薯蓣皂素合成菌株构建及应用

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种薯蓣皂素合成菌株构建及应用。


背景技术：

2.甾体化合物在自然界中广泛分布，是细胞膜的重要组成部分，如动物中常见的胆固醇、植物中的菜油甾醇、谷甾醇和豆甾醇以及低等真核生物如酿酒酵母中的麦角固醇，对动植物的生存起着至关重要的作用。此外，这些甾体化合物又可以在生物体内进一步合成其他甾体激素，如黄体酮、维他命d3等。甾体激素又称类固醇激素，是人体内源性药物，对维持人体健康有着不可替代的作用。甾体药物是一类有趣的分子，由于其结构的多样性而赋予其多样的药理学活性，主要应用在医药保健方面，具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克的药理作用，能够改善蛋白质代谢、恢复和增强体力以及利尿降压。据统计，2011年甾体激素药物销售额就已高于280亿美元，约占全球医药总销售额的6％；2016年甾体激素药物销售额就已高于1000亿美元，成为仅次于抗生素的第二大类药物。
3.薯蓣皂素(diosgenin)又称薯蓣皂甙元，其结构见图1。自1940年薯蓣属根状茎所含薯蓣配基(diosgenia)被发现可作为甾体激素药物来源以后,植物学和药物学专家对该属植物研究给予了高度重视。薯蓣皂素在结构上与甾体激素类药物有较大的相似性，是甾体激素药物的基础原料，其自身也具有抗过敏性、抗病毒性及抗休克性等功效，被称为“药用黄金”。其水溶性甾体皂苷及其衍生物具有保护胃黏膜、抗炎、抗癌等多种药理学活性。随着甾体激素市场需求的不断扩大，其前体薯蓣皂素的生物合成受到广泛关注，目前薯蓣皂素的合成工艺主要是传统的酸解法。植物黄姜经粉碎、酸解、漂洗、提取、结晶等多个步骤，最终获得薯蓣皂素。受其源植物黄姜种植状态的不确定性及长周期(超2年)，提取工艺污染严重等因素影响，薯蓣皂苷的供给和价格存在较大波动，一种高效、清洁、稳定的甾体化合物生产方式被迫切期待，若能实现由植物提取向生物合成的生产模式转型将极大的推进我国薯蓣皂素生产，促进我国甾体激素工业的发展。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是提供一种重组菌。
5.本发明提供的重组菌，为在含有薯蓣皂素合成路径相关基因的底盘酵母菌中进行如下1)的改造，得到的重组菌：
6.1)使所述底盘酿酒酵母表达甾体22位羟化酶基因；
7.或使所述底盘酿酒酵母表达甾体22位羟化酶基因且提高所述底盘酿酒酵母的基因组中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-细胞色素p450还原酶svvcpr基因的表达；
8.所述薯蓣皂素合成路径相关基因为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶1基因thmg1、α-氨基乙二酸还原酶基因lys2、甲羟戊酸激酶基因erg12、异戊烯基焦磷酸异构酶idi1、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶erg19、(来源于鲁杰式菌属)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶hmgr、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a erg13、磷酸甲羟戊酸激酶erg8、乙酰辅酶a酰基转移
酶erg10、来源于拟南芥的鲨烯合酶atsqs、来源于丹参的法尼基焦磷酸合酶smfps、鲨烯环氧酶erg1、山藜芦来源甾醇26位羟化酶vccyp94n、葡萄来源烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-细胞色素p450还原酶svvcpr、盾叶薯蓣来源甾醇16，22双羟氧化酶dgcyp90g、土豆来源甾醇7位还原酶stdwf5和/或原鸡来源甾醇24位还原酶ggdhcr24。
9.上述重组菌中，所述甾体22位羟化酶来源于山藜芦、拟南芥、番茄或盾叶薯蓣。
10.上述重组菌中，所述甾体22位羟化酶为如下1)-3)中任一种：
11.1)序列表中序列19的第482-1937位所示核苷酸编码的蛋白；
12.2)将1)进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与1)相同功能的由其衍生的蛋白质；
13.3)与1)具有95％以上同一性且与1)相同功能的蛋白质。
14.上述重组菌中，所述重组菌为在含有薯蓣皂素合成路径相关基因的底盘酵母菌中进行所述1)和如下2)的改造，得到的重组菌：
15.2)提高所述底盘酿酒酵母的基因组中甾醇26位羟化酶vccyp94n基因(山藜芦来源酶)基因、甾醇16，22双羟氧化酶基因dgcyp90g盾叶薯蓣来源、所述甾体22位羟化酶的表达。
16.上述重组菌中，所述提高底盘酿酒酵母的基因组中甾醇26位羟化酶vccyp94n基因(山藜芦来源酶)基因、甾醇16，22双羟氧化酶基因dgcyp90g盾叶薯蓣来源、所述甾体22位羟化酶的表达为将甾醇26位还原酶vccyp94n基因、甾醇16，22双羟氧化酶基因dgcyp90g、所述甾体22位羟化酶基因表达盒整合到所述含有thmg1和lys2基因的酿酒酵母基因组中得到；
17.所述vccyp94n基因包括tef1启动子、来源于山藜芦的vccyp94n基因和cyc1终止子；
18.所述dgcyp90g表达盒包括tdh3启动子、盾叶薯蓣来源的dgcyp90g基因和tpi1终止子；
19.所述甾体22位羟化酶基因表达盒表达盒包括pgk1启动子、山藜芦来源的vccyp90b27基因和adh1终止子。
20.上述重组菌中，所述重组菌为在含有薯蓣皂素合成路径相关基因的底盘酵母菌中进行所述1)、2)和如下3)的改造，得到的重组菌：
21.3)使所述底盘酿酒酵母中以质粒的形式高拷贝表达dgcyp90g基因，具体为导入prs426-ura3-ptef1-dgcyp90g-tcyc1质粒。
22.上述重组菌中，所述底盘酿酒酵母按照如下a)-d)中至少一种方式改造得到：
