包含中药成分的微生物组合物、制备方法和用途

1.本发明涉及微生物培养、污水处理及中药领域，尤其涉及促进细菌生长的药物筛选、药物最佳浓度和配比的研究，以及微生物颗粒制作及应用。


背景技术：

2.与城市具有完整的污水处理体系不同，农村的家用污水通常没有经过任何处理，就排放到附近河流，富含油脂与氮磷的污水在自然环境下无法达到自净从而造成水污染及环境污染。随着乡村城镇化，美丽乡村的建设，农村家用污水的处理与排放是一个亟需解决的问题。一般的家用污水含有动物排泄物、洗涤剂、食品油污等，常见的污水排放会破坏自然水生态环境并散发恶臭，严重影响环境美观甚至人类生活。
3.常用的污水处理方法中，生物法是利用微生物将污水中呈溶解或胶体状态的有机物分解氧化为稳定的无机物质，使污水得到净化，由于不会引入其它对水生物有害的化学物质且处理效果显著，具有较好的发展前景。
4.用于处理污水的微生物分为好氧菌及厌氧菌，针对不同类型的污水投入不同的微生物组合以达到最好的污水净化目的。本文所涉及六个微生物菌株，分别为：解脂亚罗酵母yarrowia lipolytica、施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri、解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens、蜡样芽孢杆菌bacillus cereus、苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis和硝基还原假单胞菌pseudomonas nitroreducens。其中，解脂亚罗酵母繁殖过程中分泌脂肪酶，可有效地将油脂降解为脂肪酸及三羟基甘油，常用于处理各类油脂污水；施氏假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和硝基还原假单胞菌常用于制作活性污泥。在污水处理的研究中，施氏假单胞菌和硝基还原假单胞菌多作为硝化细菌，将有机氮降解为氨氮或进一步硝基氮。其中，许多研究表明：施氏假单胞菌在厌氧环境中具有一定的反硝化能力；解淀粉芽孢杆菌可有效分解污水中植物淀粉或糖原；蜡样芽孢杆菌参与污水系统重要的生物膜形成；苏云金芽孢杆菌是一种常用于杀除鳞翅目害虫的细菌，它可以分泌内外毒素阻止害虫的聚集，常用于生物除虫剂的制作。
5.中药以植物药居多，具有种类繁多、分布广泛且药用部位不同等特点。许多中药的非药用部位被当做垃圾焚烧，对环境造成很大污染。目前，对中药尤其非药用部位的开发利用，是研究热点之一。
6.选取较常见的中药及中药非药用部位，探究其对微生物生长及功能的影响，从而获得的药物组合可与微生物制作成微生物颗粒，在污水处理领域、微生物相关的子产品或微生物代谢产物及其衍生物工业化生产中都具有较好的应用前景。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题包括提供可以促进污水处理微生物生长的药物组合、将药物组合与相应微生物固定化后制作成微生物颗粒，可针对含油脂的家用污水进行污水净化处理。还希望提供物质成分或包含所述成分的组合物，其能够有效促进和增强微生物
生长和在污水处理中降解有机质例如脂质、氮源和碳源。
8.为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
9.总体而言，本发明涉及一种微生物组合物，其包括微生物和中药成分。本发明还涉及制备所述微生物组合物的方法以及微生物的培养方法。此外，本发明涉及中药成分用于培养微生物或促进微生物生长的用途，以及微生物组合物用于污水处理的用途。
10.在一个方面，本发明涉及一种微生物组合物，其包含微生物和促使所述微生物生长的中药成分。
11.在一个方面，本发明涉及制备微生物组合物的方法，其包括将促使微生物生长的中药成分与微生物混合。
12.在一个方面，本发明涉及中药成分用于促进微生物生长或培养微生物的用途。
13.在一个方面，本发明涉及促使微生物生长或培养微生物的方法，其包括将中药成分加入到微生物培养物中；和在有效或适当条件下培养所述微生物培养物或使所述微生物生长。
