一种双sgRNA结合RecET系统敲除盐单胞菌DNA大片段的方法

一种双sgrna结合recet系统敲除盐单胞菌dna大片段的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域中，一种双sgrna结合recet系统敲除盐单胞菌dna大片段的方法。


背景技术：

2.盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0具有对“盐”和“碱”这两种极端条件的天然适应能力，可实现无灭菌开放式连续发酵，已作为低成本工业发酵菌株用于多种生物制品的合成。作为一株重要的工业生产平台菌株，需要对其进行高效的基因编辑，如dna大片段的删减。随着crispr/cas9新一代基因编辑技术的快速发展，来自酿脓链球菌的ii-a型crispr-cas系统已经在原核生物和真核生物中得到了广泛的应用。该系统实现干扰过程的效应复合物由crrna、tracrrna和具有多功能结构域的cas9蛋白组成。目前的实际应用中，crrna已与tracrrna融合为一条链，被称为sgrna，包含20个能与靶标dna发生碱基互补的碱基序列和一个能与cas9结合的rna二级结构。cas9蛋白含有hnh结构域和ruvc结构域，都具有核酸酶活性，分别切割靶标dna中与crrna互补的靶标链和被crrna替换的非靶标链。
3.前期研究已经利用酿脓链球菌的crispr-cas9系统，在盐单胞菌中初步建立了基因编辑工具。该工具由双质粒系统组成：cas9表达载体及sgrna的表达载体(qin,q.,ling,c.,zhao,y.,yang,t.,yin,j.,&guo,y.,et al.(2018).crispr/cas9 editing genome of extremophile halomonas spp.metabolic engineering,s1096717618300053.)(另见中国专利申请“一种在盐单胞菌中快速基因编辑的载体组合及其应用”，申请号201711445256.3)。该方法的测试结果显示，随着dna片段长度增加，其敲除成功率明显降低，最多能实现约3kb dna片段的敲除，且其敲除成功率仅为25％，这一方法不能实现该菌的dna大片段删减。并且在该研究中还测试了λ-red重组系统在盐单胞菌中是否能够提高crispr-cas9基因编辑的效率，结果发现λ-red重组系统的表达对细胞造成了毒性，使菌体生长受到严重抑制，敲除成功率为0。目前急需探索一种可以敲除大片段的方法。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何有效敲除盐单胞菌的dna大片段。
5.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种敲除盐单胞菌dna大片段的方法(记为方法1)，所述dna大片段大于等于10kb，所述方法1包括：将具有如下1)-4)特征的重组载体导入出发盐单胞菌中，实现所述dna大片段的敲除；
6.1)能转录sgrna1与sgrna2，所述sgrna1与所述sgrna2分别靶向所述dna大片段的两端；
7.2)含有出发盐单胞菌中所述dna大片段的上游同源臂和下游同源臂；
8.3)能表达cas9；
9.4)能表达rece蛋白质和rect蛋白质。
10.上述方法1中，所述上游同源臂和所述下游同源臂的长度均可大于等于1000bp。所
述上游同源臂和所述下游同源臂的长度均可为1000bp。
11.上述方法1中，所述重组载体可为两个、一个、三个或四个重组载体。
12.上述方法1中，所述重组载体可名称分别为重组载体1和重组载体2的两个重组载体，所述重组载体1具有如下1)和2)的特征：
13.1)能转录sgrna1与sgrna2，所述sgrna1与所述sgrna2分别靶向所述dna大片段的两端；
14.2)含有出发盐单胞菌中所述dna大片段的上游同源臂和下游同源臂；
15.所述重组载体2具有如下3)和4)的特征：
16.3)能表达cas9；
17.4)能表达rece蛋白质和rect蛋白质。
18.上述方法1中，所述重组载体1为在出发载体(记为出发载体1)中插入序列表中序列1的第21-320位所示的dna片段和所述上游同源臂、所述下游同源臂得到的重组载体；
19.所述重组载体2为向另一能表达cas9的出发载体(记为出发载体2)中插入所述rece蛋白质和所述rect蛋白质的表达盒得到的重组载体。
20.其中，序列1的第21-55位和第171-205位均为启动子序列；第56-136位和第206-286位分别为转录所述sgrna1与所述sgrna2的dna序列；第137-161位和第287-311位均为终止子序列。所述sgrna1与所述sgrna2的靶序列分别为序列1的第56-75位和第206-225位。
21.在本发明的一个实施例中，所述出发载体1为pgvector。所述重组载体1为将所述出发载体1中的agccgtcgtgactgggaaaa和taccgagctcgaattcgcgc间的dna小片段替换为序列表中序列1的第21-320位所示的dna片段和所述上游同源臂、所述下游同源臂得到的重组载体。
22.在本发明的一个实施例中，所述出发载体2为psc101-bad-etga-tet质粒。