23.a)提高含有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶1基因thmg1和α-氨基乙二酸还原酶基因lys2的酿酒酵母基因组中thmg1、甲羟戊酸激酶erg12、异戊烯基焦磷酸异构酶idi1、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶erg19、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶hmgr、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a erg13、磷酸甲羟戊酸激酶erg8和乙酰辅酶a酰基转移酶erg10的表达；
24.b)提高所述含有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶1基因thmg1和α-氨基乙二酸还原酶基因lys2基因的酿酒酵母基因组中鲨烯合酶atsqs、法尼基焦磷酸合酶smfps、鲨烯环氧酶erg1的表达；
25.c)使所述含有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶1基因thmg1和α-氨基乙二酸还原酶基因lys2基因的酿酒酵母基因组表达甾醇26位羟化酶vccyp94n、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-细胞色素p450还原酶svvcpr、甾醇16，22双羟氧化酶dgcyp90g、甾醇7位还原酶
stdwf5和/或甾醇24位还原酶ggdhcr24；
26.d)敲除所述含有thmg1和lys2基因的酿酒酵母基因组中的醇乙酰化酶atf2基因。
27.上述重组菌中，所述b中，使所述含有thmg1和lys2基因的酿酒酵母基因组表达vccyp94n、svvcpr、dgcyp90g、stdwf5和/或ggdhcr24为将vccyp94n、svvcpr、dgcyp90g、stdwf5和/或ggdhcr24表达盒整合到所述含有thmg1和lys2基因的酿酒酵母基因组中得到；
28.所述vccyp94n表达盒包括pgk1启动子、来源于山藜芦的vccyp94n基因和adh1终止子；
29.所述svvcpr表达盒包括tdh3启动子、葡萄来源的svvcpr基因和tpi1终止子；
30.所述dgcyp90g表达盒包括tef1启动子、盾叶薯蓣来源的dgcyp90g基因和cyc1终止子；
31.所述stdwf5表达盒包括pgk1启动子、土豆来源stdwf5基因和adh1终止子；
32.所述ggdhcr24表达盒包括tef1启动子、原鸡来源的ggdhcr24基因和cyc1终止子。
33.本发明另一个目的是提供一种方法。
34.本发明提供的制备第一个目的重组菌的方法，按照上述重组菌中的改造方法制备。
35.由上述方法得到的重组菌也是本发明保护的范围。
36.上述的重组菌或上述方法得到的重组菌在生产薯蓣皂素或提高薯蓣皂素产量中的应用也是本发明保护的范围；
37.本发明还提供了一种生产薯蓣皂素的方法，包括如下步骤：发酵培养上述的重组菌，得到薯蓣皂素。
38.本发明的实验证明，本发明完善了薯蓣皂素的异源合成路径，并通过不同来源关键酶活性比较，显著提高薯蓣皂素的异源生产。除此之外，通过代谢工程方法对菌株进行改造，获得薯蓣皂素人工细胞工厂。最终薯蓣皂素在5l罐中的产量达1.3g/l，是目前所报道的最高产量，为其他甾体激素类药物的异源合成提供很好的借鉴案例。
附图说明
39.图1为薯蓣皂素结构式。
40.图2为lp-074菌株发酵产物gc-ms检测分析。
41.图3为lp-085系列菌株薯蓣皂素产量。
42.图4为菌株薯蓣皂素产量。
43.图5为lp-bc分批补料发酵图。
具体实施方式
44.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
45.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
46.下面实施例中的酿酒酵母by-t1菌株(记载在中国专利201210453416.x)可从天津工业生物技术研究所获得，该菌株含有thmg1(来源于部分酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶1)和lys2(α-氨基乙二酸还原酶)，可以合成较高产量的鲨烯。
47.实施例1、打通酿酒酵母薯蓣皂素合成通路
48.一、构建菌株by-t5，增加mva路径通量
49.1、酿酒酵母内源leu2基因grna质粒的构建
50.首先以质粒p426-snr52p-grna.can.y-sup4t(#43803购买自addgene，含有cas9结合区)为模板，使用引物43803-up和43803-leu2grna-down1(见表1)进行pcr扩增。
51.扩增体系为takarahs dna聚合酶5
×
buffer 10μl，dntp mix 4μl，引物(见表1)各1μl，模板0.5μl，primerstar hs聚合酶(2.5u/μl)0.5μl，补加蒸馏水至总体积50μl。
52.扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火15秒、72℃延伸5分钟(30个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。
53.扩增获得的pcr产物进行dpn1消化处理，dpn1处理体系为：10μl 10
×
dpn1 buffer(thermo公司)、5μl dpn1(therom公司，400,000cohesive end units/ml)，100μl pcr扩增产物，消化处理4小时，随后对处理后的产物，进行胶回收处理备用。
54.将胶回收后得到的消化产物，转入trans1-t1感受态细胞中冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μl lb培养基，250rpm，37℃孵育1小时，菌液涂在含有氨苄青霉素的lb平板上，过夜培养后直接挑选两个单克隆质粒进行测序验证，测序结果表明正确的质粒命名为pleu2grna。
55.表1为构建leu2、ndt80、atf2、gal80位点grna质粒引物
[0056][0057]
上表中加粗的为各个基因对应的n20的grna序列。。
[0058]
2、同源重组片段的构建
[0059]
