一种辽宁绒山羊毛囊毛乳头细胞分离培养方法

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种辽宁绒山羊毛囊毛乳头细胞的分离培养方法。

背景技术：

羊绒和粗羊毛共同组成绒山羊的被毛，分别由次级毛囊和初级毛囊生长而成。次级毛囊的生长呈现季节周期性变化，生长过程包括三个时期：毛发快速生长的生长期(anagen)、毛发逐步停止生长的退行期(catagen)和毛发完全停止生长的休止期(telogen)。

毛乳头是位于毛囊真皮层的一团特化的成纤维细胞，在毛囊形态发生过程和周期转换过程中具有极其重要的作用，是毛囊的“信号中心”(karlsson等，1999；kulessa等，2000)。毛囊从休止期进入生长期依赖于毛乳头与毛囊干细胞之间信号的相互作用，处于静止状态的毛囊干细胞被毛乳头细胞激活，开始新一轮的毛囊生长周期(morgan等，2017)。在退行时期，毛乳头细胞随着毛根部一起向上移动，直至休止期毛乳头上移至包含毛囊干细胞的隆突部附近，此时毛乳头也进入一个相对静止的状态。

毛乳头细胞不仅对毛囊的周期生长具有调控作用，对毛发纤维的粗细和毛囊的大小也具有调控作用，从而直接影响羊绒的质量与产量(toyoshima等，2017；morgan，2014)。毛乳头细胞的研究已逐渐成为毛囊研究的关注热点。绒山羊与其他动物不同，具有产绒的较小次级毛囊，次级毛囊的毛乳头体积明显小于初级毛囊毛乳头，在分离培养过程中具有极大的挑战性。

目前对于毛乳头细胞的分离方法常用的有显微解剖法和酶消化法。对于绒山羊毛乳头细胞的分离，显微解剖法分离的效率较低，细胞贴壁时间较长不易溢出；酶消化法需要大量的皮肤样本以及长时间的消化过程，影响细胞活性状态，并且容易产生大量组织碎片，毛乳头细胞收集较为困难。上述两种分离方法的成功率均较低。因此，现急需研究开发一种操作简便、细胞纯度高以及培养成活率高的绒山羊毛囊毛乳头细胞的分离培养方法。

技术实现要素：

鉴于此，本发明的目的是提供了一种绒山羊毛囊毛乳头细胞的分离培养方法，分别进行初级毛囊和次级毛囊两种不同毛乳头细胞的分离和培养。初级毛囊在显微镜下结构较为清晰，在分离时结合酶消化法和机械法可以得到较纯的毛乳头。而次级毛囊较小，成簇排列，在显微镜下无法准确分离毛乳头，导致在培养过程中可能掺杂包裹在毛乳头外围的毛母质细胞，从而无法得到纯度较高的细胞。针对以上问题，我们设计了一种在培养过程中能够彻底清除毛母质细胞进而获得高纯度毛乳头细胞的培养方法，并且优化实验步骤提高毛乳头细胞的贴壁率。此方法相较于现有技术，更加精细且高效，此方法培养的绒山羊毛囊毛乳头细胞贴壁率可达95-100％，成功率高达99-100％。

本发明所采用的具体技术方案为：

一种辽宁绒山羊皮肤毛囊毛乳头细胞分离培养的方法，包括如下操作步骤：

(1)将采集的绒山羊颈背部皮肤用预冷的生理盐水冲洗干净，再进行消毒处理，于体式显微镜下分离绒山羊的初级毛囊和次级毛囊；

(2)将步骤(1)所得的初级毛囊和次级毛囊分别置于0.2％ⅱ型胶原酶中消化处理，然后终止消化；

(3)于显微镜下切下初级毛囊毛球部，并用注射器针头将毛乳头分离出来；于显微镜下切下次级毛囊毛球部；

(4)用注射器针头将步骤(3)中所得到的初级毛囊毛乳头以及次级毛囊毛球部，固定于培养皿中，加入含10％胎牛血清的dmem培养液进行培养；

(5)在次级毛囊毛乳头细胞培养过程中，用10微升无酶枪头剔除混杂的毛母质细胞，然后用含0.008％edta的0.1％胰蛋白酶于37℃消化3～5分钟，收集毛乳头细胞。