23.所述rece蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列3，所述rect蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列4。
24.所述表达盒含有序列2的第341-2941位所示的rece基因与第2934-3743位所示的rect基因。序列2的第22-306位为arabad启动子序列，第341-2941位为rece基因序列，第2934-3743位为rect基因序列，所述rece基因序列编码序列3所示的rece蛋白质，所述rect基因序列编码序列4所示的rect蛋白质。
25.上述方法1中，所述dna大片段可大于等于10kb小于等于50kb。进一步，所述dna大片段可大于等于10kb小于等于40kb。再进一步，所述dna大片段可大于等于10kb小于等于30kb。更进一步，所述dna大片段可大于等于10kb小于等于20kb。
26.上述方法1中，所述出发盐单胞菌可为盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0。
27.本发明还提供了一种敲除盐单胞菌dna大片段的方法(记为方法2)，所述dna大片段大于等于10kb，所述方法2包括：将具有如下1)-3)特征的重组载体导入出发盐单胞菌中，实现所述dna大片段的敲除；
28.1)能转录sgrna1与sgrna2，所述sgrna1与所述sgrna2分别靶向所述dna大片段的两端；
29.2)含有出发盐单胞菌中所述dna大片段的上游同源臂和下游同源臂；
30.3)能表达cas9。
31.上述方法2中，所述重组载体可为上文所述重组载体1和质粒pq08。
32.上述方法1或上述方法2中的所述重组载体，也属于本发明的保护范围。
33.本发明还提供了盐单胞菌dna大片段敲除系统，所述系统含有分别靶向待敲除dna大片段两端的两个sgrna或这两个sgrna的转录dna片段，cas9蛋白质或其编码基因，以及，rece蛋白质和rect蛋白质或这两种蛋白质的编码基因。
34.上述方法1或上述方法2中的所述重组载体在敲除盐单胞菌dna大片段中的应用；
35.或，上述方法1或上述方法2中的所述重组载体在制备敲除盐单胞菌dna大片段产品中的应用；
36.或，所述系统在敲除盐单胞菌dna大片段中的应用；
37.或，所述系统在制备敲除盐单胞菌dna大片段产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
38.本发明提供的利用双sgrna结合recet重组系统实现盐单胞菌中大片段dna的敲除方法，能够在盐单胞菌中实现高效的dna大片段删减。本发明完善了盐单胞菌的dna大片段遗传操作工具，为盐单胞菌的基因组精简和合成生物学改造提供了有效的工具，进一步推进了盐单胞菌作为平台菌株的研发进程。本发明解决了目前盐单胞菌中无法有效实现大片段dna敲除的问题，具有广泛的应用前景。
附图说明
39.图1为携带转录双sgrna的dna和同源臂的质粒p2gpsn构建。
40.图2为携带recet和cas9的质粒pq08-recet构建。
41.图3为本发明的dna大片段基因编辑图。
42.图4为20kb-50kb不同长度鞭毛基因片段敲除设计。
43.图5为20kb敲除pcr产物检测结果。a为vf和20kvr的pcr产物；b为vf和wtvr的pcr产物。
44.图6为30kb敲除pcr产物检测结果。a为vf和30kvr的pcr产物；b为vf和wtvr的pcr产物。
45.图7为40kb敲除pcr产物检测结果。a为vf和40kvr的pcr产物；b为vf和wtvr的pcr产物。
46.图8为50kb敲除pcr产物检测结果。a为vf和50kvr的pcr产物；b为vf和wtvr的pcr产物。
47.图9为使用pq08-recet时50kb敲除pcr产物检测结果。上图为vf和50kvr的pcr产物；下图为vf和wtvr的pcr产物。
具体实施方式
48.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
49.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所
描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
50.下述实施例中的盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0(qin,q.,ling,c.,zhao,y.,yang,t.,yin,j.,&guo,y.,et al.(2018).crispr/cas9 editing genome of extremophile halomonas spp.metabolic engineering,47(2018)219
–
229，s1096717618300053.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
