新型化合物以及含有其的用于通过对神经损伤、神经疾病或者发育障碍的神经细胞的增殖促进、分化以及/或者再生进行治疗或者预防的药物组合物

1.本发明涉及新型化合物以及含有其的用于通过对神经损伤、神经疾病或者发育障碍的神经细胞的增殖促进、分化以及/或者再生进行治疗或者预防的药物组合物。


背景技术：

2.神经细胞是包括大脑在内分布在身体的多个地方，身体可以通过神经细胞之间的信号传递，感受外部状况，并思考、反应、做运动。因此，当因某种原因而神经细胞死亡时，可能会显示认知障碍症状、麻痹症状、感觉障碍症状、运动异常症状等之类的各种症状。阿尔茨海默症是因负责大脑内记忆的地方中存在的神经细胞的死亡而产生的，帕金森病是因调节身体运动的部分中存在的神经细胞死亡而显示症状。
3.神经细胞一旦发生死亡，则难以再生。皮肤之类的其他细胞是即便因损伤而细胞发生破坏，其他细胞发生细胞分裂而制造出能够代替该细胞的新的细胞，然而神经细胞与其他细胞不同，不会发生细胞分裂，因此治疗与神经细胞的死亡相关的疾病是非常有难度的。为此，目前为止，因神经细胞的死亡导致的很多疾病的治疗仅研究到缓和症状的方法。因此，依旧要求开发出能够通过神经细胞的再生来有效治疗或者预防神经损伤或者神经疾病、发育障碍的物质。


技术实现要素：

4.本发明的一目的在于，提供能够有效治疗或者预防神经损伤、神经疾病或者发育障碍的新型化合物以及含有新型化合物的药物组合物。
5.通过提供由以下化学式1表示的化合物以及含有该化合物的药物组合物，从而能够达到本发明的前述目的。
6.【化学式1】
[0007][0008]
在所述化学式1中，
[0009]
r1至r3各自独立表示氢、直链或支链(c1-c10)烷基或者用于形成任意键的电子对，
[0010]
a表示*-(ch2)
n-a
1-*，
[0011]
n表示0至5中任意的整数，
[0012]
a1表示*-coo-*、*-co-*、*-nr
4-*、*-ch
2-*、*-conh-*或者*-o-*，
[0013]
连接基团表示*-l
1-nhco-l
2-*、*-l
1-o-r-o-l
2-*、*-l
1-ch
2-l
2-*、*-l
1-nr
5-l
2-*或者*-l
1-coo-l
2-*，
[0014]
l1表示直链或支链(c1-c30)烷基，
[0015]
l2表示单键、或者直链或支链(c1-c30)烷基，
[0016]
r表示直链或支链(c1-c20)烷基，
[0017]
r4以及r5各自独立表示氢、或者直链或支链(c1-c10)烷基，
[0018]
b表示来自视黄酸(retinoic acid)的部分。
[0019]
发明效果
[0020]
目前为止，神经损伤或者神经退化以及与此相关的各种疾病的治疗处于缓和疾病的发展的水平，完全治疗该疾病的治疗剂还尚未存在。根据本发明的化合物能够直接诱导或者促进神经突起的生成、神经突起的生长、神经细胞的分化、神经细胞的再生以及/或者神经细胞的增殖，因此能够对各种神经系统疾病提供根本性的治疗。与此同时，细胞毒性低，因此药物毒性导致的副作用少。另外，对水的溶解度以及溶解稳定性高，从而制剂的剂型柔软性高，而且体内吸收率增加，因此更能提高神经再生、分化、保护效果。
附图说明
[0021]
图1是示出将本发明的化合物(mmb-11903b)和atra(比较用化合物，all-trans retinoic acid(全反式维甲酸))刚溶解到水之后的状态以及将所述化合物静置20分钟之后的溶解状态的照片。
[0022]
图2a是示出随着atra的浓度以及经过时间的神经细胞存活率的图表，图2b是示出随着mmb-11903b的化合物的浓度以及经过时间的神经细胞存活率的图表。
[0023]
图3a是示出随着atra的浓度以及经过时间的神经细胞毒性的图表，图3b是示出随着mmb-11903b的化合物的浓度以及经过时间的神经细胞毒性的图表。
[0024]
图4是随着do3a或者mmb-11903b化合物的浓度以及处理时间的神经细胞形态的照片。
[0025]
图5a是利用对神经细胞分化的标记物，对处理do3a或者mmb-11903b化合物的神经细胞株进行染色之后，利用荧光显微镜进行拍摄，由此获得的照片，图5b是测定处理do3a或者mmb-11903b化合物之后发生变化的神经细胞的神经突起的长度并示出的图表。
[0026]
图6a是利用对神经细胞分化的标记物，对处理atra或者mmb-11903b化合物的神经细胞株进行染色之后，利用荧光显微镜进行拍摄，由此获得的照片，图6b是为了确认处理atra或者本发明的化合物mmb-11903b的神经细胞的分化，利用对神经细胞分化的标记物的抗体，通过颜色直方图测定表达程度并示出的图表。
[0027]
图7a是利用对神经细胞增殖的标记物，对处理do3a、atra或者本发明的化合物mmb-11903b的神经细胞株进行染色之后，利用荧光显微镜进行拍摄，由此获得的照片，图7b是为了确认处理do3a、atra或者本发明的化合物mmb-11903b的神经细胞的增殖，使用ki-67抗体示出相对于阳性细胞数量的比率的图表。
具体实施方式
[0028]
