1.本发明涉及一种选自唾液乳杆菌lmt15-14(保藏号kctc14142bp)和植物乳杆菌lmt19-1(保藏号kctc14141bp)的微生物或其组合或其培养物或提取物以及其用途。
背景技术：
：：2.乳杆菌属细菌为革兰氏阳性、兼性厌氧(facultativeanaerobic)或微需氧(microaerophilic)、杆状、非孢子形成细菌的属(genus)。乳酸杆菌为乳酸菌组的主要部分。在人类中，乳酸杆菌为人体许多部位微生物区系(microbiota)的主要成分，例如消化系统、泌尿系统和生殖系统。3.乳酸杆菌属细菌存在于酸奶等食物。另外，一些乳酸杆菌种具有生理活性，例如抗炎活性。例如，据报道，一些乳酸杆菌对肠易激综合征(irritablebowelsyndrome，ibs)有效。4.另一方面，肥胖是指体内脂肪蓄积过多。众所周知，肥胖会导致脂肪肝、高脂血症、高血糖、动脉硬化和糖尿病等疾病。由于脂肪分化(adipogenesis)导致脂肪细胞数量增加并且脂肪细胞的脂质含量增加，因此出现肥胖。脂肪细胞(adipocyte)在以中性脂肪(甘油三酯(triglycerides))形式合成和储存多余卡路里方面发挥着重要作用，并且作为脂肪分化的结果，脂肪细胞的大小和数量增加，细胞内脂质蓄积加速。5.脂肪肝(fattyliver)是由于肝脏内过多的脂肪蓄积而引起的，通常，当所蓄积的脂肪等于或多于肝脏重量的5％时，就被诊断为脂肪肝。这些脂肪肝可分为由于过度饮酒引起的酒精性脂肪肝和与酒精无关的非酒精性脂肪肝。非酒精性脂肪肝不是一种单一的疾病，而是包括从轻度脂肪肝到慢性肝炎和肝硬化的多种疾病。非酒精性脂肪肝与肥胖、成人型糖尿病和高脂血症等代谢综合征有关，当热量持续摄取过多时，脂肪会在体内脂肪细胞和肝脏中蓄积，所增加的脂肪会分泌各种对肝脏有害的物质，如细胞因子，导致脂肪性肝炎和肝硬化。6.作为栖息在人体肠道的正常微生物群落的主要成员，乳酸杆菌属细菌长期以来被认为对维持健康的消化系统和阴道环境很重要，根据美国公共卫生服务指南(u.s.publichealthserviceguidelines)，目前在美国菌株保藏中心(atcc)保藏的所有乳酸杆菌菌株都被归类为“生物安全1级(bio-safetylevel1)”，其为一种不存在对人类或动物造成疾病的已知风险的水平。7.然而，在现有的研究中，已知乳酸菌具有优异的免疫反应调节效果、抗癌和抗氧化效果，但乳酸杆菌菌株在减少体内脂肪含量或治疗脂肪相关疾病方面的效果尚不清楚。技术实现要素：8.技术问题9.本发明的目的在于提供一种微生物或其组合，其选自具有抑制中性脂肪、促进脂肪氧化、抑制脂肪合成的活性的唾液乳杆菌lmt15-14(保藏号kctc14142bp)和植物乳杆菌lmt19-1(保藏号kctc14141bp)。10.本发明另一目的在于提供一种用于改善肝功能或预防或治疗肥胖相关疾病的药物组合物，其包括所述微生物或其培养物或提取物，或其混合物作为活性成分。11.本发明又一目的在于提供一种用于改善肝功能或预防或改善肥胖相关疾病的食品组合物，其包括所述微生物或其培养物或提取物，或其混合物作为活性成分。12.技术方案13.本发明的一方面提供一种微生物或其组合，其选自由具有抑制中性脂肪、促进脂肪氧化、抑制脂肪合成的活性的唾液乳杆菌lmt15-14(保藏号kctc14142bp)和植物乳杆菌lmt19-1(保藏号kctc14141bp)组成的组中。14.本发明的另一方面提供一种选自由唾液乳杆菌lmt15-14(保藏号kctc14142bp)和植物乳杆菌lmt19-1(保藏号kctc14141bp)组成的组中的微生物或其组合的培养物或提取物。所述提取物可以为微生物或其组合的蛋白质提取物。所述提取物可以为通过对微生物或其组合进行溶菌处理而获得的溶菌物，或者将其离心分离以除去沉淀物后剩余的上清液。15.在所述微生物或其组合或其培养物或提取物中，所述组合可以为将唾液乳杆菌lmt15-14(保藏号kctc14142bp)与植物乳杆菌lmt19-1(保藏号kctc14141bp)以任意重量比混合的。所述混合的比例可以例如为1:0.3至3.0。16.