51.下述实施例中的质粒pq08与pseva241记载在文献(qin,q.,ling,c.,zhao,y.,yang,t.,yin,j.,&guo,y.,et al.(2018).crispr/cas9 editing genome of extremophile halomonas spp.metabolic engineering,47(2018)219
–
229，s1096717618300053.)中，公众均可从申请人处获得，这两个质粒只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。其中，质粒pq08携带cas9的编码基因，能表达cas9，并携带氯霉素抗性基因(用于大肠杆菌和盐单胞菌)。pseva241的序列为序列表中序列9。
52.下述实施例中的psc101-bad-etga-tet质粒(wang h,li z,jia r,et al.recet direct cloning and redαβrecombineering of biosynthetic gene clusters,large operons or single genes for heterologous expression.[j].nature protocols,2016,11(7):1175-1190.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0053]
下述实施例中的大肠杆菌e.coli s17-1(qin,q.,ling,c.,zhao,y.,yang,t.,yin,j.,&guo,y.,et al.(2018).crispr/cas9 editing genome of extremophile halomonas spp.metabolic engineering,crispr/cas9 editing genome of extremophile halomonas s1096717618300053.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0054]
lb培养基：5g/l酵母提取物，10g/l胰蛋白胨,10g/l nacl。调ph值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
[0055]
60lb培养基：5g/l酵母提取物，10g/l胰蛋白胨,60g/l nacl。调ph值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
[0056]
20lb培养基：5g/l酵母提取物，10g/l胰蛋白胨,20g/l nacl。调ph值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
[0057]
实施例1、携带转录双sgrna的dna和同源臂的质粒构建
[0058]
本实施例提供的携带转录双sgrna的dna和同源臂的质粒(其名称为p2gpsn)，由转录待敲除目的片段的两个sgrna的dna(将该dna片段记为2grna，所转录的两个sgrna分别记为sgrna1和sgrna2)、上游同源臂h1、下游同源臂h2以及pgvector的质粒骨架四部分连接得到，如图1所示。
[0059]
2grna的序列为序列表中序列1，序列1的第21-55位和第171-205位均为启动子序列；第56-136位和第206-286位分别为转录靶向待敲除目的片段的两个sgrna的dna序列，这两个sgrna的靶序列分别为序列1的第56-75位和第206-225位；第137-161位和第287-311位
均为终止子序列。n表示a、t、c或g。
[0060]
上游同源臂h1利用由h1f与h1r组成的引物对，以待敲除基因菌株的基因组dna为模板进行pcr扩增得到；下游同源臂h2利用由h2f与h2r组成的引物对，以待敲除基因菌株的基因组dna为模板进行pcr扩增得到。上游同源臂h1的长度为1000bp，下游同源臂h2的长度为1000bp。
[0061]
以pseva241为模板，利用pgvector f和pgvector r组成的引物对进行pcr扩增，将得到的pcr产物利用dpni消化2h去除模板质粒得到pgvector质粒骨架，该质粒骨架含有抗性基因。
[0062]
所得pcr产物1与ps1上游同源臂、ps1上游同源臂与ps1下游同源臂、ps1下游同源臂与pgvector质粒骨架、pgvector质粒骨架与pcr产物1均有一端序列相同。
[0063]
合成序列表中序列1所示的2grna(该dna片段也可通过先合成2grna，然后以其为模板利用sgrna f与sgrna r进行pcr扩增得到)。将2grna、上游同源臂h1、下游同源臂h2以及pgvector质粒骨架通过gibson组装克隆试剂盒重组，将得到的产物转化到大肠杆菌jm109中，并挑取单克隆提取质粒测序验证，得到的序列正确的重组质粒即为p2gpsn，如图1所示。
[0064]
各引物的序列如表1所示。
[0065]
表1、用于构建敲除载体的引物和合成的sgrna序列
[0066][0067]
表1中相同标记的序列反向互补或相同，n表示a、t、c或g，h1f与h1r中的利用n表示的片段用于特异识别上游同源臂，h2f与h2r中的利用n表示的片段用于特异识别下游同源臂。
[0068]
实施例2、携带recet和cas9的pq08-recet质粒构建