以下，本技术中使用的术语仅是为了说明特定的实施例而使用的，意图不在于限定本发明。在未有其他定义时，包括技术或者科学术语在内，在此使用的所有术语具有本发明所属技术领域中具有通常知识的人一般所理解的相同的含义。一般使用的辞典上所定义的相同的术语应解释为具有与相关技术的文脉上所具有的含义相一致的含义，在本技术中没有明确定义时，不应解释为理想或者过分形式上的含义。
[0029]
根据本发明的一形态，提供由以下化学式1表示的化合物。
[0030]
【化学式1】
[0031][0032]
在所述化学式1中，r1至r3各自独立表示氢、直链或支链(c1-c10)烷基或者用于形成任意键的电子对。具体地，在所述化学式1中，r1至r3可以各自独立表示氢、直链或支链(c1-c3)烷基或者用于形成任意键的电子对，更加具体地，可以表示氢或者用于形成任意键的电子对，进一步具体地，可以是氢。
[0033]
另外，在所述化学式1中，a表示*-(ch2)
n-a
1-*。
[0034]
另外，在所述化学式1中，n表示0至5中任意的整数。具体地，在所述化学式1中，n可以表示1至5中任意的整数，更加具体地，可以是1至3中任意的整数。
[0035]
另外，在所述化学式1中，a1表示*-coo-*、*-co-*、*-nr
4-*、*-ch
2-*、*-conh-*或者*-o-*。具体地，a1可以表示*-coo-*、*-co-*、*-nr
4-*或者*-conh-*，更加具体地，可以表示*-conh-*。
[0036]
另外，在所述化学式1中，连接基团表示*-l
1-nhco-l
2-*、*-l
1-o-r-o-l
2-*、*-l
1-ch
2-l
2-*、*-l
1-nr
5-l
2-*或者*-l
1-coo-l
2-*。具体地，所述连接基团可以表示*-l
1-nhco-l
2-*或者*-l
1-nr
5-l
2-*，更加具体地，可以表示*-l
1-nh-l
2-*。
[0037]
另外，在所述化学式1中，l1表示直链或支链(c1-c30)烷基。具体地，所述l1可以表示直链或支链(c1-c10)烷基，更加具体地，表示直链或支链(c1-c5)烷基。
[0038]
另外，在所述化学式1中，l2表示单键、或者直链或支链(c1-c30)烷基。具体地，l2可以表示单键、或者直链或支链(c1-c10)烷基，更加具体地，可以表示单键、或者直链或支链(c1-c5)烷基，进一步具体地，可以是单键。
[0039]
另外，在所述化学式1中，r表示直链或支链(c1-c20)烷基。具体地，r可以表示直链或支链(c1-c10)烷基，更加具体地，可以表示直链或支链(c1-c5)烷基。
[0040]
另外，在所述化学式1中，r4以及r5各自独立表示氢、或者直链或支链(c1-c10)烷基。具体地，r4以及r5可以各自独立为氢、或者直链或支链(c1-c5)烷基。更加具体地，r4可以为氢。另外，更加具体地，r5可以为氢。
[0041]
另外，在所述化学式1中，b表示来自视黄酸(retinoic acid)的部分。所述视黄酸可以包括全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，以下也称为atra)、13-顺式维甲酸、9-顺式维甲酸等之类的视黄酸的异构体。具体地，所述b可以表示以下化学式2a、2b或者2c：
[0042]
【化学式2a】
[0043][0044]
【化学式2b】
[0045][0046]
【化学式2c】
[0047][0048]
所述化学式2a是来自atra的部分，所述化学式2b是来自13-顺式维甲酸的部分，所述化学式2c是来自9-顺式维甲酸的部分。
[0049]
根据本发明的一实现例，在所述化学式1中，所述b可以表示化学式2a。
[0050]
根据本发明的另一实现例，本发明的化合物可以在所述化学式1中，n表示1至5中任意的整数，a1表示*-conh-*。
[0051]
根据本发明的另一实现例，本发明的化合物可以在所述化学式1中，所述连接基团表示*-l
1-nr
5-l
2-*，r5为氢。
[0052]
根据本发明的另一实现例，本发明的化合物可以在所述化学式1中，l1表示直链或支链(c1-c10)烷基，l2表示单键。
[0053]
根据本发明的另一实现例，本发明的化合物可以在所述化学式1中，所述r1至r3各自独立表示氢、直链或支链(c1-c3)烷基或者用于形成任意键的电子对，a表示*-(ch2)
n-a
1-*，n表示1至5中任意的整数，a1表示*-coo-*、*-co-*、*-nr
4-*或者*-conh-*，连接基团表示*-l
1-nhco-l
2-*或者*-l
1-nr
5-l
2-*，l1表示直链或支链(c1-c10)烷基，l2表示单键、或者直链或支链(c1-c10)烷基，r表示直链或支链(c1-c10)烷基，r4以及r5各自独立表示氢、或者直链或支链(c1-c5)烷基，b由所述化学式2a、2b或者2c表示。
[0054]
根据本发明的另一实现例，本发明的化合物可以在所述化学式1中，所述r1至r3各自独立表示氢或者用于形成任意键的电子对，a表示*-(ch2)
n-a
