野菊U6基因及其应用

野菊u6基因及其应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物学技术领域，尤其涉及野菊u6基因及其应用。


背景技术：

2.mirna(microrna)是一种广泛的内源性小rna，长度在20至24个核苷酸之间，通过翻译抑制和或与mrna靶标结合使靶基因降解，被证明是转录后关键的基因调控因子。mirnas在植物整个生长发育、逆境应答及激素调节等过程中都发挥着重要的作用，因其在生物中的重要性，mirnas的挖掘、表达及功能研究成为全世界科学家争相研究的热点。从2002年第1种植物mirna的发现到目前为止，已有38589条mirna被登录到mirbase22.1数据库中。
3.野菊(chrysanthemum indicum l.)是菊科菊属多年生草本植物，分布范围广，野生于山坡草地、田间、路旁等处，耐瘠薄，适应性较强。最重要的是它具药用价值，叶、花及全草都可以入药。在对野菊mirna进行研究时，如何选择一个表达稳定的基因作为内参进行数据标准化成为本领域面临的问题。
4.目前对mirna的表达分析的研究方法主要有三种，即高通量测序，基因芯片和实时荧光定量pcr。由于高通量测序和基因芯片法均为高通量监测的方法，成本高，不适于少量mirna的表达分析。而利用sybr green染料荧光定量pcr的方式进行mirna相对定量法表达分析就有着操作相对简单，成本较低，灵敏度高的优势。逐渐成为科研人员常用的mirna时空表达特异性分析常用的方法。在相对定量中，内参的选择尤为重要。目前内参的选择大多数采用一些表达相对稳定的管家基因，比如传统的β-action。但由于mirna碱基长度的特殊性，无法用之前研究过的稳定内参。因此，有必要开发新的用于mirna定量表达分析的内参基因。
5.u基因编码的一种细胞核小rna(small nuclear rna，snrna)，其长度一般为100-215bp，由于其编码的碱基序列富含u，故名为u基因。其中u6是由rna聚合酶ⅲ催化转录的，而其他snrna均由rna聚合酶ⅱ催化转录而来，且u6在植物不同组织中表达量稳定、含量丰富，且不受环境影响而变化，逐渐成为研究mirna表达的内参基因。
6.但是菊花u6基因序列和引物尚未有相关报道，更没有以野菊u6基因作为内参来对野菊中的mirna进行定量分析的相关研究。