14.在一个方面，本发明涉及一种污水处理方法，其包括将本发明的微生物组合物加入到污水中。
15.在一个方面，本发明涉及本发明的微生物组合物用于污水处理的用途，例如用于在污水处理中减少、降解或消除油脂和/或氮源的用途。氮源的降解可包括将有机氮降解为氨氮或进一步硝基氮。此外，氮源的降解可包括氨氮或硝基氮转化为游离氮气(n2)，例如通过反硝化作用。
16.在本发明的各个方面中，本发明的微生物组合物可以是与微生物的保藏、接种、生长、培养、繁殖、发酵、代谢、底物分解和/或产物生成相关的组合物。微生物组合物可以是用于微生物生长或培养的组合物。所述组合物还可以是用于微生物底物分解的组合物，例如分解污水中的底物，例如油脂、氮源或糖类。组合物还可以是用于产物生成的微生物组合物，例如发酵生产赤藓糖醇。
17.本发明的微生物组合物可以用于涉及微生物培养或生长的各种工业或农业用途，例如微生物培养、污水处理、害虫防治或发酵生产等。例如，微生物组合物可以为微生物培养组合物、污水处理组合物、代谢物发酵生产组合物或生物除虫组合物。
18.微生物组合物可以呈固体、液体或固液混合的形式。例如，固体可以是颗粒、粉末、块状、球状或板状等固体形式。液体可以是溶液、混悬液、乳浊液、泡沫或胶体液等形式。固液混合形式可以是凝胶、泥浆、胶浆、糊状物、浆液、悬浮液、固-液分散体等。在一个实例中，微生物组合物可以是微生物颗粒。微生物颗粒可以制备成直接释放或缓慢释放的形式，以用于污水处理。在另一个实例中，微生物组合物可以是除虫剂，其中所述微生物抑制或杀死害虫。在又一个实例中，微生物组合物工业发酵的接种物或培养物，在适当的培养条件下，中药成分可以促进微生物的生长、培养和产生所需产物。在又一实例中，微生物组合物可以是活性污泥，其包含本发明的中药成分和微生物。
19.除了中药成分和微生物之外，微生物组合物还可以包含形成或制成该组合物和/或实现特定功能的添加剂。固体组合物可包含填充剂、稳定剂、粘合剂、膨胀剂、胶凝剂、固定剂、聚合物、交联剂、无机盐或其它辅料。液体组合物可包含溶媒、溶剂(例如水)、增溶剂、缓冲剂或其它载体。例如，微生物颗粒所用的辅料可包括聚乙二醇、海藻酸钠和交联剂等。
又例如，微生物组合物可为培养物，其包含支持微生物生长的碳源、氮源、无机盐等。
20.微生物可包括真菌(例如丝状真菌或酵母)、细菌和放线菌，优选酵母和细菌。微生物可以是可用于污水处理的微生物。“可用于污水处理”表明，微生物可实现污水处理的功能(例如降解其中的有机污染物，例如油脂、氮源(例如含氮的无机物、有机化合物或聚合物)和糖类)中，但这可能并非该微生物的唯一用途或特性。例如，解脂亚罗酵母可以降解污水中的油脂，但解脂亚罗酵母也可能用于赤藓糖醇发酵生产。可用于污水处理的微生物可以包括亚罗酵母属yarrowia spp.、假单胞菌属pseudomonasspp.、芽孢杆菌属bacillusspp.或其组合，优选亚罗酵母属。例如，本发明的微生物可包括解脂亚罗酵母yarrowia lipolytica、施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri、解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens、蜡样芽孢杆菌bacillus cereus、苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis、硝基假单胞菌pseudomonas nitroreducens或其组合。本发明的微生物优选是解脂亚罗酵母、施氏假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，更优选解脂亚罗酵母。微生物组合可以是2、3、4、5或6种所列举的具体微生物的任意组合。例如，微生物组合可以是解脂亚罗酵母与另外1、2、3、4或5种所列举的具体微生物的任意组合，例如解脂亚罗酵母、解淀粉芽孢杆菌和硝基假单胞菌的组合。