1-*，n表示1至3中任意的整数，a1表示*-conh-*，连接基团表示*-l
1-nr
5-l
2-*，l1表示直链或支链(c1-c10)烷基，l2表示单键，r表示直链或支链(c1-c10)烷基，r5为氢，b由所述化学式2a、2b或者2c表示。
[0055]
根据本发明的化学式1的化合物，例如，可以通过将以下化学式1-1的化合物与视黄酸衍生物进行反应而制备。其中，所述视黄酸衍生物可以是在化学式1中定义的l2的前体，例如琥珀酰亚胺结合在视黄酸的形态。
[0056]
【化学式1-1】
[0057][0058]
在所述化学式1-1中，a以及l1与化学式1中所定义的相同。
[0059]
根据本发明的一形态，提供一种含有前述的化学式1的化合物或者其药学上可接受的盐的药物组合物。
[0060]
根据本发明的化学式1的化合物对诱导或者促进对神经损伤、神经疾病或者发育障碍的神经突起的生成、神经突起的生长、神经细胞的分化、神经细胞的再生以及/或者神经细胞的增殖有用。
[0061]
术语“神经突起”是指由神经细胞的细胞体延伸的突出部，例如包括轴突以及树突。
[0062]
为此，根据本发明的一形态，提供一种含有本发明的化合物或者其药学上可接受的盐的用于诱导或者促进神经突起的生成、神经突起的生长、神经细胞的分化、神经细胞的再生以及/或者神经细胞的增殖的药物组合物。
[0063]
另外，根据本发明的另一形态，提供一种诱导或者促进神经突起的生成、神经突起的生长、神经细胞的分化、神经细胞的再生或者神经细胞的增殖的方法，所述方法包括向需要神经突起的生成、神经突起的生长、神经细胞的分化、神经细胞的再生或者神经细胞的增殖的对象或者神经细胞给药本发明的化合物或者其药学上可接受的盐的步骤。
[0064]
另外，根据本发明的一形态，提供一种用于治疗或者预防神经损伤、神经疾病或者发育障碍的药物组合物，其特征在于，含有本发明的化合物或者其药学上可接受的盐。
[0065]
在本说明书中使用的术语“治疗”对对象实现优选的治疗效果，包括降低发展速度、停止发展速度、减轻症状、改善病态以及治愈病态。根据本发明的化合物可以通过损伤的细胞的形态以及功能上的修复，对疾病提供根本上的治愈，为此，所述治疗具体是指通过神经细胞的形态以及功能上的修复，治疗疾病。另外，术语“预防”可以是指目前没有发病，但是对有发病危险的对象的使用。
[0066]
术语“神经损伤”指代脊髓损伤或者视神经损伤之类的神经系统的任意损伤，其包括例如因外伤诱导或者化学诱导(例如，因神经毒或者具有免疫抑制效果的治疗方法诱导)或者因疾病或者障碍诱导的神经系统的损伤。另外，所述神经损伤包括中枢神经系统(cns)
的损伤以及末梢神经系统(pns)的损伤，更加具体为脑神经损伤、脊髓损伤、视神经损伤、末梢神经损伤等。
[0067]
术语“神经疾病”包括退行性神经疾病、缺血性神经疾病以及末梢神经疾病。所述“退行性神经疾病”具体包括退行性脑疾病(例如，记忆力减退、痴呆症、阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿病等)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、共济失调、惊厥等。所述“缺血性神经疾病”具体包括缺血性脑疾病(例如，缺血性脑卒中)。所述“末梢神经疾病”具体包括多神经病、单神经病、多发性单神经炎以及自主神经病。
[0068]
术语“发育障碍”包括脑神经发育障碍。
[0069]
如在后述的实施例中也了解，本发明的化合物可以使神经细胞的神经突起生成、生长，使神经细胞分化、再生、增殖，因此，由此本发明的所述混合物或者含有其药学上可接受的盐的药物组合物可以作为治疗或者预防神经损伤、神经疾病或者发育障碍的用途来使用。与此同时，本发明的化合物还可以作为学习能力提升剂或者认知功能改善剂非常有用。
[0070]
另外，根据本发明的另一形态，提供一种神经损伤、神经疾病或者发育障碍的治疗或者预防方法，所述方法包括向需要神经损伤、神经疾病或者发育障碍的治疗或者预防的对象给药本发明的化合物或者其药学上可接受的盐的步骤。
[0071]
根据本发明的一实现例，提供一种用于治疗或者预防脑神经损伤、退行性脑疾病或者缺血性脑疾病的药物组合物，其特征在于，含有本发明的化合物或者其药学上可接受的盐。
[0072]
根据本发明的另一实现例，提供一种用于治疗或者预防痴呆症、阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿病、惊厥、记忆力减退或者缺血性脑卒中的药物组合物，其特征在于，含有本发明的化合物或者其药学上可接受的盐。
[0073]
根据本发明的又一实现例，提供一种用于治疗或者预防末梢神经损伤、脊髓损伤、视神经损伤、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、共济失调或者末梢神经疾病的药物组合物，其特征在于，含有本发明的化合物或者其药学上可接受的盐。
[0074]
根据本发明的又一实现例，提供一种用于治疗或者预防脑神经发育障碍的药物组合物，其特征在于，含有本发明的化合物或者其药学上可接受的盐。
