TLR9基因人源化的动物模型的构建方法及应用与流程

tlr9基因人源化的动物模型的构建方法及应用
技术领域
1.本申请涉及基因人源化改造动物模型的建立方法及应用技术领域，具体而言，涉及基于一种编码人源化tlr9蛋白的基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。


背景技术：

2.天然免疫在微生物感染早期具有重要作用，参与天然免疫应答的细胞通过识别病原微生物中具有保守序列的结构后，迅速启动天然免疫应答。作为识别病原体并快速启动反应的蛋白，toll样受体家族在对抗外来病原微生物的天然免疫中发挥了重要作用。其中toll样受体9(tlr9)为i型跨膜蛋白，分为信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区四部分，胞外区由25个富含亮氨酸的重复序列(lrr)组成，是哺乳动物细胞识别病毒和细菌基因组中的非甲基化胞嘧啶
‑
磷酸
‑
鸟嘌呤二核苷酸序列(cpg)的主要受体。已有研究发现tlr9不仅表达在固有免疫系统中(包括树突细胞、b细胞和巨噬细胞等免疫细胞)，还表达在人的气管黏膜上皮、消化道、胰腺等组织，以及多种实体瘤和血液瘤细胞上。
3.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(scheer n，snaith m，wolf ct，seibler j.generation and utility of genetically humanized mouse models，drug discov today；18(23
‑
24)：1200
‑
11，2013)。
4.已有研究表明tlr9信号通路在感染性疾病、变应性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤防控应用等方面发挥重要作用。但不同种属中tlr9识别的配体不同，因此不能用普通小鼠进行抗人tlr9靶向药物的筛选。考虑tlr9在免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效，本发明在提供一种建立人源化tlr9基因改造动物模型的新方法，得到的tlr9基因人源化动物可作为新药研发和临床前研究的工具，用于药物筛选等用途。


技术实现要素：

5.本发明的第一方面，提供了一种tlr9基因人源化的动物模型的构建方法，所述的动物模型体内表达人或人源化tlr9蛋白，所述的动物模型内源tlr9蛋白表达降低或缺失。
6.优选的，所述的人源化tlr9蛋白包含人tlr9蛋白的胞外区，进一步优选包含下列
组中的一种：
7.a)seq id no：4第26
‑
818位所示氨基酸序列；
8.b)与seq id no：4第26
‑
818位所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
9.c)与seq id no：4第26
‑
818位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
10.d)与seq id no：4第26
‑
818位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
11.优选的，所述的人源化tlr9蛋白还包含动物模型内源tlr9蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞内区。进一步优选的，所述的人源化tlr9蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
12.a)seq id no：12所示氨基酸序列；
13.b)与seq id no：12所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
14.c)与seq id no：12所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
15.d)与seq id no：12所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
16.优选的，所述的动物模型的基因组中包含人tlr9基因的2号外显子的部分序列。进一步优选包含编码人tlr9胞外区的2号外显子核苷酸序列。更进一步优选包含下列组中的一种：
17.(a)seq id no：7所示核苷酸序列；
18.(b)与seq id no：7所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
19.(c)与seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
20.(d)具有seq id no：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
21.优选的，所述的动物模型的基因组中包含人源化tlr9基因，所述的人源化tlr9基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
22.(a)seq id no：11所示核苷酸序列；
23.(b)与seq id no：11所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
24.(c)与seq id no：11所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
25.(d)具有seq id no：11所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
26.(e)包含seq id no：8、seq id no：9和/或seq id no：10所示核苷酸序列；
27.(f)与包含seq id no：8、seq id no：9和/或seq id no：10所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
28.(g)与包含seq id no：8、seq id no：9和/或seq id no：10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
29.(h)具有包含seq id no：8、seq id no：9和/或seq id no：10所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
30.优选的，所述的构建方法包括将人tlr9基因的2号外显子部分核苷酸序列可操作的连接在非人动物tlr9基因座上。进一步优选包括将编码人tlr9蛋白胞外区的核苷酸序列可操作的连接在非人动物tlr9基因座上。
31.在本发明的一个具体实施方式中，包括将人tlr9基因的2号外显子部分核苷酸序列替换非人动物tlr9基因2号外显子部分核苷酸序列。
32.在本发明的一个具体实施方式中，包括将编码人tlr9蛋白胞外区的核苷酸序列替换编码非人动物tlr9蛋白胞外区的核苷酸序列。
33.在本发明的一个具体实施方式中，包括将编码人tlr9蛋白胞外区的核苷酸序列替换编码非人动物tlr9蛋白胞外区和跨膜区n端1
‑
5个氨基酸的核苷酸序列。
34.优选的，使用靶向载体进行动物模型的构建，所述的靶向载体包含人tlr9的2号外显子部分核苷酸序列。优选包含编码胞外区的核苷酸序列。进一步优选包含seq id no：7。
35.优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，所述的5’臂或3’臂与ncbi登录号为nc_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。优选自tlr9基因基因组d na的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂如seq id no：5所示，所述的3’臂序列如seq id no：6所示。
36.本发明的第二方面，提供了一种人源化tlr9蛋白，所述的人源化tlr9蛋白包含人tlr9蛋白的全部或部分。优选包含人tlr9蛋白的胞外区。进一步优选包含seq id no：4第26
‑
818位所示氨基酸序列。
37.优选的，所述的人源化tlr9蛋白的氨基酸序列中至少5至793个连续序列与人tlr9蛋白的氨基酸序列一致，且所述的人源化tlr9蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。进一步优选的，所述的人源化tlr9蛋白的氨基酸序列中至少10至100个连续序列与人tlr9蛋白的氨基酸序列一致。
38.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化tlr9蛋白的氨基酸序列中至少7、10、20、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750个或期间的任一数字个连续或不连续序列与人tlr9蛋白的氨基酸序列一致。