21.本发明的中药成分可以是促使微生物生长的中药成分。中药成分可来源于中药材或其非药用部位。中药材可为新鲜的、经保存的、干燥的、或者经过物理、化学或生物方法处理的。中药材可为植物的全株或其任何器官或组织，例如根、茎、叶、花、果实和/或种子，或者非根部分或地上部分等。本领域技术人员可以理解或分辨中药材植物中的药用部位(中药材)和非药用部位。本发明的中药材或其非药用部位包括黄精、厚朴花、芦根、大青叶、柴胡、山楂叶、大枣叶或其组合。中药材优选是芦根、柴胡、大枣叶或其组合，更优选柴胡。柴胡可以是全株、根或地上部分，优选地上部分。
22.中药材或其非药用部位的组合可以是2、3、4、5、6或7种所列举的具体中药材的任意组合。因此，本发明的中药成分可以是中药成分的组合，例如2-7种中药成分的任意组合，所述中药成分来源于本发明中药材或其非药用部位的组合。例如，中药材组合可以是柴胡与另外1、2、3、4、5或6种所列举的具体中药材的任意组合。中药材组合的实例包括(1)山楂叶、厚朴花和大青叶中的2种或3种的组合；(2)柴胡和山楂叶的组合；(3)山楂叶、芦根和大枣叶的组合；(4)大青叶、厚朴花、芦根和大枣叶的组合；(5)山楂叶、大青叶、厚朴花和柴胡中的2、3或4种的组合；(6)芦根、大枣叶和柴胡中的2或3种的组合；和(7)黄精、芦根和大枣叶中的2或3种的组合。本技术公开的中药成分组合或中药材组合并非仅限于此，本领域技术人员理解这七种具体中药材任何组合是都本技术公开或毫无疑义确定的内容。
23.中药成分组合中，各种中药成分的比例可为0.1至20比1，优选0.5至15比1，更优选1至10比1，例如0.1:1、0.15:1、0.2:1、0.25:1、0.3:1、0.35:1、0.4:1、0.45:1、0.5:1、0.55:1、0.6:1、0.65:1、0.7:1、0.75:1、0.8:1、0.85:1、0.9:1、0.95:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1。这样的比例可为两种成分的比例，同样也适用于3-7种成分组合的比例。例如在组合中，来源于山楂叶、厚朴花和大青叶的中药成分的比例可为0.2:0.6:1、0.4:1:0.2或者1:0.8:0.6。
24.中药成分或中药材或其非药用部位的提取物在微生物组合物的含量可为0.01％
体积-50％体积、优选0.05％体积-20％体积、更优选0.1％体积-10％体积，例如0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％体积，基于所述微生物组合物总体积计算。
25.在一个方面，中药成分可以是中药材或其非药用部位的提取物，例如水提取物。中药成分可为生药浓度为0.01g/ml-1g/ml的提取物，优选浓度为0.05g/ml
–
0.5g/ml，优选0.08g/ml
–
0.1g/ml，例如0.01g/ml、0.02g/ml、0.03g/ml、0.04g/ml、0.05g/ml、0.06g/ml、0.07g/ml、0.08g/ml、0.09g/ml、0.1g/ml、0.15g/ml、0.2g/ml、0.25g/ml、0.3g/ml、0.35g/ml、0.4g/ml、0.45g/ml、0.5g/ml、0.55g/ml、0.6g/ml、0.65g/ml、0.7g/ml、0.75g/ml、0.8g/ml、0.85g/ml、0.9g/ml、0.95g/ml或1g/ml。
26.中药成分提取物可通过对中药材或其非药用部位进行热回流提取或直接超声浸提得到。
27.污水处理可包括减少、降解或消除污水中的油脂、氮源和/或糖类(例如淀粉)。因此，用于污水处理的用途可包括在污水处理中减少、降解或消除污水中的油脂、氮源和/或糖类的用途。污水可以为家用污水，特别是包含动物排泄物、洗涤剂和/或油脂(例如食品油污)的家用污水，特别是农村家用污水。
