1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系及外泌体的制备方法与应用。
背景技术：2.外泌体是有活细胞分泌的磷脂双分子层结构的小囊泡，直径在30
‑
150nm，密度在1.13
‑
1.19g/ml，可存在于各种体液中，如血清、血浆、唾液、尿液、腹水、脊髓液、乳汁等。外泌体中含有多种生物分子，如mrna、mirna、蛋白质、脂质等，可以传递给受体细胞，从而改变受体细胞的生理功能或病理功能。近几年，外泌体作为细胞间的信息传递工具及各种疾病的生物标志物而引起广泛的关注，外泌体具有在生物医药及疾病诊断领域的应用具有很大的潜力。
3.获得高纯度、高产量、标准化的外泌体，是外泌体用于临床应用的前提条件。然而，目前针对外泌体的提取纯化方法还没有统一的标准，常用的方法有很多种，超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫捕获法等。超速离心法虽然是公认的外泌体提取的“金标准”方法，但是操作费时费力、高度依赖人工，回收率低，外泌体形态大小不一，高速离心会损害外泌体而影响下游实验。密度梯度离心法虽然可以获得很纯的外泌体，但该方法操作繁琐，重复性差，耗时很长，回收率低，不适合大批量提取外泌体。超滤法可以方便快速的提取外泌体，但该方法提取的外泌体中含有大颗粒杂质污染，严重影响下游应用。聚合物沉淀法操作简单方便，可以用于大体积样本的外泌体提取，但该方法提取的外泌体中杂蛋白污染较多，颗粒形态不均一，影响下游分析。免疫捕获法虽然可以特异性地捕获外泌体，获得的外泌体纯度高，但该方法成本高且产量低，不能提取样本中所有的外泌体，只能提取某种表面抗原阳性的外泌体。所以，目前常用的外泌体提取方法只限于实验室操作，没有一种适合大规模的外泌体工业化的提取方法。因此，为了加速外泌体的临床转化，急须一种操作简单，样本处理量大、可重复好且适合大规模gmp级制备外泌体的方法。
技术实现要素：4.为此，本发明提供一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系及外泌体的制备方法与应用，以解决现有技术中操作复杂、样本量小、重复性差，不能用于大规模gmp级制备外泌体的问题。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.根据本发明一方面提供的一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系制备外泌体的方法，所述方法包括：
7.步骤一，将样本溶液进行预处理，得含外泌体的样本溶液；
8.步骤二，将所述含外泌体的样本溶液置于第一储存罐中，打开第一蠕动泵，将含外泌体样本溶液泵入第一过滤装置中，循环浓缩过滤，收集滤过液至第二储存罐中；
9.步骤三，待第一储存罐中的液体体积浓缩至最小运行体积时，向第一储存罐中加入无菌pbs缓冲液，继续将第一储存罐中液体泵入第一过滤装置中，继续循环浓缩过滤，收集过滤液至第二储存罐中；
10.步骤四，待第一储存罐中的液体体积浓缩至最小运行体积时，打开第二蠕动泵，将第二储存罐中的液体泵入第二过滤装置中，进行循环浓缩过滤；
11.步骤五，待第二储存罐中的液体体积浓缩至最小运行体积时，向第二储存罐中加入无菌pbs缓冲液，继续将第二储存罐中的液体泵入第二过滤装置中，循环浓缩过滤，待第二储存罐中液体体积浓缩至一定体积，收集第二储存罐中液体，即得到提取纯化的外泌体溶液；
12.步骤六，向所述外泌体溶液中加入保护液，在
‑
80℃冷冻保存或将其制成外泌体冻干粉；
13.所述第一过滤装置是设有切向流过滤膜f
‑
1的过滤体系，所述切向流过滤膜f
‑
1的截留孔径为0.15
‑
0.45μm；所述第二过滤装置是设有切向流过滤膜f
‑
2的过滤体系，所述切向流过滤膜f
‑
2的截留分子量为50
‑
750kd。
14.进一步的，所述样本溶液是生物体液或细胞培养上清液；其中，所述生物体液包括胸腔积液、尿液、乳汁；所述细胞培养上清液包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、牙髓干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞或上述干细胞所诱导分化细胞的细胞培养上清液。
