接酶连接。适当地，连接酶可以选自任何连接酶，例如：t4连接酶、t3连接酶、taq连接酶。
[0276]
在一个实施方案中，所述或每个索引序列通过t4 dna连接酶连接。
[0277]
适当地，所述或每个桥分子通过相同方式连接到检测探针。
[0278]
适当地，可以在步骤(d)期间将连接酶添加到本发明的方法中以连接所述或每个索引序列。因此，适当地，步骤(d)可以包括将空间条形码的索引序列连接到步骤(c)中照射的位置或区域内的所述根分子或检测探针或每个根分子或检测探针。
[0279]
替代地，可以在步骤(e)之后将连接酶添加到本发明的方法中以连接所有已添加到所述根分子或检测探针或每个根分子或检测探针的索引序列。适当地，在该实施方案中，步骤(c)可以包括将空间条形码的索引序列与步骤(c)中照射的位置或区域内的所述根分子或检测探针或每个根分子或检测探针杂交。适当地，所述方法进一步包括在步骤(e)之后将索引序列连接到所述根分子或检测探针或每个根分子或检测探针的步骤。
[0280]
索引序列
[0281]
本发明的方法采用索引序列，当它们以各种不同的顺序添加在一起时形成空间条形码。这些空间条形码指示了给定检测探针在组织样品中结合的位置，因此表明了相关生物分子或标志物的表达位置。
[0282]
适当地，空间条形码由多个索引序列形成。适当地，空间条形码包括多个索引序列。适当地，将索引序列顺序地添加在一起以形成空间条形码，适当地通过重复所述方法的步骤(c)和(d)。适当地，在所述方法的每个循环期间，将索引序列添加到每个根分子、检测探针或结合的索引序列。适当地，在所述方法的第一个循环期间，将第一索引序列添加到每个根分子、检测探针或结合的索引序列，在所述方法的第二个循环期间，将第二索引序列添加到每个根分子、检测探针或结合的索引序列，并且在所述方法的后续循环期间，将第三、第四等索引序列添加到每个根分子、检测探针或结合的索引序列。
[0283]
适当地，在所述方法的第一个循环期间，将第一索引序列添加到每个检测探针或根分子。适当地，在所述方法的后续循环期间，将后续索引序列添加到每个结合的索引序列。
[0284]
每个索引序列包括：
[0285]
·
在5到50个核苷酸之间的总长度；和
[0286]
·
与分子的5’或3’端之一或两者结合的光可裂解基团。
[0287]
在一个实施方案中，索引序列是核酸序列或核酸模拟物。适当地包括5’和3’端。适当地，索引序列可以是rna、dna或修饰的主链核酸序列，由规范或非规范碱基组成。在一个实施方案中，索引序列是dna。在一个实施方案中，每个索引序列是双链dna。适当地，每个索引序列的总长度在10-40个核苷酸之间，适当地在14-30个核苷酸之间，适当地在15-25个核苷酸之间。
[0288]
在一个实施方案中，每个索引序列具有19-20个核苷酸的总长度。
[0289]
适当地，所述总长度是索引序列的双链部分的总长度，适当地排除任何突出端(如
果存在的话)。
[0290]
适当地，每个索引序列通过总长度为10-40个核苷酸、适当地14-30个核苷酸、适当地15-25个核苷酸的核酸链退火产生。
[0291]
在一个实施方案中，每个索引序列通过总长度为19-20个核苷酸的核酸链的退火产生。
[0292]
适当地，每个索引序列可以包含平末端。
[0293]
替代地，每个索引序列可以包含突出端，适当地位于5’和3’端。适当地，突出端是互补的，适当地，突出端与其他索引序列上的突出端互补。适当地，每个突出端与另一个索引序列上的突出端部分或完全互补。
[0294]
适当地，每个突出端包含1-15个核苷酸之间的长度，适当地3-9个核苷酸。适当地，每个突出端包含选自3、4、5、6、7、8和9个核苷酸的长度。适当地，每个突出端的长度为6或7个核苷酸。
[0295]
适当地，每个索引序列包含第一突出端和第二突出端。适当地，第一和第二突出端可以独立地位于每个索引序列的5’或3’端。
[0296]
在一个实施方案中，位于所述或每个索引序列的5’和3’端的突出端具有相同的长度。
[0297]
在一个实施方案中，位于所述或每个索引序列的5’和3’端的突出端具有不同的长度。适当地，每个索引序列包含较长的突出端和较短的突出端，位于分子的任一端。适当地为第一较长的突出端和第二较短的突出端。适当地，较长的突出端位于索引序列的第一端，而较短的突出端位于索引序列的第二端。
[0298]
适当地，每个索引序列包含长度为6个核苷酸的第一突出端和长度为7个核苷酸的第二突出端。适当地，当索引序列添加在一起以形成空间条形码时，索引序列的突出端交替。适当地，突出端在长度为6个核苷酸和长度为7个核苷酸之间交替。
[0299]
适当地，每个索引序列包含一个或多个光可裂解基团。所述或每个光可裂解基团如本文别处定义。
[0300]
适当地，每个索引序列包含具有不同于所有其他索引分子的独特核苷酸序列的中心区域。
[0301]
适当地，每个索引序列包含高gc含量。适当地，每个索引序列包含介于30％和80％之间的gc含量。
[0302]
适当地，每个索引序列不形成任何aa或tt二聚体。适当地，当索引序列是双链dna时，它不包含任何aa或tt二聚体。
[0303]
本发明进一步提供了索引序列文库。
[0304]
适当地，索引序列文库包含将在本发明的方法中使用的索引序列。适当地，索引序列文库包含将在本发明的方法中使用的所有索引序列。
[0305]
适当地，在本发明的方法中使用至少4个不同的索引序列。适当地，在本发明的方法中可以使用1-100个不同的索引序列。在一个实施方案中，在本发明中使用了4个不同的索引序列。适当地，更高数量的索引序列允许产生更长的空间条形码，因此可以产生更多数量的独特条形码，因此可以标记更多目的位置/区域。
[0306]
适当地，索引序列可以被分类成组。适当地，每组中的索引序列具有相同的核苷酸
序列。适当地，文库可以包含多组索引序列。
[0307]
因此，适当地，文库可以包含多个索引序列，适当地多组索引序列。适当地，文库可以包含至少2组索引序列，其中每组中的索引序列共享相同的核苷酸序列。适当地，文库可以包含多达100组索引序列，其中每组中的索引序列共享相同的核苷酸序列。
[0308]
例如，本发明的文库可以包含4组索引序列：a组、b组、c组、d组，其中每组中的索引序列共享相同的核苷酸序列。
[0309]
在一个实施方案中，索引序列可以包括根据seq id no:17-25、27-30、33-36和38-77中的任一个的序列。在一个实施方案中，索引序列可以包含选自seq id no:17-25、27-30、33-36和38-77中的任一个的序列对，适当地，其中所述序列对能够彼此退火。
[0310]
在一个实施方案中，索引序列文库可以包含根据seq id no:17-25、27-30、33-36和38-77中的任一个。在一个实施方案中，索引序列文库可以包含多个根据seq id no:17-25、27-30、33-36和38-77中的任一个。在一个实施方案中，索引序列文库可以包含选自seq id no:17-25、27-30、33-36和38-77的任何序列对，适当地，其中所述序列对能够彼此退火。在一个实施方案中，索引序列文库可以包含选自seq id no:17-25、27-30、33-36和38-77的多对序列，适当地，其中每对序列能够彼此退火。
[0311]
seq id no:17-25、27-30、33-36和38-77中的合适的序列对在本文的实施例中被鉴定，所述序列对可以退火形成索引序列。形成索引序列的任何这样的对都是本发明的实施方案。
[0312]
空间条形码
[0313]
本发明提供了空间条形码化的方法。这些方法包括向根核酸分子或检测探针添加空间条形码，任选地通过桥分子，以标记每个根分子或检测探针结合的位置。
[0314]
本发明进一步提供了包含多个索引序列的空间条形码，其中索引序列选自本文别处定义的文库。
[0315]
如上所述，每个空间条形码由多个索引序列构成。适当地，每个空间条形码中的索引序列以独特的顺序排列。因此，适当地，每个空间条形码都是独特的。
[0316]
适当地，形成空间条形码的各个索引序列通过共价化学键连接。适当地，共价化学键与聚合酶相容，并且与高通量测序化学相容。适当地，共价化学键与聚合酶相容。
[0317]
适当地，形成空间条形码的各个索引序列通过磷酸二酯键连接。
[0318]
适当地，为每个目的位置或区域分配一个空间条形码。适当地，空间条形码对于选定的位置或区域是独特的。适当地，相同的空间条形码被添加到相同的目的位置或区域内的每个根分子、桥分子或检测探针。因此，适当地，每个空间条形码指示给定的目的位置或区域。
[0319]