[0075]
在本发明的药物组合物中，根据本发明的化学式1的化合物可以使用药学上可接受的盐的形态。所述“药学上可接受的盐”作为维持母体化合物的药物学活性的化合物盐，例如可以是(i)由盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸以及磷酸之类的无机酸形成的盐；(ii)由乙酸、丙酸、异丁酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸以及甲苯磺酸之类的有机酸形成的盐；(iii)母体化合物中存在的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子、碱土金属离子或者铝离子替换时形成的盐；(iv)与乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、n-甲基葡糖胺之类的有机碱的配位体；或者(v)海藻酸之类的氨基酸的盐。
[0076]
另外，本发明的药物组合物可以含有本发明的所述化学式1的化合物的异构体、溶剂化物或者前药(prodrug)。其中，“异构体”包括非对映异构体以及对映异构体在内的所有可能的立体异构体。本发明的化合物应理解为是指代所有可能的立体异构体形态的混合物。另外，术语“溶剂化物”是指溶质(例如，化学式1的化合物)和溶剂的复合体，当溶剂为水
时，所述溶剂化物可以指代水合物。术语“前药”是指向生物体内给药之后，通过生物体吸收以及代谢而转换成具有药效的活性化合物的化合物。所述前药其本身是非活性或者相比活性化合物活性较弱的化合物，然而，可以提供对处理、给药或者代谢有利的特性。所述前药可以是活性化合物的酯类形态(例如，生理学上可接受的代谢不稳定的酯类)或者糖类衍生物的形态或者氨基酸酯类衍生物的形态。
[0077]
本发明的药物组合物可以单独含有由所述化学式1表示的化合物或者其药学上可接受的盐，然而也可以在此基础上进一步含有药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以使用药剂学领域常规使用的，可以是赋形剂(例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘露醇、纤维素等)或者稀释剂(例如，生理盐水、纯净水等)。
[0078]
另外，根据需要，本发明的药物组合物除了所述药学上可接受的载体之外，还可以含有药学上可接受的添加剂，例如结合剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、膜涂层基质、肠溶性膜涂层基质、柔性胶囊基质、溶解辅助剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂、表面活性剂、甜味剂、苦味剂、保存剂、增稠剂、芳香剂或者着色剂。
[0079]
本发明的药物组合物可以口服或者非口服给药。非口服时，可以通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、内皮给药、局部给药、鼻腔内给药、肺内给药以及直肠内给药等来给药。口服给药时，本发明的药物组合物可以剂型化为固体或者液态剂型的形态。固体剂型例如可以是片剂、胶囊剂(柔性&硬性胶囊剂)、散剂、颗粒剂、丸剂、锭剂等，液态剂型例如可以是酏剂、悬浮液剂、乳液剂、溶液剂、糖浆剂、柠檬水剂等的形态。当为片剂时，除了活性成分之外，通常还可以添加乳糖、玉米淀粉等之类的载体；硬脂酸镁等之类的润滑剂；甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯醇等之类的结合剂；膨润土、海藻酸钠等之类的崩解剂等。当为液剂时，可以将活性成分与纯净水、生理盐水等之类的载体以及根据需要与蔗糖单硬脂酸酯等之类的溶解辅助剂、聚乙烯吡咯烷酮等之类的稳定剂等一起制剂化，当为口服用水性悬浮液剂时，可以将活性成分与悬浮液剂以及根据需要与表面活性剂、保存剂、稳定剂等一起制剂化。
[0080]
本发明的药物组合物的给药量可以是考虑给药方法、服用者的年龄、性别、患者的重症度、状态、失活率以及一同使用的药物来决定，可以分成1次或者多次来给药。
[0081]
以下，为了详细理解本发明，举出本发明的代表性化合物来说明根据本发明的化合物、其制备方法以及含有其的药物组合物的特性。然而，本发明不限于以下的实施例。
[0082]
1.根据本发明的化合物的制备例
[0083][0084]
1)化合物a的合成
[0085][0086]
将全反式维甲酸(all trans retinoic acid(4g，13.31mmol))溶解到90ml的thf之后，添加dcc(4.12g，19.97mmol)，搅拌30分钟。在4℃下滴加溶解到30ml的thf的n-羟基丁二酰亚胺(nhs；2.30g，19.97mmol)溶液之后，在常温下反应18小时。过滤生成的固体之后，去除溶剂，再次溶解到二氯甲烷(dcm)，通过硅胶柱，提纯得到化合物a。收率：4.6g(87.0％)
[0087]