技术实现要素：

7.本发明针对现有研究的不足，在野菊中克隆到u6基因全长序列，并初步确定该基因可作为野菊mirna定量pcr检测的内参基因。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明野菊u6基因的核心序列为：
9.atcattgtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcacaaatcgagaaatggtccaaattttttt(seq id no.1)
10.基于野菊u6核心序列进行引物设计，获得的实时荧光定量pcr的引物序列如下：
11.fp:cgataaaattggaacgatacaga(seq id no.2)
12.rp:atttggaccatttctcgatttg(seq id no.3)
13.本发明通过对野菊根、茎、叶、花中的u6基因进行扩增发现该引物熔解曲线均出现单峰，特异性良好且无引物二聚体出现。扩增曲线表明在野菊各组织中u6基因的ct值均为18左右，稳定性较好。
14.因此，进一步，本发明提供所述野菊u6作为内参基因来确定野菊mirna的相对表达水平。
15.所述应用包括采用基于野菊u6核心序列设计的引物进行实时定量pcr；所述引物为是实时定量pcr引物，其序列如seq id no.2与seq id no.3所示。
16.由于mirna荧光定量表达分析过程需要使用特殊的茎环引物去完成rna的反转录，而传统的内参基因只适用于普通基因定量表达分析，不适用于mirna的定量研究。因此在野菊mirna研究中，选择适合野菊mirna荧光定量表达分析的内参是尤为重要的。本发明提供了一种用于野菊mirna定量表达研究所需的内参基因及合适的引物。野菊u6属于一种非编码的小rna，在目前公布的菊花基因组以及ncbi数据库网站中都没有该基因的注释信息。本发明首次从野菊中克隆得到野菊u6基因，并设计了用于野菊mirna荧光定量pcr的引物。实验证明，该基因及引物可稳定用于野菊mirna的荧光定量研究。
17.本发明的优点如下：
18.1、本发明首次从野菊中克隆了一种u6基因，该基因与拟拟南芥、玉米、番茄中的u6基因高度同源，且在野菊的根、茎、叶、花中均能检测到u6基因，可初步确认u6能用于mirna相对定量研究的内参基因。
19.2、本发明基于u6基因的高度保守序列设计引物，并采用荧光定量pcr方法检测了野菊mirna表达量，得到了mirna在不同样本中的cq值。检测结果与高通量测序结果保持一致，验证了野菊u6基因及其引物可用于野菊mirna的荧光定量研究的可靠性和稳定性。
附图说明:
20.图1为野菊u6前体序列比对结果。
21.图2为野菊根、茎、叶、花扩增得到的u6基因的凝胶电泳图。
22.图3为野菊根、茎、叶、花扩增得到的u6基因的引物溶解曲线。
23.图4为野菊根、茎、叶、花扩增得到的u6基因的扩增曲线。
24.图5为野菊mir172a基因正常环境和uvb处理下的荧光定量检验结果。
25.图6为野菊mir396a基因正常环境和uvb处理下的荧光定量检验结果。
26.图7为野菊mir858a基因正常环境和uvb处理下的荧光定量检验结果。
具体实施方式
27.下面结合附图和具体实施例对本发明野菊u6基因的获取、引物设计及应用方面进行更详尽的解释和说明，以便本研究领域技术人员更好的理解本发明。本发明的内容不仅局限于下方示例，并不对本发明保护范围造成限制。本发明中如无特殊说明，所用的的方法、试剂、仪器均为本领域常规用品。
28.实例一、野菊u6基因的克隆
29.1、野菊u6前体基因鉴定
30.为例鉴定野菊中存在的u6基因，我们首先从拟南芥基因组数据库下载了拟南芥u6前体基因核苷酸序列，并用该序列与野菊转录组测序中的unigene数据库进行blast分析，结果从野菊unigene数据库中鉴定出7种u6前体基因序列，分别命名为u6a、u6b、u6c、u6d、u6e、u6f、u6g，其前体序列比对结果如图1所示。同时，基于7条u6基因序列高度保守区设计引物进行凝胶电泳分析和pcr扩增，电泳pcr验证结果如图2所示。
31.2、野菊u6核心序列的获得
32.根据u6a、u6b、u6c、u6d、u6e、u6f、u6g前体序列比对结果确定野菊u6核心序列为：
33.atcattgtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcacaaatcgagaaatggtccaaattttttt(seq id no.1)
33.实施例二、野菊u6基因的qrt-pcr检测
34.1、基于野菊u6基因核心序列进行引物设计，引物序列如下：
35.fp:cgataaaattggaacgatacaga(seq id no.2)
36.rp:atttggaccatttctcgatttg(seq id no.3)
37.2、野菊u6反转录及pcr扩增
38.(1)反转录引物采用基于野菊u6序列设计的反向引物rp(seq id no.3)，反转录体系及程序为：
[0039][0040]
37℃5min，85℃5sec。
[0041]
(2)将反转录产物用ddh2o稀释100倍进行pcr检测，qrt-pcr反应体系为：
[0042][0043]
该forward primer即为基于野菊u6高度保守序列设计的正向引物(seq id no.2)；reverse primer即为基于野菊u6高度保守序列设计的反向引物(seq id no.3)。
[0044]
采用两步法进行qrt-pcr，反应条件：预变性95℃30sec；变性95℃5sec，延伸60℃30sec，40个循环。
[0045]
(3)结果分析：通过对野菊的根、茎、叶、花中的u6基因进行扩增发现该引物熔解曲线均出现单峰，且温度基本一致，说明引物特异性好，且没有引物二聚体出现(图3)。同时扩增曲线表示野菊不同组织中u6基因的ct值均在18左右，稳定性较好(图4)。
[0046]
3、以野菊u6为内参基因，进行野菊正常环境与uvb胁迫4h后mir172a、mir396a、
mir858a的相对表达分析
[0047]
(1)反转录引物序列为
[0048]
mir172a茎环引物：
[0049]
gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacatgcagcatcatcaagattct(seq id no.4)
[0050]
mir396a茎环引物：
[0051]
gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgaccagttcaagaaagctgtggaa(seq id no.5)
[0052]
mir858a茎环引物：
[0053]
gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacaaggtcgaacagacaacgaaa(seq id no.6)
[0054]
(2)荧光定量pcr引物序列
[0055]
mir172a-f：
[0056]
agaatcttgatgatgctgcatgt(seq id no.7)
[0057]
mir396a-f：
[0058]
tccacagctttcttgaactgg(seq id no.8)
[0059]
mir858a-f：
[0060]
tttcgttgtctgttcgacctt(seq id no.9)
[0061]
通用下游引物r：
[0062]
cagtgcgtgtcgtggagt(seq id no.10)
[0063]
(3)结果分析
[0064]
为了进一步验证野菊u6内参基因及引物的可靠性与适用性，我们以u6基因为内参，对野菊正常环境与uvb胁迫4h后mir172a、mir396a、mir858a进行相对表达量的分析。荧光定量结果与高通量测序结果表达趋势完全一致，表明本发明中的u6基因及其引物较为稳定，可用于野菊mirna表达分析研究(图5、图6、图7)。