所述微生物或其组合或其培养物或提取物可以具有选自以下的至少一个作用：具有耐酸性、具有耐胆汁酸性、促进氧化的活性、抑制脂肪合成的活性或两个活性兼有、抑制脂肪蓄积或减少所蓄积的脂肪、抑制选自srebp-1c和fas的至少一个基因的表达、促进选自ppar-1α和cpt1的至少一个基因的表达、增加ampk的磷酸化水平、施用于个体时增加血液中脂联素的水平、施用于个体时减少选自体重和体内的脂肪量的至少一个，以及改善肝功能。所述脂肪可以为甘油三酯。17.对于所述耐酸性，当在mrs培养基中在ph2.5和37℃下培养2小时时，存活率可以为至少80％、至少85％、至少90％、80％至90％、80％至95％、85％至90％或者90％至95％。18.对于耐胆汁酸性，当在含有0.3％胆汁酸的mrs培养基中于37℃下培养2小时时，存活率可以为至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、75％至90％、75％至95％、80％至90％、80％至95％、85％至90％或90％至95％。19.所述微生物或其组合或其培养物或提取物可以促进选自ppar-1α和cpt1的至少一个基因的表达。与不存在所述微生物或其组合或其培养物或提取物的情况相比，所述促进可以是指使选自ppar-1α和cpt1的至少一个基因的表达增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少45％、至少50％、至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、10％至100％、20％至100％、30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％或者90％至100％。20.所述微生物或其组合或其培养物或提取物可以抑制选自srebp-1c和fas的至少一个基因的表达。与不存在所述微生物或其组合或其培养物或提取物的情况相比，所述抑制可以是指使选自srebp-1c和fas的至少一个基因的表达减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少45％、至少50％、至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、10％至100％、20％至100％、30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％或者90％至100％。21.所述微生物或其组合或其培养物或提取物可以抑制脂肪的量或其蓄积。与不存在所述微生物或其组合或其培养物或提取物的情况相比，所述抑制可以是指减少脂肪的量或其蓄积至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少45％、至少50％、至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、10％至100％、20％至100％、30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％或者90％至100％。22.当所述微生物或其组合或其培养物或提取物施用于个体时，可以减少选自体重和体内的脂肪组织的量中的至少一个。与不存在所述微生物或其组合或其培养物或提取物的情况相比，所述减少可以是指减少体重和体内的脂肪组织的量中的至少一个至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少45％、至少50％、至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、10％至100％、20％至100％、30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％或者90％至100％。23.当所述微生物或其组合或其培养物或提取物施用于个体时，可以减少甘油三酯水平。与不存在所述微生物或其组合或其培养物或提取物的情况相比，所述减少可以是指基于重量减少甘油三酯水平至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少45％、至少50％、至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、10％至100％、20％至100％、30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％或者90％至100％。