39.优选的，所述的人源化tlr9蛋白还包含非人动物tlr9蛋白的部分。进一步优选包含非人动物tlr9蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞内区。更优选包含seq id no：2第1
‑
25位和/或第820
‑
1032位。
40.优选的，所述的人源化tlr9蛋白包含信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区。
41.优选的，所述的人源化tlr9蛋白中胞外区部分的氨基酸序列为至少5至793个连续序列与人tlr9蛋白胞外区的氨基酸序列一致，且所述的人源化tlr9蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。进一步优选的，所述的人源化tlr9蛋白中胞外区部分的氨基酸序列为至少10至100个连续序列与人tlr9蛋白胞外区的氨基酸序列一致。
42.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化tlr9蛋白中胞外区部分的氨基酸序列为至少7、10、20、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、
700、750个或期间的任一数字个连续或不连续序列与人tlr9蛋白胞外区的氨基酸序列一致。
43.进一步优选的，所述的非人动物tlr9蛋白的部分包含信号肽和/或胞内区。
44.优选的，所述的非人动物tlr9蛋白的部分包含人tlr9外显子1编码的氨基酸序列。进一步优选的，所述的非人动物tlr9蛋白的部分还包含人tlr9外显子2编码信号肽的氨基酸序列。
45.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化tlr9蛋白包含信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞内区；其中，所述的胞外区包含来源于人tlr9蛋白胞外区的全部或部分，所述的信号肽和/或胞内区来源于非人动物tlr9蛋白，优选的，所述的跨膜区来源于人和/或非人动物tlr9蛋白。
46.优选的，所述的人tlr9蛋白的部分，其氨基酸序列包含由人tlr9外显子1
‑
2的全部或部分核苷酸序列编码的氨基酸序列。进一步优选的，所述的人tlr9蛋白的部分，其氨基酸序列包含由人tlr9外显子1和/或外显子2的全部或部分核苷酸序列编码。最为优选的，所述的人tlr9蛋白的部分，其氨基酸序列包含人tlr9外显子2的全部或部分核苷酸序列编码的氨基酸序列。
47.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人tlr9外显子2的部分核苷酸序列为编码不含信号肽的胞外区的全部或部分核苷酸序列。
48.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人tlr9蛋白的部分，其氨基酸序列包含下列组中的一种：
49.a)seq id no：4或seq id no：4第26
‑
818位所示氨基酸序列的全部或部分；
50.b)与seq id no：4或seq id no：4第26
‑
818位所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
51.c)与seq id no：4或seq id no：4第26
‑
818位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
52.d)与seq id no：4或seq id no：4第26
‑
818位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
53.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化tlr9蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
54.a)seq id no：12所示氨基酸序列的全部或部分；
55.b)与seq id no：12所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
56.c)与seq id no：12所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
57.d)与seq id no：12所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
58.e)人源化tlr9蛋白中来源于人tlr9蛋白的全部或部分氨基酸序列为seq id no：4所示氨基酸序列的全部或部分；
59.f)人源化tlr9蛋白中来源于人tlr9蛋白的全部或部分氨基酸序列与seq id no：4所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至
少99％；
60.g)人源化tlr9蛋白中来源于人tlr9蛋白的全部或部分氨基酸序列与seq id no：4所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
61.h)人源化tlr9蛋白中来源于人tlr9蛋白的全部或部分氨基酸序列与seq id no：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
62.i)人源化tlr9蛋白中来源于非人动物tlr9蛋白的全部或部分氨基酸序列为seq id no：2所示氨基酸序列的全部或部分；
63.j)人源化tlr9蛋白中来源于非人动物tlr9蛋白的全部或部分氨基酸序列与seq id no：2所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
64.k)人源化tlr9蛋白中来源于非人动物tlr9蛋白的全部或部分氨基酸序列与seq id no：2所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，1)人源化tlr9蛋白中来源于非人动物tlr9蛋白的全部或部分氨基酸序列与seq id no：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
65.本发明的第三方面，提供了一种人源化tlr9基因，所述的人源化tlr9基因包含人tlr9基因的全部或部分。优选包含人tlr9基因2号外显子的部分核苷酸序列。更优选包含编码人tlr9胞外区的核苷酸序列。更进一步优选包含seq id no：7。
66.优选还包含编码非人动物tlr9信号肽、跨膜区和/或胞内区的核苷酸序列。
67.优选的，所述的人源化tlr9基因的核苷酸序列连续30
‑
2379个与人tlr9基因序列一致，且其编码的tlr9蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。进一步优选的，所述的人源化tlr9基因的核苷酸序列连续50
‑
1000个与人tlr9基因序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化tlr9基因的核苷酸序列连续或不连续30、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2300个或期间的任一数字个核苷酸序列与人tlr9基因核苷酸序列一致。
68.优选的，所述的人源化tlr9基因还包含非人动物tlr9基因的部分。
69.优选的，所述的人tlr9基因的部分，其核苷酸序列包含人tlr9外显子1
‑
2的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，所述的人tlr9基因的部分，其核苷酸序列包含由人tlr9外显子1和/或外显子2的全部或部分核苷酸序列。
70.最为优选的，所述的人tlr9基因的部分，其核苷酸序列包含人tlr9外显子2的全部或部分核苷酸序列。
71.其中，所述的人tlr9外显子2的部分核苷酸序列中连续30
‑
2379个与人tlr9基因序列一致，且其编码的tlr9蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。进一步优选的，所述的人tlr9外显子2的部分核苷酸序列中连续50
‑
1000个与人tlr9基因序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的人tlr9外显子2的部分核苷酸序列连续或不连续30、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2300个或期间的任一数字个核苷酸序列与人tlr9基因核苷酸序列一致。
72.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人tlr9外显子2的部分核苷酸序列为编
码除信号肽外的人tlr9胞外区的全部或部分核苷酸序列。即所述的人tlr9基因的部分包含编码人tlr9胞外区的全部或部分核苷酸序列。