2)化合物a的合成
[0088][0089]
将do3a(
t
buo)3(10g，19.43mmol)溶解到320ml的乙腈(acn)之后，添加khco3(5.93g，59.26mmol)，在常温下搅拌30分钟。将溴乙酸乙酯(2.36ml，21.37mmol)滴加到所述混合物中，在70℃下搅拌24小时之后，过滤无机盐，去除反应物的溶剂。进行真空干燥，得到黄色固体的化合物a。收率：11.5g(99％)
[0090]
3)化合物b的合成
[0091][0092]
向化合物a(25.4g，42.30mmol)添加乙二胺(60ml，846.1mmol)之后，在常温下搅拌4天。反应结束之后，添加150ml的盐水(brine)溶液，利用150ml的dcm溶液反复提取3次，得到有机溶剂层。利用na2so4脱水之后，去除溶剂，在dcm/meoh电解液条件下进行柱层析，进行提纯。向得到的化合物添加己烷(hexane)之后，在常温下搅拌，得到白色固体的化合物b。收率：10.43g(40.2％)
[0093]
4)化合物c的合成
[0094][0095]
将化合物b(3g，4.88mmol)溶解到含有20％的三氟乙酸(tfa)的dcm(12ml/48ml，v/v)之后，在40℃下加热回流，反应24小时。加入meoh的同时，将溶剂反复减压蒸发3次左右之后，再次溶解到meoh，在乙醚中沉淀。将得到的白色固体溶解到蒸馏水，在丙酮中再次沉淀，得到提纯的白色固体化合物c。收率：1.37g(62.9％)
[0096]
5)化合物mmb-11903b的合成
[0097][0098]
将化合物c(0.2g，0.36mmol)溶解到meoh，并添加n,n-二异丙基乙胺(dipea)(0.62ml、3.57mmol)之后，在常温下搅拌3小时。添加化合物a(0.17g，0.43mmol)，在60℃下加热回流24小时之后，在乙醚中沉淀，得到浅黄色的固态。向所述化合物添加异丙醇(ipa)，进行加热之后，冷却，过滤生成的化合物，得到化合物mmb-11903b。收率：0.09g(34.3％)
[0099]
2.溶解度试验
[0100]
为了确认根据本发明的化合物的溶解度，将在所述制备例中制备的本发明的化合
物mmb-11903b以及atra各自以100mm的浓度添加到1ml的去离子水(deionized water)中(本发明的化合物mmb-11903b：72.8mg/ml，atra：30.0mg/ml)，轻轻回旋(vortex)，进行溶解。通过照片拍摄所述刚溶解后的状态，图1中进行示出。将所述制备的本发明的化合物mmb-11903b的溶液和atra溶液在常温下静置20分钟之后，再次拍摄照片，在各个溶液中观察所述化合物的溶解状态(图1)。
[0101]
如图1所示，本发明的化合物mmb-11903b以及atra在初期均匀溶解到溶液中，但是随着时间经过，atra与溶液发生分离、沉淀，与此相反地，本发明的化合物mmb-11903b即便静置与atra相同的时间，也不与溶剂发生分离而能够维持均匀的溶解状态。由此可以确认到，本发明的化合物mmb-11903b能够容易溶解到水之类的溶剂中，从而不仅溶解度高，而且具有溶解稳定性，因此即便静置长时间，也能维持溶解状态，这种本发明的化合物mmb-11903b的溶解度以及溶解稳定性相比atra，非常卓越。
[0102]
3.细胞毒性试验
[0103]
3-1)细胞存活率试验
[0104]
将作为未分化的神经细胞株的人类成神经细胞瘤(neuroblastoma)sh-sy5y作为对象，利用cck-8分析神经细胞株的细胞存活率(cell viability；细胞活性)。作为参考，所述cck-8(cell counting kit-8)是利用高水溶性四唑盐-sst-8进行了分析，所述分析是基于如下点进行的：[2-(甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐]在电介质的存在下发生还原时，生成水溶性甲瓒橘黄色染料，在细胞中通过脱氢酶生成的甲瓒染料的量与存活的细胞数直接成比例。具体的实验方法为如下。
[0105]
sh-sy5y是在添加10％的fetal bovine serum(fbs；胎牛血清)、1％的antibiotic-antimycotic(aa；抗菌-抗真菌剂)、2mm的l-glutamine(l-谷氨酰胺)的minimum essential medium(mem；最低必需培养液)培养基中生长，为了分析细胞存活率，被稳定的细胞是以1
×
104个/well(孔)的密度浮游在200μl的培养基中，种植到96孔板(well plate)的各个孔(well)中。在37℃、5％co2的恒温箱中粘贴14小时以上，并等待稳定化。第二天，去除生长培养基，为了诱导分化，向添加1％的fbs、1％的aa、2mm的l-谷氨酰胺的100μl的dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture f-12(dmem/f-12＝1:1)培养基分别以各种浓度(0、1、2、5、10、20、30、50μm)稀释所述制备例中合成的本发明的化合物mmb-11903b以及作为比较用化合物的全反式维甲酸(all trans retinoic acid，以下称为atra)，在37℃、5％co2的状态下培养24、48、72小时。在收获时间2小时以前，向各个孔(well)添加10μl的cck-8溶液，进一步培养2小时。对于完成培养的孔板，利用酶标仪在450nm下测量吸光度。
