一种生物标志物及其应用

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及多囊卵巢综合征诊断用mirna生物标志物及其应用。

背景技术：

不孕不育在世界范围内已经成为继癌症、心血管疾病之后严重影响人类健康的第三大疾病。其中女性不孕占40％。女性不孕中，排卵障碍率占25％-30％。多囊卵巢综合征(pcos)是育龄期女性最常见的生殖内分泌紊乱性疾病,5％～10％的育龄期女性易患此病,在无排卵不孕症患者中约占75％。

多囊卵巢综合征(pcos)是以稀发排卵或无排卵、高雄激素或胰岛素抵抗、多囊卵巢为特征的内分泌紊乱的症候群。雌\雄激素比例失调引起的体内雄激素水平过高是导致pcos的主要原因。mirna是内源性长度约为21-25nt的非编码小rna，对靶基因mrna的降解和抑制起重要调控作用。mirna作为潜在的组织特异性疾病的生物标志物，可为许多病理诊断提供有效措施。mirna在pcos中的研究目前主要集中在胰岛素抵抗，肥胖等方面，而关于激素比例失调这一关键因素的致病机制仍不清楚。

技术实现要素：

本发明的目的是提供多囊卵巢综合征诊断用mirna生物标志物及其应用。

本发明提供的多囊卵巢综合征诊断用mirna生物标志物，所述mirna生物标志物为mir-96-5p。其成熟序列为：uuuggcacuagcacauuuuugcu。

本发明还提供mir-96-5p在制备或筛选人多囊卵巢综合征的诊断及治疗药物中的应用。

本发明进一步提供一种多囊卵巢综合征诊断用试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种特异性检测mir-96-5p表达水平的引物。

所述引物是基于实时定量pcr法检测mir-96-5p而设计的，所述引物序列如下：

mir-96-5p-rt:ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagagcaaaaa

mir-96-5p-f:acactccagctgggttttggcactagcacatt

mir-96-5p-r:tggtgtcgtggagtcg。

mirna在女性生殖道卵巢、子宫、子宫内膜、输卵管以及胚胎发育过程中广泛表达，通过与其靶基因特异性结合，引起靶mrna的降解或抑制其翻译。有关mirna的研究完善和丰富了疾病发生、发展的分子生物学与遗传学机制。研究表明，过表达mir-96-5p促进颗粒细胞生成雌激素，抑制卵泡膜细胞产生睾酮。mir-96-5p在颗粒细胞的低表达，导致颗粒细胞雌激素和卵泡膜雄激素分泌失调，引起多囊卵巢综合征。

本发明检测pcos病人和正常人颗粒细胞中mir-96-5p的表达，发现mir-96-5p水平显著降低,可将mir-96-5p作为多囊卵巢综合征的生物标志物，为临床制药提供理论基础。

附图说明

图1为检测多囊卵巢综合征病人和正常人颗粒细胞中mir-96-5p的表达水平；

图2为设计的mir-96-5p的mimic序列能够在体外有效提高mir-96-5p的表达水平；

图3为过表达mir-96-5p后促进人原代颗粒细胞(hgc)的雌激素分泌增多；

图4为mir-96-5p过表达促进小鼠原代颗粒细胞(mgc)雌激素的产生；

图5为过表达mir-96-5p后抑制卵泡膜细胞的睾酮分泌。

具体实施方式

以下实施举例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

1.1样本的收集

在北京大学第三医院收集26例多囊卵巢综合征患者的卵巢颗粒细胞(hgc)和20例正常女性卵巢颗粒细胞(hgc)。

1.2小鼠原代颗粒细胞和卵泡膜细胞的分离

取10-15g未成熟的雌性小鼠，先皮下注射pmsg5-10iu，40-48h后注射hcg5-10iu；15-20h后断颈处死小鼠，固定小鼠，75％的酒精消毒后，无菌迅速取下卵巢，置于预热pbs中，于体式显微镜下迅速地去除卵巢周围的包膜及组织等附着物，将剥离后的卵巢转至新的pbs缓冲液中清洗2次；将卵巢转移至混合基础培养基中，37℃温育10-15min；解剖镜下用1ml注射器针头刺破卵泡，释放颗粒细胞和卵母细胞，收集至15ml离心管中；加入i型胶原酶和透明质酸酶混合酶消化3-5min，200目筛网过滤，收集滤液，1000rpm离心5min；用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基重悬细胞沉淀，接种于细胞瓶中进行培养。