适当地，所述或每个空间条形码包含至少一个索引序列。适当地，所述或每个空间条形码包含4-50个索引序列。包含更多数量的索引序列的空间条形码具有更高的编码能力，并且可以标记更多的独特的目的位置/区域。适当地，空间条形码内的每个索引序列可以相同或不同。
[0320]
适当地，将索引序列以特定顺序添加到所述根分子、桥分子或检测探针或每个根分子、桥分子或检测探针以构建空间条形码。适当地，在第一个循环的步骤(c)和(d)中将一个索引序列添加到所述根分子、桥分子或检测探针或每个根分子、桥分子或检测探针。适当
地，然后在每个后续循环的步骤(c)和(d)中将一个索引序列添加到所述或每个检测探针。适当地通过添加到结合的索引序列。适当地，步骤(c)和(d)循环重复，直到空间条形码完全形成并连接到所述或每个检测探针。因此，适当地，步骤(c)和(d)的循环次数由所述或每个空间条形码的长度确定。
[0321]
适当地，优化每个空间条形码中的索引序列的顺序以减少测序期间的错误。
[0322]
本发明进一步提供了空间条形码文库。
[0323]
适当地，文库中的每个空间条形码包含多个索引序列，其中索引序列选自本文别处定义的索引序列文库。适当地，文库中的每个空间条形码都是独特的。适当地，文库中的每个空间条形码都包含索引序列的独特组合。
[0324]
适当地，可以设计空间条形码文库以减少测序后的错误识别错误。适当地，空间条形码文库形成纠错码。许多产生纠错码的方法在本领域中是已知的。
[0325]
适当地，可以选择包括在文库中的每个空间条形码中的索引序列的组合，使得每个空间条形码与包括在文库中的所有其他空间条形码的hamming距离为1。适当地，每个空间条形码与本发明的方法中使用的所有其他空间条形码的hamming距离为1。
[0326]
适当地，一对空间条形码之间的hamming距离被定义为第一空间条形码中必须用其他索引序列替换的元件(在这种情况下是索引序列)的数量，从而将第一空间条形码转换成第二空间条形码的拷贝。
[0327]
适当地，可以选择包括在空间条形码文库中的每个空间条形码中的索引序列的组合，使得每个空间条形码与包括在文库中的所有其他空间条形码的hamming距离为3、5或7。适当地，每个空间条形码与本发明的方法中使用的所有其他空间条形码的hamming距离为3、5或7。
[0328]
适当地，可以根据能够纠正至少一个、至少两个或至少三个替换、删除或插入错误的纠错编码方案来选择包括在空间条形码文库中的每个空间条形码中的索引序列的组合。适当地，本发明的方法可以包括将空间条形码分配给组织内的每个目的位置或区域的步骤。适当地，该步骤发生在步骤(c)之前。适当地，使用软件将空间条形码分配给每个目的位置或区域。适当地，将空间条形码分配给每个目的位置或区域是由软件自动执行的，适当地当用户选择目的位置或区域时。
[0329]
适当地，分配的空间条形码包括多个单元。适当地，每个单元对应于一个索引序列。合适的单元可以是任何形式的编码，例如数字或字母，其中每个索引序列具有相应的单元。例如，在使用4个不同的索引序列并且空间条形码具有4个单元的长度的实施方案中，单元a、b、c和d可以各自对应于不同的索引序列。在这样的实施方案中，分配的空间条形码的实例可以是：abcd、acbd、adbc等。
[0330]
测序
[0331]
在将完整的空间条形码添加到根核酸分子、桥分子或检测探针之后，就可以进行测序步骤。
[0332]
适当地，在添加空间条形码后可能不会立即进行测序。在一些实施方案中，包含连接到根分子、桥分子或检测探针的空间条形码的基底或组织可以在测序之前储存。因此，本发明提供了一种包含空间条形码化的检测探针的组织。本发明进一步提供了一种包含空间条形码化的根分子的基底。
[0333]
适当地，当完整的空间条形码已被添加到检测探针时，所述检测探针就被称为空间条形码化的检测探针。类似地，当完整的空间条形码已被添加到根分子时，所述根分子就被称为空间条形码化的根分子。
[0334]
适当地，对所述或每个空间条形码化的根分子或检测探针进行测序。因此，适当地，所述根分子或检测探针或每个根分子或检测探针和连接的空间条形码被测序为单个核酸，任选地进一步包含桥分子。
[0335]
适当地，检测探针提供关于表达什么生物分子以及在组织中表达到什么水平的信息。
[0336]
适当地，空间条形码提供关于生物分子在组织中的何处表达的信息。适当地，在哪些目的区域中表达生物分子。
[0337]
因此，适当地，在对通过本发明的方法产生的单个核酸进行测序时，为每个目的生物分子提供鉴定、定量和空间信息。
[0338]
适当地，本发明的方法可以进一步包括制备用于测序的一种或多种空间条形码化的检测探针或根分子的步骤。适当地，该步骤发生在测序步骤之前。
[0339]
在一个实施方案中，这包括从基底或组织中去除空间条形码化的检测探针或根分子。在另一个实施方案中，在制备用于测序之前，对空间条形码化的检测探针或根分子的部分或全部进行原位扩增。
[0340]
适当地，制备用于测序的一种或多种空间条形码化的检测探针或根分子可以包括向所述空间条形码化的检测探针或根分子或每种空间条形码化的检测探针或根分子添加修饰剂。合适的修饰剂可以是进行测序所需的修饰剂，例如引物或pcr手柄。
[0341]
适当地，可以将测序元件例如测序文库制备所需的测序引物添加到每个空间条形码的末端。适当地添加到5’端，或适当地添加到3’端。适当地，通过pcr、酶促连接或通过逆转录的模板转换来添加测序元件。适当地，在添加到5’端的情况下，通过连接来添加测序元件。适当地，在添加到3’端的情况下，通过逆转录的模板转换，或通过pcr或通过连接来添加测序元件。适当地，通过pcr来添加测序元件可以包括使用在其5’端包含序列元件的随机六聚体寡核苷酸。适当地，通过连接来添加测序元件可以包括延长的检测探针的片段化步骤，适当地在连接之前。适当地使用本领域已知的任何连接酶，或通过使用本领域已知的任何逆转录酶，或通过使用本领域已知的任何dna聚合酶。适当地，使用的连接酶可以是本文别处描述的连接酶中的一种。适当地，在本发明方法的步骤(f)之前进行测序元件的添加。替代地，如果测序元件是3’引物，则可以在延长检测探针的同时进行测序元件的添加，适当地在本发明方法的步骤(a)和(b)之间。适当地在第三方面的方法的步骤(a)和(b)之间，所述方法可以包括如上文所述的延长步骤。
[0342]
适当地，可以通过本领域已知的任何dna提取方法从组织或样本中提取一种或多种空间条形码化的检测探针或根分子，并且可以在测序之前储存所得的分子库。
[0343]
适当地，制备用于测序的一种或多种空间条形码化的检测探针或根分子可以包括转录步骤。适当地，将所述空间条形码化的检测探针或根分子或每种空间条形码化的检测探针或根分子转录成rna。
[0344]
适当地，制备用于测序的一种或多种空间条形码化的检测探针或根分子可以包括分离所述空间条形码化的检测探针或根分子或每个空间条形码化的检测探针或根分子的
步骤。适当地，包括分离所述或每种空间条形码化的检测探针rna的步骤。
[0345]
适当地，制备用于测序的一种或多种空间条形码化的检测探针或根分子可以包括逆转录步骤。适当地，逆转录所述或每种空间条形码化的检测探针rna。
[0346]
适当地，制备用于测序的一种或多种空间条形码化的检测探针或根分子可以包括扩增一种或多种空间条形码化的检测探针或根分子的步骤。适当地，扩增所述或每种逆转录的空间条形码化的检测探针。
[0347]
适当地，可以使用包括在每种检测探针或根分子中的扩增区通过酶促过程来扩增一种或多种空间条形码化的检测探针或根分子。适当地，这种扩增可以在空间条形码化的检测探针或根分子仍嵌入组织中时发生，或者在如上所述提取它们之后发生。在一个实施方案中，通过rna转录进行扩增，在一个实施方案中，用于扩增的酶是t7 rna聚合酶。替代地，可以通过任何其他已知的扩增过程进行扩增，例如滚环扩增。适当地在这样的实施方案中，空间条形码化的检测探针首先被环化，适当地通过端粒酶，适当地通过teln聚合酶。适当地，然后扩增环化的空间条形码化的检测探针，适当地通过链置换聚合酶，适当地通过phi29 dna聚合酶。
[0348]
适当地，扩增过程产生每个空间条形码化的检测探针或根分子的多个拷贝，复制检测探针或根分子和空间条形码的序列。在一个实施方案中，这样的拷贝是rna分子。
[0349]
因此，适当地，制备用于测序的一种或多种空间条形码化的检测探针或根分子可以包括：向所述空间条形码化的检测探针或根分子或每种空间条形码化的检测探针或根分子添加修饰剂，将所述空间条形码化的检测探针或根分子或每种空间条形码化的检测探针或根分子转录成rna，分离所述空间条形码化的检测探针或根分子rna或每种空间条形码化的检测探针或根分子rna，将所述空间条形码化的检测探针或根分子rna或每种空间条形码化的检测探针或根分子rna逆转录成dna，并扩增所述逆转录的空间条形码化的检测探针或空间条形码化的根分子dna或每种逆转录的空间条形码化的检测探针或空间条形码化的根分子dna。