28.本发明的微生物组合物还可为微生物颗粒。在所述微生物颗粒中，中药成分和微生物被固定化，例如通过交联的聚乙二醇-海藻酸钠固定化。在一个实例中，通过加入固定剂和交联剂进行固定化。所述固定剂可为聚乙二醇和海藻酸钠的混合物。所述交联剂可为硫酸铵与氯化钙(cacl2)的混合物，例如200ml交联剂中含有过饱和硫酸铵和4g cacl2。本发明微生物颗粒可包含中药成分和微生物以及用于将两者固定化的物质例如固定剂和交联剂。中药成分可为柴胡地上部分的提取物，特别是水提取物。微生物颗粒中的微生物可处于对数生长期。微生物颗粒中的微生物可包括或者是本发明所述的六种微生物或其组合，特别是所有六种微生物的组合。
29.本发明的药物组合可与相应的微生物固定化制作成微生物颗粒，在含油脂的家用污水处理中可有效降解油脂并消除氮源。
30.本发明的污水处理方法和用途中，可加入反硝化细菌。在该方面中，中药成分和微生物组合物与反硝化细菌联合增强氮源的减少、降解和消除，并且使总氮含量降低。硝化细菌可包括副球菌、芽孢杆菌、假单胞菌、产碱杆菌。
31.本发明的微生物颗粒可以是中药成分与对数生长期的相应微生物共同固定化所得。
32.本发明提供的所述的可促进本发明污水处理微生物生长的药物组合，可显著促进微生物的生长，与微生物固定化制作成微生物颗粒，可应用于含油脂的家用污水处理中。
33.进一步地，所述的微生物颗粒较不添加中药或其非药用部位的微生物降解油脂能力更强，与反硝化细菌联合使用能在两天内将家用污水中总氮含量降低。
34.本发明提供的所述的可促进本发明污水处理微生物生长的药物组合，在本发明微生物相关的子产品中，包括除虫剂、活性污泥等，有较好的应用前景。
35.本发明提供的所述的可促进本发明污水处理微生物生长的药物组合，在本发明微
生物的代谢产物或衍生物的工业化生产中也有一定的应用潜力。
36.本发明实施例还提供促进本发明污水处理微生物生长的药物筛选方法，药物组合的方式，多种药物混合最佳配比的检测方案，微生物颗粒的制作，模拟油脂污水的处理效果及实际家用污水的处理效果。
37.需要说明的是，该发明所述的微生物颗粒的制作，是由可有效促进微生物生长的药物组合，包括单药或多药混合配比，与相应单株微生物或多株微生物混合固定化。所得的微生物颗粒可针对不同类型的污水加入不同的微生物颗粒比例以达到较好的效果。
38.与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：
39.本发明提供的药物组合，可有效促进常用于污水处理微生物菌株的生长，将其与微生物固定化制作成微生物颗粒，具有较好的油脂降解及氮源消除功效。经实验证明，在处理模拟油脂污水时，该颗粒对油脂的降解能力较不添加中药的微生物作用增强；在处理实际家用污水时与反硝化细菌联用，三天内可将污水总氮降低。
40.进一步地，本发明将不同的药物组合与相应的单株或多株微生物固定化制作微生物颗粒，可根据不同类型污水添加不同比例的微生物颗粒以达到更佳的处理效果。
41.本发明提供的所述的可促进污水处理微生物菌株生长的药物组合，在与这些微生物菌株相关的子产品中，包括除虫剂、活性污泥等，有较好的应用前景。
42.本发明提供的所述的可促进污水处理微生物菌株生长的药物组合，在在与这些微生物菌株相关的代谢产物或衍生物的工业化生产中，也有一定的应用潜力。
附图说明
43.图1显示菌液起始浓度与sgt的关系。
44.图2显示中药或其非药用部位的提取液对解脂亚罗酵母生长的影响。显著性差异根据t检验:*p《0.05,**p《0.01and***p《0.001，#p《0.05,##p《0.01and###p《0.001，与空白组对比。
45.图3显示不同浓度大枣叶、山楂叶、柴胡地上部分对各种微生物生长的影响。
46.图4显示山楂叶、大青叶和厚朴花促进解脂亚罗酵母生长的最佳配比。a-山楂叶；b-厚朴花；c-大青叶；颜色越趋向蓝色代表sgt值越小，促进效果越强。
47.图5显示山楂叶和柴胡地上部分促进解脂亚罗酵母生长的最佳配比。a-柴胡地上部分；b-山楂叶；颜色越趋向蓝色代表sgt值越小，促进效果越强。
48.图6显示含柴胡地上部分的微生物颗粒。
具体实施方式
49.下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
50.本发明提供的中药或其非药用部位提取物以下也直接简称为对应中药名。
