一种基于crispr-cas12f1检测病原微生物RNA的方法

一种基于crispr
‑
cas12f1检测病原微生物rna的方法
技术领域
1.一种基于crispr
‑
cas12f1系统检测病原微生物rna的方法，其特征在于：检测病原微生物具有较好特异性。


背景技术：

2.病原微生物种类繁多，对人类，动植物危害较大，对于病原微生物的检测方法主要集中于培养法，荧光定量pcr，微生物测序。近年来crispr/cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, crispr associated)系统的发现为微生物检测提供了高特异性高灵敏度的方法。crispr/cas系统是古细菌和细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫抵御，可用来对抗入侵的病毒以及外源dna。crispr/cas系统主要分为2大类，包括有class1和class2，其中class1是利用多蛋白效应复合物，class2是单一蛋白效应器，结合引导rna形成复合物而发挥靶向切割的能力，class2包括ii，v，vi类型，包括有cas9，cas12，cas13和cas12f1系统(koonin, e. v., & makarova, k. s. (2019). origins and evolution of crispr
‑
cas systems. philosophical transactions of the royal society b, 374(1772), 20180087.)。目前用于检测方法应用的多集中于cas9，cas12和cas13系统，其中crispr/cas9系统具有依赖pam位点的靶向切割双链dna能力，根据此功能，zhou等人将cas9蛋白的ruvc或hnh结构的一个关键位点突变，进而使得cas9蛋白形成一个具有类似缺口酶的功能，同时结合链替换技术获得高灵敏度的检测方法(zhou, w., hu, l., ying, l., zhao, z., chu, p. k., & yu, x. f. (2018). a crispr
–
cas9
‑
triggered strand displacement amplification method for ultrasensitive dna detection. nature communications, 9(1), 1
‑
11.)。crispr/cas12系统可以靶向切割带有pam位点(tttn)的双链dna，单链dna或者ssrna，同时其还具有反式切割的能力，该能力被广泛的应用到检测领域，例如，wang等人通过将探针的一端修饰为蓝光可见分子设计出可视化的检测病毒的方法，其主要通过恒温扩增技术使得目标靶链发生指数增加，待cas12a发生反式切割后，其探针一端的蓝光可见分子得到释放，在蓝光的照射下，发出蓝光。该系统具有良好的检测灵敏度，其灵敏度可以达到100am(wang, b., wang, r., wang, d., wu, j., li, j., wang, j., ... & wang, y. (2019). cas12avdet: a crispr/cas12a
‑
based platform for rapid and visual nucleic acid detection. analytical chemistry, 91(19), 12156
‑
12161.)。crispr/cas13系统具有切割单链rna的能力，具有反式切割rna的能力而被广泛应用到生物传感检测体系，例如，myhrvold等人设计一段带有t7启动的引物进行恒温扩增，并通过t7转录获得ssrna靶链，开发 sherlock的检测方法，该方法具有减少时间短，高灵敏度特异性的特点(myhrvold, c., freije, c. a., gootenberg, j. s., abudayyeh, o. o., metsky, h. c., durbin, a. f., ... & sabeti, p. c. (2018). field
‑
deployable viral diagnostics using crispr
‑
cas13. science, 360(6387), 444
‑
448.)。而目前已知crisp/cas14系统具有靶向切割带pam位点的双链dna和单链dna以及具有反式切割的能力，但由于其特异性识别位点
在靶向单链dna区域的第11
‑
12位的碱基，而其他的靶向位点特异性差，这大大限制了该体系的应用(harrington, l. b., burstein, d., chen, j. s., paez
‑
espino, d., ma, e., witte, i. p., ... & doudna, j. a. (2018). programmed dna destruction by miniature crispr
‑
cas14 enzymes. science, 362(6416), 839
‑
842. karvelis, t., bigelyte, g., young, j. k., hou, z., zedaveinyte, r., budre, k., ... & siksnys, v. (2020). pam recognition by miniature crispr
–
cas12f nucleases triggers programmable double
‑
stranded dna target cleavage. nucleic acids research, 48(9), 5016
‑
5023.)。本发明利用rt
‑
pcr和t7 rna转录技术合成rna短链，同时以rna为目标底物引起cas12f1反式切割而开发出一套高灵敏度高特异性的检测病原微生物的检测方法，拓宽了该系统的应用。