[0350]
适当地，在逆转录之后，空间条形码化的检测探针或空间条形码化的根分子形成用于测序的测序文库。
[0351]
系统
[0352]
本发明进一步提供了一种集成系统来执行本文所述的空间条形码化的方法。
[0353]
所述集成系统包含：
[0354]
·
用于观察基底的仪器；
[0355]
·
用于照射基底的一个或多个位置的光源；
[0356]
·
用于将一个或多个索引序列和试剂递送到基底的微流体回路；
[0357]
·
用于执行可操作的软件以控制显微镜、光源和微流体回路的处理器。
[0358]
在一个实施方案中，所述基底是组织，如上所述。在一个实施方案中，所述系统用于对一种或多种检测探针和/或一种或多种根分子进行空间条形码化，和/或对一种或多种标志物进行空间条形码化。适当地，在一个或多个目的领域中。适当地，在组织样品的一个或多个目的区域中。适当地，所述仪器用于观察基底。适当地，所述仪器用于观察组织样品。合适的组织样品在本文别处描述。适当地，所述仪器进一步用于引导照射，适当地用于引导来自光源的照射，适当地引导到基底上。
[0359]
在一个实施方案中，所述仪器可以是显微镜。
[0360]
适当地，显微镜是光学显微镜。适当地，显微镜可以具有低放大率。适当地，显微镜可以具有衍射极限分辨率或更高。适当地，显微镜可以具有200nm或更高的分辨率。适当地，显微镜可以具有300nm或更高的分辨率。
[0361]
适当地，显微镜设计可以是本领域已知的任何设计，包括商业仪器，只要这可以与本文所述的光源、照射路径和流体系统一起工作。
[0362]
适当地，显微镜可以包含与要使用的照射相容的物镜，适当地与红外光、可见光或紫外光兼容。适当地，显微镜与将用于如本文别处所述的光裂解的光的波长相容。
[0363]
适当地，显微镜系统可以包含由软件控制的机动载物台。适当地，显微镜可以包含由软件控制的机动聚焦转台。适当地，显微镜可以包含自动闭环聚焦系统以跟踪要通过本发明的方法处理的基底。
[0364]
适当地，显微镜可以包含光源。
[0365]
适当地，光源可以产生如本文别处所述的照射(在“照射”部分中)。适当地，光源是灯、激光器或led。在一个实施方案中，激光器可以是高功率激光器。
[0366]
适当地，照射可以指向每个目的位置或区域。适当地通过使用折射或反射光学系统。适当地，折射或反射光学系统可以具有衍射极限分辨率或更高。适当地，显微镜可以具有200nm或更高的分辨率。适当地，光学系统可以包含在显微镜中，例如本领域中描述的任何显微镜。适当地，光学系统包括将照射引导至所述目的位置或区域或每个目的位置或区域的元件。适当地，光学系统包括将来自光源的照射引导至所述目的位置或区域或每个目的位置或区域的元件。
[0367]
在一些实施方案中，所述元件是可移动反射镜，例如电流计反射镜。在一些实施方案中，所述元件是数字微镜器件(dmd芯片)。在一些实施方案中，所述元件是空间光调制器。
[0368]
适当地，光学系统可以进一步包括诸如扩束器、对准镜和光强调节器的元件。
[0369]
适当地，处理器执行可操作的软件以：
[0370]
(i)对组织进行图像处理；
[0371]
(ii)将空间条形码分配给基底或组织的每个选定的目的位置或区域；
[0372]
(iii)控制选定的目的位置或区域的照射；和/或
[0373]
(iv)通过微流体回路控制流体流动。
[0374]
适当地，处理器执行可操作的软件以执行系统的所有功能。适当地，处理器执行可操作的软件以执行功能(i)至(iv)中的每一个。
[0375]
适当地，所述软件可操作以进行组织的图像的图像处理。适当地，使用显微镜和照相机获得组织的图像。适当地，图像处理可以包括以下步骤中的一个或多个：预处理、局部阈值、像素分类、分水岭分割和对象分类。适当地，图像的图像处理允许用户更容易地从图像中选择一个或多个目的区域，尤其是当所述图像是组织时。适当地，图像的图像处理允许用户更容易地从图像中选择一个或多个目的区域，例如生物特征、细胞的集合、单细胞或亚细胞区室。
[0376]
适当地，微流体回路输送流体通过所述系统。适当地，微流体回路输送试剂和索引序列通过所述系统。适当地，微流体回路输送试剂和索引序列通过所述系统以接触组织。因此，适当地，微流体回路用于将试剂和索引序列输送到组织。
[0377]
适当地，微流体回路可以包括通道。适当地，所述通道将索引序列和试剂递送到组织。适当地，所述通道与组织流体连通。
[0378]
适当地，微流体回路包括储存室。适当地，储存室用于储存索引序列和试剂。适当地，微流体回路进一步包括将储存室连接到组织的通道。适当地，所述通道与储存室流体连通。
[0379]
适当地，微流体回路可以进一步包括流动池。适当地，所述流动池包括组织。适当地，所述流动池可以包括用于组织的支架或平台，适当地，所述平台可以如上所述被机动化。适当地，所述流动池可以位于显微镜的视野内。适当地，所述通道与流动池流体连通。适当地，所述通道与流动池和储存室流体连通。
[0380]
适当地，试剂和/或索引序列可以通过微流体回路的通道从储存室流到组织/基底。
[0381]
适当地，微流体回路可以进一步包括出口以允许废试剂和索引序列离开所述系统。适当地，微流体回路可以进一步包括阀门以控制流体通过所述回路的运动。适当地，阀门和出口也可以由处理器控制。
附图说明
[0382]
现在将参考以下附图描述本发明的进一步特征和实施方案，其中：
[0383]
图1显示：本发明系统的实施方案的示意图。该系统包括显微镜主体，其可以包括低倍物镜、机动载物台和机动聚焦；连接到多个用于索引分子、试剂、缓冲液和连接酶的储器的流体回路，放置样本的流动池，包含紫外、可见或红外光谱中的高功率led或激光器的光源，用于将来自光源的光引导到显微镜中的光学路径，以及用于产生图案化的照射的光束形成器(即数字微镜设备)。系统的所有组件均由执行集成控制软件的计算机控制；
[0384]
图2显示：本发明方法的实施方案的流程图。该过程包括对样本进行成像、通过自动分割识别单个目的区域、选择目的区域的子集进行空间条形码化、将单个空间条形码分配给每个目的区域以及循环的空间条形码化过程，其中1)将照射应用于某些目的区域以释放光可裂解基团，使其中包含的dna分子与连接酶的延伸相容，2)在样品上流动索引，3)使用酶促过程将酶连接到被照射的目的区域中的dna分子，4)洗涤并重复；
[0385]
图3显示：寡核苷酸上的光可裂解5’封闭(block)的实施方案的结构。光可裂解基团通过uv或紫外光范围(340nm至410nm)的照射释放，并在寡核苷酸上产生可接近的5’磷酸基团，其可通过连接被靶向。光可裂解基团可以在与受保护的磷酸基团相反的一侧连接到荧光团基团或连接到另一个核苷酸。这允许通过荧光显微镜检测5’封闭及其释放；
[0386]
图4显示：光触发的连接的概念证明。用不同强度和波长的光辐照具有光裂解5’端的75bp双链寡核苷酸(其中光可裂解基团用荧光团标记)，并与第二较短寡核苷酸(20bp)和t4连接酶一起孵育。在所有经辐照的样品中，光笼被完全去除(参见cy3荧光的丢失)，两个寡核苷酸被连接，产生了一个95bp的新种类。泳道1-7中的高分子量条带对应于仍然与连接酶结合的两个寡核苷酸(这会影响它们的电泳迁移率)；
[0387]
图5显示：将索引分子连接到与固体表面(载玻片)连接的检测探针的概念证明。示意图(a)表示实验期间发生的过程。检测探针(bali探针)的5’处的光可裂解基团通过照射裂解，并与索引连接。在这种情况下，光可裂解基团用cy3荧光染料标记，而索引用cy5荧光
染料标记。底部的图像表示：(b)第一行：应用照射后样本表面的荧光图像，以在具有“1”和“2”数字的形状的两个目的区域中裂解光可裂解基团。“1”区域辐照2分钟，“2”区域辐照5分钟。cy3信号在辐照区域中以与辐照时间成比例的方式降低，表明光可裂解基团的去除。没有cy5信号。(c)连接cy5标记的索引和初始洗涤未连接的索引后的荧光图像。辐照区域现在对cy5信号呈阳性，而未辐照区域显示一些背景信号，表明一定数量的非特异性结合的索引。(d)延长洗涤后同一样品的荧光图像。未辐照区域中的cy5信号现在恢复到连接前的值，表明除辐照区域外的所有区域均已去除索引，其中索引已被添加到不断增长的空间条形码中。每个图像右侧的图对应于虚线上cy5图像的强度分布；
[0388]