24.本发明的另一方面提供一种组合物，其包括选自所述唾液乳杆菌lmt15-14(保藏号kctc14142bp)和植物乳杆菌lmt19-1(保藏号kctc14141bp)的微生物或其组合或其培养物或提取物作为活性成分。25.所述组合物可以具有选自以下的至少一个：具有耐酸性的组合物、具有耐胆汁酸性的组合物、促进氧化的活性的组合物、抑制脂肪合成的活性或两个活性兼有的组合物、抑制脂肪蓄积或减少所蓄积的脂肪的组合物、抑制选自srebp-1c和fas的至少一个基因的表达的组合物、促进选自ppar-1α和cpt1的至少一个基因的表达的组合物、增加ampk的磷酸化水平的组合物、施用于个体时增加血液中脂联素的水平的组合物、施用于个体时减少选自体重和体内的脂肪量的至少一个的组合物，以及改善肝功能的组合物。所述脂肪可以为甘油三酯。26.因此，所述组合物具有耐酸性和耐胆汁酸性，从而可以用于酸性肠内。另外，所述组合物可以用于如下作用中的至少一个：促进氧化、抑制脂肪合成、减少脂肪的量或蓄积或减少所蓄积的脂肪、抑制选自srebp-1c和fas的至少一个基因的表达、促进选自ppar-1α和cpt1的至少一个基因的表达、增加ampk的磷酸化水平、施用于个体以增加血液中脂联素水平、改善肝功能，以及施用于个体以减少选自体重和体内的脂肪的量的至少一个。所述脂肪可以为甘油三酯。27.减少体内的脂肪的量可以包括出于治疗目的而减少。例如，减少体内的脂肪的量可以用于预防或治疗肥胖相关疾病。所述肥胖相关疾病可以选自脂肪肝、2型糖尿病、高脂血症、心血管疾病、动脉硬化症、脂质相关代谢综合征和肥胖中的至少一种。所述脂肪肝可以为非酒精性脂肪肝。所述个体可以为患有或可能患有肥胖相关疾病的动物，其包括人类。28.所述组合物可以为食品或药物组合物，即医药品。所述组合物可以包括食品学上或药学上可接受的载体。29.并且，所述组合物可以在所述组合物中以“食品有效量”或“治疗有效量”包括所述微生物或其组合或其培养物或提取物。在所述组合物中，“治疗有效量”是指当施用于需要治疗的个体时足以显示治疗效果的量。术语“治疗”是指治疗个体，例如包括人类的哺乳动物的疾病或医学症状，例如肥胖症，包括：(a)预防疾病或医学症状的发生，即对患者进行预防性治疗；(b)缓解疾病或医学症状，即引起患者的疾病或医学症状消除或恢复；(c)抑制疾病或医学症状，即减缓或阻止个体的疾病或医学症状的进展；或者(d)减轻个体的疾病或医学症状。本领域技术人员可以适当地选择所述“有效量”。所述“有效量”可以为0.01mg至10000mg、0.1mg至1000mg、1mg至100mg、0.01mg至1000mg、0.01mg至100mg、0.01mg至10mg或0.01mg至1mg。30.所述组合物可以口服施用。因此，可以将所述组合物配制成各种形式，例如片剂、胶囊剂、水性液剂或悬浮剂。对用于口服的片剂而言，通常可以添加诸如乳糖、玉米淀粉之类的赋形剂和诸如硬脂酸镁之类的润滑剂。对用于口服的胶囊剂而言，乳糖和/或干玉米淀粉可以用作稀释剂。当需要用于口服的水性悬浮剂时，活性成分可以与乳化剂和/或助悬浮化剂组合。如果需要，可以添加特定甜味剂和/或矫味剂。31.本发明的另一方面提供一种减少肝脏或脂肪细胞中脂肪含量的方法，其包括：将选自唾液乳杆菌lmt15-14(保藏号kctc14142bp)和植物乳杆菌lmt19-1(保藏号kctc14141bp)的微生物或其组合或其培养物或提取物与肝脏或脂肪细胞接触。32.在所述方法中，所述接触可以是指在含有肝细胞或脂肪细胞的培养基中培养微生物或其组合或其培养物或提取物。所述方法可以为体外或体内方法。33.本发明的另一方面提供一种减少个体的脂肪含量或改善肝功能的方法，其包括：向个体施用选自唾液乳杆菌lmt15-14(保藏号kctc14142bp)和植物乳杆菌lmt19-1(保藏号kctc14141bp)的微生物或其组合或其培养物或提取物。34.在所述方法中，本领域技术人员可以根据患者的状况在施用时适当地选择施用途径。所述施用可以为口服的或局部施用。35.在所述方法中，如上所述，施用量根据患者的状况、施用途径、主治医师的判断等各种因素而变化。