[0069]
本实施例在pq08的基础上构建携带recet和cas9的pq08-recet质粒。步骤如下：
[0070]
利用限制性内切酶xmai酶切pq08，获得线性化的载体片段。以psc101-bad-etga-tet质粒为模板，利用引物对f与r进行pcr扩增，得到pcr产物(其序列为序列表中序列2)，所得pcr产物含有recet基因以及上游的arabad启动子。将上文所得线性化的载体片段与pcr产物通过gibson组装克隆试剂盒重组，得到的序列正确的重组质粒即为pq08-recet质粒，如图2所示，该质粒含有氯霉素抗性基因(用于大肠杆菌和盐单胞菌)。
[0071]
所用引物序列如下：5
’‑3’
[0072]
f：5
’‑
acagtaatacaaggggtgttcaagaaaccaattgtccatat-3’；
[0073]
r：5
’‑
aggtcgactctagaggatccccggttattcctctgaattatcga-3’。
[0074]
序列2中，第22-306位为arabad启动子序列，第341-2941位为rece基因序列，第2934-3743位为rect基因序列，rece基因编码序列3所示的rece蛋白质(其序列为序列3)，rect基因编码序列4所示的rect蛋白质(其序列为序列4)。
[0075]
实施例3：盐单胞菌中敲除10-50kb鞭毛基因dna大片段敲除测试
[0076]
本实施例利用实施例1所得p2gpsn与pq08质粒分别敲除盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的不同长度的鞭毛基因dna大片段，如图3所示，所敲除的dna大片段的长度分别为20kb、30kb、40kb、50kb，将其分别记为20kb片段、30kb片段、40kb片段、50kb片段，各片段的敲除设计如图4所示，所用上游同源臂均为h1，下游同源臂分别为20kh2、30kh2、40kh2、50kh2，将所涉及的片段包含在片段1中，片段1的序列为genbank id gl949758.1(更新日期2015年3月13日)的第305096-253077位。
[0077]
genbank id gl949758.1(更新日期2015年3月13日)中，第306095-305096位所示为h1；第305095-284367位所示为待敲除的20kb片段，第284368-283369位所示为20kh2；第305095-274216位所示为待敲除的30kb片段，第274217-273218位所示为30kh2；第305095-263758位所示为待敲除的40kb片段，第263759-262760位所示为40kh2；第305095-254075位所示为待敲除的50kb片段，第254076-253077位所示为50kh2。
[0078]
1、接合转化
[0079]
使用e.coli s17-1作为接合转化的工具菌株，其过程如下：
[0080]
将待转化质粒导入e.coli s17-1中，得到携带待转化质粒的e.coli s17-1；
[0081]
将目的盐单胞菌和携带待转化质粒的e.coli s17-1菌种分别在添加相应抗生素的lb60和lb培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将目的盐单胞菌和携带待转化质粒的e.coli s17-1重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于lb20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔重悬于100μl的含相应抗生素的lb60培养基中并涂布于相应抗性的lb60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h，即得到携带转化质粒的盐单胞菌。
[0082]
2、20kb片段的敲除
[0083]
合成转录靶向待敲除20kb片段的2grna，记为20-2grna，其序列为序列表中序列5，序列5的第56-136位和第206-286位分别转录两个sgrna序列。
[0084]
以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的基因组dna为模板，利用h1f和h1r组成的引物对进行pcr扩增，得到含有上游同源臂h1的pcr产物；以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的基因组dna为模板，利用20-h2f和20-h2r组成的引物对进行pcr扩增，得到含有下游同源臂20kh2的pcr产物。所用引物序列如下：
[0085]
h1f：actgcatgtgcagctaatgccacgttgtttgcctcatcgt；
[0086]
h1r：
[0087]
20-h2f：
[0088]
20-h2r：ttttcccagtcacgacggctcccaggaagcgttggtcgac。
[0089]
将20-2grna、含有上游同源臂h1的pcr产物、含有下游同源臂20kh2的pcr产物以及实施例1的pgvector质粒骨架通过gibson组装克隆试剂盒重组，将得到的产物转化到大肠