图6显示：通过索引连接和dna桥连接的两个循环的固体表面上的空间条形码化的概念证明。顶部的示意图(a)表示实验期间发生的过程。检测探针(bali探针)连接到带有用alexa 488荧光团(青色)标记的光可裂解基团的dna桥分子上。光可裂解基团通过照射裂解，并连接带有用cy5荧光团(紫色)标记的第二光可裂解基团的第一索引。第二光可裂解基团再次通过照射去除，并连接用atto 568标记的第三索引(黄色)。底部上的图像(b)显示了第一个光释放步骤后、第一索引连接后和第二索引连接后的载玻片表面。在左侧图像中可以看到alexa 488信号(青色)降低的两个区域，其对应于dna桥分子上失去第一光可裂解基团的区域。在中间图像中，两个区域都显示cy5信号(粉红色)，表明第一索引连接成功。在右侧图像中，最左侧区域显示由于第二光可裂解基团的去除而降低的cy5信号，并显示atto568信号(黄色)，表明第二索引连接成功；
[0389]
图7显示：细胞上索引连接的光控概念证明。顶部的示意图(a)表示实验期间发生的过程。检测探针(bali探针)的5’处的光可裂解基团通过照射裂解，并连接索引。在这种情况下，光可裂解基团用cy3荧光染料标记，而索引用cy5荧光染料标记。下图(b)对应于标记的索引连接后在荧光显微镜上收集的cy5通道(红色)图像。目的区域的形状(“1”)可以看作是cy5信号增强的区域。在图像的左上角可以看到红色光晕，对应于647nm激光在盖玻片表面的反射(不是真实信号)；
[0390]
图8显示：通过比较不同的索引突出端序列和长度来优化索引序列，以最大限度地提高连接效率并最大限度地减少条形码之间的串扰。顶部的示意图(a)描述了实验期间发生的过程：第一dna双链体(对应于检测探针、桥dna分子或根dna分子的最后部分或对应于索引)与表示索引序列的第二dna双链体连接。每个双链体是通过12nt和18-19nt dna寡核苷酸的退火产生的。两种分子的5’突出端在实验中的不同泳道之间是不同的。有四个突出端序列，命名为a-d。序列a的突出端与序列b的突出端互补，序列c的突出端与序列d的突出端互补。此外，每个突出端可以有两种不同的长度6nt或7nt。含有不同突出端组合的dna双链体混合并通过t4连接酶连接。底部的图像对应于非变性琼脂糖凝胶，其中分子种类由连接反应产生。泳道上样如下：gel 1(b)：1：dna长度ladder，2：突出端a+b，均为6nt，3：突出端a+b，均为7nt，4：突出端c+d，均为6nt，5：突出端c+d，均为7nt，6：突出端a6nt+b7nt，7：突出端a7nt+b6nt，8：突出端c6nt+d7nt，9：突出端c7nt+d6nt，10：dna长度ladder，gel 2(c)：1：dna长度ladder，2：突出端a6nt+d7nt，3：突出端a7nt+d6nt，4：突出端c6nt+b7nt，5：突出端c7nt+b6nt，6：突出端a+d，均为6nt，7：突出端a+d，均为7nt，8：突出端c+b，均为6nt，9：突出端c+b，均为7nt，10：dna长度ladder。条带在～30bp(连接的双链体，30或31bp)、～20bp(非连接的双链体，19或20bp，有突出端)和低于10nt(单链dna种类，低于相应的dsdna条带)可
见。有时不存在未连接的双链体条带，因为凝胶运行的条件(特别是温度)在某些情况下可能会导致其变性。仅当突出端的长度和序列都相容时，才会出现与连接的双链体相对应的条带，这表明不同突出端之间没有串扰。连接效率在80％/90％范围内；
[0391]
图9显示：使用实施例5中测试的优化的索引分子设计，通过顺序连接结合到固体表面(磁珠)的检测探针上的索引分子产生空间条形码的概念证明。两个循环使用没有光可裂解基团的索引。该图像表示变性tbe-尿素聚丙烯酰胺凝胶，根据表6在其上上样了不同的样品。对于样品1-7，凝胶上上样的材料是由与空间条形码连接的检测探针的t7转录产生的rna。检测证明长度为100nt，单独检测探针产生的rna为70nt。每个索引向分子增加约20nt。因此，未延伸的检测探针的预期rna长度为70nt，检测探针+1个索引的预期rna长度为90nt，检测探针+2个索引的预期rna长度为110nt。100nt bali_26寡核苷酸上样在倒数第二个泳道中以供尺寸参考。第一个和最后一个泳道上样有dna大小ladder。
[0392]
图10显示：涉及检测探针的本发明的空间条形码化方法中包含的各种选项的示意图；(a)显示检测探针与目的核酸结合的典型空间条形码化方法，其中检测探针包含3’端的结合区、种类条形码和5’端的光可裂解基团；(b)进一步包括预扩增步骤的空间条形码化方法，其中在与检测探针结合之前通过滚环扩增从目的核酸产生扩增产物；(c)使用包含第一部分和第二部分的分裂检测探针的空间条形码化方法，所述第一部分和第二部分均与目的核酸结合并彼此退火以形成完整的检测探针；(d)其中检测探针与目的核酸的polya区结合的空间条形码化方法，通常用于转录组分析，所述方法包括通过在3’端进行逆转录来延长检测探针以形成包含与目的转录物互补的序列的检测探针的步骤。
[0393]
图11显示：在凝胶珠上执行循环条形码化以产生长度为1至7位的空间索引的实验结果(实施例7)。(a)实验方案：用荧光基团修饰的双链dna根分子连接到琼脂糖珠上，并通过使用不同索引序列和两个交替的连接突出端的数个连接循环进行延伸。(b)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的实验结果。泳道1是dna长度标记(marker)，泳道2是1次连接循环后的分子，泳道3-8 2-7次是连接循环后的分子，泳道9-12是单独增加用于通过密度测定法定量分子丰度的根分子的浓度。(c)左：1-7个循环后的累积连接效率的估计，被定义为完全延伸的根分子占实验中存在的总根分子的分数。右：每个连接步骤的每个循环连接效率的估计，被定义为该循环的延伸的根分子占至少延伸到被测量前一个步骤的根分子总量的分数。第一个循环的效率较低，可能是由于凝胶珠的空间位阻。
[0394]
图12显示：在与实施例7中描述的条件相似的条件下比较不同索引序列的连接效率的实验结果(实施例8)。具体地，测试不同序列在延长空间条形码的位置2的连接，为了避免由于图11所示的凝胶珠的空间位阻而导致效率降低。(a)显示了根分子(约70个核苷酸)和每个索引序列的连接产物(超过100个核苷酸)的聚丙烯酰胺凝胶电泳。序列id在实施例8中进行了描述。每个凝胶还包括数个泳道，这些泳道上样了用于校准密度测定法定量的增加浓度的根寡核苷酸。(b)每个索引序列的连接效率的估计，通过索引序列7(实施例8中的条形码7)的效率标准化，索引序列7被选择作为参照。效率被计算为延长的根分子(超过100个核苷酸)的丰度与实验中使用的根分子的总丰度之间的比率。
[0395]
图13显示：旨在使用本发明的方法和illumina dna测序作为定量工具测量培养的细胞中基因表达的概念验证实验(实施例9)的结果。对于该实验，我们使用了一组检测探针，其靶向两个基因，即绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，它们在两个独立的细胞群体中表
达。每个群体都用不同的索引序列进行条形码化。在测序后通过匹配由本发明的方法分配的空间条形码对这两个群体进行去卷积，并定量靶向每个基因的检测探针的丰度。在一个成功的实验中，实验测得的基因丰度应该与每个细胞群体中表达的荧光基因相对应。(a)实验方案，(b)用于计算结果的计算分析路线。(c)左：映射到每个空间条形码(“gfp群体”或“rfp群体”)的读段的分数，检测到由gfp或rfp细胞产生的文库中。基本上所有读段都带有正确的空间条形码。右：针对每个细胞群体中的gfp和rfp检测探针测量的基因丰度。gfp检测探针主要在gfp群体中检测到，反之亦然，表明该方案可以检测基因表达。rfp的检测证明在gfp群体中，反之亦然，这是由于检测探针的非特异性结合。
[0396]
图14显示：旨在表明空间条形码化可以成功测量与同一组织的不同区域结合的检测探针的丰度的实验(实施10)的结果(实施例9是在不同的细胞群体上进行的)。该实验使用了一种带有被设计为类似于检测探针的根分子的功能化的水凝胶。使用本发明的方法，对不同大小的区域进行释放并用2位空间条形码进行条形码化。每个空间条形码化的区域中检测探针的丰度通过illumina测序通过映射每个读段中存在的空间条形码来测量。在一个成功的实验中，在每个空间条形码化的区域中测量的根分子的丰度应与区域大小相匹配。(a)实验方案。(b)定量结果。分配给“大”和“小”区域的2位空间条形码是“1a2a”和“1b2b”。该实验正确地测量了更多的1a2a分子。其他组合(“1a2b”和“1b2a”)可能是实验中杂散光产生的自发释放和连接的产物(因为概念验证实验无法在完全避光的条件下进行)。