可以通过从体外实验或动物模型试验获得的剂量反应曲线估计有效剂量。被施用的组合物中存在的本发明化合物的比例和浓度可取决于化学性质、施用途径、治疗剂量等。所述剂量可以每天约1μg/kg至约1g/kg，或每天约0.1mg/kg至约500mg/kg的有效量施用于个体。所述剂量可根据个体的年龄、体重、易感性或症状而改变。36.在所述方法中，所述个体可以为哺乳动物，包括人类。37.有益效果38.根据本发明一方面的微生物或其组合或其培养物或提取物可用于减少脂肪含量或改善肝功能。39.根据本发明另一方面的组合物可用于减少脂肪含量或改善肝功能。40.根据本发明又一方面的方法，可以有效地减少脂肪含量或有效地改善肝功能。附图说明41.图1a和图1b为在由高脂肪饮食诱导脂肪肝的小鼠中施用两种乳酸菌的预防模型(图1a)和治疗模型(图1b)中体重随时间变化图。42.图2a和图2b为在由高脂肪饮食诱导脂肪肝的小鼠中施用两种乳酸菌的预防模型(图2a)和治疗模型(图2b)中肝组织重量和脂质蓄积的变化图。43.图3a和图3b为在由高脂肪饮食诱导脂肪肝的小鼠中施用两种乳酸菌的预防模型(图3a)和治疗模型(图3b)中肝组织内中性脂肪含量的图。44.图4a和图4b为在由高脂肪饮食诱导脂肪肝的小鼠中施用两种乳酸菌的预防模型(图4a)和治疗模型(图4b)中肝组织内ampk活性的图。45.图5a和图5b为在由高脂肪饮食诱导脂肪肝的小鼠中施用两种乳酸菌的预防模型(图5a)和治疗模型(图5b)中肝组织内脂肪氧化相关基因和脂肪合成相关基因的表达量的图。46.图6a和图6b为在由高脂肪饮食诱导脂肪肝的小鼠中施用两种乳酸菌的预防模型(图6a)和治疗模型(图6b)中内脏脂肪组织的重量变化图。47.图7a和图7b为在由高脂肪饮食诱导脂肪肝的小鼠中施用两种乳酸菌的预防模型(图7a)和治疗模型(图7b)中内脏脂肪组织内ampk活性的图。48.图8a和图8b为在由高脂肪饮食诱导脂肪肝的小鼠中施用两种乳酸菌的预防模型(图8a)和治疗模型(图8b)中内脏脂肪组织内脂肪氧化相关基因和脂肪合成相关基因的表达量的图。49.图9a和图9b为在由高脂肪饮食诱导脂肪肝的小鼠中施用两种乳酸菌的预防模型(图9a)和治疗模型(图9b)中血液中脂联素含量的图。具体实施方式50.下面将参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅是为了示例性地描述本发明，而本发明的范围不限于这些实施例。51.实施例1、菌株的分离52.1、菌株的分离53.菌株的分离如下进行：将100g在家直接浸泡的传统发酵食品和未接触过乳酸菌的婴幼儿粪便用无菌水稀释，并用均质器(stomacher)进行均质5分钟。将均质后的样本逐步稀释，铺展在含有溴酚蓝(sigma，美国)的mrs(difco，美国)琼脂平板培养基上，于37℃培养2天至3天，将所出现的菌落按形状和颜色进行区别，再次进行纯分离以获得最终两个菌株。对经纯分离的乳酸菌进行如实施例1.2中的16srdna系统分析以确认每个系统。54.2、16srdna分析55.所选取的乳酸菌分别以27f(seqidno：3)和1492r(seqidno：4)的引物组与各自的lmt15-14和lmt19-1的基因组为模板进行pcr，从而获得16srdna扩增产物。通过测序确认了所述扩增产物的核苷酸序列。其结果，lmt15-14和lmt19-1的16srdna分别具有seqidno：1和seqidno：2的核苷酸序列。另外，使用ncbiblast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析了所述16srdna的核苷酸序列。系统树分析结果，lmt15-14与唾液乳杆菌种相同，lmt19-1与植物乳杆菌种相同。lmt15-14和lmt19-1的16srdna分别与唾液乳杆菌种和植物乳杆菌种具有99.9％和99.9％的序列同源性，因此，lmt15-14和lmt19-1菌株被鉴定为属于唾液乳杆菌种和植物乳杆菌种的新型菌株。