[0106]
【细胞存活率计算式】
[0107][0108]
(在所述式中，a为在对照组孔中测量的吸光度值，b为在添加有药物的孔中测量的吸光度值。)
[0109]
对于计算的值，利用graphpad prism应用程序画出图表。通过单因素方差分析(one-way anova with dunnett's multiple comparison test)确认计算的数值的统计显著性。显示对于*p《0.5,***p《0.01vs.24hcontrol,#p《0.5,###p《0.01vs.48h control,
p《0.01vs.72h control具有显著性。在图2a和图2b分别示出对atra和本发明的化合物mmb-11903b的结果。
[0110]
在图2a和2b中，当将atra或者化合物mmb-11903b的浓度为0μm时(即，完全没有给药atra以及化合物mmb-11903b的情况)的24小时存活率、48小时存活率、72小时存活率设为100％时，atra是浓度越高以及时间越长，细胞存活率越低(参考图2a)。与此相反地，可以确认到与没有给药本发明的化合物mmb-11903b的情况相比，给药本发明的化合物mmb-11903b的情况的72小时存活率始终更高，因此可以确认到本发明的化合物mmb-11903b随着给药时间的经过而更能提高细胞存活率。尤其是，在50μm的浓度下，本发明的化合物mmb-11903b的72小时存活率相比atra更高约2倍以上。由此确认到mmb-11903b在长时间暴露下，对神经细胞的毒性也在减少。
[0111]
3-2)利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ldh)分析的细胞毒性试验
[0112]
可以通过细胞存活率试验间接测量细胞毒性(cytotoxicity)(细胞死亡)，但是为了更灵敏(sensitive)、准确地测量，通过利用与细胞死亡或者细胞损伤有关的酶的方法进行验证。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ldh)是细胞质中存在的稳定的酶，通常不通过细胞膜而不向细胞外排出，但是当细胞膜损伤或者细胞死亡时，释放到培养基中。因此，培养基中的ldh量与死亡或者受损的细胞数成比例，由此测量ldh量。
[0113]
sh-sy5y是在添加10％的fetal bovine serum(fbs；胎牛血清)、1％的antibiotic-antimycotic(aa；抗菌-抗真菌剂)、2mm的l-glutamine(l-谷氨酰胺)的minimum essential medium(mem；最低必需培养液)培养基中生长，为了分析细胞存活率，被稳定的细胞是以2.5
×
104个/well(孔)的密度浮游在200μl的培养基中，种植到96孔板(well plate)的各个孔(well)中。在37℃、5％co2的恒温箱中粘贴14小时以上，并等待稳定化。第二天，去除生长培养基，为了诱导分化，向添加1％的fbs、1％的aa、2mm的l-谷氨酰胺的100μl的dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture f-12(dmem/f-12＝1:1)培养基分别以各种浓度(0、1、5、10、20、30、50、100、200μm)稀释本发明的所述制备例中制备的化合物mmb-11903b以及全反式维甲酸(all trans retinoic acid；atra)，在37℃、5％co2的状态下培养24、48、72小时。向新的96孔板(well plate)以10μl分株培养液的上层部分，分别添加100μl的ldh反应混合物(reaction mixture；d-plus
tm ldh kit,cat.no.ldh-500)，以黑暗状态反应30分钟。对于完成培养的孔板，利用酶标仪在450nm下测量吸光度。
[0114]
【细胞毒性计算式】
[0115]
细胞毒性(％)＝(a-b)/(c-b)
×
100(％)
[0116]
(在所述式中，a为添加有药物的组的吸光度值，b为未处理药物的组的吸光度值，c为向实验中使用的细胞添加10μl的裂解(lysis)液，测量在细胞中可释放的最大的ldh量的吸光度值。)
[0117]
对于计算的值，利用graphpad prism应用程序画出图表。通过单因素方差分析(one-way anova with dunnett's multiple comparison test)确认计算的数值的统计显著性。显示对于***p《0.01vs.24h control,###p《0.01vs.48h control,p《0.5,p《0.01vs.72h control具有显著性。在图3a和图3b分别示出对atra和本发明的化合物mmb-11903b的结果。