73.优选的，所述的人源化tlr9基因编码的蛋白包含信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区。进一步优选的，所述的人tlr9基因的部分，其核苷酸序列包含编码人tlr9胞外区的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选的，所述的人tlr9基因的部分，其核苷酸序列不包含编码人tlr9信号肽的核苷酸序列。
74.进一步优选的，所述的非人动物tlr9基因的部分，其核苷酸序列包含编码信号肽、跨膜区和/或胞内区的核苷酸序列。
75.再进一步优选的，所述的非人动物tlr9基因的部分，其核苷酸序列包含编码信号肽和/或胞内区的核苷酸序列。
76.优选的，所述的非人动物tlr9基因的部分，其核苷酸序列包含tlr9基因的外显子1全部核苷酸序列。
77.进一步优选的，所述的非人动物tlr9基因的部分，其核苷酸序列还包含tlr9基因的外显子2中编码信号肽的核苷酸序列。
78.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化tlr9基因编码的蛋白包含信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞内区；其中，所述的胞外区包含编码人tlr9基因胞外区的全部或部分核苷酸序列，所述的信号肽和/或胞内区来源于编码非人动物tlr9蛋白的核苷酸序列，优选的，所述的跨膜区来源于编码人和/或非人动物tlr9蛋白的核苷酸序列。
79.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人tlr9基因的部分，其核苷酸序列包含下列组中的一种：
80.(a)seq id no：3或seq id no：7所示核苷酸序列的全部或部分；
81.(b)与seq id no：3或seq id no：7所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
82.(c)与seq id no：3或seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
83.(d)具有seq id no：3或seq id no：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
84.优选的，所述的人源化tlr9基因编码上述的人源化tlr9蛋白。
85.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化tlr9基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：
86.(a)seq id no：11所示核苷酸序列的全部或部分；
87.(b)与seq id no：11所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
88.(c)与seq id no：11所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
89.(d)具有seq id no：11所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
90.(e)为包含seq id no：8、seq id no：9和/或seq id no：10所示核苷酸序列的全部或部分；
91.(f)与包含seq id no：8、seq id no：9和/或seq id no：10所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
92.(g)与包含seq id no：8、seq id no：9和/或seq id no：10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
93.(h)具有包含seq id no：8、seq id no：9和/或seq id no：10所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
94.(i)人源化tlr9基因中来源于人tlr9基因的全部或部分核苷酸序列为seq id no：3所示核苷酸序列的全部或部分；
95.(j)人源化tlr9基因中来源于人tlr9基因的全部或部分核苷酸序列与seq id no：3所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
96.(k)人源化tlr9基因中来源于人tlr9基因的全部或部分核苷酸序列与seq id no：3所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
97.(1)人源化tlr9基因中来源于人tlr9基因的全部或部分核苷酸序列具有seq id no：3所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
98.(m)人源化tlr9基因中来源于非人动物tlr9基因的全部或部分核苷酸序列为seq id no：1所示核苷酸序列的全部或部分；
99.(n)人源化tlr9基因中来源于非人动物tlr9基因的全部或部分核苷酸序列与seq id no：1所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
100.(o)人源化tlr9基因中来源于非人动物tlr9基因的全部或部分核苷酸序列与seq id no：1所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或(p)人源化tlr9基因中来源于非人动物tlp9基因的全部或部分核苷酸序列具有seq id no：1所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
101.优选的，所述的人源化tlr9基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet
‑
offsystem/tet
‑
on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
102.优选的，所述人源化tlr9基因小鼠tlr9 d na的非模板链、编码链或有义链包含序列seq id no：7。
103.本发明的第四方面，提供了一种tlr9基因的靶向载体，所述的靶向载体包含人tlr9的2号外显子部分核苷酸序列。优选包含编码胞外区的核苷酸序列。进一步优选包含seq id no：7。优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，所述的5’臂或3’臂与ncbi登录号为nc_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选自tlr9基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；进一步优选的，所述的5’臂如seq id no：5所示，所述的3’臂序列如seq id no：6所示。
104.优选的，所述的靶向载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人tlr9基因的全部或部分。
105.优选的，所述的供体dna序列包含人tlr9外显子1
‑
2的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，所述的供体dna序列包含人tlr9外显子2的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选的，所述的供体dna序列包含编码人tlr9胞外区的全部或部分核苷酸序列。再进一步优选的，所述的供体dna序列不包含编码人tlr9信号肽的核苷酸序列。最为优选的，所述的供体dna序列包含seq id no：7。
106.优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自tlr9基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列如seq id no：5所示。
107.优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段，即3’臂，其选自tlr9基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述3’臂序列如seq id no：6所示。
108.优选的，所述的待改变的转换区位于tlr9基因的外显子2上。
109.优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
110.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
111.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点(也可选择常规的loxp重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
