一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法

本发明属于棉花育种技术领域，具体涉及一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法。

背景技术：

棉花作为重要的经济作物和油料作物，具有重要的经济价值，在我国乃至世界的国民经济发展中占据重要地位。其在植物学分类上属于锦葵科(malvaceae)棉属(gossypium)。在长期的栽培与驯化过程中，棉花共形成了四个栽培种，包括两个二倍体栽培种：草棉(g.herbaceum)、亚洲棉(g.arboreum)，和两个四倍体栽培种：陆地棉(g.hirsutum)、海岛棉(g.barbadense)。陆地棉产量约占世界棉花总产量的90％，海岛棉约占5～8％(qinetal.,2011)。海岛棉纤维品质优良，对棉花黄萎病具有较高的耐病性，但产量相对较低，这很大程度上限制了海岛棉品种的生产实践过程。通过遗传突变的方法来改良海岛棉的生产特性，有利于提高海岛棉的种植价值。

crispr/cas9技术的简单高效，目前已经广泛的应用于作物的遗传改良中。在棉花中，利用crispr/cas9技术创制突变体材料需要经过组织培养过程。而棉花组织培养再生过程，受到基因型影响，只有个别品种能够进行组织培养再生获得植株，且目前还未有海岛棉再生成功的报道，因此无法直接通过转基因再生技术获得突变体材料，这就大大的限制了crispr/cas9技术在棉花遗传改良上的应用，特别是在海岛棉中的应用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，是利用陆地棉转基因雄性不育突变体材料与海岛棉材料进行杂交，以获得在海岛棉材料中相应的雄性不育的突变体材料，实现海岛棉的遗传改良目的。

本发明提供了一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，包括以下步骤：

1)设计合成ghnsp基因的sgrna1和sgrna2；

2)将sgrna1和sgrna2串联构建到crispr/cas9基因编辑载体中；

3)将步骤2)构建的crispr/cas9基因编辑载体在农杆菌的介导下转化陆地棉材料，筛选获得陆地棉突变体材料；

4)将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行hi-tom检测，筛选含crispr/cas9与sgrna的t-dna片段、敲除ghnsp基因的杂交后代。

优选的，步骤1)中所述sgrna1的核苷酸序列如seqidno:1所示；

所述sgrna2的核苷酸序列如seqidno:2所示。

优选的，步骤2)中sgrna1和sgrna2串联构建到crispr/cas9基因编辑载体的方法，包括以下步骤：

a.以pgtr载体为模板，分别扩增含所述sgrna1的目标片段1和含所述sgrna2的目标片段2；

b.将所述含所述sgrna1的目标片段1和含所述sgrna2的目标片段2利用重叠延伸pcr方法连接形成串联有sgrna1和sgrna2的长片段；

c.将所述串联有sgrna1和sgrna2的长片段插入prgeb32-ghu6.7-nptii载体中，得到含sgrna1和sgrna2的crispr/cas9基因编辑载体。

优选的，步骤a中所述扩增含所述sgrna1的目标片段1用引物对为inf-prger32-7-s和ghnsp-crispr-1-as；

所述inf-prger32-7-s的核苷酸序列如seqidno：3所示；

所述ghnsp-crispr-1-as的核苷酸序列如seqidno：4所示。

优选的，步骤a中所述扩增含所述sgrna2的目标片段2用引物对为ghnsp-crispr-2-s和ghnsp-crispr-2-as；

所述ghnsp-crispr-2-s的核苷酸序列如seqidno：5所示；

所述ghnsp-crispr-2-as的核苷酸序列如seqidno：6所示。

优选的，所述重叠延伸pcr方法中所用的引物为核苷酸序列如seqidno：3所示的inf-prger32-7-s和核苷酸序列如seqidno：7所示的infghnsp-crispr-as。

优选的，所述陆地棉材料包括jin668。

优选的，所述筛选含crispr/cas9和sgrna的t-dna片段的方法是利用grna1-hi-tom-gb-s和grna1-hi-tom-as引物对检测grna1，用grna2-hi-tom-gb-s和grna2-hi-tom-as引物对检测grna2；

grna1-hi-tom-gb-s的核苷酸序列如seqidno：8所示；

grna1-hi-tom-as的核苷酸序列如seqidno：9所示；

grna2-hi-tom-gb-s的核苷酸序列如seqidno：10所示；

grna2-hi-tom-as的核苷酸序列如seqidno：11所示。

优选的，所述海岛棉包括新海35号。

本发明提供了一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，本发明通过在可以进行遗传转化的陆地棉材料中对棉花隐性核不育恢复基因ghnsp进行基因编辑敲除，创制陆地棉突变体材料，再通过杂交将含crispr/cas9与sgrna的t-dna片段转移到海岛棉中，获得杂交后代中发生ghnsp基因的敲除，获得雄性不育性状。本发明提供的创制方法对海岛棉材料的遗传改良与基因功能验证具有非常重要的意义。

附图说明

图1为本发明中用于创造基因编辑棉花材料的prgeb32-ghu6.7-npt2-ghnsp质粒载体图谱，其中，左下角sgrna功能元件已用圆角方框标出，lbt-dnarepeat和rbt-dnarepeat中间的片段为插入到基因组中的t-dna片段；

图2为利用ghnsp-crispr/cas9系统在陆地棉中获得不育系材料；其中a为转化受体材料jin668植株形态图；b为转化prgeb32-ghu6.7-nptii-ghnsp的植株形态图；c为jin668材料与转基因植株t0代花药的表型图，左边为jin668花药图表现为正常开裂，右边为转基因材料花药图表现花丝变短，花药不能正常开裂的败育表型；d为jin668材料花粉碘碘化钾染色结果，花粉被染成黑色，表示为花粉发育正常可育；e为转基因材料花粉碘碘化钾染色结果，花粉无法被染成黑色，表示为花粉发育异常不育；

图3为杂交后代检测t-dna片段的电泳图；

图4为利用ghnsp-crispr/cas9系统在海岛棉中突变ghnsp的同源基因gbar_d02g025630与gbar_d04g020900，创制海岛棉不育系材料，在后代群体材料中筛选获得不育系材料；a为杂交后代表型鉴定结果；b和c为hi-tom鉴定基因型结果，其中a的比例尺为2cm。

具体实施方式

本发明提供了一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，包括以下步骤：

1)设计合成ghnsp基因的sgrna1和sgrna2；

2)将sgrna1和sgrna2串联构建到crispr/cas9基因编辑载体中；

3)将步骤2)构建的crispr/cas9基因编辑载体在农杆菌的介导下转化陆地棉材料，筛选获得陆地棉突变体材料；

4)将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行hi-tom检测，筛选含crispr/cas9与sgrna的t-dna片段、敲除ghnsp基因的杂交后代，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料。