这两个菌株分别命名为唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)lmt15-14和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)lmt19-1，并于2020年2月21日，将其保藏在位于韩国生命工学研究院的韩国典型培养物保藏中心(koreancollectionfortypecultures，kctc)，保藏号为kctc14142bp和kctc14141bp。56.实施例2、乳酸菌对由高脂肪饮食诱导非酒精性脂肪肝的c57bl/6j小鼠模型脂肪肝抑制功效的评价57.1、c57bl/6j小鼠的肥胖诱导和乳酸菌处理58.为了评估抑制由高脂肪饮食诱导的脂肪肝的功效，在两种模型，即预防模型和治疗模型中评估了施用乳酸菌时脂肪肝诱导模式。59.实验中使用的动物为由高脂肪饮食诱导肥胖的c57bl/6j小鼠，预防模型为7周龄小鼠(雄性，18g至22g)，治疗模型为4周龄小鼠(雄性，13g至17g)，购自orientbio公司，喂普通饲料(safe，法国)1周以适应环境。然后，在于预防模型中，除正常对照组之外的其余组使用用于口服施用的探针(zonde)每天一次将高脂肪饮食(researchdiet，美国)、阳性对照物质和各自的乳酸菌直接施用到胃中，持续8周以进行比较总共8周后的非酒精性脂肪肝诱导模式。在治疗模型中，由高脂肪饮食诱导非酒精性脂肪肝8周，8周后，使用用于口服施用的探针(zonde)每天一次将高脂肪饮食、阳性对照物质和各自的乳酸菌直接施用到胃中，以进行比较总共16周后的非酒精性脂肪肝诱导模式。组(n＝10)由总共8组组成，如下表1所示。60.【表1】[0061][0062]每周测量一次体重和饮食量，实验期结束后，将实验动物禁食，用二氧化碳气体诱导缺氧和睡眠并实施安乐死。血浆和组织样本储存在-80℃直至使用。[0063]2、由高脂肪饮食诱导非酒精性脂肪肝的c57bl/6j小鼠模型的体重变化的测量[0064]在整个实验期间，每天在一定时间测量实验动物的体重，预防模型的结果如图1a所示，治疗模型的结果如图1b所示。图1示出了在将两种选择的乳酸菌施用于由高脂肪饮食诱导脂肪肝的小鼠时体重随时间的变化。在图1中，横轴表示时间(周)，纵轴表示体重。[0065]如图1所示，在预防模型和治疗模型中，喂食脂肪肝诱导的高脂肪饮食的组体重增加。对于口服施用高脂肪饮食和乳酸菌的组，与对照组相比，预防模型中的唾液乳杆菌lmt15-14减少了7.5％，植物乳杆菌lmt19-1减少了12.1％，而治疗模型中的唾液乳杆菌lmt15-14减少了7.9％，植物乳杆菌lmt19-1减少了5.6％。[0066]3、由高脂肪饮食诱导非酒精性脂肪肝的c57bl/6j小鼠模型的肝组织变化的分析[0067](1)肝组织称重[0068]在使用高脂肪饮食的非酒精性脂肪肝诱导模型中，评估了乳酸菌的施用对脂肪肝改善的效果。在预防模型和治疗模型的实验期结束后，取各组小鼠的肝组织并称重，预防模型的结果如图2a所示，治疗模型的结果如图2b所示。[0069]如图2所示，确认了口服施用高脂肪饮食和乳酸菌的组的肝组织重量，其结果，与对照组相比，预防模型中唾液乳杆菌lmt15-14减少了26.6％，植物乳杆菌lmt19-1减少了24.6％，而治疗模型唾液乳杆菌lmt15-14减少了27.8％，植物乳杆菌lmt19-1减少了24.9％。[0070](2)肝组织中中性脂肪含量的确认[0071]在使用高脂肪饮食的非酒精性脂肪肝诱导模型中，为了确认乳酸菌的施用对脂肪肝改善的效果，确认了肝脏中中性脂肪的含量。将从各组小鼠获得的肝组织样本用5％np-40(biovision，美国)在100℃加热5分钟，在室温下进行冷却，然后重复所述过程3次。重复后，仅获取上清液，使用中性脂肪定量试剂盒(biovision，美国)，用分光光度计测量中性脂肪含量在570nm处的吸光度，预防模型的结果如图3a所示，治疗模型的结果如图3b所示。[0072]如图3所示，确认了口服施用高脂肪饮食和乳酸菌的组的肝脏中中性脂肪的含量，其结果，与对照组相比，预防模型中唾液乳杆菌lmt15-14减少了65.4％，植物乳杆菌lmt19-1减少了68.7％，而治疗模型中唾液乳杆菌lmt15-14减少了54.4％，植物乳杆菌lmt19-1减少了55.5％。经证实，与对照组相比，乳酸菌施用组的肝组织中中性脂肪的含量显着低，预计乳酸菌通过促进肝脏中中性脂肪的分解并抑制其合成来改善非酒精性脂肪肝。