技术实现要素：

3.为实现上述目的是针对crispr/cas12f1系统检测病原微生物特异性差的问题，提供基于cas12f1结合rt
‑
pcr和t7rna转录技术来检测病原微生物的方法；本发明采用的技术方案为：1.根据病原微生物rna设计不同特异性引物，其中forward primer5’端加上t7 启动子序列(taatacgactcactatagg)；2.将病原微生物接种于1ml lb放于37℃条件下，培养12h，然后通过细菌rna提取试剂盒(omega)提取细菌的病原微生物rna，以rna为模板，使用primescript ii 1st strand cdna 合成试剂盒 (takara)在37℃条件下反应1h产生cdna链；3.以上述cdna链为模板，使用pcr技术扩增出带t7启动子的双链dna，然后加入1ul t7 rna聚合酶(20u/ul)在37℃下反应3h；4.以上述rna转录产物为检测目标物，使用sgrna与cas12f1蛋白按照500nm：500nm的浓度比例在20mmtris
‑
hcl，20mm nacl，ph9.0的缓冲液，37℃条件下孵育30min，其中sgrna的序列为：cuucacugauaaaguggagaaccgcuucaccaaaagcugucccuuaggggauuagaacuugagugaaggugggcugcuugcaucagccuaaugucgagaagugcuuucuucggaaaguaacccucgaaacaaauucauuugaaagaaugaaggaaugcaaccugcggguaacgucaauugc(划线部位识别底物靶点区域)，然后加入检测目标与100nm的荧光探针(5
’ꢀ5‑
fam
‑
tttttttttttt
‑
bhq1 3’)在37℃，激发光为492nm，发射光为520nm条件下检测荧光信号值。
附图说明
4.图1 cas12f1诊断病原微生物实验原理图图2 不同病原微生物rna电泳图；图3 不同病原微生物cdna合成电泳图；图4 不同病原微生物pcr电泳图；图5 t7 rna聚合酶转录后电泳图；图6不同种类病原微生物的荧光强度柱状图；图7 不同伤寒沙门扩增子浓度的荧光强度柱状图。
具体实施方式
5.以下通过具体的实施例对本发明作进一步的说明，有助于本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明；实施例1大肠杆菌(e.coli)接种于lb培养基中，在37℃培养12小时，使用6000rpm/min离心4min，弃去上清后，使用细菌rna提取试剂盒(omega)提取病原微生物rna，然后使用primescript ii 1st strand cdna合成试剂盒(takara)在37℃条件下反应1h合成cdna链，以cdna链为模板，加入1ul forward 引物(taatacgactcactataggggaggaagggagtaaagttaat)，1ul reverse引物(ggagttagccggtgcttct)，9.5ul 无菌水，12.5ul 预混酶(takara)。pcr程序为95℃ 5min，95℃ 30s， 64℃ 30s， 72℃ 30s，20个循环，pcr结束后加入1ul t7 rna聚合酶(20ul/ul)，4ul buffer mix (neb)，10ul depc水，在37℃条件下孵育3h进行rna转录反应。500nm cas12f1与500nm sgrna在缓冲液(20mm tris
‑
hcl，20mm nacl，10mm mg
2+
) 37℃孵育30min，加入转录产物与100nm荧光探针后在37℃，激发波长492nm，发射波长520nm条件下检测荧光信号强度；实施例2肺炎克雷伯菌(k.pneumonia)接种于lb培养基中，在37℃培养12小时，使用6000rpm/min离心4min，弃去上清后，使用细菌rna提取试剂盒(omega)提取病原微生物rna，然后使用primescript ii 1st strand cdna合成试剂盒(takara)在37℃条件下反应1h合成cdna链，以cdna链为模板，加入1ul forward 引物(taatacgactcactataggggaggaaggcggtgaggt)，1ul reverse引物(acggagttagccggtgcttct)，9.5ul 无菌水，12.5ul 预混酶(takara)。pcr程序为95℃ 5min，95℃ 30s， 66℃ 30s， 72℃ 30s，20个循环，pcr结束后加入1ul t7 rna聚合酶(20ul/ul)，4ul buffer mix (neb)，10ul depc水，在37℃条件下孵育3h进行rna转录反应。500nm cas12f1与500nm sgrna在缓冲液(20mm tris