[0397]
图15显示：旨在展示信号放大方法的实验(实施例11)的结果。在其基因组中带有表达的条形码(因此表达具有条形码序列的mrna转录物)的细胞群体经受“starmap”方案，产生对条形码本身特异的dna多联体。然后根据本发明的方法设计的检测探针与多联体杂交，并通过与带有荧光基团的光笼索引连接来检测。在单独的盖玻片中也通过荧光原位杂交(fish)直接检测多联体。预期的结合模式是细胞核周围的点状染色。顶部：来自直接fish结合的核染色和多联体信号，底部：来自与荧光索引连接的检测探针的核染色和多联体信号。结合模式对应，表明可以将结合探针靶向(并因此执行本发明的方法)在通过诸如starmap的方法产生的扩增的靶标上。
[0398]
实施例
[0399]
使用时方法如下。所有寡核苷酸序列均获自集成dna技术、atdbio或biomers，所有化学品(除非另有说明)均获自sigma-aldrich。
[0400]
术语“笼”或“pc间隔区”通篇是指具有以下结构(式i)的光可裂解间隔区修饰，如图3所示：
[0401][0402]
实施例1
[0403]
通过在2x ssc缓冲液中混合bali_01和bali_02引物至10μm最终浓度，在95℃下孵
育溶液2分钟，然后让它在室温(20℃)下冷却30分钟，产生了一个75np dna双链体，其中荧光5’磷酸封闭覆盖了一个8nt突出端。通过与bali_03和bali_04引物退火的相同程序产生第二个较短的dna双链体。
[0404]
二聚化后立即将较长的双链体分成几个样品，并用不同波长的光辐照(或不辐照)，持续时间增加。辐照是通过强度约为100mw/mm2的准直固态405nm激光器或配备365nm荧光灯泡的紫外交联剂(uvp-cl1000)产生的，样品距离发射器约2cm。
[0405]
辐照后，将2μl双链体(相当于20pmol)与1摩尔当量的较短双链体、10μl neb快速连接酶缓冲液(见下文)和2000u t4连接酶(neb)在20μl反应中混合，置于室温(21℃)下30分钟。连接后，将样品(以及仅包括第一双链体的对照样品)在tris-硼酸盐edta缓冲液中的非变性12％丙烯酰胺凝胶上运行。凝胶使用sybr-gold(thermo fischer scientific)在1x tbs中以1:10000稀释度染色30分钟，并在amersham typhoon成像仪的cy2和cy3通道中成像。背景/校正图像是通过将cy3通道图像除以cy2通道图像来产生的，以便从sybr-gold中去除渗出信号。
[0406]
表1
[0407][0408][0409]
(“笼”是指光可裂解间隔区寡核苷酸修饰，如图3所示，“cy3”是指与分子5’结合的花青3荧光基团)
[0410]
实施例2
[0411]
如下产生用检测探针标记的固体表面：将bali_05寡核苷酸在pbs缓冲液中稀释至1μm最终浓度(每张载玻片250μl)。将10mm bs(peg)9交联剂(pierce)在dmso中的10mm溶液以1:100稀释液添加到混合物中，并将所得溶液使用盖玻片涂抹在涂覆有氨基烷基硅烷(sigma,silane-prep)的载玻片上。将载玻片在湿室中于30℃孵育2小时，用pbs中的0.1％甘氨酸洗涤10分钟，并在pbs中洗涤数次。
[0412]
为了在检测探针上产生双链末端，将bali_06寡核苷酸在2x ssc中稀释至1μm最终浓度，并在载玻片表面上在95℃温度下孵育5分钟，然后在室温下孵育30分钟。载玻片在2x ssc中洗涤3次，每次5'。
[0413]
用双链分子功能化的载玻片在配备30mw 405nm固态激光器、514氩激光线、543nm氦氖激光器和647nm固态激光器的leica sp5共聚焦显微镜上成像。cy3使用514和543nm激光线激发，荧光信号在550-600nm带通滤光器后由pmt捕获。cy5被647nm激光激发，相对荧光信号在660-750nm带通滤光器后由pmt捕获。一旦通过检测最大cy3信号的平面识别到载玻片表面，则通过分别用100％功率的405nm激光照射两个目的区域2分钟和5分钟来产生光释放。光释放后，载玻片在2x ssc中洗涤3次，每次5'。
[0414]
bali_07和bali_08寡核苷酸在2x ssc缓冲液中混合至5μm最终浓度，在95℃下加热5分钟，然后在室温下冷却30分钟。通过混合以下来制备连接溶液：107.5μl超纯水、125μl 2x快速连接混合物(neb)、12.5ul t4连接酶、高浓度(neb)和5μl(最终100um)bali_07/08寡核苷酸。将连接溶液在载玻片上在室温下孵育30分钟，然后在2x ssc中进行3次5'洗涤。
[0415]
在第一系列洗涤后，使用与第一次成像相同的参数再次对载玻片进行成像。成像后，将载玻片在50℃下在0.2x ssc中再洗涤两次，每次10分钟，然后在室温下在0.2x ssc中洗涤一次。然后使用相同的设置对载玻片进行第三次成像。
[0416]
表2
[0417][0418]
(“笼”是指如图3所示的光可裂解间隔区寡核苷酸修饰，“cy3”是指与分子的5’结合的花青3荧光基团，“cy5”是指与分子的5’端结合的花青5荧光基团，“氨基连接臂c6”是指nh2基团)
[0419]
实施例3
[0420]
如下产生用检测探针标记的固体表面：将bali_09寡核苷酸在pbs缓冲液中稀释至1μm最终浓度(每张载玻片250ul)。将10mm bs(peg)9交联剂(pierce)在dmso中的10mm溶液以1:100稀释液添加到混合物中，并将所得溶液使用盖玻片涂抹在涂覆有氨基烷基硅烷(sigma,silane-prep)的载玻片上。将载玻片在湿室中于30℃孵育2小时，用pbs中的0.1％甘氨酸洗涤10分钟，并在pbs中洗涤数次。
[0421]
为了在检测探针上产生双链末端，将bali_09寡核苷酸在杂交缓冲液(在2x ssc中的10％碳酸亚乙酯)中稀释至1μm最终浓度，并在室温下在载玻片表面上孵育15分钟，然后
在室温下在杂交溶液中进行两次5'洗涤，在室温下在2x ssc中洗涤三次。
[0422]
与载玻片结合的检测探针通过带有光可裂解基团和alexa-488荧光团的dna桥分子进行如下延伸：将bali_10和bali_11引物在5x ssc缓冲液中稀释至5μm最终浓度，在95℃下加热5分钟，然后在pcr循环仪上使用-1℃/30”的温度梯度逐渐冷却至30℃。通过混合以下来制备连接溶液：107.5μl超纯水、125ul 2x快速连接混合物(neb)、12.5μl t4连接酶、高浓度(neb)和5μl(最终100μm)bali_10/11寡核苷酸。将连接溶液在载玻片上在室温下孵育30分钟，然后在2x ssc中进行3次5'洗涤。
[0423]
载有由光裂解的dna桥分子延伸的检测探针的载玻片在配备30mw 405nm固态激光器、488和514nm的氩激光线、543nm的氦氖激光器和647nm固态激光器的leica sp5共聚焦显微镜上进行成像。使用488nm激光激发alexa 488，并在510-540nm带通滤光器后由pmt捕获相对荧光信号。atto 568被543nm激光线激发，相对荧光信号在560-600nm带通滤光器后由pmt捕获。cy5被647nm激光激发，相对荧光信号在660-750nm带通滤光器后由pmt管捕获。一旦通过检测最大alexa 488信号的平面识别到载玻片表面，则通过以100％功率的405nm激光照射两个矩形目的区域各5分钟来产生光释放。光释放后，载玻片在2x ssc中洗涤3次，每次5'。
[0424]
对于第一个空间条形码化步骤，如前所述，由bali_12和bali_13引物组成的双链索引是通过将两个寡核苷酸以5μm的最终浓度退火来产生的。如前所述制备第二个连接反应，并在室温下在载玻片上孵育30'。连接后，载玻片在室温下在2x ssc中洗涤3次。如上所述对载玻片进行成像。光被用来在相同的时间和使用上述相同的功率仅在两个条形码化的区域之一上光释放光可裂解基团。
[0425]
对于第二个空间条形码化步骤，如前所述，由bali_13和bali_14引物组成的双链索引是通过将两个寡核苷酸以5μm的最终浓度退火来产生的。如前所述制备第三个连接反应，并在室温下在载玻片上孵育30'。连接后，载玻片在室温下在2x ssc中洗涤3次，在50℃下在0.2x ssc中洗涤3次，每次5'。如上使用相同的设置对载玻片进行第三次成像。
[0426]
表3
[0427][0428][0429]
(“笼”是指如图3所示的光可裂解间隔区寡核苷酸修饰，“atto488”是指与分子的5’结合的atto488绿色荧光基团，“atto565”是指与分子的5’端结合的atto565红色荧光基团，“cy5”是指与分子的5’端结合的花青5荧光基团，“氨基连接臂c6”是指nh2基团，5’phos是指磷酸)