112.本发明的第五方面，提供了一种包含上述的靶向载体的细胞。
113.本发明的第六方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的细胞在tlr9基因编辑中的应用。
114.优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换tlr9基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列。
115.进一步优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换tlr9基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列。
116.本发明的第七方面，提供了一种tlr9基因人源化的动物模型，所述的动物模型体内表达人或人源化tlr9蛋白。
117.本发明的第八方面，提供了一种tlr9基因人源化的动物模型的构建方法，所述的动物模型体内表达人或人源化tlr9蛋白。
118.优选的，所述的动物模型内源tlr9蛋白表达降低或缺失。
119.优选的，所述的人源化tlr9蛋白包含人tlr9蛋白的全部或部分。
120.优选的，所述的人源化tlr9蛋白的氨基酸序列中至少5至793个连续序列与人tlr9蛋白的氨基酸序列一致，且所述的人源化tlr9蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。进一步优选的，所述的人源化tlr9蛋白的氨基酸序列中至少10至100个连续序列与人tlr9蛋白的氨基酸序列一致。
121.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化tlr9蛋白的氨基酸序列中至少7、10、20、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750个或期间的任一数字个连续序列与人tlr9蛋白的氨基酸序列一致。
122.优选的，所述的人tlr9蛋白的部分包含人tlr9蛋白的胞外区全部或部分。
123.优选的，所述的人tlr9蛋白的部分，其氨基酸序列包含由人tlr9外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列编码。进一步优选的，所述的人tlr9蛋白的部分，其氨基酸序列包含由人tlr9外显子1和/或外显子2的全部或部分核苷酸序列编码。最为优选的，所述的人tlr9蛋白的部分，其氨基酸序列包含由人tlr9外显子2的全部或部分核苷酸序列编码的氨基酸序列。
124.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人tlr9外显子2的部分核苷酸序列为编码不含信号肽的胞外区的全部或部分核苷酸序列。
125.优选的，所述的人源化tlr9蛋白还包含非人动物tlr9蛋白的部分。进一步优选的，所述的非人动物tlr9蛋白的部分包含信号肽、跨膜区和/或胞内区。
126.最为优选的，所述的人源化tlr9蛋白选自上述的任一的人源化tlr9蛋白。
127.优选的，所述的tlr9基因人源化的动物模型的基因组中包含人tlr9基因的全部或部分。进一步优选的，所述的人tlr9基因的部分，其核苷酸序列包含人tlr9外显子1
‑
2的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选的，所述的人tlr9基因的部分，其核苷酸序列包含人tlr9外显子2的全部或部分核苷酸序列；再进一步优选的，所述的人tlr9基因的部分，其核苷酸序列包含编码人tlr9胞外区的全部或部分核苷酸序列。最为优选的，所述的人tlr9基因的部分，其核苷酸序列不包含编码人tlr9信号肽的核苷酸序列。
128.在本发明的一个具体实施方式中，所述的tlr9基因人源化的动物模型的基因组中包含上述的人源化tlr9基因。
129.优选的，将人源化tlr9基因或者人tlr9基因的全部或部分核苷酸序列可操作的连接在非人动物tlr9基因座上，获得tlr9基因人源化的动物模型。
130.优选的，所述的人源化tlr9基因在动物模型中通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源性或者外源性。
131.优选的，所述的调控元件包括但不限于启动子。
132.在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源性调控元件来自非人动物tlr9基因，所述的外源性调控元件来自人tlr9基因。
133.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化tlr9基因在动物模型中通过内源调控元件进行调控。
134.优选的，所述的tlr9基因人源化的动物模型是纯合或杂合的。
135.优选的，使用基因编辑技术进行tlr9基因人源化的动物模型的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
136.在本发明的一个具体实施方式中，破坏非人动物tlr9基因的编码框，将编码人tlr9蛋白的全部或部分核苷酸序列或者本发明所述的人源化tlr9基因核苷酸序列插入非人动物tlr9基因内源调控元件之后，获得tlr9基因人源化的动物模型。优选的，所述的破坏非人动物tlr9基因的编码框可以采用敲除非人动物tlr9基因的功能区或者采用插入一段
序列，使得非人动物tlr9蛋白不表达或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的破坏非人动物tlr9基因的编码框可以为敲除非人动物tlr9基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列。
137.在本发明的一个具体实施方式中，将编码人tlr9蛋白的全部或部分核苷酸序列或者本发明所述的人源化tlr9基因核苷酸序列，和辅助序列插入非人动物tlr9基因内源调控元件之后，获得tlr9基因人源化的动物模型。优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子，使得tlr9基因人源化的动物模型体内表达人tlr9蛋白，不表达非人动物tlr9蛋白。进一步优选的，所述的辅助序列为wpre和/或polya。
138.在本发明的一个具体实施方式中，将编码人tlr9蛋白的全部或部分核苷酸序列或者本发明所述的人源化tlr9基因核苷酸序列替换非人动物tlr9基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列，获得tlr9基因人源化的动物模型。
139.在本发明的一个具体实施方式中，将人tlr9基因的全部或部分替换非人动物tlr9基因的全部或部分，获得tlr9基因人源化的动物模型。
140.在本发明的一个具体实施方式中，将人tlr9基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列替换非人动物tlr9基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列，获得tlr9基因人源化的动物模型。
141.在本发明的一个具体实施方式中，将人tlr9基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列替换非人动物tlr9基因外显子2的全部或部分核苷酸序列，获得tlr9基因人源化的动物模型。
142.优选的，用人tlr9基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列替换非人动物tlr9基因外显子2的全部或部分核苷酸序列。
143.进一步优选的，用编码人tlr9蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列替换非人动物tlr9基因编码胞外区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列。
144.最为优选的，用编码人tlr9蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列替换非人动物tlr9基因编码胞外区的全部或部分核苷酸序列。
145.在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的任一靶向载体实现上述任一所述的替换。
146.优选的，也可以使用靶位点位于tlr9基因外显子2上的sgrna序列靶向，实现上述任一替换或插入。
147.本发明的第九方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括如下步骤：
148.i)提供上述的tlr9基因人源化的动物模型，或者采用上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型；
149.ii)将步骤i)获得的tlr9基因人源化的动物模型与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