本发明设计合成ghnsp基因的sgrna1和sgrna2。

本发明对ghnsp基因的sgrna的设计方法没有特殊性限制，采用本领域所熟知的设计方法即可，例如采用网站http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/设计获得陆地棉ghnsp基因特异的sgrna。所述sgrna1是针对陆地棉ghnsp基因的三号外显子区域设计得到。所述sgrna2是针对陆地棉ghnsp基因的二号外显子区域设计得到。所述sgrna1的核苷酸序列优选如seqidno:1所示(aggctcgtagtgtccctccgtgg，下划线部分为pam序列)；所述sgrna2的核苷酸序列优选如seqidno:2所示(attatggagcagacccaacgggg，下划线部分为pam序列)。

得到sgrna1和sgrna2后，本发明将sgrna1和sgrna2串联构建到crispr/cas9基因编辑载体中。

在本发明中，sgrna1和sgrna2串联构建到crispr/cas9基因编辑载体的方法，优选包括以下步骤：

a.以pgtr载体为模板，分别扩增含所述sgrna1的目标片段1和含所述sgrna2的目标片段2；

b.将所述含所述sgrna1的目标片段1和含所述sgrna2的目标片段2利用重叠延伸pcr方法连接形成串联有sgrna1和sgrna2的长片段；

c.将所述串联有sgrna1和sgrna2的长片段插入prgeb32-ghu6.7-nptii载体中，得到含sgrna1和sgrna2的crispr/cas9基因编辑载体。

本发明对pgtr载体的来源不做具体限制，采用本领域所熟知的pgtr载体即可。在本发明实施例中，所述pgtr载体来自华中农业大学谢卡斌教授馈赠。

在本发明中，所述扩增含所述sgrna1的目标片段1用引物对优选为inf-prger32-7-s和ghnsp-crispr-1-as；所述inf-prger32-7-s的核苷酸序列优选如seqidno：3所示；所述ghnsp-crispr-1-as的核苷酸序列优选如seqidno：4所示。所述扩增的反应体系为20μl：ddh2o15.1μl、10×buffersolution2.0μl、10mmdntp0.3μl、上游引物0.2μl、下游引物0.2μl、cdna2.0μl、taq聚合酶0.2μl。所述扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃50sec，32个循环；72℃7min。

在本发明中，所述扩增含所述sgrna2的目标片段2用引物对优选为ghnsp-crispr-2-s和ghnsp-crispr-2-as。所述ghnsp-crispr-2-s的核苷酸序列优选如seqidno：5所示；所述ghnsp-crispr-2-as的核苷酸序列优选如seqidno：6所示。所述扩增的反应体系为20μl：ddh2o15.1μl、10×buffersolution2.0μl、10mmdntp0.3μl、上游引物0.2μl、下游引物0.2μl、cdna2.0μl、taq聚合酶0.2μl。所述扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃50sec，32个循环；72℃7min。

在本发明中，所述sgrna1的目标片段1和sgrna2的目标片段2优选进行纯化，所述纯化的方法优选采用dna片段纯化试剂盒进行，分别得到纯化片段1和纯化片段2。

在本发明中，所述重叠延伸pcr方法中所用的引物优选为核苷酸序列如seqidno：3所示的inf-prger32-7-s和核苷酸序列如seqidno：7所示的infghnsp-crispr-as。所述重叠延伸pcr的扩增体系为100μl：ddh2o83.5μl、10×buffersolution10μl、10mmdntp1.5μl、上游引物inf-prger32-7-s1μl、下游引物infghnsp-crispr-as1μl、纯化片段11μl、纯化片段21μl、taq聚合酶1μl。所述扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃50sec，32个循环；72℃7min。

在本发明中，将所述串联有sgrna1和sgrna2的长片段插入prgeb32-ghu6.7-nptii载体中的方法，优选采用利用infusion反应进行。得到的连接载体转入大肠杆菌中，培养，菌落pcr鉴定，提取重组质粒见图1，可用于后续方案。所述菌落pcr鉴定用引物优选为prger32-7-s/infghnsp-crispr-as。所述prger32-7-s的核苷酸序列如的核苷酸序列优选如seqidno：12所示。所述infghnsp-crispr-as的核苷酸序列如的核苷酸序列优选如seqidno：7所示。所述反应程序为a.95℃5min；b.95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，32个循环；c.72℃7min。

得到重组crispr/cas9基因编辑载体，本发明将所述重组crispr/cas9基因编辑载体在农杆菌的介导下转化陆地棉材料，筛选获得陆地棉突变体材料。

在本发明中，本发明对所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可。所述陆地棉材料优选包括jin668。所述筛选优选用prger32-7-s和infghnsp-crispr-as进行转基因阳性检测。

得到陆地棉突变体材料和海岛棉后，本发明将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行hi-tom检测，筛选含crispr/cas9与sgrna的t-dna片段的杂交后代。

在本发明中，所述海岛棉优选包括新海35号。本发明对所述杂交的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的杂交方法即可。

在本发明中，所述筛选含crispr/cas9和sgrna的t-dna片段的杂交后代的方法优选是利用grna1-hi-tom-gb-s和grna1-hi-tom-as引物对杂交材料dna序列进行第一轮pcr扩增，再进行第二轮pcr扩增加测序接头，得到的pcr扩增产物进行二代测序检测grna1，用grna2-hi-tom-gb-s和grna2-hi-tom-as引物对杂交材料dna序列进行第一轮pcr扩增，再进行第二轮pcr扩增加测序接头，得到的pcr扩增产物进行二代测序检测grna2；通过测序结果分析，表明杂交后代转基因材料中ghnsp-crispr/cas9也可以对海岛棉杂交后代的ghnsp的同源基因进行编辑，产生雄性不育系材料。所述grna1-hi-tom-gb-s的核苷酸序列优选如seqidno：8所示；grna1-hi-tom-as的核苷酸序列优选如seqidno：9所示；grna2-hi-tom-gb-s的核苷酸序列优选如seqidno：10所示；grna2-hi-tom-as的核苷酸序列优选如seqidno：11所示。所述第一轮pcr扩增的反应体系为10×buffersolution，2μl；taq聚合酶，0.3μl；10mmdntp，0.3μl；上游引物(seqidno:8或seqidno:10)，0.2μl；下游引物(seqidno:9或seqidno:11)，0.2μl；模板dna，1μl；ddh2o，16μl；所述第一轮pcr扩增的反应程序为a.95℃5min；b.95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，32个循环；c.72℃7min；d.15℃保温。所述第二轮pcr扩增可参考文献进行(hi-tom:aplatformforhigh-throughputtrackingofmutationsinducedbycrispr/cassystems,qing,etal.,sciencechina.lifescience,2019jan；62(1):1-7)。

得到含crispr/cas9与sgrna的t-dna片段的杂交后代，为了得到纯合海岛棉雄性不育材料，本发明将所述含crispr/cas9与sgrna的t-dna片段的杂交后代与海岛棉杂交，筛选，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料。