酵母内源基因thmg1(来源于部分酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶1)、erg12(酿酒酵母的甲羟戊酸激酶)、idi1(酿酒酵母的异戊烯基焦磷酸异构酶)、erg19(酿酒酵母的焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶)、erg13(酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a)、erg8(酿酒酵母的磷酸甲羟戊酸激酶)、erg10(酿酒酵母的乙酰辅酶a酰基转移酶)由带有sexa i酶切位点的上游引物和带有asc i酶切位点的下游引物从酿酒酵母by4742(saccharomyces cerevisiae by4742，记载在carrie baker brachmann et al.,1998,yeast,14:115-132,公众可从天津工业生物技术研究所获得)菌株的基因组上扩增(扩增引物如表2所示)。
tadh2-peno2-r(见表3)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得tadh1-50-ppdc1-erg12-tadh2-peno2-50片段(序列2)，该片段包含pdc1启动子(序列2的第51-851位),酿酒酵母内源erg12基因(序列2的第852-2184位)以及adh2终止子(序列2的第2185-2585位)。
[0068]
以构建好的质粒m16-idi1为模板使用引物3g-2-m-tadh2-peno2-f和3g-2-m-tpdc1-ppyk1-r(见表3)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得tadh2-50-peno2-idi1-tpdc1-ppyk1-50片段(序列3)，该片段包含eno2启动子(序列3的第51-1051位),酿酒酵母内源idi1基因(序列3的第1052-1949位)以及pdc1终止子(序列3的第1950-2350位)。
[0069]
以构建好的质粒m5-erg19为模板使用引物3g-3-m-tpdc1-ppyk1-f和s-8g-1-m-tpgi1-ptef2-r(见表3)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得tpdc1-50-ppyk1-erg19-tpgi1-ptef2-50片段(序列4)，该片段包含pyk1启动子(序列4的第51-1051位),酿酒酵母内源erg19基因(序列4的第1052-2243位)以及pgi1终止子(序列4的第2244-2643位)。
[0070]
以构建好的质粒m7-hmgr-n为模板使用引物s-8g-1-m-tpgi1-ptef2-f和s-8g-1-m-teno2-pfba1-r(见表3)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得tpgi1-50-ptef2-hmgr-n-teno2-pfba1-50片段(序列5)，该片段包含tef2启动子(序列5的第51-613位),hmgr-n基因(序列5的第614-1916位)以及eno2终止子(序列5的第1917-2317位)。
[0071]
以构建好的质粒m8-erg13为模板使用引物s-8g-1-m-teno2-pfba1-f和s-4g-4-m-ttdh2-ptdh3-r(见表3)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得teno2-50-pfba1-erg13-ttdh2-ptdh3-50片段(序列6)，该片段包含fba1启动子(序列6的第51-873位),酿酒酵母内源erg13基因(序列6的第874-2299位)以及tdh2终止子(序列6的第2300-2701位)。
[0072]
以构建好的质粒m4-erg8为模板使用引物s-4g-3-m-ttdh2-ptdh3-f和3g-3-m-ttpi1-ptef1-r(见表3)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得ttdh2-50-ptdh3-erg8-ttpi1-ptef1-50片段(序列7)，该片段包含tdh3启动子(序列7的第51-851位),酿酒酵母内源erg8基因(序列7的第852-2208位)以及tpi1终止子(序列7的第2209-2609位)。
[0073]
以构建好的质粒m3-erg10为模板使用引物3g-2-m-ttpi1-ptef1-f和leu2-50-tcyc1-r(见表3)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得ttpi1-50-ptef1-erg10-tcyc1-leu2-50片段(序列8)，该片段包含tef1启动子(序列8的第51-454位),酿酒酵母内源erg10基因(序列8的第455-1652位)以及cyc1终止子(序列8的第1653-1960位)。
[0074]
表3为扩增leu位点同源重组片段引物
[0075][0076][0077]
3、cas9质粒的转化
[0078]
以by-t1菌株(记载在中国专利201210453416.x)出发，sd-ura-his-leu-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.，
0.01％trp.(各百分号均表示g/100ml)。取1ml(od约0.6-1.0)分装到1.5ml ep管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mm liac；10mm dtt；0.6m山梨醇；10mm tris-hcl(ph7.5)，处理液使用时才加dtt)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml 1m山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1m山梨醇重悬二次)，到最终体积约为80μl。加入cas9质粒p414-tef1p-cas9-cyc1t(#43802购买于addgene)1μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml 1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵母选择培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.,0.01％ura.,1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。
[0079]