150.优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因cd137、lag
‑
3、ctla
‑
4、tim
‑
3、btla、4
‑
1bb、cd27、cd28、cd47、tigit、gitr、ox40、pd
‑
1或pd
‑
l1修饰的非人动物。
151.优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基
因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
152.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
153.本发明的第十方面，提供了一种tlr9基因人源化的细胞、组织、器官或荷瘤后的瘤组织，所述的细胞、组织、器官或荷瘤后的瘤组织表达权利要求9
‑
10任一所述的人源化tlr9蛋白，优选的，所述的细胞、组织、器官或荷瘤后的瘤组织的基因组中包含权利要求11
‑
12任一所述的人源化tlr9基因
154.本发明的第十一方面，提供了一种上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型或其子代及多基因修饰的非人动物或其子代。
155.本发明的第十二方面，提供了一种荷瘤或炎症的动物模型，所述的动物模型来源于上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型、上述的tlr9基因人源化的动物模型、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物或者上述的多基因修饰的非人动物或其子代。
156.本发明的第十三方面，提供了一种荷瘤或炎症的动物模型的制备方法，所述的制备方法包括提供上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型、上述的tlr9基因人源化的动物模型、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物或者上述的多基因修饰的非人动物或其子代。优选的，所述的制备方法还包括植入肿瘤细胞的步骤。
157.本发明的第十四方面，提供了上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型、上述的tlr9基因人源化的动物模型、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物或者上述的多基因修饰的非人动物或其子代在构建荷瘤或炎症的动物模型中的应用。
158.本发明的第十五方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型、上述的tlr9基因人源化的动物模型、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。
159.本发明的第十六方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型、上述的tlr9基因人源化的动物模型、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。
160.本发明的第十七方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型、上述的tlr9基因人源化的动物模型、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。
161.本发明的第十八方面，提供了一种tlr9基因人源化的细胞株，所述的细胞株表达人或人源化tlr9蛋白。
162.优选的，所述的细胞株中内源tlr9蛋白表达降低或缺失。
163.优选的，所述的人源化tlr9蛋白包含人tlr9蛋白的全部或部分。
164.优选的，所述的人源化tlr9蛋白的氨基酸序列中至少5至793个连续序列与人tlr9蛋白的氨基酸序列一致，且所述的人源化tlr9蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。进一
步优选的，所述的人源化tlr9蛋白的氨基酸序列中至少10至100个连续序列与人tlr9蛋白的氨基酸序列一致。
165.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化tlr9蛋白的氨基酸序列中至少7、10、20、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750个或期间的任一数字个连续序列与人tlr9蛋白的氨基酸序列一致。
166.优选的，所述的人tlr9蛋白的部分包含人tlr9蛋白的胞外区全部或部分。
167.优选的，所述的人tlr9蛋白的部分，其氨基酸序列包含由人tlr9外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列编码。进一步优选的，所述的人tlr9蛋白的部分，其氨基酸序列包含由人tlr9外显子1和/或外显子2的全部或部分核苷酸序列编码。最为优选的，所述的人tlr9蛋白的部分，其氨基酸序列包含由人tlr9外显子2的全部或部分核苷酸序列编码的氨基酸序列。
168.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人tlr9外显子2的部分核苷酸序列为编码不含信号肽的胞外区的全部或部分核苷酸序列。
169.优选的，所述的人源化tlr9蛋白还包含非人动物tlr9蛋白的部分。进一步优选的，所述的非人动物tlr9蛋白的部分包含信号肽、跨膜区和/或胞内区。
170.最为优选的，所述的人源化tlr9蛋白选自上述任一的人源化tlr9蛋白。
171.优选的，所述的细胞株的基因组核苷酸序列中包含人tlr9基因的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，所述的人tlr9基因的部分核苷酸序列包含人tlr9外显子1
‑
2的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选的，所述的人tlr9基因的部分核苷酸序列包含人tlr9外显子2的全部或部分核苷酸序列。再进一步优选的，所述的人tlr9基因的部分核苷酸序列包含编码人tlr9胞外区的全部或部分核苷酸序列。最为优选的，所述的人tlr9基因的部分核苷酸序列不包含编码人tlr9信号肽的核苷酸序列。
172.在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞株的基因组中包含上述任一的人源化tlr9基因。
173.本发明的第十九方面，提供了一种tlr9基因人源化的细胞株的构建方法，使用基因编辑技术进行细胞株的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
174.优选的，所述的构建方法包括将人源化tlr9基因或者人tlr9基因的全部或部分核苷酸序列可操作的连接在非人动物细胞tlr9基因座上。
175.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括破坏非人动物细胞tlr9基因的编码框，将编码人tlr9蛋白的全部或部分核苷酸序列或者本发明所述的人源化tlr9基因核苷酸序列插入非人动物细胞tlr9基因内源调控元件之后。优选的，所述的破坏非人动物细胞tlr9基因的编码框可以采用敲除非人动物细胞tlr9基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物细胞tlr9蛋白不表达或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的破坏非人动物细胞tlr9基因的编码框可以为敲除非人动物细胞tlr9基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列。
176.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人tlr9蛋白的全部或部分核苷酸序列或者本发明所述的人源化tlr9基因核苷酸序列，和辅助序列插入非人动
物细胞tlr9基因内源调控元件之后。优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子，使得细胞表达人tlr9蛋白，不表达非人动物细胞内源tlr9蛋白。进一步优选的，所述的辅助序列为wpre和/或polya。
177.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人tlr9蛋白的全部或部分核苷酸序列或者本发明所述的人源化tlr9基因核苷酸序列替换非人动物细胞tlr9基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列。
178.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将人tlr9基因的全部或部分替换非人动物细胞tlr9基因的全部或部分。