杆菌jm109中，并挑取单克隆提取质粒测序验证，得到的序列正确的重组质粒即为敲除质粒p2gps20，该质粒含有卡那霉素抗性基因(用于大肠杆菌)与壮观霉素抗性基因(用于盐单胞菌)。
[0090]
将敲除质粒p2gps20导入大肠杆菌e.coli s17-1中，将得到的重组菌记为e.coli s17-1/p2gps20。
[0091]
以pq08作为待转化质粒，以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0作为目的盐单胞菌，按照步骤1的方法将pq08导入盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0中，得到重组菌halomonas td1.0/pq08。
[0092]
将重组菌halomonas td1.0/pq08和e.coli s17-1/p2gps20菌种分别在添加相应抗生素的lb60和lb培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将重组菌halomonas td1.0/pq08和e.coli s17-1/p2gps20重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于lb20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔涂布于含氯霉素和壮观霉素的lb60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h进行转化筛选，将生长出的单克隆利用引物进行pcr扩增进行鉴定，引物对vf和20kvr用以验证是否存在敲除，敲除成功则vf和20kvr能扩增到一条约2400bp条带，引物对vf和wtvr用以验证野生型条带是否存在，如果敲除失败则vf和wtvr能扩增到一条约1700bp条带。各引物序列如下：
[0093]
vf：ccttcacgaatagcttcgcg；
[0094]
wtvr：ctcattgcggaactagcaat；
[0095]
20kvr：gggcgagattctcaacctga。
[0096]
统计纯和率(即敲除成功率)和突变率，纯和率＝纯和单克隆数/总单克隆数
×
100％，突变率＝(纯和单克隆数+杂合单克隆数)/总单克隆数
×
100％。纯和单克隆是指vf和20kvr能扩增到一条约2400bp条带且vf和20kvr不能扩增到约1700bp条带的克隆，杂合单克隆是指vf和20kvr能扩增到一条约2400bp条带且vf和20kvr能扩增到约1700bp条带的克隆，总单克隆数是指所鉴定的总的克隆数。
[0097]
随机挑选的32个单克隆的pcr产物的电泳结果如图5所示，利用盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0作为野生型对照。随机挑选的32个单克隆中，2、4、5、6、7、8、10、11、15、18、21、22、23、24、25、28、29、30、31、32号成功敲除，为纯和单克隆，1、3、12、13、14、17、19、20、26、27号为杂合单克隆，9、16未发生目的片段的敲除，纯和率为62.5％，突变率为93.75％。经测序验证所得纯和单克隆均成功实现了目标20kb片段的敲除，不含其上下游同源臂间的20kb片段。
[0098]
3、30kb片段的敲除
[0099]
合成转录靶向待敲除30kb片段的2grna，记为30-2grna，其序列为序列表中序列6，序列6的第56-136位和第206-286位分别转录两个sgrna。
[0100]
以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的基因组dna为模板，利用30-h2f和30-h2r组成的引物对进行pcr扩增，得到含有下游同源臂30kh2的pcr产物。所用引物序列如下：
[0101]
30-h2f：
[0102]
30-h2r：ttttcccagtcacgacggctcggctagctggggagcataa。
[0103]
将30-2grna、上文所得含有上游同源臂h1的pcr产物、含有下游同源臂30kh2的pcr
产物以及实施例1的pgvector质粒骨架通过gibson组装克隆试剂盒重组，将得到的产物转化到大肠杆菌jm109中，并挑取单克隆提取质粒测序验证，得到的序列正确的重组质粒即为敲除质粒p2gps30，该质粒含有卡那霉素抗性基因(用于大肠杆菌)与壮观霉素抗性基因(用于盐单胞菌)。
[0104]
将敲除质粒p2gps30导入大肠杆菌e.coli s17-1中，将得到的重组菌记为e.coli s17-1/p2gps30。
[0105]