[0430]
实施例4
[0431]
如下产生与检测探针结合的细胞单层：u2os细胞(htb-96)生长直至在直径为40mm的圆形#1.5盖玻片上汇合，所述盖玻片之前涂覆有在pbs中的10mg/ml聚-l-赖氨酸12小时。细胞在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素抗生素的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中生长。实验前，将细胞在pbs中的4％多聚甲醛中在室温下固定15分钟，在室温下洗涤3次，每次5分钟。
[0432]
为了将检测探针与细胞表面交联，将bali_05寡核苷酸在pbs缓冲液中稀释至1μm最终浓度(每张载玻片250μl)。将10mm bs(peg)9交联剂(pierce)在dmso中的1:100稀释液添加到混合物中，并将所得溶液涂抹在含有细胞的盖玻片上。将载玻片在室温(21℃)下孵育12小时，用pbs中的0.1％甘氨酸洗涤10分钟，然后在2x ssc中洗涤两次，每次5分钟。
[0433]
为了在检测探针上产生双链末端，将bali_06寡核苷酸在杂交缓冲液(2x ssc中的10％碳酸亚乙酯)中稀释至1μm最终浓度，并在室温下在载玻片表面上孵育15分钟，然后在室温下在杂交溶液中进行两次5'洗涤，在室温下在2x ssc中洗涤三次。
[0434]
用双链分子功能化的载玻片在配备30mw 405nm固态激光器、514氩激光线、543nm氦氖激光器和647nm固态激光器的leica sp5共聚焦显微镜上成像。cy3使用514和543nm激光线激发，荧光信号在550-600nm带通滤光器后由pmt捕获。cy5被647nm激光激发，相对荧光信号在660-750nm带通滤光器后由pmt捕获。一旦通过检测最大cy3信号的平面识别到载玻片表面，则通过用100％功率的405nm激光照射目的区域5分钟来产生光释放。光释放后，载玻片在2x ssc中洗涤3次，每次5'。
[0435]
bali_07和bali_08寡核苷酸在2x ssc缓冲液中混合至5μm最终浓度，在95℃下加热5分钟，然后在室温下冷却30分钟。通过混合以下来制备连接溶液：107.5μl超纯水、125ul 2x快速连接混合物(neb)、12.5ul t4连接酶、高浓度(neb)和5μl(最终100um)bali_07/08寡核苷酸。将连接溶液在载玻片上在室温下孵育30分钟，然后在2x ssc中进行3次5'洗涤。
[0436]
在第一系列洗涤后，使用与第一次成像相同的参数再次对载玻片进行成像，仅在cy5通道中。
[0437]
实施例5
[0438]
通过对以下寡核苷酸中的每一个进行退火来产生两个索引分子：
[0439]
表4
[0440]
[0441][0442]
使用bali_025寡核苷酸：
[0443][0444]
在每种情况下，将正向和反向寡核苷酸在te缓冲液中稀释至5μm最终浓度，在95℃下孵育5分钟，然后在pcr循环仪中使用-1c/30秒的温度梯度冷却至25℃。
[0445]
通过混合以下来制备连接混合物：7μl超纯水、10μl 2x快速连接混合物(neb)、1μl t4连接酶、高浓度(neb)和待测试的两种索引分子各1μl(最终浓度200nm)
[0446]
反应在室温下孵育30分钟。然后将样品在上样缓冲液中稀释并在非变性丙烯酰胺凝胶上运行。凝胶使用sybr-gold(thermo fischer scientific)在1x tbs中以1:10000稀释度染色30分钟，并在amersham typhoon成像仪的cy2通道中成像。
[0447]
实施例6
[0448]
如下用检测探针对磁珠进行功能化。根据供应商的说明，使用ge生命科学illustra microspin g-25柱对bali_26寡核苷酸进行脱盐。50μl 100μm寡核苷酸用于脱盐。将200μl dynabeads m270羧酸(thermo scientific)在25mm mes缓冲液(ph 4.7)中洗涤两次，然后重新悬浮在50μl 100mm mes缓冲液(ph 4.7)中。用30μl脱盐的bali_26寡核苷酸和20μl超纯水补充珠浆。将该混合物(100μl)添加到100ul 25mm mes缓冲液(ph 4.7)中，其中1mg edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)已预先重悬。反应在管旋转器上在4℃下孵育12小时，将珠子在50mm tris ph 7.4+0.1％tween 20中洗涤4次，每次5'，
以淬灭反应。
[0449]
bali_26寡核苷酸编码以“a”突出端(6nt)结尾的检测探针。
[0450]
为了在检测探针末端产生双链分子，将140μl功能化的珠子重新悬浮在2x ssc中，并补充14μl 100um bali_10寡核苷酸(参见上面的实施例)。将所得混合物在95℃下孵育5分钟并在旋转器上冷却至室温30分钟。
[0451]
通过退火下面指定的寡核苷酸来产生不同的索引分子。在每种情况下，通过在te缓冲液中以5um的最终浓度混合寡核苷酸，将它们加热至95℃5分钟，然后在温度梯度为-1℃/30秒的pcr循环仪中将它们冷却至25℃，从而使寡核苷酸退火。
[0452]
表5
[0453]
[0454][0455]
具有退火的bali_10寡核苷酸的功能化的珠子被捕获在磁性管架上并重新悬浮在包含以下的连接溶液中：8μl超纯水、10μl 2x快速连接混合物(neb)、1μl t4连接酶、高浓度(neb)和按照上述方案的1μl 5μm退火的寡核苷酸(最终100nm)。组合第七个反应作为阴性对照，没有任何索引分子。每个反应在室温下旋转孵育30分钟。
[0456]
在第一次连接反应后，珠子在2x ssc中洗涤3次，每次5'。
[0457]
然后根据以下方案为样品5和6组合第二个连接混合物。
[0458]
表7
[0459][0460]
如上所示组合连接反应并旋转孵育相同时间。连接后，将珠子在2x ssc中洗涤3次，每次5'。
[0461]
在对样品5和6进行第二次连接后，所有七个样品都使用t7rna体外转录进行信号放大。对于每个样品，使用磁性管架捕获珠子并重新悬浮在100μl补充有1μm最终浓度的t7启动子寡核苷酸的杂交缓冲液(2x ssc中的10％碳酸亚乙酯)中。将珠子在该溶液中在室温下旋转孵育30分钟并在杂交溶液中洗涤3次，每次5分钟。
[0462]
最后一次洗涤后，将每个样品的珠子重新悬浮在50μl包含以下的t7转录溶液中：10μl 5x转录缓冲液(promega)、2μl rnaseout核酸酶抑制剂(thermo fisher)、2μl t7聚合酶(promega)、5μl 100mm dtt、10μl 2.5mm ntp混合物和21μl超纯水。将反应在37℃下振荡孵育3小时。
[0463]
反应后，使用磁性管架固定每个样品的珠子，收集包含连接到空间条形码的扩增的检测探针的上清液，与2x变性rna上样缓冲液混合，并在15％tbe-urea聚丙烯酰胺凝胶上运行。
[0464]
表8
[0465][0466]
(“氨基连接臂c6”是指nh2基团)
[0467]
实施例7
[0468]
固体凝胶珠上的循环条形码化。
[0469]
表9
[0470][0471]
(“cy5”是指花青5荧光基团)
[0472]
该方案模拟了在检测探针上产生空间条形码的过程。带有荧光团的双链dna根分子连接在琼脂糖凝胶珠上，该凝胶珠具有与原位标记方案期间产生的凝胶的机械特性相兼容的机械特性。然后使用不同的索引序列进行多个连接循环。每个连接步骤的效率通过变性丙烯酰胺电泳上的光密度测定法测量。
[0473]
通过将nhs修饰的琼脂糖珠(ge healthcare)与最终浓度为25um的bali_31寡核苷酸在50mm硼酸钠缓冲液(ph 8.5)中在室温下反应4小时来制备寡核苷酸修饰的琼脂糖珠。通过添加1/5体积的1m tris-hcl ph 8来停止反应，然后在tris-edta缓冲液(100mm tris-hcl ph 8,2.5mm edta)中洗涤数次。对于每次洗涤，通过对珠子离心来使其沉淀。
[0474]
寡核苷酸bali_32、bali_34和bali_35通过在由200um atp、1x pnk反应缓冲液(neb)和10u t4多核苷酸激酶(neb)组成的反应缓冲液中以10um的浓度在37℃下孵育30分钟而被磷酸化，并通过g25琼脂糖离心柱(illustra microspin)纯化。在此之后，通过将寡核苷酸bali_33和bali_34以及寡核苷酸bali_35和bali_36以5um的最终浓度混合在tris-edta缓冲液(te)中进行退火，在95℃下加热2分钟，然后冷却至室温30分钟。