进一步的，步骤(1)所述消毒处理过程具体为用75％酒精处理15秒。

进一步的，步骤(1)所述分离绒山羊的初级毛囊和次级毛囊的具体操作为将消毒后的绒山羊皮肤沿毛囊生长方向切成细长薄片，从薄片中分离出初级毛囊和次级毛囊，并将毛球部周围组织剔除干净。

进一步的，步骤(2)所述消化处理过程的条件为于37℃水浴锅中消化12分钟。

进一步的，步骤(2)所述终止消化处理过程具体为添加含10％胎牛血清的dmem培养基。

进一步的，步骤(4)所述固定步骤是用注射器针头将初级毛囊毛乳头或次级毛囊毛球部在细胞培养皿中划一下加以固定。

进一步的，步骤(5)所述次级毛囊毛乳头细胞的培养过程如下：首先用10微升无酶枪头剔掉混杂的毛母质细胞，然后用含0.008％edta的0.1％胰蛋白酶于37℃细胞培养箱中消化4分钟，此时毛乳头细胞被消化下来，而未剔除干净的残留毛母质细胞仍旧贴壁，收集消化下来的毛乳头细胞进行传代培养。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

1.本发明的分离方法结合ⅱ型胶原酶消化和机械分离法，大大提高了毛乳头的分离效率，较短时间的酶消化可以使毛囊结构较为松散，利于在机械法分离中获得毛乳头。步骤简单，操作方便，省时省力。

2.本发明的分离方法为了提高毛乳头的贴壁率，保证细胞的有效溢出的情况下，将初级毛囊毛乳头或次级毛囊毛球部使用注射器针头在培养皿中划一下加以固定，此方法简单且效果显著。

3.本发明的分离方法通过用枪头机械去除极大部分混杂的毛母质细胞，和酶消化差异细胞法，成功得到极其纯净的次级毛囊毛乳头细胞，现有技术中未公开采用上述方法进行次级毛囊毛乳头细胞纯化的方法，此方法合理、科学、效率高。

4.本发明的分离方法构建的绒山羊初级毛囊毛乳头细胞系和次级毛囊毛乳头细胞系均能稳定传代，且状态良好。

5.本发明的分离方法构建的绒山羊毛囊毛乳头细胞，在鉴定时毛乳头细胞体外特异表达物α-sma及毛囊真皮源性细胞标记物vim表达均呈阳性。此外，经过对毛乳头细胞的形态学观察、生长曲线绘制及细胞免疫化学鉴定，进一步证明，本发明的分离方法获得的细胞为绒山羊毛囊毛乳头细胞，可为研究绒山羊初级毛囊和次级毛囊生长和分化，以及次级毛囊周期性生长过程中各类型细胞间相互作用提供良好模型。

6.本发明的分离方法获得的绒山羊次级毛囊毛乳头细胞不仅为研究绒山羊毛囊周期性生长提供实验素材，也为绒山羊羊绒质量提高的育种改良奠定基础，也可为其他类似较小毛囊动物的毛乳头细胞的培养研究提供参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

图1为本发明分离培养的绒山羊次级毛囊毛乳头细胞；图1a为绒山羊次级毛囊毛乳头细胞培养3天游离出来的毛乳头细胞，为三角形或短梭形(200×)，图1b为绒山羊次级毛囊毛乳头细胞培养9天时，细胞融合率达到80％以上(100×)，图1c为绒山羊次级毛囊毛乳头细胞培养9天时，细胞融合率达到80％以上(200×)；

图2为本发明分离培养的绒山羊初级毛囊毛乳头细胞体外特异标记物α-sma的表达，图2a为绒山羊初级毛囊毛乳头细胞的α-sma免疫荧光标记与dapi免疫荧光标记合并的结果(200×)，图2b为绒山羊初级毛囊毛乳头细胞的α-sma免疫荧光标记结果(200×)，图2c为绒山羊初级毛囊毛乳头细胞的dapi免疫荧光标记结果(200×)；

图3为本发明分离培养的绒山羊次级毛囊毛乳头细胞体外特异标记物α-sma的表达，图3a为绒山羊次级毛囊毛乳头细胞的α-sma免疫荧光标记与dapi免疫荧光标记合并的结果(200×)，图3b为绒山羊次级毛囊毛乳头细胞的α-sma免疫荧光标记结果(200×)，图3c为绒山羊次级毛囊毛乳头细胞的dapi免疫荧光标记结果(200×)。