51.本发明使用的活性比较方法—sgt(start growth time)法，简言之为达到相同od
600
值时所需的时间。主要操作方法为中药与微生物共培养后，将菌液稀释除去中药影响，并继续培养，记录微生物生长曲线。由于中药对微生物生长的影响不同，稀释后的菌液起始浓度不同；达到相同od
600
所需时间(sgt)越短，说明菌液起始浓度越高，即中药对微生物生
长的促进作用越强。
52.实施例1：
53.本实施案例提供中药或其非药用部位提取物的提取方法，包括热回流提取及超声浸提法，具体按照以下操作进行：
54.热回流提取法：称取中药材或其非药用部位50g并粉碎，加入500ml去离子水浸泡30分钟，加热回流提取2小时，得生药浓度为0.1g/ml的中药或其非药用部位的提取物。离心，收集提取液上清，0.22μm滤膜过滤后，4℃保存待用。
55.超声浸提法：称取中药材或其非药用部位50g并粉碎，加入500ml去离子水浸泡30分钟，超声提取30分钟，离心，收集提取液上清，0.22μm滤膜过滤后，4℃保存待用。
56.实施例2：
57.本实施案例利用六种微生物菌株不同起始浓度的生长曲线，将达到同一od
600
所需时间与菌液起始浓度相关性进行分析，旨在探讨活性筛选方法—sgt法的可行性。六种微生物菌株包括：解脂亚罗酵母yarrowia lipolytica、施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri、解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens、蜡样芽孢杆菌bacillus cereus、苏云金芽孢杆菌bacillus thuringiensis以及硝基还原假单胞菌pseudomonas nitroreducens。
58.具体按照以下步骤进行：
59.1.分别培养菌液至对数生长期，利用平板涂布法计算其菌株数量。
60.2.利用培养基将对数生长期的菌液进行倍比梯度稀释，得102、103、104、105、106、107cfu/ml六种浓度的菌液；
61.3.将以上所得菌液100μl加入至96孔板中，37℃震荡培养，每隔20min检测od
600
；
62.4.绘制生长曲线，选取od
600
＝0.2/0.3作为生长目标，记录六株微生物达到该值时所需时间(sgt)，并以菌液起始浓度为横坐标，达到相同od
600
所需时间(sgt)为纵坐标作图。
63.结果如图1所示，选取od
600
＝0.3作为生长目标，记录每个菌液达到该od
600
时所需时间(sgt)，数据显示，微生物起始浓度与sgt成负相关，可用sgt代表微生物起始浓度差异。
64.实施例3：
65.本实施案例通过sgt法筛选具有促进六种微生物菌株生长活性的中药或其非药用部位。具体地，活性筛选通过以下步骤进行：
66.1.分别培养微生物菌液至对数生长期，制得微生物种子液；
67.2.向4.5ml新鲜培养基中加入0.5ml生药浓度为0.1g/ml的中药或其非药用部位浸提物，并接入1％微生物种子液，37℃，100-150rpm震荡培养16小时，每组设置五个重复对照，以在培养基中加入0.5ml无菌水作为空白对照；
68.3.用新鲜培养基将培养后菌液稀释相应倍数(解脂亚罗酵母组稀释10倍；其他细菌组稀释100倍)后，转移200μl至96孔板中，37℃，震荡培养，每隔20min检测od
600
；
69.4.绘制生长曲线，选取od
600
＝0.2/0.3作为生长目标，记录各组达到该值时所需时间(sgt)，并以菌液起始浓度为横坐标，达到相同od
600
所需时间(sgt)为纵坐标作图。
70.以解脂亚罗酵母筛选结果为例(如图2)，添加山楂叶、大青叶、厚朴花或柴胡地上部分培养后的微生物组达到od
600
＝0.2时的sgt显著比空白对照组低，说明其菌液初始浓度显著比空白对照组高，说明这几种中药对解脂亚罗酵母生长具有较好的促进作用。
71.针对六种微生物菌株，对28种中药或其非药用部位进行的筛选结果见表1。从表中