任选一株命名为菌株by-t1(cas9)，该菌为将质粒p414-tef1p-cas9-cyc1t转入酿酒酵母by-t1中，得到的重组菌。
[0080]
4、grna质粒和基因同源重组片段的共转化
[0081]
by-t1(cas9)于筛选培养基中过夜培养。筛选培养基组成如下：sd-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.(各百分号均表示g/100ml)。制备酿酒酵母感受态(方法同步骤3)向制备好的by-t1(cas9)的感受态细胞中加入pleu2grna质粒和八个同源重组片段各2μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml 1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵母选择培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.,1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株by-t5(cas9)。
[0082]
菌株by-t5为将by-t1(cas9)基因组中的leu2基因(gene id:850342,updated on 14-jan-2021)替换为ppgk1-thmg1-tadh1-ppdc1-erg12-tadh2-peno2-idi1-tpdc1-ppyk1-erg19-tpgi1-pte f2-hmgr-n-teno2-pfba1-erg13-ttdh2-ptdh3-erg8-ttpi1-ptef1-erg10-tcyc1(核苷酸序列由序列1第51-2545、序列2第51-2585、序列3第51-2350、序列4第51-2643、序列5第51-2317、序列6第51-2701、序列7第51-2609和序列8第51-1960组成)得到的重组菌。
[0083]
5、grna质粒消除
[0084]
byt5于筛选培养基平板上三区划线。筛选培养基组成如下：5-foa-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖0.005％5-foa，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.1.5％琼脂(各百分号均表示g/100ml)。待平板上单克隆长出后，在sd-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.(各百分号均表示g/100ml)和sd-trp-ura(配方：0.8％酵母选择培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.,1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)上反筛，挑选在sd-trp-ura平板上不能生长、在sd-trp可以生长的菌株备用。
[0085]
二、构建菌株by-t30，增加羊毛甾醇产量
[0086]
1、酿酒酵母内源ndt80基因grna质粒的构建
[0087]
首先以质粒p426-snr52p-grna.can.y-sup4t(#43803购买自addgene，含有cas9结合区)为模板，使用引物43803-up和43803-ndt80grna-down1(见表1)进行pcr扩增。
[0088]
扩增体系为takarahs dna聚合酶5
×
buffer 10μl，dntp mix 4μl，引
ttpi1-r(见表5)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得tadh1-50-ptdh3-erg1-ttpi1-ptef1-50片段(序列10)，该片段包含tdh3启动子(序列10的第51-851位)，酿酒酵母来源erg1基因(序列10的第852-2343位)以及tpi1终止子(序列10的第2344-2746位)。对扩增获得的目的片段进行胶回收处理备用。
[0102]
以构建好的质粒m3-smfps为模板使用引物3g-2m-ttpi1-ptef1-f和ndt80-50-tcyc1-r(见表5)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得ttpi1-50-ptef1-smfps-tcyc1-ndt80-50片段(序列11)，该片段包含tef1启动子(序列11的第51-481位)，丹参来源的smfps基因(序列11的第482-1532位)以及cyc1终止子(序列11的第1533-1840位)。
[0103]
表5为扩增ndt80、atf2、gal80位点同源重组片段引物
[0104][0105][0106]
3、grna质粒和基因同源重组片段的共转化
[0107]
by-t5于筛选培养基中过夜培养。筛选培养基组成如下：sd-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.(各百分号均表示g/100ml)。制备酿酒酵母感受态(方法同一步骤3)向制备好的by-t5的感受态细胞中加入pndt80grna质粒和三个同源重组片段(序列9至序列11)各2μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml 1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵
母选择培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.,1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株by-t30。
[0108]
菌株by-t30为将by-t5基因组中的ndt80基因(gene id:856524,updated on 6-oct-2020)替换为ppgk1-atsqs-tadh1-ptdh3-erg1-ttpi1-ptef1-smfps-tcyc1(核苷酸序列由序列9第51-2194、序列10第51-2746、序列11第51-1840组成)得到的重组菌。
[0109]
4、grna质粒消除
[0110]