[0073](3)肝组织内ampk(amp-activatedproteinkinase)激活的确认[0074]ampk为一种检测细胞中能量状态的蛋白质，在调节与能量代谢相关的肝脏、肌肉和脂肪组织中的糖、脂肪和胆固醇的分解和合成中发挥作用。即，作为一种促进细胞内糖吸收和脂肪氧化的物质，ampk的激活会增加肝组织中的脂质氧化并降低中性脂肪水平。[0075]在使用高脂肪饮食的非酒精性脂肪肝诱导模型中，为了确认乳酸菌的施用对脂肪肝改善的效果，确认了肝脏中ampk的活性程度。即，使用蛋白质提取溶液pro-pre-p(intron，韩国)从每组小鼠的肝组织样本中获得蛋白质。所提取的蛋白质通过bradford测定法(bio-rad，美国)进行定量，然后在sds-聚丙烯酰胺凝胶(invitrogen，美国)上以电泳进行分离，并转移到pvdf膜(polyvinylidenedifluoridemembrane，bio-rad，美国)上。用含有5％bsa的0.1％tbst(trisbufferedsalinewith0.1％tween20)溶液在室温下封闭蛋白转移的pvdf膜1小时，然后在4℃下与一抗即抗p-ampk、抗ampk和抗β-肌动蛋白抗体(1:1000，cellsignaling，美国)反应18小时。反应完成后，用0.1％tbst溶液洗涤，与二抗即抗-兔igghrp-偶联抗体(1:2000，cellsignaling，美国)在室温下反应1小时，然后用0.1％tbst洗涤。洗涤后，与ecl溶液(thermofisherscientific，美国)反应，用chemi-doc(bio-rad，美国)测定。预防模型的结果如图4a所示，治疗模型的结果如图4b所示。[0076]如图4所示，确认了口服施用高脂肪饮食和乳酸菌的组的肝组织中ampl激活，其结果，与对照组相比，预防模型中唾液乳杆菌lmt15-14增加了39.7％的磷酸化ampk，植物乳杆菌lmt19-1增加了42.1％的磷酸化ampk，而治疗模型唾液乳杆菌lmt15-14增加了45.4％的磷酸化ampk，植物乳杆菌lmt19-1增加了66.0％的磷酸化ampk。这启示，随着磷酸化ampk的增加，肝脏中的脂肪氧化激活增加，因此调节脂肪合成，从而可以抑制非酒精性脂肪肝。[0077](4)与肝组织中脂肪氧化和脂肪合成相关的生物标志物基因表达的显着差异确认[0078]为了在使用高脂肪饮食的非酒精性脂肪肝诱导模型中确认乳酸菌施用对脂肪肝的改善效果，使用从各组小鼠获得的肝组织样本，通过实时(realtime)pcr测量肝组织中脂肪氧化相关基因ppar-α和cpt1以及脂肪合成相关基因srebp-1c和fas的表达差异。[0079]即，使用rna提取试剂盒universalrnaextractionkit(bioneer，韩国)从每组小鼠的肝组织样本中提取rna。然后，使用rocketscriptcyclertpremix(bioneer，韩国)获得与rna互补的dna后，使用sybr绿色(takara，日本)和下表2中的引物确认脂肪氧化相关基因(ppar-α和cpt1)和脂肪合成相关基因(srebp-1c和fas)的表达。预防模型的结果如图5a所示，治疗模型的结果如图5b所示。[0080]【表2】[0081][0082]如图5所示，在口服施用高脂肪饮食和乳酸菌的组中，确认了肝组织中脂肪氧化相关基因ppar-α和cpt1的表达量，与对照组相比，预防模型的唾液乳杆菌lmt15-14分别增加了131.3％和438.1％，植物乳杆菌lmt19-1分别增加了163.6％和494.9％，而治疗模型的唾液乳杆菌lmt15-14分别增加了43.5％和102.2％，植物乳杆菌lmt19-1分别增加了44.2％和69.2％。另外，确认了肝组织中脂肪合成相关基因srebp-1c和fas的表达量，与对照组相比，预防模型的唾液乳杆菌lmt15-14分别减少了58.0％和65.8％，植物乳杆菌lmt19-1分别减少了39.2％和57.7％，而治疗模型的唾液乳杆菌lmt15-14分别减少了69.1％和60.1％，植物乳杆菌lmt19-1分别减少了65.7％和60.1％。因此，可以通过在所述乳酸菌施用期间增加脂肪氧化并抑制脂肪合成来抑制脂肪肝。