在本发明中，所述海岛棉优选包括新海35号。由于海岛棉与陆地棉杂交后，得到的杂交后代中含部分陆地棉基因片段，因此，通过与海岛棉杂交得到纯化海岛棉突变体材料。所述筛选优选是筛选含t-dna片段、敲除ghnsp基因的海岛棉突变材料。所述筛选含t-dna片段的海岛棉突变材料用引物为正向引物：ttgtcactgaagcgggaagg，seqidno:12和反向引物：cgataccgtaaagcacgagg，seqidno:13。所述敲除ghnsp基因的海岛棉突变材料用引物为seqidno:8和seqidno:9与seqidno:10和seqidno:11。

本发明采用上述方法创制得到新的海岛棉杂交后代雄性不育材料对海岛棉材料的遗传改良与基因功能验证具有非常重要的意义。

下面结合实施例对本发明提供的一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

转基因陆地棉阳性植株的获得

1转基因载体构建

1.1靶点sgrna的获得

嵌合引导rna(chimericguiderna)由网站http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/设计获得陆地棉ghnsp基因特异的sgrna(序列见表1)。

表1ghnsp基因的sgrna序列

根据两条sgrna序列设计用于扩增的引物对，其中inf-prger32-7-s/ghnsp-crispr-1-as用于扩增ghnsp-sgrna1+trnagly形成的含sgrna1的目标片段1；ghnsp-crispr-2-s/ghnsp-crispr-2-as用于扩增ghnsp-sgrna2+trnagly形成的含sgrna2的目标片段2，具体引物序列如下：

inf-prger32-7-s：5'aagcatcagatgggcaaacaaa3'(seqidno:3)；

ghnsp-crispr-1-as：5'cggagggacactacgagccttgcaccagccgggaat3'(seqidno:4)；

ghnsp-crispr-2-s：5'aggctcgtagtgtccctccggttttagagctagaaata3'(seqidno:5)

ghnsp-crispr-2-as：5'cgttgggtctgctccataattgcaccagccgggaat3'(seqidno:6)。

以pgtr载体为模板，利用上述引物进行目的基因片段1(ghnsp-sgrna1+trnagly)和目的基因片段2(ghnsp-sgrna2+trnagly)的扩增；目的片段的扩增体系(20μl)：ddh2o15.1μl、10×buffersolution2.0μl、10mmdntp0.3μl、上游引物0.2μl、下游引物0.2μl、pgtr2.0μl、taq聚合酶0.2μl。pcr条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃50sec，32个循环；72℃7min，15℃保温。

1.2载体构建

扩增完成后，利用dna纯化回收试剂盒，分别回收目的片段，再利用重叠延伸pcr将两个目标片段连接成为一个片段。

重叠延伸pcr的扩增体系(100μl)：ddh2o83.5μl、10×buffersolution10μl、10mmdntp1.5μl、上游引物inf-prger32-7-s1μl、下游引物infghnsp-crispr-as1μl、纯化片段11μl、纯化片段21μl、taq聚合酶1μl。其中上游引物inf-prger32-7-s：5'aagcatcagatgggcaaacaaa3'(seqidno:3)；infghnsp-crispr-as5'ttctagctctaaaaccgttgggtctgctccataat3'(seqidno:7)。

扩增完成后，利用dna纯化回收试剂盒回收目的片段，再利用infusion反应，将目标片段构建到prgeb32-ghu6.7-nptii载体上(xie,k.,minkenberg,b.andyang,y.(2015)boostingcrispr/cas9multiplexeditingcapabilitywiththeendogenoustrna-processingsystem.proc.natl.acad.sci.usa,112,3570–3575.wang,p.etal.highefficientmultisitesgenomeeditinginallotetraploidcotton(gossypiumhirsutum)usingcrispr/cas9system.plantbiotechnol.j.16,137-150,(2018).)。连接反应体系(5μl)如下：目的片段1.0μl、酶切好prgeb32-ghu6.7-nptii1.0μl、cebuffer1.0μl、exnase0.5μl、ddh2o1.5μl。

连接两条sgrna后载体总长度为16,495bp，载体环形图谱如图1所示。

1.3重组载体的验证及转化农杆菌的方法

通过热激转化的方法转入大肠杆菌top10中，然后涂到含有kan+抗性的固体lb培养皿中，37℃过夜培养。挑取单菌落，pcr阳性鉴定(prger32-7-s/infghnsp-crispr-as引物对进行验证阳性重组载体)，将重组载体命名为prgeb32-ghu6.7-nptii-ghnsp(表达ghnsp-crispr/cas9)。将构建好的载体利用电激转化方法转到农杆菌gv3101中。

2.陆地棉转化

(1)无菌苗的种植。挑选饱满的棉花种子，剥去种壳，用0.1％的hgcl2消毒8min左右，再用无菌水清洗3～5次，清除升汞，每次约5min，种于无菌苗培养基中，28℃黑暗培养于培养箱中。

(2)菌液的活化。取保存的含有目的基因的农杆菌菌液，划平板，2d后挑取单克隆，摇菌过夜；经高速离心使菌液沉淀，弃上清，加入10ml的mgl和25μl的as，充分震荡，使菌液悬浮，28℃摇床，200rpm/min活化至少30min。

(3)切苗及侵染。在无菌条件下，将暗培养了7d左右的无菌苗下胚轴切割成0.5～0.8cm的小段；用已活化的农杆菌菌液侵染下胚轴8min，弃菌液，将下胚轴转移到有滤纸的培养皿中，吹干约10min；然后将下胚轴转至共培养皿中，21℃暗培养2～3d。

(4)下胚轴的筛选培养。将共培养皿中的下胚轴转移到筛选培养皿中(含有卡那霉素和头孢霉素)，摆放整齐，通过筛选可以去除未被农杆菌侵染的下胚轴，然后放到光照培养室培养。每隔30d左右继代一次，约3～5次，在这个过程中会长出大量愈伤组织和胚性愈伤。

(5)分化培养。将胚性愈伤转入到分化培养基中，经30d左右继代一次，出现体胚；把体细胞胚再继代一次，直到长出真叶。

(6)生根培养。将长出真叶后的小苗转移到生根培养基中，7d左右会长出新根，进而长成苗子；若苗子较小，可以再继代一次，提高苗子的成活率。

(7)练苗。揭开再生植株封口膜，练苗3d，再在水中练苗3d，即可移栽。

表2组织培养以及转化中用到的培养基(参见金双侠博士论文2006)

3.转基因棉花植株dna的提取与检测

采用ctab法提取t0代转基因棉花叶片dna。具体包括以下步骤：取转基因叶片置于2ml离心管中，冰上摆好后逐个加入钢珠和200μl抽提缓冲液(0.35m葡萄糖，0.1mtris-hcl，0.005mna2edta，2％pvpk-30和0.1％dieca，ph值7.5)，磨样机打60s，频率为60hz；加700μl裂解液(0.1mtris-hcl，1.4mnacl，0.02mna2edta，2％ctab，2％pvpk-30和0.1％dieca，ph值8.0)在65℃水浴30min裂解，取上清加800μl氯仿轻柔摇匀抽提20min，后取上清加等体积异丙醇后混匀沉淀dna，最后倒掉上清，絮状沉淀用75％酒精洗两次后吹干，用适ddh2o溶解。