15.进一步的，所述样本进行预处理的方法是将样本加入离心管中，5000
‑
12000g，离心5
‑
50min，取上清液，过0.22
‑
0.45μm滤膜过滤除菌。
16.进一步的，所述第一过滤装置的最小运行体积为50
‑
500ml；所述第二过滤装置的最小运行体积为50
‑
500ml。
17.进一步的，所述切向流过滤系统的蠕动泵的转数均为50
‑
500rpm/min。
18.进一步的，所述步骤六中，所述保护液是浓度为0
‑
100mmol/l的海藻糖溶液。
19.进一步的，所述步骤六中，所述制备外泌体冻干粉末的过程包括：
20.常压下、
‑
35℃至
‑
45℃冷冻2
‑
5h；
21.然后在真空度值为0.04mbar的真空条件下，先在
‑
35℃至
‑
45℃冷冻2
‑
5h，接着升温到
‑
20℃至
‑
30℃冷冻干燥7
‑
14h，继续升温到
‑
10℃至5℃冷冻干燥1
‑
5h，最后升温到25℃至37℃干燥2
‑
5h，即得外泌体冻干粉。
22.进一步的，所述步骤六中，所述制成外泌体冻干粉保存在4℃。
23.本发明的第二方面提供的一种用于制备外泌体提取的双重切向流过滤体系，所述双重切向流过滤体系包含第一储存罐、第二储存罐、第一过滤装置、第二过滤装置、第一蠕动泵、第二蠕动泵；
24.其中，第一储存罐的出口经第一蠕动泵与第一过滤装置的入口连接，第一过滤装置的出口与第一储存罐的入口连接，过滤后的液体出口与第二储存罐的第一入口连接；第二储存罐的出口经第二蠕动泵与第二过滤装置的入口连接，第二过滤装置的出口与第二储存罐的第二入口连接，经第二过滤装置过滤后的液体直接流出体系；
25.所述第一过滤装置是设有切向流过滤膜f
‑
1的过滤体系，所述切向流过滤膜f
‑
1的
截留孔径为0.15
‑
0.45μm；所述第二过滤装置是设有切向流过滤膜f
‑
2的过滤体系，所述切向流过滤膜f
‑
2的截留分子量为50
‑
750kd。
26.本发明的第三方面提供的上述方法制备的外泌体，在医美类产品，促进伤口愈合的外泌体液体敷料，缓解哮喘及急性呼吸窘迫症的外泌体喷雾，以及外泌体相关生物制品的制备中的应用。
27.本发明具有如下优点：
28.本发明提供了一种双重切向流过滤体系用于大体积样本来源外泌体的提取纯化，该体系通过两种不同孔径的切向流过滤膜提取纯化外泌体，即可以去除样本中颗粒较大的细胞微囊泡及细胞碎片，又可以最大程度的提取浓缩外泌体，非常适合大规模的外泌体生产制备。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
30.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
31.图1为本发明提供的一种切向流过滤膜纯化外泌体原理示意图，其中，(1)为切向流过滤膜f
‑
1原理示意图，(2)为切向流过滤膜f
‑
2原理示意图；
32.图2为本发明提供的一种双重切向流过滤体系的结构图，1为第一储存罐，2为第一蠕动泵，3为第一过滤装置，4为第二储存罐，5为第二过滤装置，6为第二蠕动泵；
33.图3为本发明提供的一种脐带间充质干细胞显微镜观察图；
34.图4为本发明提供的一种脐带间充质干细胞特异蛋白cd34的流式检测结果图；
35.图5为本发明提供的一种脐带间充质干细胞特异蛋白cd45的流式检测结果图；
36.图6为本发明提供的一种脐带间充质干细胞特异蛋白cd73的流式检测结果图；
37.图7为本发明提供的一种脐带间充质干细胞特异蛋白cd90的流式检测结果图；
38.图8为本发明提供的一种脐带间充质干细胞特异蛋白cd105的流式检测结果图；
39.图9为本发明提供的对比例提取的外泌体电镜检测结果图；
40.图10为本发明提供的实施例提取的外泌体电镜检测结果图；
41.图11为本发明采用bsa蛋白定量检测不同提取方法制得外泌体蛋白浓度检测结果图，其中，a为对照组所得外泌体蛋白浓度检测结果，b为实施例所得外泌体蛋白浓度检测结果；
42.图12为本发明通过nta检测不同提取方法制得外泌体数量的检测结果图，其中，a为对照组所得外泌体数量的检测结果，b为实施例所得外泌体数量的检测结果；
43.图13为本发明提供的不同提取方法的外泌体相对纯度检测结果图；