179.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将人tlr9基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列替换非人动物细胞tlr9基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列。
180.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将人tlr9基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列替换非人动物细胞tlr9基因外显子2的全部或部分核苷酸序列。
181.优选的，使用上述的任一靶向载体将人tlr9基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列替换非人动物tlr9基因外显子2的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，也可以使用靶位点位于tlr9基因外显子2上的sgrna序列靶向，实现该替换或插入。
182.本发明所述的非人动物为非人哺乳动物。优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备tlr9基因人源化的动物模型的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。
183.本发明的第二十方面，提供了一种包含上述人源化tlr9基因的构建体。优选的，所述的构建体表达人或人源化tlr9蛋白。
184.本发明的第二十一方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
185.本发明的第二十二方面，提供了一种包含上述细胞的组织。
186.本发明的第二十三方面，提供了来源于上述的人源化tlr9蛋白、上述的人源化tlr9基因、上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型、上述的tlr9基因人源化的动物模型、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症的动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞株、上述的构建体、上述的细胞或者上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究tlr9功能、人tlr9信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用；以及制备筛选、验证、评价或研究tlr9功能、人tlr9信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效的产品中的应用。
187.本发明的第二十四方面，提供了来源于上述的tlr9基因人源化的动物模型、上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型用作人tlr9特异性调节剂的筛选。
188.本发明的第二十五方面，提供了一种人tlr9特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型、上述的tlr9基因人源化的动物模型、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。
189.优选的，所述的调节剂选自car
‑
t、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体。
190.优选的，所述筛选方法不是治疗方法。该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
191.本发明的第二十六方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括向个体体内移植人肿瘤细胞，向移入人肿瘤细胞的动物给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的tlr9基因人源化的动物模型、上述的tlr9基因人源化的动物模型、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。
192.优选的，所述药物筛选或评价的方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
193.优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。
194.优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
195.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
196.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
197.通过上述的技术方案，本发明取得了良好的技术效果，包括：在tlr9基因人源化的动物模型体内正常表达人或人源化tlr9蛋白，以及表达的人源化tlr9蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。
198.本发明所述的“人源化tlr9蛋白”，包含来源于人tlr9蛋白的部分和非人tlr9蛋白的部分，其中，所述“人tlr9蛋白”为人tlr9蛋白的全长氨基酸序列。所述的人tlr9蛋白的部分与非人tlr9蛋白的部分之间可以直接连接或者接头连接，所述的“接头”为柔性接头，优选为肽接头，其氨基酸数目和种类没有限定，只要可以连接人tlr9蛋白的部分与非人tlr9蛋白部分，且不影响人源化tlr9蛋白的功能即可。
199.本发明所述的“人源化tlr9基因”，包含来源于人tlr9基因的部分和非人tlr9基因的部分，所述的“人tlr9基因”为人tlr9基因的全长核苷酸序列。
200.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体；“部分”为整体中的局部，或者整体中的个体。例如“外显子1至外显子2的全部或部分”，“外显子1至外显子2的全部”为整体，即外显子1至外显子2的全部核苷酸序列；“外显子1至外显子2的部分”为整体的局部或整体的个体，即外显子1至外显子2连续或间隔的核苷酸序列。其中，所述的“外显子1至外显子2”包括外显子1至外显子2之间的内含子。
201.本发明所述的“tlr9蛋白”，例如“人tlr9蛋白”、“非人动物tlr9蛋白”或“人源化tlr9蛋白”，均包含信号肽、胞外区、胞内区和/或跨膜区，且本发明所述的“胞外区”均不包含信号肽。
202.本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
203.本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
204.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
205.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecular cloning a laboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschand maniatis(cold spring harbor laboratory press：1989)；dna cloning，volumes i and ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture ofanimal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irl press，1986)；b.perbal，a practical guide to molecularcloning(1984)；the series，methods in enzymology(j.abelson and m.simon，eds.in chief，academic press，inc.，new york)，specifically，vols.154 and 155(wuetal.eds.)and vol.185，
″
gene expression technology
″
(d.goeddel，ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.，1987，cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecula rbiology(mayer and walker，eds.，academic press，london，1987)；handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1986)。