获得dna后，用prger32-7-s和infghnsp-crispr-as进行转基因阳性检测。挑选阳性植株进行表型鉴定，发现在陆地棉材料jin668背景中，转化prgeb32-ghu6.7-nptii-ghnsp的植株表现正常(图2中a和b)，但花丝变短，花药不能正常开裂(图2中c)，且花粉不能被碘碘化钾染成黑色，表现为败育(图2中d和e)。

实施例2

利用crispr/cas9系统在海岛棉中创制不育系材料

在海岛棉中分析ghnsp的同源基因，发现在海岛棉中具有两个同源基因，分别为gbar_d02g025630(seqidno:14～seqidno:15)与gbar_d04g020900(seqidno:16～seqidno:17)。同时，发现在这两条序列中，均含有ghnsp-crispr/cas9的靶向的位点。因此，ghnsp-crispr/cas9在海岛棉中也是具有靶向突变的功能。因此，利用实施例1制备的陆地棉突变体t0代plant1植株与海岛棉材料(新海35号)进行杂交，获得杂交种子，对杂交后代(命名规则为h+植株编号，如h1代表杂交后代编号为1的植株)进行pcr检测，所用引物序列为正向引物：ttgtcactgaagcgggaagg，seqidno:12；反向引物：cgataccgtaaagcacgagg，seqidno:13；反应体系为10×buffersolution，2μl；taq聚合酶，0.3μl；10mmdntp，0.3μl；正向引物，0.2μl；反向引物，0.2μl；模板dna，1μl；ddh2o，16μl。反应程序为：a.95℃5min；b.95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，32个循环；c.72℃7min；d.15℃保温。

检测结果表明，杂交后代h1和h2为转基因阳性植株，即杂交后代含有t-dna片段，杂交后代h6为转基因阴性植株，即杂交后代不含有t-dna片段(序列见seqidno:18)(图3)。

同时，为了对杂交后代进行表型鉴定，在杂交后代材料开花时，对花药的外在形态进行观察拍照。

结果表明，杂交后代h1和h2表现出花药不能正常开裂的不育表型特征，而杂交后代h6表现出花药能正常开裂的正常可育表型(图4中a)。同时，该结果也表明转基因阳性的杂交后代表现为不育表型，转基因阴性的杂交后代表现为正常可育表型。

为了证明不育表型的出现是由于海岛棉中ghnsp的同源基因突变导致了不育表型的出现，对杂交后代进行hi-tom检测，利用hi-tom平台对获得的杂交后代材料进行crispr/cas9系统诱导的突变类型鉴定，具体实施过程如下，首先提取获得转基因材料的dna样品；其次利用设计好的hi-tom检测引物，引物序列如下：

grna1-hi-tom-gb-s：ggagtgagtacggtgtgcatttgctgagttgggtattt(seqidno:8)；

grna1-hi-tom-as：gagttggatgctggatggtaagatacccatcaaccggaaa(seqidno:9)；

grna2-hi-tom-gb-s：ggagtgagtacggtgtgctgtaattgagaatggatttg(seqidno:10)；

grna2-hi-tom-as：gagttggatgctggatgggcgattgccttgtttagtgctt(seqidno:11)。

序列中有下划线的小写字母为特异的接头引物，接头引物信息详见参考文献(hi-tom:aplatformforhigh-throughputtrackingofmutationsinducedbycrispr/cassystems,qing,etal.,sciencechina.lifescience,2019jan；62(1):1-7doi：10.1101/235903)。利用上述引物进行第一轮pcr扩增，得到的pcr产物后再根据参考文献(hi-tom:aplatformforhigh-throughputtrackingofmutationsinducedbycrispr/cassystems,qing,etal.,sciencechina.lifescience,2019jan；62(1):1-7)给出的第二轮引物进行第二轮pcr扩增(该轮pcr主要目的是加上测序接头以便于高通量测序)，最后对pcr产物进行纯化回收；纯化后的pcr产物送公司进行二代测序；最后在网站上(http://www.hi-tom.net/hi-tom/)对测序的结果进行分析。

结果分析表明，杂交后代h1和h2在ghnsp同源基因gbar_d02g025630与gbar_d04g020900的靶标序列上均发生了纯合隐性突变。而在杂交后代h6中没有检测到纯合隐性突变(图4中b和c)。结合上述表型数据结果。最终，确认ghnsp-crispr/cas9在海岛棉杂交后代材料中也可以对ghnsp的同源基因进行编辑，产生不育系材料。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法

<160>18

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aggctcgtagtgtccctccgtgg23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

attatggagcagacccaacgggg23

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aagcatcagatgggcaaacaa21

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cggagggacactacgagccttgcaccagccgggaat36

<210>5

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aggctcgtagtgtccctccggttttagagctagaaata38

<210>6

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cgttgggtctgctccataattgcaccagccgggaat36

<210>7

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ttctagctctaaaaccgttgggtctgctccataat35

<210>8

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ggagtgagtacggtgtgcatttgctgagttgggtattt38

<210>9

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gagttggatgctggatggtaagatacccatcaaccggaaa40

<210>10

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

ggagtgagtacggtgtgctgtaattgagaatggatttg38

<210>11

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gagttggatgctggatgggcgattgccttgtttagtgctt40

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

ttgtcactgaagcgggaagg20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

cgataccgtaaagcacgagg20

<210>14

<211>5802

<212>dna

<213>海岛棉(gossypiumbarbadense)