可知：山楂叶、大青叶、厚朴花和柴胡地上部分对解脂亚罗酵母生长具有较好的促进作用；大枣叶和柴胡地上部分对施氏假单胞菌有促进作用；芦根、大枣叶和柴胡地上部分对解淀粉芽孢杆菌有促进作用；芦根对蜡样芽胞杆菌有促进作用；大枣叶和柴胡地上部分对苏云金芽孢杆菌有促进作用；黄精、芦根和大枣叶对硝基假单胞菌有促进作用。汇总结果如表2。
72.表1中药或其非药用部位筛选结果
73.[0074][0075]
(+：加药组微生物浓度显著高于空白对照组；-：加药组与空白对照组未见显著差异)表2.具有促进几株微生物生长的中药目录汇总
[0076][0077][0078]
(+：加药组微生物浓度显著高于空白对照组；-：加药组与空白对照组未见显著差异)
[0079]
实施例4：
[0080]
本实施案例通过sgt法，针对几种具有活性的中药或其非药用部位，对促进几种菌株生长的最适药物浓度进行研究。具体地，实验步骤如下进行：
[0081]
1.分别培养微生物菌液至对数生长期，制得微生物种子液；
[0082]
2.向4.5ml新鲜培养基中加入0.05、0.1、0.25、0.5ml生药浓度为0.1g/ml的中药或其非药用部位浸提物，用无菌水补足至5ml，并接入1％微生物种子液，37℃，100-150rpm震荡培养16小时，每组设置五个重复对照，以在培养基中加入0.5ml无菌水作为空白对照；
[0083]
3.用新鲜培养基将培养后的菌液稀释10-100倍后，转移200μl至96孔板中，37℃，震荡培养，每隔20min检测od
600
；
[0084]
4.绘制生长曲线，选取od
600
＝0.2/0.3作为生长目标，记录各组达到该值时所需时间(sgt)，并以菌液起始浓度为横坐标，达到相同od
600
所需时间(sgt)为纵坐标作图。
[0085]
结果如图3所示，不同浓度大枣叶、山楂叶、柴胡地上部分对微生物生长的影响，添加1％-5％药物即可基本促进微生物生长，为尽可能降低处理成本，可适当降低中药使用量。
[0086]
实施例5：
[0087]
本实施案例通过sgt法和均匀实验，针对具有活性的中药或其非药用部位混合添加的最佳配比进行探索，具体地，实验步骤如下进行：
[0088]
1.分别培养微生物菌液至对数生长期，制得微生物种子液；
[0089]
2.按照均匀实验u64(如表3)或u74(如表4)，使用2个或3个因素(不同中药)，6个或7个水平(添加浓度0-10％)，向新鲜培养基中加入相对应浓度生药浓度为0.1g/ml的中药或其非药用部位浸提物，并接入1％微生物种子液，37℃，100-150rpm震荡培养16小时，每组设置五个重复对照；
[0090]
3.用新鲜培养基将培养后菌液稀释10-100倍后，转移200μl至96孔板中，37℃，震荡培养，每隔20min检测od
600
；
[0091]
4.绘制生长曲线，选取od
600
＝0.2/0.3作为生长目标，记录各组达到该值时所需时间(sgt)；
[0092]
5.将对应sgt进行神经网络作图，计算出最佳混合浓度；
[0093]
表3均匀实验u64中药添加量及对应sgt
[0094]
[0095]
表4均匀实验u74对应中药添加量及对应sgt
[0096][0097]
以a-山楂叶、b-厚朴花、c-大青叶作为3因素(表3)，添加浓度为0-10％设置6水平，所得sgt进行神经网络作图，结果如图4所示。图4为假设三种中药添加量分别为1％时的二维图。可知，随着添加浓度的增加，山楂叶对解脂亚罗酵母生长的促进作用增强，其促进作用与厚朴花和大青叶的添加无关；而厚朴花和大青叶添加量具有一定的相关性，二者添加量均为5％时，对解脂亚罗酵母生长的促进作用较好。
[0098]
以a-柴胡地上部分、b-山楂叶作为2因素(表4)，添加浓度为0-10％设置7水平，所得sgt进行神经网络作图，结果如图5所示。随着添加浓度的增加，两种中药单独对解脂亚罗酵母生长促进作用增强，当添加量为5％-8％时，两种中药的活性具有一定相关性。
[0099]
以上以解脂亚罗酵母为探究对象，说明多药混合最佳配比的探究过程，全部药物组合如表5-6所示：
[0100]
表5.针对解脂亚罗酵母的药物组合