206.在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物。在一个实施方式中，所述tlr9基因人源化的动物模型是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实
施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
207.在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自balb/c、a、a/he、a/j、a/wysn、akr、akr/a、akr/j、akr/n、ta1、ta2、rf、swr、c3h、c57br、sjl、c57l、dba/2、km、nih、icr、cfw、faca、c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola的c57bl、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st、cba/h品系的小鼠及nod、nod/scid、nod
‑
prkdc
scid
il
‑
2rg
null
背景的小鼠。
208.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
209.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
210.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
211.图1：小鼠和人tlr9基因对比示意图(非按比例)；
212.图2：人源化小鼠tlr9基因座示意图(非按比例)；
213.图3：打靶策略示意图(非按比例)；
214.图4：细胞southern blot结果，分别用bamhi、asei、saci或econi消化细胞dna并使用3个探针分别进行杂交，其中wt为野生型；
215.图5：frt重组过程示意图(非按比例)；
216.图6：f1代鼠尾pcr鉴定结果，其中，图(a)使用引物对wt
‑
f1和wt
‑
r用于扩增野生型小鼠tlr9基因2号外显子部分片段；图(b)使用引物对mut
‑
f和wt
‑
r用于扩增改造后的小鼠tlr9基因2号外显子部分片段，用以验证靶向载体是否存在并正确插入基因组位点；图(c)使用引物对frt
‑
f和frt
‑
r用以扩增neo片段以验证抗性片段是否去除；图(d)使用引物对flp
‑
f和flp
‑
r用以确认f中片段的存在；其中，wt为野生型，pc为阳性对照，h2o为水对照，m为marker；
217.图7：脾脏b细胞流式分析结果，其中，图a、c为野生型c57bl/6鼠，图b、d为tlr9基因人源化杂合子小鼠；
218.图8：脾脏nk细胞流式分析结果，其中，图a、c为野生型c57bl/6鼠，图b、d为tlr9基因人源化杂合子小鼠；
219.图9：脾脏dc细胞流式分析结果，其中，图a、c为野生型c57bl/6鼠，图b、d为tlr9基
因人源化杂合子小鼠。
具体实施方式
220.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
221.在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
222.c57bl/6小鼠和flp工具鼠均购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
223.pd
‑
1人源化小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，产品编号为b
‑
cm
‑
001；
224.brilliant violet 510
tm anti
‑
mouse cd45 anhbody来源biolegend，货号103138；
225.percp/cyanine5.5anti
‑
mouse tcrβchainantibody来源biolegend，货号109228；
226.pe anti
‑
mouse cd19antibody(cd19
‑
pe)来源biolegend，货号115508；
227.brilliant violet 605
tm anti
‑
mouse cd11c antibody来源biolegend，货号117334；
228.apc anti
‑
human cd289(tlr9)antibody(htlr9
‑
apc)来源biolegend，货号394807；
229.percp
‑
cy
tm
5.5mouseanti
‑
mousenk
‑
1.1来源bdpharmingen，货号552878；
230.anti
‑
tlr9 antibody[abm4d70](fitc)(mtlr9
‑
fitc)来源abcam，货号ab210925；
[0231]
foxp3/转录因子染色试剂盒(ebioscience
tm foxp3/transcription factor staining buffer set)来源ebioscience，货号00
‑
5523
‑
00；
[0232]
bamhi、asei、econi或saci酶购自neb，货号分别为：r3136m、r0526m、r3101m和r3156m。
[0233]
本发明计划对非人动物(如小鼠)进行改造，使该动物体内包含编码人tlr9蛋白的核苷酸序列的全部或部分，以使其体内表达人或人源化tlr9蛋白。可通过各种基因编辑系统和制备方法得到表达人或人源化tlr9蛋白的非人哺乳动物，包括但不限于利用胚胎干细胞(embryonic stem cell，es)的基因打靶技术、锌指核酸酶(zfn)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(talen)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)、规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr)技术或其他分子生物学技术。本发明实施例主要以es细胞的基因同源重组技术为例，阐述如何通过构建特异靶向小鼠tlr9基因靶向载体实现序列替换得到所述人源化小鼠。
[0234]
实施例1 tlr9基因人源化小鼠
[0235]
小鼠tlr9基因(ncbi gene id：81897，primary source：mgi：1932389，uniprot iid：q9equ3，基于转录本nm_031178.2(seq id no：1)及其编码蛋白np_112455.2(seq id no：2))和人tlr9基因(ncbigeneiid：54106，primary source：hgnc：15633，uniprotiid：q9nr96，基于转录本nm_017442.3(seq id no：3)及其编码蛋白np_059138.1(seq id no：
4))对比示意图如图1所示。
[0236]
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源tlr9基因座的胞外区引入编码人tlr9蛋白胞外区的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化的tlr9蛋白。具体而言，用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在小鼠内源tlr9基因座上用人tlr9基因的序列替换特定小鼠tlr9基因序列。在小鼠tlr9基因调节元件的控制下，如将至少包含小鼠tlr9基因的2号外显子约2.4kb的序列用对应的人基因序列替换，得到小鼠人源化tlr9基因座，示意图如图2所示。
[0237]
进一步的，设计如图3所示的打靶策略，实现人的tlr9蛋白(np_059138.1)的第26
‑
818位氨基酸替换小鼠的tlr9蛋白(np_112455.2)的第26
‑
819位氨基酸，对应的转录本替换策略，实现人的tlr9转录本(nm_017442.3)的第710
‑
3088位碱基替换小鼠的tlr9转录本(nm_031178.2)的第182
‑
2563位碱基，其中图3所示的靶向载体上含有5’同源臂(seq id no：5)、3’同源臂(seq id no：6)以及包含人tlr基因片段的dna片段(以下简称a片段)，其中5’同源臂与ncbi登录号与nc_000075.6的第106218978
‑
106223586位核苷酸序列相同；3’同源臂与ncbi登录号与nc_000075.6的第106227223
‑
106231701位核苷酸序列相同；a片段中人tlr基因片段(seq id no：7)与ncbi登录号与nc_000003.12的第52224240
‑
52221862位核苷酸序列相同，其中，人tlr基因片段和5’同源臂直接连接，人tlr基因的序列下游与鼠基因座的下游连接设计为5
’‑’‑