<400>14

gtgacttttaagtcaaattttgacaaaaataaacatggtgtagttcaggtggttgagaaa60

gggcagagtttcaaggatcaaaggggaatgaaaatcacgtgtttcactttggagaatcga120

gtatgggtttcccaaattcggatgtgcaagcagtgtagacggttttatccaacagaagaa180

accaccagattgcgaattggaaggtgatgaatccccaatggtggagctaacgacgacaat240

ggagggcattgaacaaggaaccccgaatagttccccagcagaagaattaatttctgtggt300

ggaaggtatggatgataatgctatcagaaatgtcgaggtagttgctgaatttggtgttga360

aacttggattggctgtttgttgttgttttatggattcaaaactattcttctggaactgtc420

aaggaacgagtcatctccgtttccataaatttgtggctgagtatggaagagaattttgtc480

caggtgttatatgtttgtttgagactcagttcggtggtgttagggtgaatggcatcattt540

ccaagcttgggttcccaaattctttcaatttggatgtagtaactttcaattttttctgtt600

tgataatggtatccgtgacttggggttcagtgggccctgggcttagtggaccagcccacc660

cttggtccaatcgaaggatgctggccatgttccctttcaaacggcctactttcgaactca720

aggagaacgtccattaacctgcgtagtggaagcggctcagaggagaaagacgcaagagtg780

acaaccgcgtcatactcggacgacaaccccgcaagaacaatctccaccctttcggaatcc840

gaaatctgatgatctgaggcctcaagcagagcacatgtattttgaattttagcaatgtat900

tctttaatcctttgggtacttttcttgatggaatgtaaatcgtgtttgatacgagacaac960

ttggcagcagtcacggcggcaaacagacgattggcggtggtccatacatcattagaggtt1020

cgcacatcagtgaaacacgagagtaaggagccactgatcgtggatagcaaccatgacgca1080

aggagcttatcctgttgatgaaacaccgaagctttaggattcaacaccatctggccctct1140

tgagtcgacacaaaacgaggtggagacgaaagagatccatcaacaaaaccggtgagatca1200

taaccttatagaatgagtttaatgtgttgctgccactgtataaaattgccttcatcgagc1260

ttaactgtatcctgtttaggaaaacactgcagtcttaccagattcagagtgaaccgaagg1320

tgccggatcacgcacaggtggagaatggtcattagtggcagagacaaaattcgtggattg1380

agccatgagaacgcagcaggaaacgcaaccaggatcttaggcgaatgaaccatgaaagta1440

aatggaacaatatgaaaatcaaatttgagactaacactggtaaatgaatcttttcactga1500

atactaacaacctactaacaatttgaacaaactgaactgactaattgacttgcagctcct1560

tttatatattctaacagaagcaaagaaaggtttctttgtttggttgagttttgggttact1620

tcaagatgaagaagaacatccaattccatgtagtagcaattggaagctaccttacccatt1680

actcaacccactgcatattccttcaatccttcagttttctttctttctttctaccataga1740

ttattacttaaataaaaacataaaaacaatcatccatgtttttctcttcttccctttttt1800

ttttcttagaaaataaatttattgaattaaaatgtagaaactagtcttacaaaagttcat1860

tacagttttgaaatattagatgaaacaataagaaacacgcttcaaacatggatactctct1920

caatgccattttcgcccaagaatctgcaaagaagttagcttccctgaaggcacgaggtga1980

aaaatctttttaacggtacaatttgatatataaatgataaactatatgtttgtgatgtta2040

gtgtgcatataaattaaaatggagtcgtgttaaatggatgtttgacaaaaaatttaaaaa2100

attaaattataattataattgcaattgtaatttaagactataattataattgcaattgta2160

atttaagtaataaatggtataagaaatcacaaagttttcatcaaaatgacttcaattata2220

gttcctaaccctttgtctgacttatgacgattgcttttgctttgtaatagtaagtaaaag2280

ataagatccaagatgaaaaagaatattggacctagctatctttgatgcattggcaatcta2340

gctagtaggggaactggatccatccttctacttggcagggcaggcgtaaaaatagacaaa2400

cacattgaattcatataccacttatctctttctttttcagccctctagctagtcttctac2460

cattacatttgttcctcccatttaattcatctcttaattaaatttatcatgatctgtatg2520

ttacttacatcgcatgcctagtaatatttcaatttattgattccttattgtaacatatac2580

atattcactcttaattgcatttttaattttctttaatttcactccacaattaatttatac2640

gcgtttaataatcaattattaatttgtgtgtatataaatattctactcatttgatatgtg2700

aatcagcagaaaattcaagaacaaaaaaatatctcctcctccttctcatgcgaaggtctg2760

ggtccatcaacgcaagatatcaattcatgaatataagaagttggtaaaaagttgataaga2820

agctgataagtgattagtgttttgtcaaacaagaagtttttttttatccattgtcagaca2880

agaaattaaatttcaaacaggctttttacctaagcaagctctcctcgcaagtcatgtcga2940

aaaatcccccacacatttaaacagaaactataggtgtcatgtgtgtgatctaatattata3000

aaacattctatagatttcctagcaaatcttagttagccccttctctttccatgttcctcc3060

tcttgctccttcccttcgtcatttaaaccgtatgtctctctctcaaaacggagagaaaac3120

agatcgaaagatgatggagagaagaaacatgggaggaaggaatattgctgtagcaacact3180

ctccatgatattgggtttgttcctaatccatgtttctggcgataattcacgagtgggaaa3240

gttttctgctgctcctgaccacgaccaaatgcgccaattgcaagcgtttaaggcctctct3300

tattggtcgacaatccgtttcaggttcacctatctcgccctcttcttcgccactgcaggt3360

aaataatttcttgtgcatctagtttctaacatttcctcaatggcggaatgatgttaatta3420

attaaattaatgcaatgtaattgagaatggatttggatatataggaagccataggtccac3480

gtgtgtatcatgtaacaaattatggagcagacccaacggggaaatcagacagcacagaag3540

cactaaacaaggcaatcgcggatgcatttcaggttcctagtgaagggttcttgatggagg3600

ggatcactaatcttggagggccacaaattaatcttgaaggtgggaactaccttatcagta3660

aaccactgcagttagttgctgccggtgcaggaaatcttatggtatgcgcaaccaaacatt3720

tttaatcaattgaaattatcttttatactagctaattgctgtcatgtcataatctttctt3780

tataaagtagaacaatatatatatacttgtatttatattggctcatcatctacgtactta3840