[0118]
在图3a中，atra是大致从30μm附近的浓度开始显示细胞毒性，并在200μm的浓度下
培养24小时时，细胞毒性大致为55％。与此相反地，在图3b中，本发明的化合物mmb-11903b是大致从100μm附近的浓度开始显示细胞毒性，并在200μm的浓度下培养24小时时，细胞毒性大致为5％。由此可以确认到，本发明的化合物mmb-11903b相比atra细胞毒性显著低(例如，在200μm的浓度下培养24小时时，本发明的化合物mmb-11903b的细胞毒性相比atra更低10倍以上)。
[0119]
4.确认对神经细胞的效果
[0120]
4-1)神经细胞的形态(morphology)变化
[0121]
sh-sy5y是在添加10％的fetal bovine serum(fbs；胎牛血清)、1％的antibiotic-antimycotic(aa；抗菌-抗真菌剂)、2mm的l-glutamine(l-谷氨酰胺)的minimum essential medium(mem；最低必需培养液)培养基中生长，为了分析细胞存活率，被稳定的细胞是以4
×
105个/皿(dish)的密度种植到60nm皿中。在37℃、5％co2的恒温箱中粘贴14小时以上，并等待稳定化。第二天，去除生长培养基，为了诱导分化，向添加1％的fbs、1％的aa、2mm的l-谷氨酰胺的dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture f-12(dmem/f-12＝1:1)培养基以各种浓度(0、5、10、20μm)稀释本发明的所述制备例中制备的化合物mmb-11903b以及以下化学式的do3a，在37℃、5％co2的状态下培养1、3、5天。对于细胞的形态，利用尼康倒置显微镜(nikon inverted microscope)获得图像(nikon,eclipse ts2,nikon corporation,tokyo,japan)。图4中示出处理do3a或者本发明的化合物mmb-11903b的神经细胞株的图像。
[0122]
【do3a的化学式】
[0123][0124]
当处理本发明的化合物mmb-11903b时，可以从低浓度开始观察到细胞形态的变化。诱导向神经细胞的分化，从而细胞体(cell body)变小，作为神经轴突(axon)和树突(dendrite)的前体的神经突起增生(neurite outgrowth)，从而其长度成为细胞体的2倍以上。随着时间，神经突起的增生进一步扩张，神经突起网络的形成变明显。与本发明的化合物mmb-11903b相比，当处理do3a时，未观察到神经突起的增生，反而是从10μm、第5天和20μm、第3天开始观察到因细胞毒性导致的细胞死亡。确认到do3a不具有神经细胞分化功能，反而会引起毒性，参与到神经细胞死亡中，与此相比，在具有do3a的骨干(backbone)的本发明的化合物mmb-11903b中细胞毒性被改善，不仅如此，诱导向神经细胞的分化。
[0125]
4-2)利用免疫荧光染色法(immunofluorescence staining)的神经突起增生促进效果的试验
[0126]
sh-sy5y是在添加10％的fetal bovine serum(fbs；胎牛血清)、1％的antibiotic-antimycotic(aa；抗菌-抗真菌剂)、2mm的l-glutamine(l-谷氨酰胺)的minimum essential medium(mem；最低必需培养液)培养基中生长，为了分析细胞存活率，被稳定的细胞是以4
×
105个/皿(dish)的密度种植到60nm皿中。在37℃、5％co2的恒温箱中粘贴14小时以上，并等待稳定化。第二天，去除生长培养基，为了诱导分化，向添加1％的
fbs、1％的aa、2mm的l-谷氨酰胺的dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture f-12(dmem/f-12＝1:1)培养基以10μm浓度处理本发明的制备例中制备的化合物mmb-11903b以及do3a，在37℃、5％co2的状态下进行培养。将培养后第1、3、5天收获的细胞利用dpbs进行清洗，在10％的中性福尔马林固定液(neutral buffered formalin)固定10分钟，在tris缓冲盐溶液(tris-buffered saline)清洗3次之后，在0.3％的triton x-100(in tbs)反应15分钟。在tbs清洗3次，倒入5％的牛血清白蛋白(bovine serum albumin；bsa)和正常山羊血清(normal goat serum)(in tbs)的溶液，在4℃下反应24小时。作为神经元特异性标记物(neuron specific marker)利用β-iii tubulin(微管蛋白)1次抗体，作为新生儿未成熟神经元标记物(newborn immature neuron marker)利用双皮质素(doublecortin)的1次抗体，确认神经细胞的分化以及神经突起的诱导。