44.图14为本发明采用western blot检测不同提取方法制得外泌体的cd9，cd63，alix
标志蛋白检测结果图，(1)为实施例所得外泌体蛋白检测结果，(2)为对照例所得外泌体蛋白检测结果；
45.图15为本发明提供的不同提取方法制得外泌体对细胞增殖实验检测结果图，其中a为外泌体组，b为空白对照组；
46.图16为本发明提供的不同浓度的保护剂对外泌体颗粒浓度的影响结果图；
47.图17为本发明提供的不同浓度的保护剂对外泌体促进细胞增殖的影响结图。
具体实施方式
48.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
49.实施例1本发明提供的一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系制备外泌体的方法
50.一.脐带间充质干细胞培养
51.1.脐带间充质干细胞的提取制备
52.从手术室采集新生儿脐带，用无菌pbs缓冲液将脐带冲洗干净，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将组织充分剪碎至1mm3大小的组织块。将组织块均匀铺于培养皿中，至于培养箱中培养1h(培养条件为5％co2，37℃)。待组织块贴壁比较牢固时，加入适量的干细胞培养基，置于培养箱培养(培养条件为5％co2，37℃)。待细胞贴壁情况良好后，轻轻吸去培养基，并用干细胞培养基轻轻漂洗一次，再加入10ml新鲜的干细胞培养基置于培养箱中培养(培养条件为5％co2，37℃)。待培养皿中贴壁细胞铺满70％
‑
85％时，用消化液(0.25％胰蛋白酶)消化，待细胞开始脱落飘起时，加入终止液终止消化，用移液器轻轻吹打成单细胞悬液，1000rpm离心10min后弃上清，最后用10ml新鲜干细胞培养基重悬，所得细胞为原代脐带间充质干细胞(p0)，如图3所示，原代脐带间充质干细胞显微镜观察图。
53.2.脐带间充质干细胞的鉴定
54.获得原代干细胞p0后，加无菌pbs缓冲液调整细胞浓度至1
×
106/ml，取五份200μl细胞悬液，分别加入5μl荧光标记的单抗cd34、5μl荧光标记的单抗cd45、5μl荧光标记的单抗cd73、5μl荧光标记的单抗cd90、5μl荧光标记的单抗cd105混匀，室温下避光孵育20min，于流式细胞仪中检测，如图4、图5、图6、图7、图8所示，分别为脐带间充质干细胞特异蛋白cd34、cd45、cd73、cd90、cd105的流式检测结果图。
55.3.脐带间充质干细胞的培养
56.将原代脐带间充质干细胞置于干细胞培养基中培养(培养条件为5％co2、37℃)，待细胞贴壁铺满90％时，5000g离心10min收集细胞培养上清液，得脐带间充质干细胞溶液。
57.二、双重切向流过滤体系提取纯化外泌体
58.1.脐带间充质干细胞溶液预处理
59.将脐带间充质干细胞溶液加入离心管中，5000
‑
12000g，离心5
‑
50min，再用0.22
‑
0.45μm滤膜过滤除菌，得预处理的外泌体样本溶液，放置4℃备用；
60.2.双重切向流过滤体系提取纯化外泌体
61.(1)向第一储存罐1和第二储存罐4中加入无菌水，分别打开蠕动泵(第一蠕动泵2和第二蠕动泵6)，冲洗系统；
62.(2)向第一储存罐1中加入4l预处理的样本溶液，打开第一蠕动泵2使系统循环，预处理的样本溶液经设有切向流过滤膜f
‑
1的第一过滤装置3浓缩过滤，其中，切向流过滤膜f
‑
1原理如图1(1)所示，使含有外泌体的溶液进入第二储存罐4中；待第一储存罐1中的液体体积为最小运行体积时，加入2l无菌的pbs缓冲液继续浓缩过滤至最小运行体积；
63.(3)待第二储存罐4中的液体体积超过400ml时，打开第二蠕动泵6使系统循环，含有外泌体的溶液经设有切向流过滤膜f
‑
2的第二过滤装置5，浓缩过滤，其中，切向流过滤膜f
‑
2原理如图1(2)所示，去除了小分子物质；
64.(4)待第二储存罐4中的液体体积为最小运行体积时，向第二储存罐4中加入2000ml的pbs缓冲液，继续浓缩过滤至第二储存罐4中溶液为200ml，收集该溶液，即得到双重切向流过滤体系提取纯化的外泌体。
65.实施例2一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系
