1.nk细胞类外泌体(nkem)的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
s101:分离:把nk细胞培养物转入500ml离心管,2000rpm离心20分钟;上清为nk细胞培养上清液,沉淀为nk细胞;
s102:收集:把nk细胞培养上清液分装在50ml锥底离心管中,2000xg离心30分钟去除细胞碎片;把去除碎片后的nk细胞培养上清液(nks)收集在新的容器中,约1000ml,含有大量的nk细胞外泌体(nke);
s103:悬浮:用生理盐水悬浮s101沉淀中的nk细胞,离心洗涤一次,再悬浮在生理盐水中,调整nk细胞浓度为2*107/ml,约500ml;
s104:冻融:把s103的nk细胞悬浮液放液氮中快速冷冻,然后37℃水浴充分融解;重复冻融5次,形成nk细胞裂解液;
s105:挤压:将s104的nk细胞裂解液用liposofastlf-50,经10um、1um、200nm3个不同孔径的聚碳酸酯滤膜依次挤压5次,形成约150nm的nk细胞脂质体样纳米颗粒(nkl);
s106:合并:把s105的nkl与s101收集的nks合并形成nkls,共约1500ml;
s107:浓缩纯化:用切向流过滤(tff)系统,300k中空纤维去除nkls中的细胞代谢小分子产物及nk细胞挤压过程中产生的除脂质体之外的细胞碎片,截留nke及nkl,并浓缩至300ml,获得80-150nm的nke及nkl混合物,即nk细胞类外泌体(nkem)。
2.根据权利要求1所述的nk细胞类外泌体(nkem)的制备方法,其特征在于,在所述的s101之前,还包括:
s100:制备nk细胞外泌体(nke)。
3.根据权利要求2所述的nk细胞外泌体(nke)的制备方法,其特征在于:在所述的s100中,采用lifetechnology的总外泌体分离(tei)试剂盒,富集nk细胞培养上清液中的外泌体,包括以下步骤:
s1001:收集nk细胞培养上清液,分装在50ml锥底离心管中,2000xg离心30分钟;
s1002:把上清液转入两个新离心管,加入0.5倍体积的tei试剂,彻底混匀,4度孵育过夜,次日10,000xg离心1小时;
s1003:吸出上清液,把沉淀悬浮在5mlpbs中;
s1004:10,000xg离心1小时,吸出上清液,把沉淀悬浮在20mlpbs中,即为80-150nm的nke,分装后-20度保存备用。
4.根据权利要求1所述的nk细胞类外泌体(nkem)的制备方法,其特征在于,在所述的s100之前,还包括:
s90:nk细胞培养。
5.根据权利要求4所述的nk细胞类外泌体(nkem)的制备方法,其特征在于,在所述的s90中,包括以下步骤:
s901:采集50ml健康人抗凝外周血;
s902:用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞;
s903:用nk细胞体外培养试剂盒制备nk细胞,按试剂盒说明书在x-vivo15无血清培养液中添加il-2及膜嵌合细胞因子,37℃、5%co2孵箱培养约14天;
s904:nk细胞计数:用血细胞计数板对培养的hank细胞计数,1l培养液中共有4.8×109个nk细胞。
6.nk细胞类外泌体(nkem)的应用,其特征在于,应用上述权利要求1至5任一项所述的nk细胞外泌体(nke)及nk细胞类外泌体(nkem)。