[0101][0102]
(+：添加；-：不添加)
[0103]
表6.针对其他微生物的药物组合
[0104][0105]
(a.施氏假单胞菌；b.解淀粉芽孢杆菌；c.蜡样芽孢杆菌；d.苏云金芽孢杆菌；e.硝
基还原假单胞菌；+:添加；-：不添加)
[0106]
实施例6：
[0107]
本实施案例为含有药物组合的微生物颗粒制作流程，微生物包括实施例2和3中描述的所有六种微生物。具体地，步骤如下进行：
[0108]
1.分别培养六种微生物菌液至对数生长期；
[0109]
2.将所得菌液离心，去除培养液，保留菌体，并重悬于少量生理盐水中；
[0110]
3.配制固定剂：称取聚乙二醇8g和海藻酸钠3g于80ml水中加热溶解后，加水定容至100ml；同时配制交联剂200ml：饱和硫酸铵中加入4gcacl2；
[0111]
4.将生理盐水中的微生物菌体分别与相应的药物组合混合，加入已冷却的固定剂中搅拌混匀，并滴加于无菌的交联剂中；
[0112]
5.将含有固定微生物的交联剂放置于4℃过夜，次日用无菌生理盐水将已成型的微生物颗粒进行清洗并适当干燥后装袋。
[0113]
其中，加入了柴胡地上部分的微生物颗粒如图6所示，可见含有药物组合的微生物颗粒为胶质小球状，呈黄褐色，在水溶液中呈一定程度的膨胀状态。这样可以让微生物与中药充分混合，形成的微球颗粒强度高，可保持微生物活性，同时污水可有效通过颗粒微孔与微生物相互作用并缓慢释出。
[0114]
如果立即使用，可以直接加入污水处理容器中。如果暂时不用，可以冷冻保存。
[0115]
实施例7：
[0116]
本实施案例模拟含油脂污水，以其中两种药物组合为例，考察添加中药与否微生物对油脂的降解能力的差异，具体地，实验步骤如下进行：
[0117]
1.分别培养微生物菌液至对数生长期；
[0118]
2.配制模拟油脂污水培养基：橄榄油1.0g，酵母提取物0.17g，微量元素0.05ml，加入如下中药混合物，无机盐培养基补足至100ml，调节ph至7.0，高温高压灭菌待用。(其中，无机盐培养基：kh2po40.3g，mgso
4 0.1g，k2hpo41.5g，nh4cl 1.0g，nacl 5.0g，ddh2o 1l；微量元素：mnso
4 1.44g，cuso40.8g，ddh2o 1l)
[0119]
加入与中药等体积去离子水为空白组(m0)；
[0120]
加入山楂叶5ml、芦根5ml和大枣叶5ml为中药组(m1)；
[0121]
加入大青叶5ml、厚朴花5ml、芦根5ml和大枣叶5ml为中药组(m2)
[0122]
3.分别向m0、m1、m2三种培养基中接入1％六株微生物的种子液；37℃，100-150rpm震荡培养16小时；
[0123]
4.离心除去菌体，利用石油醚分别对剩余培养液上清进行油脂提取：向上清中加入1：1体积比的石油醚，萃取三次，收集石油醚层，蒸干有机层，称量所得油脂并记录；不接入微生物的培养基作为对照组以计算油脂提取率；
[0124]
实验结果见表7，根据空白培养基的提取效率，油脂提取率约为50％，中药组(m1)和(m2)油脂含量均比空白组(m0)低；m2组比m1组去油脂作用更好一些。说明中药可促进微生物对油脂降解。
[0125]
表7含中药微生物对模拟油脂污水降解效果
[0126][0127]
实施例8：
[0128]
本实施案例选取农村住户进行试点，其生活污水直接通入安装在房子外面的小型污水处理装置，污水处理装置后连接湿地。在湿地的出水口采集三个水样作为处理前(0h)空白对照组，-20℃冷冻保存；向污水处理装置中加入由实施例6制备的含药物组合的微生物颗粒及反硝化细菌(可包括副球菌、芽孢杆菌、假单胞菌、产碱杆菌)后，本实施案例提供其中药物组合之一(柴胡地上部分)微生物颗粒作为探究目标。分别于24小时(24h)和48小时(48h)收集水样比较；将全部水样立即送到当地检测中心进行氨氮及总氮含量检测。检测结果见表8，加入含柴胡地上部分的微生物颗粒24小时后，水样中氨氮含量有一定增加，总氮含量稳定，48小时后氨氮及总氮含量均下降。
[0129]
表8实际家用污水处理结果
[0130]