byt30于筛选培养基平板上三区划线。筛选培养基组成如下：5-foa-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖0.005％5-foa，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.1.5％琼脂(各百分号均表示g/100ml)。待平板上单克隆长出后，在sd-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.(各百分号均表示g/100ml)和sd-trp-ura(配方：0.8％酵母选择培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.,1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)上反筛，挑选在sd-trp-ura平板上不能生长、在sd-trp可以生长的菌株备用。
[0111]
三、酿酒酵母底盘菌株lp-034的构建
[0112]
酿酒酵母自身的醇乙酰化酶(atf2)基因会对甾体化合物的c3位进行乙酰化反应形成酯类沉淀物质，使后续反应无法进行。所以为了避免甾体c3-羟基的乙酰化反应对实验造成影响，通过crispr-cas9的方法在atf2位点敲整操作构建酿酒酵母底盘菌株lp-034：
[0113]
1、酿酒酵母内源atf2基因grna质粒的构建
[0114]
首先以质粒p426-snr52p-grna.can.y-sup4t(#43803购买自addgene，含有cas9结合区)为模板，使用引物43803-up和43803-atf2grna-down1(见表1)进行pcr扩增。
[0115]
扩增体系为takarahs dna聚合酶5
×
buffer 10μl，dntp mix 4μl，引物(见表1)各1μl，模板0.5μl，primerstar hs聚合酶(2.5u/μl)0.5μl，补加蒸馏水至总体积50μl。
[0116]
扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火15秒、72℃延伸5分钟(30个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。
[0117]
扩增获得的pcr产物进行dpn1消化处理，dpn1处理体系为：10μl 10
×
dpn1 buffer(thermo公司)、5μl dpn1(therom公司，400,000cohesive end units/ml)，100μl pcr扩增产物，消化处理4小时，随后对处理后的产物，进行胶回收处理备用。
[0118]
将胶回收后得到的消化产物，转入trans1-t1感受态细胞中冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μl lb培养基，250rpm，37℃孵育1小时，菌液涂在含有氨苄青霉素的lb平板上，过夜培养后随机挑选两个单克隆质粒进行测序验证，测序结果表明正确的质粒命名为patf2grna。
[0119]
patf2grna质粒包含atf2基因对应的n20的grna序列。
[0120]
2、同源重组片段的构建
[0121]
外源基因vccyp94n(山藜芦来源甾醇26位羟化酶)、dgcyp90g(盾叶薯蓣来源甾醇16，22双羟氧化酶)、svvcpr(葡萄来源烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-细胞色素p450还原酶)为薯蓣皂素合成相关基因，序列根据酿酒酵母密码子偏好性进行优化，由金斯瑞公司合成。合成基因时在5’端引入sexa i酶切位点、3’端引入asc i酶切位点。
[0122]
将获得的全基因合成产物用thermo公司sexa i和asc i进行双酶切，同时sexa i和asc i酶切质粒m2，m3，m4，酶切产物胶回收备用。
[0123]
50ng酶切质粒m2，m3，m4分别与上述所得vccyp94n、dgcyp90g、svvcpr基因片段各50ng加入连接体系：5μl 2
×
quick ligation buffer(neb公司)、0.5μl quick ligase(neb公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至10μl，室温反应10min得到连接产物，转入trans1-t1感受态细胞中冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μl lb培养基，250rpm，37℃孵育1小时，菌液涂在含有氨苄青霉素的lb平板上，过夜培养后，pcr筛选5个阳性单菌落，将验证正确的单克隆测序验证，得到质粒m2-vccyp94n、m3-dgcyp90g和m4-svvcpr。
[0124]
以构建好的质粒m2-vccyp94n为模板使用引物atf2-50-ppgk1-f和3g-2m-ptdh3-tadh1-r(见表5)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得atf2-50-ppgk1-vccyp94n-adh1t-ptdh3-50片段(序列12)，该片段包含pgk1启动子(序列12的第51-801位)，山藜芦来源vccyp94n基因(序列12的第802-2257位)以及adh1终止子(序列12的第2258-2416位)。
[0125]
以构建好的质粒m3-dgcyp90g为模板使用引物3g-2m-ttpi1-ptef1-f和atf2-50-tcyc1-r(见表5)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得ptef1-dgcyp90g-tcyc1片段(序列13)，该片段包含tef1启动子(序列13的第51-481位)，盾叶薯蓣来源的dgcyp90g基因(序列13的第482-1949位)以及cyc1终止子(序列13的第1950-2257位)。
[0126]
以构建好的质粒m4-svvcpr为模板使用引物3g-2m-tadh1-ptdh3-f和3g-2m-ptef1-ttpi1-r(见表5)进行pcr扩增(方法同步骤1)，获得ptdh3-svvcpr-ttpi1片段(序列14)，该片段包含tdh3启动子(序列14的第51-851位)，葡萄来源的svvcpr基因(序列14的第852-2964位)以及tpi1终止子(序列14的第2965-3367位)。对扩增获得的目的片段进行胶回收处理备用。
[0127]
3、grna质粒和基因同源重组片段的共转化
[0128]