[0475]
通过在室温下在补充有1um最终浓度的根寡核苷酸的杂交缓冲液(10％碳酸乙烯酯，2x ssc)中孵育寡核苷酸缀合的琼脂糖珠(每个样品20ul 25％珠浆)30分钟，使其与根寡核苷酸bali_32杂交。在此之后，将珠子在杂交缓冲液中洗涤3次，每次10分钟，在2x ssc中洗涤3次，每次5分钟。
[0476]
通过在室温下在20ul由1x t4连接酶缓冲液(neb)、0.75um退火的寡核苷酸bali_33和bali_34以及100/ul u t4 dna连接酶(neb)组成的反应缓冲液中孵育珠子样品30分钟
来进行第一个连接循环。连接后，样品在2x ssc中洗涤两次，每次5分钟。在此之后，如上所述进行更多个连接循环(总共最多七个)，退火的寡核苷酸bali_35/36和bali 33/34交替。
[0477]
通过在2x ssc中洗涤珠子样品两次，每次5分钟，将它们重新悬浮在20ul2x ssc中，并加入20ul 2x变性rna上样缓冲液(95％甲酰胺、5％tbe、10mg/ml溴酚蓝)来纯化最终连接的产物。将样品在95℃下加热5分钟，快速旋转成丸粒，收集上清液并上样到8％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。比较经过一、二、三、四、五、六或七次连接循环的珠子，并在凝胶成像后通过光密度测定法定量，测量连接效率。结果如图11所示。
[0478]
实施例8
[0479]
不同索引序列的连接效率的比较。
[0480]
表10
[0481]
[0482][0483]
该实验旨在比较20对不同空间索引的相对连接效率。该实验是通过连接每对寡核苷酸在不断增长的空间条形码的位置“2”中形成条形码来进行的。用于连接的突出端序列对于所有条形码都是相同的，并且对应于用于寡核苷酸bali_35和bali_36的突出端序列。
[0484]
使用与上述“固体凝胶珠上的循环条形码”相同的方案在珠子上进行连接。与bali_31缀合并与bali_32杂交的琼脂糖珠首先与退火的寡核苷酸bali_33/34连接，然后(对于第二个循环)与对应于每个条形码的一对退火的寡核苷酸(即条形码1的bali_37/38)连接。在第二次连接之后，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品并通过如上所述的光密度测定法进行定量，并且测量每个条形码的第二次连接循环的连接效率。结果如图12所示。
[0485]
实施例9
[0486]
通过bali对细胞进行光依赖性条形码化基因表达测量。
[0487]
在本实验中，将表达绿色荧光蛋白(gfp)或红色荧光蛋白(rfp)的培养细胞铺在两个单独的盖玻片上，并接受我们的光依赖性条形码化和基因表达测量方案。这是通过包含靶向gfp和rfp基因(bali_77到bali_84)的序列的检测探针文库完成的，并使用光以两种不同空间条形码之一对此类探针进行条形码化。空间条形码1用于标记gfp细胞，而空间条形码2用于标记rfp细胞。然后使用illumina测序来测量每个空间条形码化的群体中存在多少靶向gfp/rfp的检测探针。
[0488]
将表达gfp或rfp的4t1小鼠肿瘤细胞在#1.5厚的玻璃盖玻片上培养，所述盖玻片首先用bind-硅烷(ge healthcare)进行功能化，然后在完全培养基(dmem，10％胎牛血清)中用0.01％聚-l-赖氨酸培养过夜。在实验之前，将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，在pbs中洗涤，并在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的0.5％triton x-100中透化10分钟。
[0489]
将检测探针稀释在编码杂交缓冲液(2x ssc缓冲液、30％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、1mg/ml酵母trna、1:100neb鼠核糖核酸酶抑制剂)中，最终浓度为1um，将样品在湿室中在37℃下在所得混合物中稀释48小时。杂交后，样品在编码洗涤缓冲液(2x ssc，30％甲酰胺)中于47℃洗涤两次，每次30分钟，并在2x ssc中在室温下洗涤两次，每次5分钟。
[0490]
通过用80ul脱气的水凝胶缓冲液滴(4％19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺混合物，0.3m nacl，60mm tris-hcl ph 8，0.05％temed，0.05％过硫酸铵)涂覆盖玻片来将薄水凝胶敷在细胞上并在室温下孵育1小时。然后在湿室中于37℃将样品在消化缓冲液(2％sds、50mm tris-hcl ph8、0.5％triton x-100、1:100neb蛋白酶k)中消化过夜。清除后，盖玻片在2x ssc中洗涤3次，每次1小时，然后在二次杂交缓冲液(10％碳酸乙烯酯，2x ssc)中洗涤5分钟，并与bali_85寡核苷酸(10nm最终浓度，在二次杂交缓冲液中稀释)在室温下杂交15分钟。最后，样品在二次杂交缓冲液中洗涤一次，在ssc中洗涤一次，每次5分钟。
[0491]
使用10x物镜和100％激光功率，在配备30mw 405nm激光器的leica sp5共聚焦显微镜上进行检测探针的释放(uncaging)。在每个样品的5个视场(每个约1mm2)上进行5分钟的释放。释放后，通过首先使bali_86和bali_87条形码或bali_88和bali_89条形码退火(通过以5um浓度在5x ssc中稀释它们，在95℃下加热5分钟并缓慢冷却至室温超过30分钟)，将样品与空间条形码1或空间条形码2连接)，然后将它们在由1x neb快速连接缓冲液、100u/ul t4 dna连接酶和100nm退火的空间条形码组成的连接混合物中在室温下孵育30分钟，来将样品与空间条形码1或空间条形码2连接。
[0492]
在连接步骤之后，从盖玻片上刮下包含细胞的水凝胶，转移到1.5ml管中，并在500ul 0.4m nacl中稀释。高速涡旋1h释放dna，通过乙醇沉淀纯化。
[0493]
沉淀的dna(包括条形码化的检测探针)用于通过两轮连续pcr产生illumina测序文库，首先使用bali_90和bali_91引物以及来自neb的q5酶(标准方案)，然后使用illumina通用正向truseq引物和带索引的dna lt反向truseq引物(索引006和012)和neb phusion酶(标准方案)。
[0494]
使用illumina miseq测序仪(配对末端150读段)对文库进行测序，并通过使用python编程语言开发的生物信息学路线进行分析，在另外的图13b中对其进行了简要图解。
[0495]
表11
[0496]
[0497]
[0498][0499]
(“笼”是指如图3所示的光可裂解间隔区修饰，“n”是指a、t、g或c的任意核苷酸)
[0500]
实施例10
[0501]
功能化水凝胶的空间索引和量化能力评估。
[0502]
表12
[0503]
[0504][0505]
(“笼”是指如图3所示的光可裂解间隔区修饰，“丙烯酸酯”是5’丙烯酸酯基团，“cy3”是指与分子的5’结合的花青3荧光基团，“cy5”是指与分子的5’端结合的花青5荧光基团，“n”是指a、t、g或c的任意核苷酸)
[0506]
该实验旨在测量与样品空间区域(在本例中为功能化的水凝胶)结合并通过我们的技术进行空间索引的检测探针的数量是否可以通过测序来测量。检测探针均匀分布在功能化的盖玻片上，两个区域(较大的和较小的)使用不同的2位空间条形码(每个两个索引)进行功能化。然后使用测序来验证分配给“大”区域的条形码是否比分配给“小”区域的条形码更丰富。
[0507]
寡核苷酸功能化的水凝胶如下制备：首先通过将寡核苷酸bali_92和bali_93在2x ssc中混合至15um的最终浓度来使其预退火，加热至95℃2分钟并冷却至室温30分钟，然后在脱气的凝胶缓冲液(4％19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺、0.3m nacl、60mm tris-hcl ph 8)中稀释退火的寡核苷酸至最终浓度为1um。通过在室温下孵育1小时，使用80ul凝胶溶液滴涂覆在bind-盐水(ge healthcare)中功能化的盖玻片。bali_92和bali_93旨在模拟具有退火的稳定剂区域的检测探针。