图4为本发明分离培养的绒山羊初级毛囊毛乳头细胞真皮源性细胞标记物vimentin的表达，图4a为绒山羊初级毛囊毛乳头细胞真皮源性细胞标记物vimentin免疫荧光标记与dapi免疫荧光标记合并的结果(200×)，图4b为绒山羊初级毛囊毛乳头细胞真皮源性细胞标记物vimentin免疫荧光标记结果(200×)，图4c为绒山羊初级毛囊毛乳头细胞的dapi免疫荧光标记结果(200×)。

图5为本发明分离培养的绒山羊次级毛囊毛乳头细胞真皮源性细胞标记物vimentin的表达；图5a为绒山羊次级毛囊毛乳头细胞真皮源性细胞标记物vimentin免疫荧光标记与dapi免疫荧光标记合并的结果(200×)，图5b为绒山羊次级毛囊毛乳头细胞真皮源性细胞标记物vimentin免疫荧光标记结果(200×)，图5c为绒山羊次级毛囊毛乳头细胞的dapi免疫荧光标记结果(200×)。

图6为本发明分离培养的绒山羊毛囊毛乳头细胞的生长曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

本发明实验过程中所用的主要试剂及来源如下：dmemf-12培养基购于美国hyclone公司；胎牛血清、胰岛素转铁蛋白(100×)、ii型胶原酶购于美国gibco公司；表皮生长因子购于sigma公司；南美乌拉圭胎牛血清购自excellbio公司；vimentin抗体、α-smoothmuscleactin(a-sma)抗体购于美国abcam公司；dapi染色液、1×pbs缓冲液、青链霉素混合液(100×)、0.25％胰蛋白酶-edta消化液、tritonx-100、二甲基亚砜(dmso)购于生工生物工程(上海)有限公司。

本发明实验动物及样品采集过程如下：实验动物为健康的2.5周岁辽宁绒山羊。用剪刀将颈背部皮肤毛发剪掉，并用刮胡刀刮净，酒精棉擦拭消毒后用手术刀割取1.0cm×1.0cm大小的皮肤，置于预冷的生理盐水中带回实验室。

本发明实验过程中所用溶液的配制过程如下：

(1)0.2％ii型胶原酶溶液的配制：精确称取0.2gii型胶原酶粉末，加入100mlpbs，完全溶解后过0.22μm滤膜进行分装，-20℃保存；

(2)细胞培养液的配制：dmemf-12培养液中含有10％胎牛血清，1％青链霉素混合液(100×)，1％胰岛素转铁蛋白，1％表皮生长因子；

(3)细胞冻存液的配制：dmemf-12中含有5％dmso，10％胎牛血清。

本发明分离获得的绒山羊毛囊毛乳头细胞的鉴定方法

1.形态学观察

在显微镜普通光下观察分离培养的绒山羊毛囊毛乳头细胞贴壁情况、生长情况和细胞形态。

2.细胞传代

当毛乳头细胞生长至70-80％汇合后，进行传代培养。首先弃掉旧培养液，用无菌pbs冲洗一次，每孔加入适量的含0.25％胰蛋白酶-edta消化液，于37℃培养箱中消化4分钟，显微镜下观察到细胞单层收缩形态向圆球形转变时，加入含10％胎牛血清的dmem细胞培养液终止消化，用移液枪将贴壁细胞吹打下来收集到离心管中，1500rpm离心5分钟收集细胞。再按照1：4的比例传代到新的细胞培养皿中。本发明的次级毛囊毛乳头细胞的首次传代使用机械法剔除掉毛母质细胞后，用含0.008％edta的0.1％胰蛋白酶在37℃培养箱中消化4分钟，收集漂浮的毛乳头细胞，再按照上述方法进行传代培养。

3.免疫荧光鉴定

将细胞按照上述方法使用含0.25％胰蛋白酶-edta消化液进行消化，经过离心收集后将细胞铺到放有无菌细胞爬片的6孔细胞培养皿中，缓缓加入适量细胞培养液，于37℃，5％co2培养箱中培养。待细胞长到良好的单层细胞后，进行vimentin和a-sma蛋白表达的检测。

4.生长曲线绘制

取生长状况良好的细胞以10⁴个/孔铺板，每天取3孔，连续统计16天，细胞计数板统计每天细胞密度；以培养时间为横坐标，以细胞密度为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