by-t30于筛选培养基中过夜培养。筛选培养基组成如下：sd-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.(各百分号均表示g/100ml)。制备酿酒酵母感受态(方法同步骤3)向制备好的by-t30的感受态细胞中加入patf2grna质粒(包含cas9结合区)和三个同源重组片段(序列12至序列14)各2μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml 1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵母选择培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.,1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株lp-034。
[0129]
菌株lp-034为将byt30基因组中的atf2基因(gene id:853088,updated on 21-mar-2020)替换为ppgk1-vccyp94n-tadh1-ptdh3-svvcpr-ttpi1-tef1-dgcyp90g-tcyc1片段(核苷酸序列依次由序列12第51-2416位核苷酸、序列14第51-2964位核苷酸和序列13第51-2257位核苷酸组成)，得到的重组菌。
[0130]
二、酿酒酵母底盘菌株lp-074的构建
[0131]
1、引入胆固醇合成基因，打通薯蓣皂素合成路径
[0132]
外源基因stdwf5(土豆来源甾醇7位还原酶)、ggdhcr24(原鸡来源甾醇24位还原酶)为薯蓣皂素合成路径中胆固醇前体所需酶，序列根据酿酒酵母密码子偏好性进行优化，
由金斯瑞公司合成。合成基因时在5’端引入sexa i酶切位点、3’端引入asc i酶切位点。将获得的全基因合成产物用thermo公司sexa i和asc i进行双酶切，同时sexa i和asc i酶切质粒m2，m3酶切产物胶回收备用。得到质粒m2-stdwf5,m3-ggdhcr24(方法同一的步骤1)。
[0133]
以构建好的质粒m2-stdwf5为模板使用引物1m-peasy-ppgk1-f和1m-tadh1-ptef1-r(见表6)进行pcr扩增(方法同一的步骤1)，获得ppgk1-stdwf5-tadh1t片段(序列15)，该片段包含pgk1启动子(序列15的第63-813位)，土豆来源stdwf5基因(序列15的第814-2119位)以及adh1终止子(序列15的第2120-2278位)。
[0134]
以构建好的质粒m3-ggdhcr24为模板使用引物2m-tadh1-ptef1-f和2m-tcyc1-peasy-r(见表6)进行pcr扩增(方法同一的步骤1)，获得ptef1-ggdhcr24-tcyc1片段(序列16)，该片段包含tef1启动子(序列16的第51-481位)，原鸡来源的ggdhcr24基因(序列16的第482-2033位)以及cyc1终止子(序列16的第2034-2341位)。
[0135]
制备酿酒酵母lp-034感受态(方法同步骤3)，向制备好的感受态细胞中加入ppgk1-stdwf5-tadh1片段、ptef1-ggdhcr24-tcyc1及实验室已有的同源臂marker片段trp-his3-up，trp-down(记载在中国专利zl201210453416.x中)，各2μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml1 m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体筛选培养基(配方：酵母选择培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，0.01％leu.，0.01％ura.，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株lp-074。
[0136]
经过测序，菌株lp-074为将his-ppgk1-stdwf5-tadh1-tef1-ggdhcr24-tcyc1(核苷酸序列由his序列(gene id:854377,updated on 6-oct-2020)、序列15第63-2278位核苷酸和序列16第51-2341位核苷酸组成)替换酿酒酵母lp-034的trp1基因(gene id:851570,updated on 10-oct-2020)得到的重组菌，即stdwf5及ggdhcr24基因片段整合于lp-034的trp1位点得到的重组菌。
[0137]
表6为stdwf5、ggdhcr24基因整合扩增引物
[0138][0139][0140]
2、酿酒酵母lp-074菌株产物鉴定
[0141]
摇瓶发酵：在相应固体选择培养基(配方：固体酵母筛选培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)中活化酿酒酵母lp-074菌株；再接种
tcyc1-r(见表5)进行pcr扩增(方法同实施例1步骤1)，获得ptef1-dgcyp059-tcyc1片段(序列18)，该片段包含tef1启动子(序列18的第51-481位)，盾叶薯蓣来源的dgcyp059基因(序列18的第482-1934位)以及cyc1终止子(序列18的第1935-2242位)。
[0158]
制备酿酒酵母lp-074菌株感受态(方法同实施例1步骤3)，加入pgal80grna质粒和两个同源重组片段(ppgk1-svvcpr-adh1t片段和ptef1-dgcyp059-tcyc1片段)各2μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml 1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵母选择培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，0.01％leu.,1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。
[0159]
pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株lp-085-dg。
[0160]