将去除颗粒细胞的残余卵巢组织pbs清洗两次后剪碎，加入含有胶原酶ⅳ的mccoy's5a培养液(4g/l胶原酶溶于mccoy's5a培养液)在37℃摇床中消化分离卵泡膜间质细胞，消化1h，200目筛网过滤，收集滤液，1000rpm离心5min；用含10％胎牛血清的mccoy's5a培养基重悬细胞沉淀，接种于细胞瓶中进行培养

1.3细胞总rna的提取与反转录

利用trizol法提取细胞的总rna，利用nanodrop测定rna浓度，将提取的rna置于-80℃冰箱中保存待用。

反转录体系：在无rnase的0.2mlpcr管中依次加入4μl5×reactionbuffer,1μldntp(10mm)，1μl特异性茎环结构反转录引物(5μm),0.5μlm-mlv反转录酶，1μgrna,0.5μlrnase抑制剂,depc水补足20μl。反应条件：16℃30min，42℃30min，85℃5min。本发明我们对mirna设计了特异性茎环结构反转录引物，如上操作，单管合成cdna。

茎环是指反转录过程中使用的茎环结构反转录引物，其由以下核苷酸序列组成：

mir-96-5p-rt:ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagagcaaaaa

反转录完成后，可将产物短时间保存在-20℃冰箱中或进行real-timepcr反应。

1.4cdna稀释

反转录后，每孔加80μlrnasefreeh2o稀释。

1.5荧光定量pcr

取稀释后的cdna产物2μl，10μlsybrgreenimaster(2×)，0.4μl正向引物(10μm)和0.4μl反向引物(10μm)，ddh2o补足20μl。在agilentstratagenemx3005p仪上进行实时荧光定量pcr反应，以u6为内参照。反应条件为95℃10min，然后95℃15s，60℃30s，45个循环。反应结束后由配套的计算机软件计算各反应管内的ct值。以2-^δδct法计算mirna的相对表达量。

荧光定量pcr引物序列如下：

mir-96-5p：

f:acactccagctgggttttggcactagcacatt

r:tggtgtcgtggagtcg

u6：

f:ctcgcttcggcagcaca

r:aacgcttcacgaatttgcgt

实施例2

2.1mir-96-5p在多囊卵巢综合征患者颗粒细胞中的表达

利用sybrgreenmixture(genstar公司)以为u6内参检测收集到的原代人颗粒细胞(hgc)中mir-96-5p的相对表达(图1)，以2^-δδct法计算mirna的相对表达量。

2.2mir-96-5p特异mimic的设计

基于mir-96-5p的序列，设计mir-96-5pmimic，uucacaguggcuaaguuccgc和mir-nc，并检测其在体外细胞中表达mir-96-5p的水平(图2)。

mir-ncmimic:

sense:uucuccgaacgugucacgutt

antisense:acgugacacguucggagaatt

2.3sirna转染细胞

使用invitrogen公司生产的lipofectamine^tm3000，按说明书操作(以12孔板，共a、b两组，每组一个孔为例，实际转染时每个处理组设置3个复孔)：

转染前24h接种细胞(1×10⁵个/孔)，培养于含血清培养基，24h后细胞贴壁率约为70％-80％；转染分以下a、b两组进行，c组为稀释的转染试剂。

a：40pmolmir-ncmimic+75μl无血清dmem/f12培养基

b：40pmolmir-96-5pmimic+75μl无血清dmem/f12培养基

c：3μllipofectamine^tm3000+75μl无血清dmem/f12培养基

以上两组预混液配好后吹打混匀，室温静置5min。分别将a、b两组预混液与c组预混液等体积混合，得到约150μl转染试剂(小rna混合液)，吹打混匀，室温孵育5min，每孔加入150μl上述配制的转染试剂，37℃培养箱中孵育6h后，换正常10％fbsdmem/f12培养基继续培养18-48h，然后观察结果。

实施例3细胞激素测定

体外培养原代人颗粒细胞hgc，原代小鼠颗粒细胞mgc和原代小鼠卵泡膜细胞mtc，分为实验组和对照组，分别转染mir-96-5pmimic和mir-nc，转染细胞培养48h后，收集细胞上清，送至北京北方生物技术研究所，测定细胞上清中雌二醇和睾酮的含量。

通过测定发现，mir-96-5p超表达促进雌二醇的分泌(图3和图4)。

mir-96-5p对卵泡膜细胞睾酮分泌的影响，测定方法同上。通过测定发现，mir-96-5p超表达抑制睾酮的分泌(图5)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种生物标志物及其应用

<130>mp21000673z

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

uuuggcacuagcacauuuuugcu23

<210>2

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagagcaaaaa44

<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

acactccagctgggttttggcactagcacatt32

<210>4

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tggtgtcgtggagtcg16

<210>5

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

uucuccgaacgugucacgutt21

<210>6

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

acgugacacguucggagaatt21