将上文的重组菌halomonas td1.0/pq08和e.coli s17-1/p2gps30菌种分别在添加相应抗生素的lb60和lb培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将重组菌halomonas td1.0/pq08和e.coli s17-1/p2gps30重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于lb20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔涂布于含氯霉素和壮观霉素的lb60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h进行转化筛选，将生长出的单克隆利用引物进行pcr扩增进行鉴定，引物对vf和30kvr用以验证是否存在敲除，敲除成功则vf和30kvr能扩增到一条约2400bp条带，vf和wtvr用以验证野生型条带是否存在，如果敲除失败则引物对vf和wtvr能扩增到一条约1700bp条带。vf与wtvr的引物同步骤2，30kvr引物序列：30kvr：aagtcggcaagggcaatctt。
[0106]
统计纯和率(即敲除成功率)和突变率，随机挑选的32个单克隆的pcr产物的电泳结果如图6所示，利用盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0作为野生型对照。随机挑选的32个单克隆中，2、6、9、11、15、17、18、25号成功敲除，为纯和单克隆，22、27号为杂合单克隆，其余未发生目的片段的敲除，纯和率为25％，突变率为31.25％。经测序验证所得纯和单克隆均成功实现了目标30kb片段的敲除，不含其上下游同源臂间的30kb片段。
[0107]
4、40kb片段的敲除
[0108]
合成转录靶向待敲除40kb片段的2grna，记为40-2grna，其序列为序列表中序列7，序列7的第56-136位和第206-286位分别转录两个sgrna的靶序列。
[0109]
以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的基因组dna为模板，利用40-h2f和40-h2r组成的引物对进行pcr扩增，得到含有下游同源臂40kh2的pcr产物。所用引物序列如下：
[0110]
40-h2f：
[0111]
40-h2r：ttttcccagtcacgacggctatcggcattttgtttcaccg。
[0112]
将40-2grna、上文所得含有上游同源臂h1的pcr产物、含有下游同源臂40kh2的pcr产物以及实施例1的pgvector质粒骨架通过gibson组装克隆试剂盒重组，将得到的产物转化到大肠杆菌jm109中，并挑取单克隆提取质粒测序验证，得到的序列正确的重组质粒即为敲除质粒p2gps40，该质粒含有卡那霉素抗性基因(用于大肠杆菌)与壮观霉素抗性基因(用于盐单胞菌)。
[0113]
将敲除质粒p2gps40导入大肠杆菌e.coli s17-1中，将得到的重组菌记为e.coli s17-1/p2gps40。
[0114]
将上文的重组菌halomonas td1.0/pq08和e.coli s17-1/p2gps40菌种分别在添加相应抗生素的lb60和lb培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将重组菌halomonas td1.0/pq08和e.coli s17-1/p2gps40重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于lb20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取
菌苔涂布于含氯霉素和壮观霉素的lb60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h进行转化筛选，将生长出的单克隆利用引物进行pcr扩增进行鉴定，引物对vf和40kvr用以验证是否存在敲除，敲除成功则vf和40kvr能扩增到一条约2400bp条带，vf和wtvr用以验证野生型条带是否存在，如果敲除失败则引物对vf和wtvr能扩增到一条约1700bp条带。vf与wtvr的引物同步骤2，40kvr引物序列：40kvr：taccgaggcattgagtgcca。
[0115]
统计纯和率(即敲除成功率)和突变率，随机挑选的32个单克隆的pcr产物的电泳结果如图7所示，利用盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0作为野生型对照。随机挑选的32个单克隆中，3、5、6、12、15、22、29、31号成功敲除，为纯和单克隆，21号为杂合单克隆，其余未发生目的片段的敲除，纯和率为25％，突变率为28.125％。经测序验证所得纯和单克隆均成功实现了目标40kb片段的敲除，不含其上下游同源臂间的40kb片段。
[0116]
5、50kb片段的敲除
[0117]
合成转录靶向待敲除50kb片段的2grna，记为50-2grna，其序列为序列表中序列8，序列8的第56-136位和第206-286位分别转录两个sgrna。
[0118]
以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的基因组dna为模板，利用50-h2f和50-h2r组成的引物对进行pcr扩增，得到含有下游同源臂50kh2的pcr产物。所用引物序列如下：
[0119]
50-h2f：
[0120]
50-h2r：ttttcccagtcacgacggctatatcatcacgtacataggt。
[0121]