[0083]4、由高脂肪饮食诱导非酒精性脂肪肝的c57bl/6j小鼠模型的内脏脂肪组织变化的分析[0084](1)内脏脂肪组织的称重[0085]正常情况下，80％的肝组织脂肪酸由脂肪组织中的中性脂肪分解为脂肪酸，然后通过循环系统进入肝组织，15％在进食后通过消化系统被吸收，然后通过循环系统进入肝组织，剩下的5％通过肝组织的脂肪从头合成(denovolipogenesis)而新产生。因此，从脂肪组织中脂肪酸进入量的增加与肝组织中过量脂肪肝的形成密切相关。[0086]在使用高脂肪饮食的非酒精性脂肪肝诱导模型中，评估了乳酸菌的施用对内脏脂肪组织抑制的效果。在预防模型和治疗模型的实验期结束后，从各组小鼠中摘出内脏脂肪组织并称重，所述内脏脂肪组织存在于腹侧腹腔内的脂肪，是除皮下脂肪外有机存在于肠道之间的脂肪，预防模型结果如图6a所示，治疗模型结果如图6b所示。[0087]如图6所示，确认了口服施用高脂肪饮食和乳酸菌的组的内脏脂肪组织重量，其结果，与对照组相比，预防模型中唾液乳杆菌lmt15-14减少了27.1％，植物乳杆菌lmt19-1减少了33.9％，而治疗模型唾液乳杆菌lmt15-14减少了33.7％，植物乳杆菌lmt19-1减少了24.6％。[0088](2)内脏脂肪组织中的ampk激活确认[0089]在使用高脂肪饮食的非酒精性脂肪肝诱导模型中，为了确认乳酸菌的施用对内脏脂肪肝改善的效果，确认了内脏脂肪组织中ampk的活性程度。使用从各组小鼠获得的内脏脂肪组织样本，以与所述实施例3.3相同的方法进行实验，预防模型的结果如图7a所示，治疗模型的结果如图7b所示。[0090]如图7所示，确认了口服施用高脂肪饮食和乳酸菌的组的内脏脂肪组织中ampk激活，其结果，与对照组相比，预防模型中唾液乳杆菌lmt15-14的磷酸化ampk增加了73.0％，植物乳杆菌lmt19-1增加了80.8％，而治疗模型唾液乳杆菌lmt15-14增加了44.8％，植物乳杆菌lmt19-1增加了44.9％。这启示，随着磷酸化ampk的增加，脂肪细胞中的脂肪氧化激活增加，从而可以调节脂肪合成，减少脂肪酸进入肝脏。[0091](3)与内脏脂肪组织中脂肪氧化和脂肪合成相关的生物标志物基因表达的显着差异确认[0092]为了确认在使用高脂肪饮食的非酒精性脂肪肝诱导模型中乳酸菌的施用对脂肪肝改善的效果，通过实时pcr测量了内脏脂肪组织中脂肪氧化相关基因ppar-α和cpt1以及脂肪合成相关基因srebp-1c和fas的表达差异。使用从各组小鼠获得的内脏脂肪组织样本，以与所述实施例3.4相同的方法进行实验，预防模型的结果如图8a所示，治疗模型的结果如图8b所示。[0093]如图8a和图8b所示，在口服施用高脂肪饮食和乳酸菌的组中，确认了内脏脂肪组织中脂肪氧化相关基因ppar-α和cpt1的表达量，与对照组相比，预防模型的唾液乳杆菌lmt15-14分别增加了78.8％和86.8％，植物乳杆菌lmt19-1分别增加了76.6％和83.0％，而治疗模型的唾液乳杆菌lmt15-14分别增加了36.9％和112.3％，植物乳杆菌lmt19-1分别增加了41.7％和117.5％。另外，确认了内脏脂肪组织中脂肪合成相关基因srebp-1c和fas的表达量，与对照组相比，预防模型的唾液乳杆菌lmt15-14分别减少了65.5％和59.1％，植物乳杆菌lmt19-1分别减少了80.7％和67.1％，而治疗模型的唾液乳杆菌lmt15-14分别减少了53.4％和53.7％，植物乳杆菌lmt19-1分别减少了59.3％和71.1％。因此，所述乳酸菌可以通过增加脂肪组织的脂肪氧化和抑制脂肪合成来抑制中性脂肪的合成，从而减少脂肪酸进入肝脏内以抑制脂肪肝。[0094]5、由高脂肪饮食诱导非酒精性脂肪肝的c57bl/6j小鼠模型的脂联素的确认[0095]脂联素为一种从脂肪组织分泌的激素，通过影响ampk活性和pparα活性来影响脂肪调节。在肥胖患者中，血液中脂联素的量减少，体脂肪的减少增加脂联素的产生并促进脂肪酸的β-氧化，从而起到抑制脂肪肝的作用。这种脂联素可以用作脂肪蓄积的指标，因为在体脂肪过度蓄积时，其表达量和血中浓度会降低。[0096]为了测量影响脂肪氧化激活的激素即脂联素含量，将从每组小鼠采集的血液样本收集在试管中，并离心分离血清。使用脂联素(adiponectin)(小鼠)elisa试剂盒(adipogeninc，韩国)测量所分离的血清中脂联素的含量，预防模型的结果如图9a所示，治疗模型的结果如图9b所示。