66.所述双重切向流过滤体系包含第一储存罐1、第二储存罐4、第一过滤装置3、第二过滤装置5、第一蠕动泵2、第二蠕动泵6；
67.其中，第一储存罐的出口经第一蠕动泵与第一过滤装置的入口连接，第一过滤装置的出口与第一储存罐的入口连接，过滤后的液体出口与第二储存罐的第一入口连接；第二储存罐的出口经第二蠕动泵与第二过滤装置的入口连接，第二过滤装置的出口与第二储存罐的第二入口连接，经第二过滤装置过滤后的液体直接流出体系。
68.其中，第一过滤装置3是设有切向流过滤膜f
‑
1的过滤装置；第二过滤装置5是设有切向流过滤膜f
‑
2的过滤装置。
69.所述第一过滤装置是设有切向流过滤膜f
‑
1的过滤体系，所述切向流过滤膜f
‑
1的截留孔径为0.15
‑
0.45μm；所述第二过滤装置是设有切向流过滤膜f
‑
2的过滤体系，所述切向流过滤膜f
‑
2的截留分子量为50
‑
750kd。
70.所述过滤体系是第一储存罐1中液体经第一蠕动泵2泵入第一过滤装置3中，经第一过滤装置纯化后的液体流入第二储存罐4中，在第一过滤装置3存留的液体流回第一存储罐1中；第二储存罐4经第二蠕动泵6泵入第二过滤装置5中，经第二过滤装置纯化后的无外泌体的液体直接流出体系，在第二过滤装置5留存的液体重新流回第二储存罐4中，重新流回第二储存罐4中的液体即为提纯所得外泌体。
71.对比例 超速离心法提取外泌体
72.将20ml预处理后样本溶液加至超速离心管中，4℃条件下100000g离心2h，用1ml的无菌pbs缓冲液进行重悬，即得到超速离心法提取纯化的外泌体。
73.实验例1不同提取方法的对比
74.1.外泌体电镜对比
75.利用戊二醛液将实施例和对比例得到的外泌体分别固定在载样铜网上，反应5min后，用ddh2o洗涤铜网，再将铜网置于草酸双氧铀液中孵育5min，最后用滤纸上吸去多余液体，待铜网干燥后，将其放在样品盒里，80kv下拍摄电镜照片。如图10所示，实施例提取纯化的外泌体电镜检测结果图，图9所示，对比例提取的外泌体电镜检测结果图。结果可见，电镜下都可见茶托状的双层囊泡结构，粒径大小在30
‑
150nm范围内，且结构清晰，无明显差别。
76.2.外泌体蛋白浓度的对比
77.采用bca法检测实施例和对比例得到的外泌体的蛋白浓度，将收集的实施例和对比例得到的外泌体溶液中分别加入等体积的ripa裂解液(50mm tris，150mm nacl，1％np
‑
40，0.5％脱氧胆酸钠，ph 7.4)，充分混匀，4℃静置30min，裂解处理后的外泌体蛋白溶液按照bca检测试剂盒说明书的操作要求进行外泌体蛋白浓度测定。实验结果如图11所示，采用bsa蛋白定量检测不同提取方法制得外泌体蛋白浓度检测结果图。对比例提取的外泌体蛋白浓度明显高于实施例，对比例提取的外泌体蛋白浓度约是实施例的3倍。
78.3.外泌体颗粒范围及浓度的对比
79.将实施例和对比例得到的外泌体颗粒浓度稀释至1
×
107/ml和1
×
109/ml范围内。采用纳米粒径示踪分析仪分别对实施例和对比例得到的外泌体浓度进行检测。如图12可见，实施例得到的外泌体的颗粒浓度约是对比例得到的外泌体的3倍，实施例可以得到更多的外泌体，其回收率更高。
80.根据外泌体的颗粒浓度和蛋白浓度的比值，可以简单比较外泌体的相对纯度(颗粒浓度与蛋白浓度的比值越大，其外泌体的纯度越高)。如图13所示，实施例所得到的外泌体，其颗粒浓度蛋白比是超速离心法得到的外泌体的9倍，实施例得到的外泌体纯度更高，对比例得到的外泌体中可能含有大量的污染蛋白。
81.4.外泌体western blot检测
82.将实施例和对比例得到的外泌体分别加入适量的loading buffer，沸水浴加热使蛋白充分变性。配置sds
‑
page凝胶，将蛋白加样至sds
‑
page胶的加样孔，电泳分离蛋白样本并进行转膜。转膜完毕后，把蛋白膜放置5％封闭液中封闭。封闭完成后，一抗(cd9、cd63、alix)4℃孵育过夜，再用酶标二抗室温孵育1h。最后将蛋白膜放置在ecl发光液中，反应2min后，放入化学发光成像系统进行显色成像。实施例和对比例得到的外泌体的cd9、cd63、alix蛋白western blot实验结果如图14所示，实施例提取纯化的外泌体条带清晰明亮，而对比例提取的外泌体条带的清晰度较低，是由于对比例的提纯方法得到的外泌体中混有杂蛋白导致的，这也能够说明对比例提取的外泌体的纯度低于实施例。