将50-2grna、上文所得含有上游同源臂h1的pcr产物、含有下游同源臂50kh2的pcr产物以及实施例1的pgvector质粒骨架通过gibson组装克隆试剂盒重组，将得到的产物转化到大肠杆菌jm109中，并挑取单克隆提取质粒测序验证，得到的序列正确的重组质粒即为敲除质粒p2gps50，该质粒含有卡那霉素抗性基因(用于大肠杆菌)与壮观霉素抗性基因(用于盐单胞菌)。
[0122]
将敲除质粒p2gps50导入大肠杆菌e.coli s17-1中，将得到的重组菌记为e.coli s17-1/p2gps50。
[0123]
将上文的重组菌halomonas td1.0/pq08和e.coli s17-1/p2gps50菌种分别在添加相应抗生素的lb60和lb培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将重组菌halomonas td1.0/pq08和e.coli s17-1/p2gps50重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于lb20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔涂布于含氯霉素和壮观霉素的lb60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h进行转化筛选，将生长出的单克隆利用引物进行pcr扩增进行鉴定，引物对vf和50kvr用以验证是否存在敲除，敲除成功则vf和50kvr能扩增到一条约2400bp条带，vf和wtvr用以验证野生型条带是否存在，如果敲除失败则引物对vf和wtvr能扩增到一条约1700bp条带。vf与wtvr的引物同步骤2，50kvr引物序列：50kvr：cgtaggtagccatcgtacga。
[0124]
统计纯和率(即敲除成功率)和突变率，随机挑选的32个单克隆的pcr产物的电泳结果如图8所示，利用盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0作为野生型对照。随机挑选的32个单克隆中，2、7、9、22号成功敲除，为纯和单克隆，22号为杂合单克隆，其余未发生目的片段的敲除，纯和率为12.5％，突变率为15.6％。经测序验证所得纯和单克隆均成功实现了目标50kb片段的敲除，不含其上下游同源臂间的50kb片段。
[0125]
6、双sgrna结合recet重组系统在盐单胞菌中敲除50kb dna大片段
[0126]
利用步骤5中的敲除质粒p2gps50与实施例2所得pq08-recet分别敲除盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0的50kb片段。具体步骤如下：
[0127]
将敲除质粒p2gps50导入大肠杆菌e.coli s17-1中，将得到的重组菌记为e.coli s17-1/p2gps50。以实施例2所得pq08-recet作为待转化质粒，以盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0作为目的盐单胞菌，按照步骤1的方法将pq08-recet导入盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0中，得到重组菌halomonas td1.0/pq08-recet。
[0128]
将所得重组菌halomonas td1.0/pq08-recet和e.coli s17-1/p2gps50菌种分别在添加相应抗生素的lb60和lb培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将重组菌halomonas td1.0/pq08和e.coli s17-1/p2gps50重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于lb20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔涂布于含氯霉素和壮观霉素的lb60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h进行转化筛选，将生长出的单克隆利用引物进行pcr扩增进行鉴定，鉴定方法同步骤5。
[0129]
统计纯和率(即敲除成功率)和突变率，随机挑选的16个单克隆的pcr产物的电泳结果如图9所示，利用盐单胞菌(halomonas bluephagenesis)td1.0作为野生型对照。随机挑选的16个单克隆中，1、3、7、11号成功敲除，为纯和单克隆，2、4、5、6、9、12号为杂合单克隆，其余未发生目的片段的敲除，纯和率为25％，突变率为62.5％。经测序验证所得纯和单克隆均成功实现了目标50kb片段的敲除，不含其上下游同源臂间的50kb片段。
[0130]
该方法能够在盐单胞菌中实现20-50kb大片段dna的敲除，但随着片段的延长，敲除效率下降，本发明进一步通过在系统中添加recet重组系统，成功提高了更大片段(如50kb)的敲除率。
[0131]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。