attaccgtttctatgctagcagtaccacacatacacacatataagcagttggtgtttttg3900

gtgaatgaaacacacctggttggatgacttatatcgtccccgagaaaattgcagatagat3960

ttctatatgttaatgtttcggcacttaactctcaaagcaaagcaattggtcttttctagg4020

atagaaaaaatggtaataataatatctagtaggatatgttcatgtttggaattgatgata4080

acatttgttgaagactgaaatgacaaccatttttatcatatgaaaatgaggtgatgtgca4140

cctaattccaattggttaaactgacacagactgtatataatataatatagtatgtacatt4200

ttgcaacatggtagacctgctcaccatattgaattccagtgagcaatcgttggagaagag4260

agggtctgggtctagattctgtaattgatgtaatataacatatataaatttacatatgtt4320

gaggttgcattaattaacaacgtcgagttatattttttttcttttttggtatctaacaac4380

gtcaggttaattaataaagcatataaattatatcaccaaataaaacttcgttttaatttg4440

ctgagttgggtatttctttgtttaaattatatatggagcagatccacggagggacactac4500

gagcctcagatgattttccggttgatgggtatcttattgatttgtctccaaattcatggg4560

ctagcagtactgaagaagaaataagagaagggagctccttgaaattgaatttacagctta4620

cctcatcatcatcatcctataactacgagtacataaccctcagagacctgatgttggatt4680

ctaattacaggggtggtggcatttcagttataaactcactaaggactagcattgacaatt4740

gctacattgcccatttctccactaatggaattttagtccaaggcgggcacgagacctata4800

tcaggaattctttccttgggcaacatatcacggccggtggtgatgcaggcgaaaggaact4860

ataccggcactgccattaacctaatgggaaacgataatgcagtgacggatgtggtgattt4920

tttcagctgccataggaataatggcctcaggtcaagccaacaccttttctggggtgcatt4980

gttacaacaaggcaacaggttttggtggcacggggatttacttgaagctgcctggtctta5040

cacaaacccggatagtaaattcatacctagattacactgggattgtggctgaagacccag5100

tgcaacttcatatctctagcagttttttcctcggtgatgcatttatcctcttgaaatcaa5160

taaatggggtagcaaatggagtgactatagtggataacatgttcagtggatctaataagg5220

gggttgatatagttcagttagagggtcctttcacacaaattgatcaggttgtagttgata5280

ggaatagtgccaaggggatgaacattaaagcaacagttgcgagagggtctgttgaaggga5340

atagcagctcctggacggttgattttaatcctgttcttttatttcctaacctgattaagc5400

atgttcagtattcactaagctcaagcaggggcagctcatttcctagccatgccctgagaa5460

atgtgtctgaaaatcaagttgtgattgagtctgatctcgctgtgctggctaatgttttcg5520

tcacggtggatcaagcttaagcaccatgacctgacttattattattattattattattat5580

tatcatcatcagcagcagcagcatcattatcagcatcatcatctgatggagagttaagat5640

cctttgacaattgtgaatatggggtgaaagactagtattgtctttttctctgaaagttca5700

actcaaatcaaacatatatcggctaaaaggatagatttccagaagatacaaaattgacaa5760

gaaggaattgaataaataaaagctttccctcacccatttact5802

<210>15

<211>507

<212>prt

<213>海岛棉(gossypiumbarbadense)

<400>15

metmetgluargargasnmetglyglyargasnilealavalalathr

151015

leusermetileleuglyleupheleuilehisvalserglyaspasn

202530

serargvalglylyspheseralaalaproasphisaspglnmetarg

354045

glnleuglnalaphelysalaserleuileglyargglnservalser

505560

glyserproileserproserserserproleuglnglualailegly

65707580

proargvaltyrhisvalthrasntyrglyalaaspprothrglylys

859095

seraspserthrglualaleuasnlysalailealaaspalaphegln

100105110

valprosergluglypheleumetgluglyilethrasnleuglygly

115120125

proglnileasnleugluglyglyasntyrleuileserlysproleu

130135140

glnleuvalalaalaglyalaglyasnleumetilehisglyglythr

145150155160

leuargalaseraspasppheprovalaspglytyrleuileaspleu

165170175

serproasnsertrpalaserserthrgluglugluileargglugly

180185190

serserleulysleuasnleuglnleuthrsersersersersertyr

195200205

asntyrglutyrilethrleuargaspleumetleuaspserasntyr

210215220

argglyglyglyileservalileasnserleuargthrserileasp

225230235240

asncystyrilealahispheserthrasnglyileleuvalglngly

245250255

glyhisgluthrtyrileargasnserpheleuglyglnhisilethr

260265270

alaglyglyaspalaglygluargasntyrthrglythralaileasn

275280285

leumetglyasnaspasnalavalthraspvalvalilepheserala

290295300

alaileglyilemetalaserglyglnalaasnthrpheserglyval

305310315320

hiscystyrasnlysalathrglypheglyglythrglyiletyrleu

325330335

lysleuproglyleuthrglnthrargilevalasnsertyrleuasp

340345350

tyrthrglyilevalalagluaspprovalglnleuhisileserser

355360365

serphepheleuglyaspalapheileleuleulysserileasngly

370375380

valalaasnglyvalthrilevalaspasnmetpheserglyserasn

385390395400

lysglyvalaspilevalglnleugluglyprophethrglnileasp

405410415

glnvalvalvalaspargasnseralalysglymetasnilelysala

420425430

thrvalalaargglyservalgluglyasnsersersertrpthrval

435440445

asppheasnprovalleuleupheproasnleuilelyshisvalgln

450455460

tyrserleuserserserargglyserserpheproserhisalaleu

465470475480

argasnvalsergluasnglnvalvalilegluseraspleualaval

485490495

leualaasnvalphevalthrvalaspglnala

500505

<210>16

<211>3461

<212>dna

<213>海岛棉(gossypiumbarbadense)