lp-085-dg为将ppgk1-svvcpr-tadh1-ptef1-dgcyp059-tcyc1(核苷酸序列由序列17第51-3073位核苷酸和序列18第51-2242位核苷酸组成)替换lp-074菌基因组中的gal80基因(gene id:854954,updated on 14-jan-2021)，得到的重组菌。
[0161]
3、酿酒酵母lp-085-dg发酵产物检测
[0162]
按照实施例1的二的2检测重组菌株lp-085-dg薯蓣皂素产量，结果如图3所示，lp-085-dg菌株薯蓣皂素产量为3.75mg/l发酵液上清液；因此，外源导入的甾体22位羟化酶完善了薯蓣皂素的合成通路，提高了酿酒酵母合成薯蓣皂素的能力。
[0163]
二、不同来源甾体22位羟化酶活性筛选
[0164]
为了筛选合适的甾体22位羟化酶，通过crispr-cas9的方法将不同来源的甾体22位羟化酶导入，构建酿酒酵母底盘菌株lp-085-vc、lp-085-at和lp-085-sl：
[0165]
1、酿酒酵母内源gal80基因grna质粒的构建
[0166]
同上述一的步骤1，得到pgal80grna质粒。
[0167]
2、同源重组片段的构建
[0168]
外源基因vccyp90b27、atdwf4、slcyp90b3序列根据酿酒酵母密码子偏好性进行优化，由金斯瑞公司合成。合成基因时在5’端引入sexa i酶切位点、3’端引入asc i酶切位点。将获得的全基因合成产物用thermo公司sexa i和asc i进行双酶切，同时sexa i和asc i酶切质粒m3酶切产物胶回收备用。得到质粒m3-vccyp90b27、m3-atdwf4、m3-slcyp90b3(方法同实施例1步骤2)。分别以构建好的质粒m3-vccyp90b27 m3-atdwf4、m3-slcyp90b3为模板使用引物2m-tadh1-ptef1-f和gal80-50-tcyc1t-r(见表5、6)进行pcr扩增(方法同实施例1步骤1)，获得ptef1-vccyp90b27-tcyc1片段(序列19)，该片段包含tef1启动子(序列19的第51-481位)，山藜芦来源的vccyp90b27基因(序列19的第482-1937位)以及cyc1终止子(序列19的第1938-2245位)、ptef1-atdwf4-tcyc1片段(序列20)，该片段包含tef1启动子(序列20的第51-481位)，拟南芥来源的atdwf4基因(序列20的第482-2024位)以及cyc1终止子(序列20的第2025-2332位)。ptef1-sl-cyp90b3-tcyc1片段(序列21)，该片段包含tef1启动子(序列21的第51-481位)，山藜芦来源的slcyp90b3基因(序列21的第482-1955位)以及cyc1终止子(序列21的第1956-2263位)。
[0169]
制备酿酒酵母lp-074菌株感受态(方法同实施例1步骤3)，加入pgal80grna质粒和两个同源重组片段各2μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml 1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵母选择培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，0.01％leu.,1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养
36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株lp-085-vc(对应的2个同源片段为ppgk1-svvcpr-adh1t片段和ptef1-vccyp90b27-tcyc1片段)、lp-085-at(对应的2个同源片段为ppgk1-svvcpr-adh1t片段和ptef1-atdwf4-tcyc1片段)和lp-085-sl(对应的2个同源片段为ppgk1-svvcpr-adh1t片段和ptef1-sl-cyp90b3-tcyc1片段)。
[0170]
lp-085-vc为将ppgk1-svvcpr-tadh1-ptef1-vccyp90b27-tcyc1(核苷酸序列由序列17第51-3073位核苷酸和序列19第51-2245位核苷酸组成)替换lp-074菌基因组中的gal80基因(gene id:854954,updated on 14-jan-2021)，得到的重组菌。
[0171]
lp085-at为将ppgk1-svvcpr-tadh1-ptef1-atdwf4-tcyc1(核苷酸序列由序列17第51-3073位核苷酸和序列20第51-2332位核苷酸组成)替换lp-074菌基因组中的gal80基因(gene id:854954,updated on 14-jan-2021)，得到的重组菌。
[0172]
lp-085-sl为将ppgk1-svvcpr-tadh1-ptef1-slcyp90b3-tcyc1(核苷酸序列由序列17第51-3073位核苷酸和序列21第51-2263位核苷酸组成)替换lp-074菌基因组中的gal80基因(gene id:854954,updated on 14-jan-2021)，得到的重组菌。
[0173]
3、酿酒酵母lp-085-vc、lp-085-at和lp-085-sl发酵产物检测
[0174]
按照实施例1的二的2检测重组菌株，薯蓣皂素产量见图3，可以看出，导入vccyp90b27的重组菌的薯蓣皂素产量最高。
[0175]
实施例3、构建高产薯蓣皂素菌株lp-104
[0176]
由于前体胆固醇大量积累，通过增加薯蓣皂素合成模块拷贝数增加薯蓣皂素产量。
[0177]
构建质粒m2-vccyp90b27,m3-vccyp94n，m4-dgcyp90g(方法同实施例1步骤2)。
[0178]
以构建好的质粒m2-vccyp90b27为模板使用引物1m-peasy-ppgk1-f和3g-2m-tadh1-ptdh3-r(见表5、6)进行pcr扩增(方法同实施例1步骤1)，获得ppgk1-vccyp90b27-adh1t片段(序列22)，该片段包含pgk1启动子(序列22的第1-750位)，山藜芦来源vccyp90b27基因(序列22的第751-2206位)以及adh1终止子(序列22的第2207-2365位)。
[0179]