83.5.外泌体生物活性对比
84.采用mtt法检测实施例和对比例得到的外泌体的增殖效能。取脐带间充质干细胞，以每孔5
×
103个细胞接种于96孔板中，将实施例和对比例得到的外泌体稀释到相同浓度，各取10μl分别加入培养的细胞中，用10μl不添加外泌体的培养基培养作对照组。培养3d后，每孔加mtt溶液(5mg/ml)20μl。继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μldmso，振荡10min。用酶标仪在450nm处检测od值，每组6个重复，取平均值。结果如图15所示，脐带间充质干细胞外泌体对细胞增殖起到了明显的促进作用，实施例所得外泌体对细胞增殖的效果明显高于对比例，这是超速离心法的强大的离心力破坏了外泌体部分膜结构导致的，而实施例提取外泌体方式更为温和，这样更好的保证了外泌体的生物学活性。
85.实验例2外泌体的储存
86.1.不同的储存条件对外泌体浓度的影响
87.1.1外泌体冻干粉的制备
88.配制500mm的海藻糖母液，按比例加入实施例得到的外泌体溶液中，得海藻糖的终浓度分别为0mm、20mm、40mm、60mm、80mm、100mm的外泌体溶液，将上述配置好的外泌体溶液
分别吸取2ml置于5ml的玻璃瓶中，上述配置好的外泌体溶液分别吸取2ml置于5ml的离心管中。将5ml离心管置于4℃和
‑
80℃保存。将5ml玻璃瓶盖上胶塞，并置于真空冷冻干燥机中，开启冻干程序：
89.(1)压力为常压，在
‑
35至
‑
45℃温度下冷冻2
‑
5h；
90.(2)开启真空泵，使真空度值为0.04mbar，在
‑
35至
‑
45℃温度下冷冻2
‑
5h；
91.(3)真空度不变，升温至
‑
20至
‑
30℃温度下冷冻干燥7
‑
14h；
92.(4)真空度不变，升温至
‑
10至5℃温度下冷冻干燥1
‑
5h；
93.(5)真空度不变，升温至25至37℃温度下干燥2
‑
5h；
94.(6)程序结束后，即得外泌体冻干粉。
95.1.2不同的储存条件对外泌体浓度的影响
96.将4℃保存的外泌体冻干粉、4℃保存的外泌体溶液和
‑
80℃保存的外泌体溶液，放置3个月后进行纳米粒径示踪分析(外泌体冻干粉复溶至2ml)，分别比较外泌体的颗粒浓度。如图16可见，4℃保存的外泌体溶液，其颗粒浓度降低了10倍左右，说明4℃保存3个月的外泌体已经出现了破碎或者聚集的现象，而且海藻糖的加入没有对该条件下的外泌体起到保护作用。
‑
80℃储存和冻干粉4℃储存的外泌体具有与新鲜外泌体相近的颗粒浓度，但随着海藻糖浓度的增加，外泌体的颗粒数越多，说明海藻糖能够使冷藏或冻干后复苏的外泌体分散性更好，当海藻糖浓度为60mm时，外泌体浓度最接近新鲜外泌体，而且冻干粉4℃储存的外泌体颗粒浓度略高于
‑
80℃储存，所以最适的外泌体储存条件为终浓度60mm海藻糖且冻干4℃储存。
97.2.不同的储存条件对外泌体生物活性的影响
98.将4℃保存的外泌体冻干粉、4℃保存的外泌体溶液和
‑
80℃保存的外泌体溶液分别采用mtt法检测不同海藻糖浓度及不同保存方法的外泌体对细胞增殖能力的评估，如图17可见，4℃保存的外泌体溶液，其促进细胞增殖的能力大大降低，表明该条件下保存的外泌体已失去生物活性。
‑
80℃储存和冻干粉4℃储存的外泌体具有较好的促细胞增殖能力，而且该能力随海藻糖浓度的增加而增加，最佳的海藻糖浓度为60mm，且冻干粉4℃储存的外泌体的生物活性略高于
‑
80℃储存，其结果与外泌体浓度结果相匹配。
99.本发明提供了一种双重切向流过滤系统提取纯化外泌体的方法，可对各种大体积样本来源的外泌体进行提取纯化，而且该方法操作简单，获得的外泌体纯度高，产量大，可以实现外泌体的自动化批量生产，制备gmp级的外泌体，大大的加速了外泌体相关的生物制品的技术开发及临床转化应用的进程，该技术可应用在各种领域，包括外泌体医美类产品，促进伤口愈合的外泌体液体敷料，缓解哮喘及急性呼吸窘迫症的外泌体喷雾，以及外泌体相关生物制品的制备，因此，本发明提供的技术方案可助力外泌体的产业化应用，具有极大的商业价值。
100.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。