[0508]
功能化的凝胶首先在2x ssc(室温)中洗涤3次，每次5分钟。然后进行第一次连接以将笼状“桥”分子连接到检测探针。通过在2x ssc中将寡核苷酸bali_94和bali_95混合至最终浓度为5um，加热至95℃2分钟并冷却至室温30分钟，使寡核苷酸bali_94和bali_95退火，然后在包括1x快速连接缓冲液(neb)和100u/ul t4 dna连接酶的连接混合中进一步稀释至最终浓度为500nm。将功能化的盖玻片与连接混合物在室温下孵育30分钟，并在室温下在2x ssc中洗涤3次，每次3分钟。
[0509]
在连接之后，进行去磷酸化反应以去除由光笼基团的自发非特异性释放产生的任何磷酸基团。这通过以下完成：将样品在包括1x cutsmart缓冲液(neb)和0.05u/ul虾碱性磷酸酶的混合物中在37℃下孵育30分钟，然后在室温下在2x ssc中洗涤3次，每次5分钟。
[0510]
然后在配备30mw 405nm激光器的leica sp5共聚焦显微镜上使用10x物镜和100％激光功率对第一个“大”区域进行释放。对20个视场(每个约1mm2)进行5分钟的释放。在此之后，通过将样品在室温下在包含1x快速连接缓冲液(neb)、100u/ul t4 dna连接酶和如上所述退火的500nm寡核苷酸bali_96和bali_97的连接混合物中孵育30分钟来将空间条形码的
第一位连接到该区域。连接后在室温下在2x ssc中洗涤3次，每次5分钟。
[0511]
然后释放第二个“小”区域(如上，4个视场)，然后使用退火的寡核苷酸bali_98和bali_99进行连接并进行另一轮洗涤。
[0512]
然后使用cy5荧光的丢失和cy3荧光的获得作为指导，在显微镜上再次定位第一个“大”区域，并使用相同的参数再次释放，然后与寡核苷酸bali_100和bali_101连接。对于“小”区域也是如此，使用寡核苷酸bali_102和bali_103。在连接/释放步骤之间，样品在室温下在2x ssc中洗涤3次，每次5分钟。
[0513]
完成空间条形码化后，通过在含有130ul超纯水、72ul ntp混合物(来自neb hiscribe t7快速试剂盒)和14.4ul t7 rna聚合酶的转录混合物中孵育样品通过原位rna转录来扩大来自条形码化的检测探针的信号。在37℃下进行转录2小时，然后收集凝胶和转录混合物，用130ul超水稀释，并在0.3m乙酸钠存在下通过乙醇沉淀进行纯化。
[0514]
使用bali_104作为基因特异性引物，根据标准方案使用superscript iii试剂盒(thermo scientific)对回收的rna进行逆转录。然后使用引物bali_105和标准反向索引的truseq lt引物(索引006)在illumina测序文库中转换得到的cdna
[0515]
使用illumina miseq测序仪(配对末端150读段)对文库进行测序，并通过定制的生物信息学路线进行分析，以对每个空间索引组合的丰度进行定量。结果如图14所示。
[0516]
实施例11
[0517]
通过使用针对预扩增的转录物的检测探针来提高信噪比。
[0518]
表13
[0519][0520]
(“n”指a、t、g或c的任意核苷酸，“atto565”指与分子的5’端结合的atto565红色荧光基团)
[0521]
在该实验中，我们展示了针对在靶标rna转录物之上产生的扩增的分子靶向检测
探针的可能性。具体来说，我们正在通过在细胞群体基因组中表达的人工条形码的检测探针的环化之后进行滚环扩增(rca)来产生dna多联体。环化是通过夹板连接(splint ligation)进行的，使用第二探针(在相同表达的条形码上正好位于第一探针的下游)作为稳定剂。该信号放大方案在本领域中是已知的并且在称为“starmap”的技术中进行了描述(参见参考文献pubmed id29930089)。
[0522]
在该实验中，检测探针针对扩增产生的dna多联体上的独特序列。放大技术可用于增加来自检测探针的每个靶标的信号，从而提高检测的信噪比。
[0523]
在该实验中，我们通过与荧光探针(bali_109)直接杂交，然后通过检测探针杂交，然后连接笼状桥分子来检测dna多联体，表明获得了相同的结合模式。
[0524]
将表达人工dna条形码的细胞(4t1_条形码细胞，由我们实验室的合作者提供)在#1.5厚的玻璃盖玻片上培养，所述盖玻片首先用bind-硅烷(ge healthcare)进行功能化，然后在完全培养基(dmem，10％胎牛血清)中用0.01％聚l-赖氨酸培养过夜。制备了两种样品，一种用于通过荧光原位杂交直接检测，一种用于通过检测探针杂交和连接进行检测。
[0525]
实验前，将细胞在4％多聚甲醛中固定10分钟，在pbs中洗涤，并通过在-20℃的甲醇中孵育10分钟来透化。
[0526]
透化后，将样品在补充有0.1％tween 20和0.1u/ul superase rnase抑制剂(thermo scientific)(从现在起：pbstr)的pbs中在室温下洗涤一次5分钟，在杂交缓冲液(2x ssc、10％甲酰胺、1％tween 20、20mm氧钒核糖核酸酶复合物、0.1mg/ml鲑鱼精子dna)中室温下洗涤一次5分钟。将两种杂交探针(bali_106和bali_107)在超纯水中稀释至25um，在95℃下加热2分钟，然后冷却至室温30分钟，然后在杂交缓冲液中进一步稀释至100nm最终浓度。在40℃下进行杂交过夜。
[0527]
第二天，将样品在37℃下在pbstr中洗涤两次，每次20分钟，然后在37℃在1:1的4x ssc/pbstr溶液中洗涤一次20分钟。然后加入连接混合物，其包括40u/ul t4 dna连接酶、0.1u/ul superase rnase抑制剂、1x t4连接酶缓冲液(neb)和0.2mg/ml bsa。连接在室温下进行2小时，然后将样品在pbstr中在室温下洗涤两次，每次5分钟。然后通过将样品在包含0.2u/ul phi29 dna聚合酶、250um dntp、20um氨基烯丙基dutp、0.1u/ul superase rnase抑制剂和1x phi29聚合酶缓冲液(neb)的扩增混合物中在30℃下孵育2小时来进行信号放大。最后，样品在pbstr中在室温下洗涤两次，每次5分钟，在pbs中在室温下洗涤一次5分钟。
[0528]
通过在室温下将样品在pbs中的20mm丙烯酸nhs酯中孵育2小时，然后在室温下在pbs中洗涤两个5分钟，将样品中产生的扩增子用丙烯酸功能化。通过用80ul脱气的水凝胶缓冲液滴(4％19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺混合物，2x ssc，0.05％temed，0.05％过硫酸铵)涂覆盖玻片来将薄水凝胶敷在细胞上并在室温下孵育1小时。然后将样品在37℃的湿室中在消化缓冲液(1％sds，2x ssc，0.2mg/ml neb蛋白酶k)中消化1小时，并在室温下在pbs中洗涤3次，每次5分钟。
[0529]
对于直接fish检测，通过将样品在2x ssc/10％甲酰胺中存在500nm稀释的检测探针(bali_109)的情况下孵育30分钟，然后在室温下在2x ssc中洗涤3次，每次5分钟来检测扩增子。图像是在leica sp5共聚焦显微镜上获得的。
[0530]
为了检测探针结合和连接，将样品在室温下在编码杂交缓冲液(2x ssc，30％甲酰
胺)中孵育5分钟，并与在包括2x ssc缓冲液、30％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、1mg/ml酵母trna和1:100neb鼠核糖核酸酶抑制剂的编码杂交混合物中稀释至最终浓度为225nm的bali_108探针杂交。然后将样品在编码杂交缓冲液中在47℃下洗涤两次，每次30分钟，并在2x ssc中在室温下洗涤一次5分钟。然后进行连接以将笼状荧光“桥”分子连接到检测探针上。通过在2x ssc中将寡核苷酸bali_94和bali_95混合至最终浓度为5um，加热至95℃2分钟并冷却至室温30分钟，使寡核苷酸bali_94和bali_95退火，然后在包括1x快速连接缓冲液(neb)和100u/ul t4 dna连接酶的连接混合物中进一步稀释至最终浓度为500nm。将功能化的盖玻片与连接混合物在室温下孵育30分钟，并在室温下在2x ssc中洗涤3次，每次3分钟。然后将样品成像以在上述相同显微镜上检测笼状检测探针。对于两个成像实验，在syto 16中以0.33um浓度在2x ssc中对细胞核进行复染色10分钟。结果如图15所示。