[0097]如图9a和图9b所示，确认了口服施用高脂肪饮食和乳酸菌的组的血中脂联素含量，其结果，与对照组相比，预防模型中唾液乳杆菌lmt15-14增加了22.4％，植物乳杆菌lmt19-1增加了26.7％的脂联素，而治疗模型唾液乳杆菌lmt15-14增加了25.6％，植物乳杆菌lmt19-1增加了26.3％。因此，随着脂联素的增加，可以通过增加与脂肪酸的β-氧化相关的ampk的激活来抑制脂肪肝的产生。[0098]实施例3、菌株形态学和发酵特性调查[0099]1、真菌学特性(mycologicalproperties)分析[0100]将对非酒精性脂肪肝有抑制作用的两种乳酸菌即唾液乳杆菌lmt15-14和植物乳杆菌lmt19-1在mrs平板培养基中培养，观察菌落形态，菌落形态如下表3所示。[0101]【表3】[0102]lmt15-14lmt19-1形态圆形圆形尺寸1.5㎜1㎜颜色奶油色奶油色不透明度不透明不透明隆起突出突出表面光滑光滑好氧性生长++厌氧性生长++[0103]2、所选的乳酸菌株的糖发酵特性[0104]根据供应商的实验方法，使用api50chl试剂盒(biomerieux，法国)调查糖发酵特性。下表4显示了唾液乳杆菌lmt15-14和植物乳杆菌lmt19-1的糖发酵特性，这两种乳酸菌可有效抑制非酒精性脂肪肝。[0105]【表4】[0106][0107][0108]实施例7、稳定性[0109]1、乳酸菌的耐酸性调查[0110]为了使乳酸菌在肠道中发挥作为益生菌的功效，摄入后，必须通过较低ph值的胃。为了检查乳酸菌的耐酸性，接种于无菌mrs液体培养基后，在37℃下培养18小时，然后使用氯化氢将ph调节至2.5，将所述乳酸菌接种于无菌mrs液体培养基中，在37℃下培养2小时。回收乳酸菌接种后即刻的样本和培养2小时后的样本，用mrs液体培养基稀释，铺展在mrs平板培养基上，在37℃下培养24小时后，计数平板培养基上的菌落数以测量乳酸菌数，如下表5所示。[0111]【表5】[0112][0113]实施例7、稳定性[0114]1、乳酸菌的耐酸性调查[0115]为了使乳酸菌在肠道中发挥作为益生菌的功效，摄入后，必须通过较低ph值的胃。为了调查乳酸菌的耐酸性，接种于无菌mrs液体培养基后，在37℃下培养18小时，然后使用氯化氢将ph调节至2.5，将所述乳酸菌接种于无菌mrs液体培养基中，在37℃下培养2小时。回收乳酸菌接种后即刻的样本和培养2小时后的样本，用mrs液体培养基稀释，铺展在mrs平板培养基上，在37℃下培养24小时后，计数平板培养基上的菌落数以测量乳酸菌数，如下表6所示。[0116]【表6】[0117][0118]其结果，作为对抑制非酒精性脂肪肝有效的两种乳酸菌，唾液乳杆菌lmt15-14和植物乳杆菌lmt19-1分别为84.4％和97.8％，由此可见，在ph值为2.5时，其在酸性条件下的存活率很高。这些乳酸菌的特点在于，由于可以在接近于胃的生理ph值的低于3的ph值下维持50％或更多的适当数量的乳酸菌，因此即使在胃酸分泌导致的低ph下也可以稳定地维持生菌数，并且可以预期摄取时到肠内的存活率非常高。[0119]2、乳酸菌的耐胆汁性调查[0120]为了检查乳酸菌的耐胆汁性，按照以下方法进行了实验。乳酸菌接种于无菌mrs液体培养基中后，再37℃下培养18小时，考虑到肠道中胆汁酸盐的浓度在0.1(w/v)％左右，将所述乳酸菌接种到含有0.3(w/v)％胆汁酸盐[bilesalts(sigma，美国)]的mrs液体培养基中，分别在37℃下培养2小时。回收乳酸菌接种后即刻的样本和培养2小时后的样本，用mrs液体培养基稀释，铺展在mrs平板培养基上，在37℃下培养24小时后，计数平板培养基上的菌落数以测量乳酸菌数，如下表7所示。[0121]【表7】[0122][0123]其结果，作为对抑制非酒精性脂肪肝有效的两种乳酸菌，唾液乳杆菌lmt15-14和植物乳杆菌lmt19-1分别为0.8％和73.9％，尤其，即使在比与肠道实际浓度相似的0.1％更高的0.3％中，植物乳杆菌lmt19-1维持了50％或更多的适当数量的乳酸菌。因此，其可以作为预测在人体或动物的肠道中能够充分存活并且到肠内的存活率非常高的依据。[0124][0125]当前第1页12当前第1页12