一种高效快速的生物合成茉莉酸的生产工艺的制作方法

本发明涉及茉莉酸的生物合成技术领域，尤其涉及一种高效快速的生物合成茉莉酸的生产工艺。

背景技术：

茉莉酸(又名茉莉酮酸)是一种有芳香味的环戊烷类化合物，化学名：反-3-氧代-2-(顺-2-戊烯基)-环戊乙酸甲酯，英文名：jasmonicacid，在农业、工业及医药领域有良好的应用价值，特别是近年发现,茉莉酮酸及其酯类对植物的器官和细胞起着许多特殊的生理作用,由此引起了生理生化学者的普遍关注。茉莉酸的来源有三种途径，一是从富含茉莉酸的植物中提取分离获得，但茉莉酸高的植物较少，提取成本较高，研究工作前人做了许多，都不宜用于大规模的生产实际中。其二是化学合成方法，从结构上分析茉莉酸及其酯具有两个手性中心，有4个同分异构体，在化学合成上具有一定的挑战性，化学法的优点是可以合成高纯度的茉莉酸，且可以通过特殊的分离手段把4种同分异构体分开，得到单一的消旋体，合成的起始反应物不同，合成路径差异很大，反应器的要求差异也大，得率从5％至60％，得率高的起始反应物，成本就比较高，反应器的耐温耐压要求就很高，所以，化学合成法的缺点也是成本高，产物是4种同分异构体的混合物，手性物质的分离难度非常大，混合物可以应用于工业领域，但不宜应用于农业生产和医药行业中。第三种是生物合成方法，就是利用一种特殊的菌，在特定的培养基中适宜的条件下，培养一定的时间后，培养液中会生成一定量的茉莉酸，不同的菌种，不同的培养基，不同的培养条件，茉莉酸的得率从1mg·l^-1至1080mg·l^-1，差异非常大，得率的大小主要受菌种的影响，其次是培养基和培养条件。菌种选择不对时，培养液中几乎检测不到茉莉酸。

茉莉酸的生物合成，关键是菌种的选择，分离出一株好的菌种，可以达到事半功倍的效果，自然界中的菌有千千万万种，可可毛色二胞菌只是其中一种，而可可毛色二胞菌也不是都可以用于茉莉酸的生物合成，很多可可毛色二胞菌的培养液中，现在的检测仪器是检测不到茉莉酸的存在。我们经过广泛的初筛，从不同的热带水果中分离出单一的可可毛色二胞菌株，用薄层色谱(tlc)、高效液相色谱(hplc)和超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)对培养液中的茉莉酸进行定性定量，发现从芒果中分离得到的可可毛色二胞菌，产茉莉酸的得率最高可以达到1080mg·l-1，而且生产成本很低(1g/50元)，且可以生物合成单一的茉莉酸手性化合物，非常适合应用于大规模农业生产和医药行业中。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的培养难度及差异性较大，且产得率低、生产成本高的缺点，而提出的一种高效快速的生物合成茉莉酸的生产工艺。

一种高效快速的生物合成茉莉酸的生产工艺，包括以下步骤：

步骤一：从热带水果中分离得到可可毛色二胞菌的单一菌株；

步骤二：将菌株接种到培养基中，所述培养基包括以下原料：碳源25-75g/l、玉米浆1-3g/l、硝酸钠3-7g/l、硫酸锰0.001-0.003g/l、硫酸铜0.001-0.003g/l、硫酸锌0.01-0.03g/l、硫酸镁2-4g/l、硫酸亚铁0.3-0.6g/l、氯化钾0.3-0.5g/l和磷酸二氢钾1-2g/l；

步骤三：在28-30℃温度下静置培养6天，取培养6天后的培养液20ml，用乙酸乙酯萃取，氮气吹干，定容，分别用液相色谱进行茉莉酸标准品和样品的检测。

优选的，所述步骤一中，热带水果采用芒果、龙眼、荔枝、香蕉、菠萝、黄皮中的一种或多种。

优选的，所述步骤二中，碳源为蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉或乳糖的其中一种。

优选的，所述步骤三中，静置培养的过程中ph值为5.5-6.5。

优选的，所述步骤三中，液相色谱检测条件：c18反相色谱柱，检测波长210nm，设置柱温为30度，流动相为甲醇：0.1070磷酸＝11:9，进样量为定量20ul，流速1ml/min。

本发明将可可毛色二胞菌应用于茉莉酸的生物合成中，可以得到含茉莉酸浓度较高的培养液，且培养周期短，极大的降低生产成本，让植物的组织或器官产生特殊的生理功能，达到增加产量或防治病虫害的目的，广泛应用于农业、工业和医药行业。

附图说明

图1为本发明的菌种培养工艺流程图；

图2为本发明的茉莉酸标准品8mg的检测图谱；

图3为本发明的茉莉酸含量检测图谱；

图4为本发明的茉莉酸甲酯标准品30mg的检测图谱；

图5为本发明的茉莉酸甲酯含量检测图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例

参照图1，本发明提出的一种高效快速的生物合成茉莉酸的生产工艺，包括以下步骤：

(1)从热带水果中分离得到的一株高效快速生物合成茉莉酸的可可毛色二胞菌。

(2)可可毛色二胞菌经分离纯化后，应用于茉莉酸的生物合成中，在特制的培养基中，静置培养6天，茉莉酸的产量达到最高1080mg·l^-1，并且能获得单一的茉莉酸手性化合物。

(3)上述的生物合成茉莉酸，其培养液稀释到一定浓度后，应用于大规模的农业生产中，让植物的组织或器官产生特殊的生理功能，达到增加产量或防治病虫害的目的。

本发明中，步骤(1)中所述的可可毛色二胞菌的分离纯化是关键的一步。

本发明中，步骤(2)中的培养基成分配比和培养条件是提高茉莉酸产量，降低生产成本，扩大应用范围的核心问题。

培养基成分配比：碳源25-75g/l、玉米浆1-3g/l、硝酸钠3-7g/l、硫酸锰0.001-0.003g/l、硫酸铜0.001-0.003g/l、硫酸锌0.01-0.03g/l、硫酸镁2-4g/l、硫酸亚铁0.3-0.6g/l、氯化钾0.3-0.5g/l和磷酸二氢钾1-2g/l。

培养条件：ph＝5.5-6.5,培养温度28-30℃，培养方式适宜静置，培养时间6天。

培养基碳源成分配比选择结果(茉莉酸含量)见下表：

从检测结果可以确定，最好的碳源是蔗糖，最佳浓度为50克/升，可以得到含茉莉酸浓度较高的培养液，最高可达1080mg·l^-1。

用同样的选择方法，可以确定最佳氮源为玉米浆和硝酸钠，最佳配比分别为：2克/升和7克/升。其它成分的最佳配比为(克/升)：硫酸锰0.002、硫酸铜0.002、硫酸锌0.01、硫酸镁2、硫酸亚铁0.3、氯化钾0.3和磷酸二氢钾1。

取培养6天后的培养液20毫升，用乙酸乙酯萃取，氮气吹干，定容，上机检测。在液相色谱检测条件：色谱柱：c18反相色谱柱，检测波长210nm，设置柱温为30度，流动相为甲醇：0.1070磷酸＝11:9，进样量为定量20ul，流速1ml/min，进行茉莉酸标准品和样品的检测，检测结果如图2、图3、图4、图5。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。