<400>16

atggtgttaaatggatgtttaacaaaaattttaaaaagttaaactataattataattata60

attgcaattgtaatttaagtaataaatggtataagaaatcaccaagttttcatcaaaatg120

actttaattatagttcctaaccctttgtctgacttacgacgattgcttatgctttgtaat180

agtaagtaaaagacaagatccaagatgaaaaagaatactggacctagctatctttgatgc240

attggcaatctagctagtaggggaactggatccatccttctacttggcagggcaggcgta300

aaaatagacaaacatattgaattcatataccacttatctctttctttttcagtcctctag360

ctagtcttctaccattatatttgttccttcccatttaattcatctctcaattaaatttat420

catgctctgtatgttacttacatcacatgcctagtaatatttcaatttattggttcctta480

ttgtaacatatacatattcactcttaattgcatttttaatattctttaatttcactccac540

aattaatttatatgcgtttaataatcaattatttaatttgtgtgtatataaatattctac600

tcatttgatatgtgaatcagcagaaaattgaagaaatttttttttctccttctcgttctc660

atgcgaaggtctgggtccatcaacgcaagatatcaattcatgaatataagaagttggtaa720

aaagttgataagaagctgataagtgattagtgttttgtcaaacaagaatattttttttat780

ccattgtcagacaagaaattaaatttcaaacaggctttacctaagcaagctatcctcgca840

agtcatgtctaaaaatcccccacacatttaaacagaaactataggtgtcatgtgtgtgat900

ctaatattataaaacattctatagatttcctagcaaatcttagttagccccttctctttc960

catgttcctcctcttgctccttcccttcgtcatttaaaccgtatgtctctctctcaaaac1020

ggagagaaaacagatcgaaagatgatggagagaagaaacatgggaggaaggaatattgct1080

gtagcaacactctccatgatattgggtttgttcctaatccatgtttctggcgataattca1140

cgagtgggaaagttttctgcttctccttaccacgaccaaatgcgccaattgcaagcgttt1200

aaggcttctcttattggtcgacaatccgtttcagtttcacctatctcgccctcttcttca1260

tcatcctcttcttcgccactgcaggtaaataatttcttgtgcatctaatttctaacattt1320

cctcaatggcggaacgatgttaattaattaaattaatgcaatgtaattgagaatggattt1380

ggatatataggaagccataggtccacgtgtgtatcatgtaacaaattatggagcagaccc1440

aacggggaaatcagacagcacagaagcactaaacaaggcaatcgcggatgcatttcaggt1500

tcctagtgaagggttcttgatggaggggatcactaatcttggagggccacaaattaatct1560

tgaaggtgggaactaccttatcagtaaaccattgcagttagttgctgccggtgcaggaaa1620

tcttatggtatgcgcaaccaaacatttttaatcaattgaaattatcttttatactagcta1680

attgatgtcatgtcataatctttctttataaagtagaacaatatatatacttgtatttat1740

attggctcatcatctacctacttaattaccgtttctatgctagcagtaccacacatacac1800

acatataagcatctggtgtttttggtgaatgaaacccacctggttggatgacttatgtcg1860

tccctgagaaaattgcagatttctatatgttaatgtttcggcacttaactctcaaagcaa1920

agcaatcggtcttttctaggatagaaaaaatggtaataataatagctagtaggatatgtg1980

catgtttggaattgatgataacatatttgttgaagactgaaatgacgaccttttttatca2040

tatgaaaatgagatgatgtgcacctaattccaattggttaaactggcacagactgtatat2100

aatataatatagtatgtacattttgcaacattgtagacctgctcaccatactgaattcca2160

atgagcaatcgttggagaagagagagtctgggtctagattctgtaattgacgtaatataa2220

catatataaaatttacgtatgttgaggtttcattaattaacaacgtcgagttattttttt2280

tcttttttggtatctaacaacgtcagattaattaatgaagcatataaactatatcaccaa2340

ataaaactttgtttgaatttgctgagttgggtatttctttatttaaattatatatggagc2400

agatccacggagggacactacgagcctcagatgattttccggttgatgggtatcttattg2460

atttgtctccaaattcatgggctagcagaactgaacaagaaataagaaaagggagctcct2520

tgaaattgaattcacagcttacctcatcatcgtcatcctataactacgagtacataaccc2580

tcagagacctgatgttggattctaattacagaggtggtggcatttcagttataaactcac2640

taaggactagcattgacaattgctagattgcccatttctccactaatggaattttagtcc2700

aaggcgggcacgagacctatatcaggaattctttccttgggcaacatatcacggccggtg2760

gtgatgcaggcgaaaggaactataccggcactgcaattaacctaatgggaaacgataatg2820

cagtgacggatgtggtgattttttcagctgccataggaataatggcctcaggtcaagcca2880

acactttttctggggtgcattgttacaacaaggcaacaggttttggtggcacggggattt2940

acttgaagctgcctggtcttacacaaacccggatagtgaattcatacctagattacactg3000

ggattgtggctgaagacccagtgcaacttcatatctctagcagttttttcctcggtgatg3060

catttatcctcttgaaatcaataaatggggtagcaaatggagtgactgtagtggataaca3120

tgttcagtggatctaataagggggttgatataatccagttagagggtcctttcacagaaa3180

ttgatcaggttgtagttgataggaatagtgccaaggggatgaacattaaagcaacagttg3240

cgagagggtctgttgaagggaatagcagctccaggacggttgattttaatcctgttcttt3300

tatttcctaacctgattaagcatgttcagtattcactaagatcaagcaggggcagctcat3360

ttcctagccatgccctgagaaatgtgtctgaaaatcaagttgtgattgagtctgatctcg3420

ctatgcccgcaaatgttttcgtcacggtggatcaagcttaa3461

<210>17

<211>514

<212>prt

<213>海岛棉(gossypiumbarbadense)

<400>17

metvalleuasnglycysleuthrlysileleulysasnarglysmet

151015

metgluargargasnmetglyglyargasnilealavalalathrleu

202530

sermetileleuglyleupheleuilehisvalserglyaspasnser

354045

argvalglylyspheseralaserprotyrhisaspglnmetarggln

505560

leuglnalaphelysalaserleuileglyargglnservalserval

65707580

serproileserproserserserserserserserserproleugln

859095

glualaileglyproargvaltyrhisvalthrasntyrglyalaasp

100105110

prothrglylysseraspserthrglualaleuasnlysalaileala

115120125

aspalapheglnvalprosergluglypheleumetgluglyilethr

130135140

asnleuglyglyproglnileasnleugluglyglyasntyrleuile

145150155160

serlysproleuglnleuvalalaalaglyalaglyasnleumetile

165170175

hisglyglythrleuargalaseraspasppheprovalaspglytyr

180185190

leuileaspleuserproasnsertrpalaserargthrgluglnglu

195200205

ilearglysglyserserleulysleuasnserglnleuthrserser

210215220

sersersertyrasntyrglutyrilethrleuargaspleumetleu

225230235240

aspserasntyrargglyglyglyileserilealahispheserthr

245250255

asnglyileleuvalglnglyglyhisgluthrtyrileargasnser

260265270

pheleuglyglnhisilethralaglyglyaspalaglygluargasn

275280285

tyrthrglythralaileasnleumetglyasnaspasnalavalthr

290295300

aspvalvalilepheseralaalaileglyilemetalaserglygln

305310315320

alaasnthrpheserglyvalhiscystyrasnlysalathrglyphe

325330335

glyglythrglyiletyrleulysleuproglyleuthrglnthrarg

340345350

ilevalasnsertyrleuasptyrthrglyilevalalagluasppro

355360365

valglnleuhisileserserserphepheleuglyaspalapheile

370375380

leuleulysserileasnglyvalalaasnglyvalthrvalvalasp

385390395400

asnmetpheserglyserasnlysglyvalaspileileglnleuglu

405410415

glyprophethrgluileaspglnvalvalvalaspargasnserala

420425430

lysglymetasnilelysalathrvalalaargglyservalglugly

435440445

asnserserserargthrvalasppheasnprovalleuleuphepro

450455460

asnleuilelyshisvalglntyrserleuargserserargglyser

465470475480

serpheproserhisalaleuargasnvalsergluasnglnvalval

485490495

ilegluseraspleualametproalaasnvalphevalthrvalasp

500505510

glnala

<210>18

<211>10242

<212>dna

<213>海岛棉(gossypiumbarbadense)

<400>18

tggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcg60

gacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtact120

ggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatac180

atactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaattcc240

cttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagctcagaagaactcgtca300

agaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgagg360

aagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatg420

tcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggcca480

ttttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcatcgccg540

tcgggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctct600

tcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatg660

cgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgc720

attgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcc780

tgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagc840

acagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgc900

agttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgct960

gacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccg1020

aatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatc1080

ccgggatctgcgaaagctcgagagagatagatttgtagagagagactggtgatttcagcg1140

tgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaaggtcttgcgaaggatagtgg1200

gattgtgcgtcatcccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagac1260

gtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttggga1320

ccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttg1380

taggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatgg1440

aatccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtct1500

tctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgtta1560

tcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctc1620

ctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcc1680

tttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttccttttctactgtccttttg1740

atgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgt1800

tgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatattcttggagtag1860

acgagagtgtcgtgctccaccatgttggcaagctgctctagccaatacgcaaaccgcctc1920

tccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaag1980

cgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctt2040

tacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcaca2100

caggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttttaatctgatgctccacctgctttt2160

gattttctttattggaagagtctttaagagatatgttaagtagcataacagtttcatcaa2220

aaacaacatttctgttaatcacaacttttctattttcaggataccataacttatacactt2280

ttacactagctttataaccaagaaaaacacatttaatggtacacaattttaattttccat2340

tatcagcatgagtatacgcaaaacacccaaaaatctttaaatcagaatcgtcagcaggat2400

tactaaaccatacttcttatggagtctttttctcaatagcaacgaatagagacggattga2460

tcaaaaacatatagttgacattgctttggcccaaaataactttgataagttgccatttga2520

caacatacatcgaacattctccatgatcgttctattcattcgttctacaatacctttttt2580

aaaatgttcaggttctaaaatgaaaaacaatatgaattgcatgaattgcttatatgtcct2640

atgaattataaaggaatgcggttgaaatattcccatcgatacatacatacatattcgtga2700

agtatgttccaatataatatcaatattgggatttacgttttataaagcaacattattgat2760

tggtaatatacattaattccaaggcaaacccaaatattttaaaatttaacctacaactgt2820

ggtaaatcaaacttaatagtaacccgattgtaatgtgaagtcaaatatgaaagtaacatt2880

ggtttatatatatatttttctctaaattctaataatcaagttgggataagtgataaacac2940

tgagcttgccacgtgtgttaacctcgttttcatcatgtgccactccaaagacatcaggcc3000

tctattcaagctggcatggtcaggacgtggtagcatacttcagggatctggttagaaaat3060

atcccatatcgctaaagaactataacacaggagcgtttatataagcgaaagaagcatcag3120

atgggcaaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacc3180

cgggttcgattcccggctggtgcaaggctcgtagtgtccctccggttttagagctagaaa3240

tagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc3300

aacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttc3360

gattcccggctggtgcaattatggagcagacccaacggttttagagctagaaatagcaag3420

ttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttg3480

ttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtttttagcgcgtgcatgcc3540

tgcaggtccacaaattcgggtcaaggcggaagccagcgcgccaccccacgtcagcaaata3600

cggaggcgcggggttgacggcgtcacccggtcctaacggcgaccaacaaaccagccagaa3660

gaaattacagtaaaaaaaaagtaaattgcactttgatccaccttttattacctaagtctc3720

aatttggatcacccttaaacctatcttttcaatttgggccgggttgtggtttggactacc3780

atgaacaacttttcgtcatgtctaacttccctttcagcaaacatatgaaccatatataga3840

ggagatcggccgtatactagagctgatgtgtttaaggtcgttgattgcacgagaaaaaaa3900

aatccaaatcgcaacaatagcaaatttatctggttcaaagtgaaaagatatgtttaaagg3960

tagtccaaagtaaaacttatagataataaaatgtggtccaaagcgtaattcactcaaaaa4020

aaatcaacgagacgtgtaccaaacggagacaaacggcatcttctcgaaatttcccaaccg4080

ctcgctcgcccgcctcgtcttcccggaaaccgcggtggtttcagcgtggcggattctcca4140

agcagacggagacgtcacggcacgggactcctcccaccacccaaccgccataaataccag4200

ccccctcatctcctctcctcgcatcagctccacccccgaaaaatttctccccaatctcgc4260

gaggctctcgtcgtcgaatcgaatcctctcgcgtcctcaaggtacgctgcttctcctctc4320

ctcgcttcgtttcgattcgatttcggacgggtgaggttgttttgttgctagatccgattg4380

gtggttagggttgtcgatgtgattatcgtgagatgtttaggggttgtagatctgatggtt4440

gtgatttgggcacggttggttcgataggtggaatcgtggttaggttttgggattggatgt4500

tggttctgatgattggggggaatttttacggttagatgaattgttggatgattcgattgg4560

ggaaatcggtgtagatctgttggggaattgtggaactagtcatgcctgagtgattggtgc4620

gatttgtagcgtgttccatcttgtaggccttgttgcgagcatgttcagatctactgttcc4680

gctcttgattgagttattggtgccatgggttggtgcaaacacaggctttaatatgttata4740

tctgttttgtgtttgatgtagatctgtagggtagttcttcttagacatggttcaattatg4800

tagcttgtgcgtttcgatttgatttcatatgttcacagattagataatgatgaactcttt4860

taattaattgtcaatggtaaataggaagtcttgtcgctatatctgtcataatgatctcat4920

gttactatctgccagtaatttatgctaagaactatattagaatatcatgttacaatctgt4980

agtaatatcatgttacaatctgtagttcatctatataatctattgtggtaatttcttttt5040

actatctgtgtgaagattattgccactagttcattctacttatttctgaagttcaggata5100

cgtgtgctgttactacctatctgaatacatgtgtgatgtgcctgttactatctttttgaa5160

tacatgtatgttctgttggaatatgtttgctgtttgatccgttgttgtgtccttaatctt5220

gtgctagttcttaccctatctgtttggtgattatttcttgcagatagttatcaacaagtt5280

tgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccaattctctaaggaaatacttaacca5340

tggactataaggaccacgacggagactacaaggatcatgatattgattacaaagacgatg5400

acgataagatggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccg5460

acaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatca5520

ccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcaca5580

gcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggcca5640

cccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatc5700

tgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactgg5760

aagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaaca5820

tcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaac5880

tggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatga5940

tcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtgg6000

acaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatca6060

acgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggc6120

tggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggaaacctga6180

ttgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatg6240

ccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccaga6300

tcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgc6360

tgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatga6420

tcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagc6480

agctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggct6540

acattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaa6600

agatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagc6660

agcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgcca6720

ttctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgaga6780

agatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagat6840

tcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtgg6900

tggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacc6960

tgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtata7020

acgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcg7080

gcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtga7140

agcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccg7200

gcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatca7260

aggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctga7320

ccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacc7380

tgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggc7440

tgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatt7500

tcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcc7560

tgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacg7620

agcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtga7680

aggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcg7740

aaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatga7800

agcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtgg7860

aaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggata7920

tgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcg7980

tgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgaca8040

agaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaact8100

actggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgacca8160

aggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctgg8220

tggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacacta8280

agtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagc8340

tggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactacc8400

accacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtacc8460

ctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatga8520

tcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaaca8580

tcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctc8640

tgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgcca8700

ccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcaga8760

caggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgcca8820

gaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctatt8880

ctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaag8940

agctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttc9000

tggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtact9060

ccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcaga9120

agggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccact9180

atgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagc9240

acaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcc9300

tggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagccca9360

tcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctg9420

ccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagagg9480

tgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacc9540

tgtctcagctgggaggcgacaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaa9600

agaaaaagtaagaattcgcggccgcactcgagatatctagacccagctttcttgtacaaa9660

gtggttgataacagcgactacaaggatgacgatgacaaggcttagagctcgaatttcccc9720

gatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcg9780

atgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgc9840

atgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatac9900

gcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatct9960

atgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacactggccgtcgttttacaacgt10020

cgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttc10080

gccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagc10140

ctgaatggcgaatgctagagcagcttgagcttggatcagattgtcgtttcccgccttcag10200

tttaaactatcagtgtttgacaggatatattggcgggtaaac10242