以构建好的质粒m3-vccyp94n为模板使用引物3g-2m-ttpi1-ptef1-f和2m-tcyc1-peasy-r(见表2、3)进行pcr扩增(方法同实施例1步骤1)，获得ptef1-vccyp94n-tcyc1片段(序列23)，该片段包含tef1启动子(序列23的第51-481位)，山藜芦来源的vccyp94n基因(序列23的第482-2027位)以及cyc1终止子(序列23的第2028-2335位)。以构建好的质粒m4-dgcyp90g为模板使用引物3g-2m-tadh1-ptdh3-f和3g-2m-ptef1-ttpi1-r(见表5)进行pcr扩增(方法同实施例1步骤1)，获得ptdh3-dgcyp90g-tcyc1片段(序列24)，该片段包含tdh3启动子(序列24的第51-851位)，盾叶薯蓣来源的dgcyp90g基因(序列24的第852-2319位)以及tpi1终止子(序列24的第2320-2722位)。制备酿酒酵母lp-085感受态，加入ppgk1-vccyp90b27-adh1t片段、ptdh3-dgcyo90g-ttpi1片段、ptef1-vccyp94n-tcyc1片段及实验室已有的同源臂marker片段rdna-leu2-up(序列25；该同源臂片段包含rdna位点上游400bp同源区域，leu2 marker基因(gene id:850342,updated on 14-jan-2021)，以及pgk启动子400bp同源区域)，rdna-leu2-down(序列26；该同源臂片段包含adh1终止子200bp同源区域，以及rdna位点下游300bp同源区域)各2μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml1 m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体筛选培养基(配方：酵母选择培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养
36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株lp-104。
[0180]
菌株lp-104为将leu2-ppgk1-vccyp90b27-tadh1-ptdh3-dgcyp90g-ttpi1-tef1-vccyp94n-tcyc1(核苷酸序列由序列25第687-1746位核苷酸、序列22第1-2365位、序列23的第51-2335位和序列27的第51-2722位核苷酸组成)替换lp-085-vc基因组中的rdna(中国专利201210453416.x)得到的重组菌，实现将vccyp90b27、dgcyp90g及vccyp94n基因片段整合于酿酒酵母lp-085的rdna位点。
[0181]
实施例4、运用高拷贝质粒过表达dgcyp90g，获得菌株lp-bc
[0182]
利用酿酒酵母高效的同源重组能力，构建高拷贝质粒prs426-ura3-ptef1-dgcyp90g-tcyc1
[0183]
1、获得同源重组片段
[0184]
首先以prs425质粒为模板，使用引物425-f和425-50-tcyc1-r(见表7)进行pcr扩增(方法同一的1)，获得片段425(序列27)，胶回收处理备用。
[0185]
以酿酒酵母by4742菌株基因组为模板，使用引物425-50-ura3-r和ptef1-50-ura3-f(见表7)进行pcr扩增(方法同一的1)，获得片段425-50-ura3-ptef1-50(序列28)，胶回收处理备用。
[0186]
以m3-dgcyp90g质粒为模板，使用引物ptef1-up-f和tcyc1-down-r(见表7)进行pcr扩增(方法同一的1)，获得片段ptef1-dgcyp90g-tcyc1(序列29)，胶回收处理备用。
[0187]
2、酿酒酵母体内同源重组
[0188]
制备酿酒酵母lp-104菌株感受态(方法同实施例1步骤3)，加入上述三个片段各2μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml 1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵母选择培养基sd-ura-his-leu-trp，2％葡萄糖，0.01％leu.,1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。随机挑选5个单克隆，用引物425-50-ura3-r和tcyc1-down-r进行验证，正确大小为3274bp。命名为lp-bc。
[0189]
重组菌lp-bc为将高拷贝质粒prs426-ura3-ptef1-dgcyp90g-tcyc1导入酿酒酵母lp-104中得到的菌株。
[0190]
表7为高拷贝质粒构建引物
[0191][0192]
3、酿酒酵母lp-034、lp-074和lp-085-vc、lp-104、lp-bc(基因型见表8)发酵产物检测
[0193]
方法同实施例1的步骤2，薯蓣皂素产量见图4。
[0194]
上述数据显示，菌株lp-074薯蓣皂素的产量极低，而在菌株lp-074的基础上表达了山藜芦来源的vccyp90b27的菌株lp-085的薯蓣皂素产量显著提高。在rdna多拷贝位点进一步整合薯蓣皂素合成模块，筛选到一株可产24.6mg/l薯蓣皂素的lp-104菌株，进一步整合高拷贝质粒，过表达dgcyp90g将薯蓣皂素产量提高至32.3mg/l。
[0195]
4、分批补料发酵
[0196]
具体方法及步骤参考文献[paddon c j,westfall p j,pitera d j,et al.high-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin[j].nature,2013,496(7446):528-32.，或westfall p j,pitera d j,lenihan j r,et al.production of amorphadiene in yeast,and its conversion to dihydroartemisinic acid,precursor to the antimalarial agent artemisinin[j].proc natl acad sci usa,2012,109(3):e111-8.]，在5升发酵罐中lp-bc菌株最终薯蓣皂素产量为1.3g/l，最终od600为401(见图5)。
[0197]
本发现结果表明山藜芦来源的vccyp90b27对酿酒酵母异源生产薯蓣皂素有较大帮助作用。此外，lp-bc菌株薯蓣皂素产量为已报道的最高产量，为一步法生物合成甾体激素打下坚实基础。
[0198]
表8为本发明涉及菌株的基因型
[0199]