‑
hcl，20mm nacl，10mm mg
2+
) 37℃孵育30min，加入转录产物与100nm荧光探针后在37℃，激发波长492nm，发射波长520nm条件下检测荧光信号强度；实施例3铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)接种于lb培养基中，在37℃培养12小时，使用6000rpm/min离心4min，弃去上清后，使用细菌rna提取试剂盒(omega)提取病原微生物rna，然后使用primescript ii 1st strand cdna合成试剂盒(takara)在37℃条件下反应1h合成cdna链，以cdna链为模板，加入1ul forward 引物(taatacgactcactataggggaggaagggcagtaagtt)，1ul reverse引物(acgaagttagccggtgctta)，9.5ul 无菌水，12.5ul 预混酶(takara)。pcr程序为95℃ 5min，95℃ 30s， 62℃ 30s， 72℃ 30s，20个循环，pcr结束后加入1ul t7 rna聚合酶(20ul/ul)，4ul buffer mix (neb)，10ul depc水，在37℃条件下孵育3h进行rna转录反应。500nm cas12f1与500nm sgrna在缓冲液(20mm tris
‑
hcl，20mm nacl，10mm mg
2+
) 37℃孵育30min，加入转录产物与100nm荧光探针后在37℃，激发波长492nm，发射波长520nm条件下检测荧光信号强度；实施例4伤寒沙门氏菌(e.typhi)接种于lb培养基中，在37℃培养12小时，使用6000rpm/min离心4min，弃去上清后，使用细菌rna提取试剂盒(omega)提取病原微生物rna，然后使用
primescript ii 1st strand cdna合成试剂盒(takara)在37℃条件下反应1h合成cdna链，以cdna链为模板，加入1ul forward 引物(taatacgactcactataggggaggaaggtgttgtggtta)，1ul reverse引物(gagttagccggtgcttcttc)，9.5ul 无菌水，12.5ul 预混酶(takara)。pcr程序为95℃ 5min，95℃ 30s， 64℃ 30s， 72℃ 30s，20个循环，pcr结束后加入1ul t7 rna聚合酶(20ul/ul)，4ul buffer mix (neb)，10ul depc水，在37℃条件下孵育3h进行rna转录反应。500nm cas12f1与500nm sgrna在缓冲液(20mm tris
‑
hcl，20mm nacl，10mm mg
2+
) 37℃孵育30min，加入转录产物与100nm荧光探针后在37℃，激发波长492nm，发射波长520nm条件下检测荧光信号强度；实施例6灵敏度检测：将伤寒沙门氏菌的扩增子(ggaggaaggtgttgtggttaataaccgcagcaattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactc)按照10倍梯度进行稀释至1 am进行pcr扩增，扩增后加入1ul t7 rna聚合酶(20ul/ul)，4ul buffer mix (neb)，10ul depc水，在37℃条件下孵育3h。转录产物加入孵育好的500nm cas12f1
‑
sgrna复合物和100nm荧光探针后放置在37℃，激发波长492nm，发射波长520nm条件下检测荧光信号强度。