在4℃下反应1次抗体24小时之后，在tbs清洗3次，2次抗体是在常温下反应染料(fluorescent)(green；绿色)和染料(fluorescent)(red；红色)1小时。在tbs清洗3次进行封固(vector防荧光萃灭封片剂；vectashield mounting medium with dapi；vector laboratories,bur-lingame,ca,usa)，利用荧光显微镜获得图像。图5a中示出如此获得的图像。如图5a所示，当处理本发明的化合物mmb-11903b时，神经突起增生以及神经突起网络的形成变明显，与此相反地，当处理do3a时，未观察到神经突起的增生。
[0127]
利用imagej软件测量增生突起的长度。仅测量成为细胞体长度的2倍以上的神经突起的长度。对于计算的值，利用graphpad prism应用程序画出图表。图5b中示出该图表。通过单因素方差分析(one-way anova with dunnett's multiple comparison test)确认计算的数值的统计显著性。显示对于*p《0.5,***p《0.01vs.control,##p《0.1,###p《0.01vs.do3a具有显著性。利用神经细胞标记物进行荧光染色之后，测量神经突起的长度的结果，属于mmb-11903b的骨干(backbone)的do3a与对照组相同，不显示神经突起的增生，与对照组和do3a处理组相比，通过本发明的化合物mmb-11903b的神经细胞的神经突起增生诱导在第1天增加平均1.7倍，在第3天增加平均2.6倍，在第5天增加平均2.5倍。
[0128]
4-3)利用免疫荧光染色法(immunofluorescence staining)的神经突起增生以及新生神经元的生成和生长效果的试验
[0129]
进一步地，按照与前述的方法相同的方法，将atra作为比较化合物而不是do3a，从而通过免疫荧光染色法观察神经细胞分化。图6a中示出利用荧光显微镜获得的图像。
[0130]
利用imagej软件测量颜色直方图。对于计算的值，利用graphpad prism应用程序画出图表。图6b中示出所述图表。与对照组(无处理组)和作为阳性对照组的atra处理组相比，确认到通过处理本发明的化合物mmb-11903b，从第3天开始神经细胞的分化以及表达增加，其到第5天为止也维持高的表达。与对照组和阳性对照组atra处理组维持低的新生神经元的表达相比，确认到新生神经元的表达在第3天开始显著增加。通过单因素方差分析(one-way anova with dunnett's multiple comparison test)确认计算的数值的统计显著性。显示对于*p《0.5,***p《0.01vs.control,#p《0.5,##p《0.1,###p《0.01vs.atra具有显著性。
[0131]
4-4)利用免疫荧光染色法(immunofluorescence staining)的细胞增殖效果的试验
[0132]
对于作为对神经细胞增殖的标记物的ki-67，比较阳性数量。利用imagej软件自动
获得阳性细胞数(positive cell number)。图7a中示出利用荧光显微镜获得的照片。
[0133]
【ki-67阳性细胞数的计算式】
[0134]
ki-67 positive cells(％)＝(ki-67 positive cell number/dapi positive cell number)x 100
[0135]
对于计算的值，利用graphpad prism应用程序画出图表。图7b中示出该图表。在暴露第1天，与对照组(无处理组)相比，在do3a以及本发明的化合物mmb-11903b处理组中显示接近2倍的细胞增殖，atra没有显示与对照组显著差异。在暴露第3天，除了atra处理组之外，在所有组中显示神经细胞增殖，本发明的化合物mmb-11903b到第5天为止显示高的神经细胞增殖率。确认到通过本发明的化合物mmb-11903b，促进向神经细胞的分化的同时，还诱导新的神经细胞的增殖。通过单因素方差分析(one-way anova with dunnett's multiple comparison test)确认计算的数值的统计显著性。显示对于*p《0.5,**p《0.1,***p《0.01vs.control,#p《0.5,##p《0.1vs.do3a,p《0.5,p《0.01vs.atra具有显著性。
[0136]
可以从前述的实施例4-1至4-4确认到本发明的化合物mmb-11903b在神经细胞株中，与作为对照组的do3a或者atra相比，能够诱导神经细胞的增殖，维持这种增殖，与此同时，可以确认到诱导神经突起的生成以及增生，从而促进向神经细胞的分化。
[0137]
以上参考本发明的优选实施例进行了说明，然而应理解该技术领域的熟知的技术人员可以在不脱离专利权利要求书中记载的本发明的构思以及领域的范围内对本发明进行各种修改以及改变。