5.细胞冻存与复苏

当细胞长满至85-90％时，应用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入细胞冻存液，分装于2毫升冻存管中，标记好细胞名称和日期等。将冻存管放入装有异丙醇的thermo程序降温盒中，于-80℃冰箱长期保存。

复苏细胞时，从-80℃冰箱中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中使其融化，融化后将细胞转移到离心管中1500rpm离心5分钟收集细胞，用含10％胎牛血清的dmem培养液重悬细胞，重新铺到细胞培养皿中进行培养。

实施例1：

一种绒山羊毛囊毛乳头细胞分离培养方法，主要包括如下步骤：

(1)将获得的绒山羊皮肤放置于装有预冷生理盐水的平皿中去除皮肤血迹及脂肪，生理盐水反复冲洗至干净，用75％酒精将其消毒15秒，再用生理盐水进行冲洗；

(2)于显微镜下分离绒山羊皮肤毛囊，分别获得初级毛囊和次级毛囊；

(3)将初级毛囊和次级毛囊分别置于0.2％的ii型胶原酶中，于37℃水浴锅中消化12分钟，用含10％胎牛血清的dmem培养液终止消化；

(4)于显微镜下用1ml注射器针头切下初级毛囊毛球部，将毛球部的真皮鞘掀开挤出毛乳头细胞团，并切断毛乳头细胞团与外鞘连接处，获得纯净的初级毛囊毛乳头细胞团；于显微镜下用1ml注射器针头切下次级毛囊毛球部；

(5)将上述所得初级毛囊毛乳头和次级毛囊毛球部分别培养在6孔细胞培养皿中，每孔放5-6个，用注射器将初级毛囊毛乳头或次级毛囊毛球部在培养皿中划一下加以固定，加入含10％胎牛血清的dmem培养液进行培养；

(6)培养后3天内即可观察到毛乳头细胞溢出，初级毛囊毛乳头细胞和次级毛囊毛乳头细胞在观察到细胞溢出后即可首次更换培养液，之后每两天更换一次；由于次级毛囊较小，无法从毛球部精准分离出毛乳头细胞，分离的毛球部包括毛乳头细胞和包裹在毛乳头外围的毛母质细胞。但在培养时毛母质细胞的形态与毛乳头细胞差别很大，毛乳头细胞呈三角形或多边形，而毛母质细胞呈圆形铺路石状，且细胞间生长较为紧凑，与毛乳头细胞形成明显的分界线。当细胞培养过程中出现毛母质细胞溢出时，结合机械法和酶消化法两种方法将毛母质细胞去除，从而获得高纯度的毛乳头细胞；具体方法为将装有次级毛囊毛乳头细胞的培养皿放于显微镜下，在一侧点燃酒精灯防止污染，使用灭菌的10微升无酶枪头将毛母质细胞刮掉，由于毛母质细胞之间较为紧凑，所以在刮时会一整块被挑起，较易去除。毛母质细胞在显微镜下去除后使用pbs轻轻冲洗。为防止毛母质细胞未去除干净，再用含0.008％edta的0.1％胰蛋白酶于37℃细胞培养箱中消化4分钟，此时毛乳头细胞会自动脱落，而毛母质细胞仍固定在细胞培养板中。收集消化下来的毛乳头细胞进行传代培养。

对照例1：

一种利用显微镜分离绒山羊毛囊毛乳头细胞的方法，主要包括如下步骤：

(1)将获得的绒山羊皮肤进行预处理，于装有预冷生理盐水的平皿中去除皮肤血迹及脂肪，生理盐水反复冲洗至干净，用75％酒精将其消毒15秒，再用生理盐水进行冲洗；

(2)于体式显微镜下分离绒山羊皮肤毛囊，分别获得初级毛囊和次级毛囊；

(3)于显微镜下用1ml注射器针头切下初级毛囊毛球部，将毛球部的真皮鞘掀开挤出毛乳头细胞团，并切断毛乳头细胞团与外鞘相连处，获得纯净的初级毛囊毛乳头细胞团；于显微镜下用1ml注射器针头切下次级毛囊毛球部；