(seq id no：8)，其中序列“actgt”的最后一个“t”是人序列的最后一个核苷酸，序列的第一个“t”是小鼠序列的第一个核苷酸。a片段上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassette)；neo盒和鼠基因座的上游连接设计为在5
’‑’‑
(seq id no：9)内，其中序列“aacag”的“g”是鼠序列的最后一个核苷酸，序列的“g”是neo盒的第一个核苷酸。neo盒和鼠基因座的下游连接设计为在5
’‑’‑
(seq id no：10)内，其中序列的最后一个“c”是neo盒的最后一个核苷酸，序列“caagg”的“c”是鼠序列的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠tlr的mrna序列及其编码的蛋白序列分别如seq id no：11和seq id no：12所示。
[0238]
此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素a亚基的编码基因(dta))。
[0239]
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体可通过酶切进行初步验证，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经pcr鉴定为阳性的克隆再进行southern blot(分别用bamhi、asei、saci或econi消化细胞dna并使用3个探针进行杂交，见表1)检测，5’探针、3’探针和neo探针分别位于5’同源臂外侧、3’同源臂外侧和neo盒上。结果见如图4所示，检测结果表明8个经pcr验证为阳性的克隆中，有4个克隆(分别为1
‑
a12、1
‑
h09、2
‑
g08、3
‑
f04)确认无随机插入。
[0240]
pcr测定包括下述引物：
[0241]
f1：5
’‑
gctcgactagagcttgcgga
‑3’
(seq id no：13)，
[0242]
r1：5
’‑
ccctgttgtaacatggctttgacg
‑3’
(seq id no：14)；
[0243]
f2：5
’‑
gttgacagactaggataggcccaac
‑3’
(seq id no：15)，
[0244]
r2：5
’‑
caggcacagtcatgatgttg
‑3’
(seq id no：16)；
[0245]
southern blot检测包括如下探针引物：
[0246]5’
探针(5'probe)：
[0247]
f：5
’‑
gacgaggtacatcccaagcaacac
‑3’
(seq id no：17)，
[0248]
r：5
’‑
cacccactgtagccaaaggcttttg
‑3’
(seq id no：18)；
[0249]3’
探针(3'probe)：
[0250]
f：5
’‑
cttctgggtctgaggcagaagtg
‑3’
(seq id no：19)，
[0251]
r：5
’‑
gagaagctgctggtcacgtggaag
‑3’
(seq id no：20)；
[0252]
neo探针(neoprobe)：
[0253]
f：5
’‑
ggatcggccattgaacaagatgg
‑3’
(seq id no：21)，
[0254]
r：5
’‑
cagaagaactcgtcaagaaggcg
‑3’
(seq id no：22)。
[0255]
表1具体探针及目的片段的长度
[0256][0257][0258]
将筛选出的正确阳性克隆按照本领域已知的技术将阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。可将f1代阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到表达人源化tlr9蛋白的人源化纯合子小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的f1代小鼠(已去neo)的鉴定结果见图6，综合图6的四组结果可见，编号为f1
‑
1的小鼠为阳性杂合小鼠。
[0259]
pcr测定包括下述引物：
[0260]
wt
‑
f：5
’‑
tgaacctgacagttctagacgtgagaag
‑3’
(seq id no：23)，
[0261]
wt
‑
r：5
’‑
ccatgccaggcacagatgaaaac
‑3’
(seq id no：24)；
[0262]
mut
‑
f：5
’‑
cggcttcttttccaaggccaag
‑3’
(seq id no：25)；
[0263]
wt
‑
r：5
’‑
ccatgccaggcacagatgaaaac
‑3’
(seq id no：24)；
[0264]
frt
‑
f：5
’‑
gatgaaaggctagtttgtctttgacc
‑3’
(seq id no：26)；
[0265]
frt
‑
r：5
’‑
cacacctttgactctcctctggc
‑3’
(seq id no：27)；
[0266]
flp
‑
f：5
’‑
gacaagcgttagtaggcacatatac
‑3’
(seq id no：28)；
[0267]
flp
‑
r：5
’‑
gctccaatttcccacaacattagt
‑3’
(seq id no：29)。
[0268]
通过常规检测方法可确认小鼠体内人源化tlr9蛋白的表达情况，例如取野生型
c57bl/6小鼠和tlr9基因人源化杂合子小鼠(5
‑
7周龄)各1只，分离脾脏细胞，加入brilliaut violet 510
tm anti
‑
mouse cd45 antibody、percp/cyanine5.5anti
‑
mouse tcrβchain antibody、pe anti
‑
mouse cd19 antibody(cd19
‑
pe)、brilliant violet 605
tm anti
‑
mouse cd11c antibody和percp
‑
cy
tm
5.5mouseanti
‑
mousenk
‑
1.1抗体标记后，使用foxp3/转录因子染色试剂盒(ebioscience
tm
foxp3/transcription factor staining buffer set)进行固定和破膜，具体实验过程按照说明书进行，然后再加入apc anti
‑
human cd289(tlr9)antibody(htlr9
‑
apc)和anti
‑
tlr9 antibody[abm4d70](fitc)(mtlr9
‑
fitc)抗体染色后进行流式检测tlr9蛋白的表达。检测结果表明，可在野生型c57bl/6小鼠和tlr9基因人源化杂合子小鼠的脾脏来源的b细胞(图7a、图7b)、nk细胞(图8a、图8b)、树突细胞(dc)(图9a、图9b)内检测到表达鼠tlr9蛋白的细胞，但只能在tlr9基因人源化杂合子小鼠体内中检测到表达人源化tlr9蛋白的细胞(图7d、图8d、图9d)，不能在野生型c57bl/6小鼠体内检测到表达人或人源化tlr9蛋白的细胞(图7c、图8c、图9c)。
[0269]
其中，流式检测门控策略为，b细胞被定为完整的、单一的、活的，mcd45+，mcd19+；nk细胞被定为完整的、单一的、活的，mcd45+，nk1.1+；dc细胞被定为完整的、单一的、活的，mcd45+，tcrb
‑
，cd11c+。
[0270]
实施例2双重人源化或多基因人源化tlr9小鼠
[0271]
利用实施例1制得的tlr9人源化小鼠制备包含tlr9基因人源化的多基因人源化小鼠模型。如，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞，如，对pd
‑
1人源化小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以得到pd
‑
1和tlr9双基因人源化小鼠模型。也可将tlr9人源化小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到tlr9人源化小鼠与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。
[0272]
实施例3评估药效
[0273]
利用本方法制得的tlr9基因人源化小鼠可以用于评估靶向人tlr9的调节剂药效。例如可以皮下接种小鼠结肠癌细胞mc38，待肿瘤体积生长到约100mm3后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人tlr9的化合物，对照组注射等体积的生理盐水。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，可通过结果比较小鼠体重变化和肿瘤大小即可有效评估化合物的体内安全性和体内药效。
[0274]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0275]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0276]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。