(4)用1ml注射器针头将上述获得的初级毛囊毛乳头和次级毛囊毛球部转移到放有少量培养液的6孔细胞培养皿中，每孔放5-6个；

(5)培养毛乳头细胞，缓缓加入10％胎牛血清的dmem培养基。于37℃，5％co2饱和湿度的条件下进行培养。每日观察，当有细胞溢出后进行首次换液，之后每两天换一次液。

对照例2：

一种利用显微分离法和酶消化法分离绒山羊次级毛囊毛乳头细胞的方法，主要包括如下步骤：

(1)将获得的绒山羊皮肤进行预处理，于装有预冷生理盐水的平皿中去除皮肤血迹及脂肪，生理盐水反复冲洗至干净，用75％酒精将其消毒15秒，再用生理盐水进行冲洗；

(2)于体式显微镜下分离绒山羊皮肤次级毛囊；

(3)将次级毛囊置于0.2％的ii型胶原酶中，于37℃水浴锅中消化12分钟，用含10％胎牛血清的dmem培养液终止消化。于显微镜下用1ml注射器针头切下次级毛囊毛球部；

(4)用1ml注射器针头将上述获得的次级毛囊毛球部转移到放有少量培养液的6孔细胞培养皿中，每孔放5-6个；

(5)培养毛乳头细胞，缓缓加入10％胎牛血清的dmem培养液。于37℃，5％co2饱和湿度的条件下进行培养。每日观察，当有细胞溢出后进行首次换液。之后每两天换一次液。

实施例1和对比例1-2的鉴定结果与分析

1.分离培养效果

表1.实施例1和对比例1-2分离培养方法的效果

从表1可以看出，利用本发明所提供的方法，可以获得初级毛囊和次级毛囊毛乳头1×10⁸个；而显微分离方法得到的初级毛囊毛乳头仅4×10⁶个，次级毛囊毛乳头2×10⁶个；使用显微解剖法和酶消化法结合的方法分离的次级毛囊毛乳头，但未在培养时进行纯化的对比例2可以得到4×10⁶个细胞，且两种对比例对于次级毛囊毛乳头细胞的培养成功率仅为40-50％。利用本发明所提供的方法分离的毛乳头细胞贴壁率可达95-100％，培养成功率也高达99-100％。由此可见，本发明方法在获得的细胞数量、贴壁率及培养成功率等方面明显优于现有方法。

2.形态学观察

本发明分离获得的毛乳头部位呈圆形、椭圆形或水滴状，培养后20小时几乎所有毛乳头可牢固贴壁，培养后3天内便可见细胞从毛乳头边缘长出(图1a)，并向四周呈放射状生长，迁出细胞为三角形或多边形。在第6天左右，细胞进入对数生长期，生长迅速，向四周呈放射状生长。在第9天左右，细胞生长范围不再扩大，融合率达到80％以上(图1b,1c)。经过首次传代，12小时细胞即可贴壁，24小时细胞形态与原代细胞相比较为均一，细胞生长加速，在培养5天左右细胞完全融合，形成生长致密区，细胞以长梭形纤维样多极向排列。

3.特异标记物表达

应用细胞免疫荧光技术检测本发明分离培养的毛乳头细胞的特异性标记物α-sma(图2，图3)及毛囊真皮源性细胞标记物vimentin(图4，图5)的表达情况。免疫荧光结果显示，分离培养的细胞表达α-sma及vimentin，阳性率均在98％以上。进一步验证，本发明分离培养的毛乳头细胞确为毛囊真皮源性的毛乳头细胞。

4.生长曲线绘制

对本发明分离培养的细胞进行细胞生长曲线观察，细胞贴壁后的前3天，生长缓慢，数量无明显变化，第6天进入对数生长期，第14天达到增殖高峰，之后进入衰退期，表明分离的毛乳头细胞生长及分裂能力旺盛。初级毛囊毛乳头细胞和次级毛囊毛乳头细胞的生长速率相似(图6)。

5.细胞冻存与复苏能力

对冻存1年的本发明分离培养的对数期毛乳头细胞复苏后，台盼蓝染色计数统计发现，初级毛囊毛乳头细胞和次级毛囊毛乳头细胞平均活率均在75.6％。解冻后的细胞经培养发现细胞贴壁依然迅速，12小时细胞即可贴壁，24小时细胞形态均一，细胞生长加速。细胞培养皿中培养大约5天左右细胞汇合度可达90％，细胞形态与冻存前基本一致。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。