一株高产洛伐他汀红色红曲霉菌的制作方法

1.本发明属于生物工程的技术领域，具体涉及一株高产洛伐他汀红色红曲霉菌。


背景技术：

2.目前有一种新型高效的物理诱变方法
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氦气常压室温等离子体诱变育种技术，可以广泛应用于细菌、真菌、放线菌、霉菌、藻类、大型真菌、植物及动物细胞。该诱变方法以高纯氦气为工作气体，利用射频辉光放电原理，在常温常压状态下产生高能量的等离子体，其富含的高能化学活性粒子能够对细胞产生高强度遗传物质损失，进而利用细胞启动的sos高容错率修复机制，产生种类多样的错配位点，最终形成了遗传稳定、种类丰富的突变株。氦气常压室温等离子体诱变育种技术具有突变率高、突变范围广、对基因损伤强度高、操作简便、环境友好、无辐射、对操作者安全、所获得的突变株遗传稳定性良好等优点。
3.红曲霉菌是一种丝状真菌，经大米固态发酵可以得到红曲米。红曲米作为中国传统的药食同源的天然制品，广泛应用于食品着色、肉类保鲜、酒类糖化发酵、降脂保健等诸多行业。红曲菌发酵能够产生多种对人体有益的代谢产物，其中洛伐他汀具有很强的降胆固醇、降血脂的保健作用。我国工业化生产洛伐他汀普遍存在成本高、产量低的问题，因此提高红曲霉菌发酵生产高汀红曲米的能力具有极其重要的现实意义。


技术实现要素：

4.本发明为解决上述背景技术中存在的技术问题，提供一株高产洛伐他汀红色红曲霉菌。
5.本发明采用以下技术方案：一株高产洛伐他汀红色红曲霉菌，命名为 hq007菌株，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 简称cgmcc，保藏日2020年10月19日，保藏登记号：cgmcc no.20278； 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其拉 丁文名称为：monascus anka。
6.本发明的有益效果：本发明提供了一株高产洛伐他汀的红色红曲菌株。由该菌株发酵生产的红曲米中洛伐他汀稳定在14.8~20mg/g，色价稳定在1200~1600u/g，多糖产量为6.4%~6.9%。相比于红曲霉菌的原始生产菌株，该菌株生长速度快，发酵的红曲米色价高、多糖产量高、洛伐他汀的产量高，遗传性状稳定，适用于工业化红曲米的生产。
附图说明
7.图1是诱变致死率曲线。
8.图2是红曲菌
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粗糙脉孢菌的抑菌圈。
具体实施方式
9.下面结合附图说明和具体实施例对本发明做进一步的描述。
10.实施例1一株高产洛伐他汀红色红曲霉菌，命名为hq007菌株，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏日2020年10月19日，保藏登记号：cgmcc no. 20278；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
11.为制备上述菌株，目前诱变处理采用的常规方法是化学诱变剂处理法或紫外诱变法，这两种方法对操作人员的安全都有一定程度的威胁，其中化学诱变剂处理过程中会产生对环境有害的废液或废弃物。
12.针对上述问题，本实施例还介绍了用于制备hq007菌株的筛选方法，所述方法无任何污染物产生，对操作人员安全友好，其优化过程采用氦气常压室温等离子体进行诱变处理，该处理引起的dna物质损伤具有非常丰富的多样性，诱发的sos修复强度与目前常见的紫外诱变或者化学诱变剂处理相比更加显著，且致畸致变性能明显，可获得更高的突变率。与较常规方法相比，氦气常压室温等离子体诱变技术操作过程无辐射、无毒性、无有害废弃物排出，对操作人员相对安全，对环境也比较友好。
13.本实施例进一步完善了高产洛伐他汀红曲霉菌的筛选方案。初筛在最初突变株生长时就可以从形态学上开始进行判断，复筛采用粗糙脉孢菌抑菌圈法，用hplc检测法对发酵好的红曲米粉进行洛伐他汀含量的测定以筛选出优秀突变株，最后筛选出遗传性状稳定的突变株。
14.具体如下：本发明实施例中所使用的察氏培养基成分：葡萄糖3%，nano30.3%，k2hpo40.1%，kcl0.05%，mgso40.05%，feso40.001%，琼脂2%；pda培养基成分：马铃薯粉0.6%，葡萄糖2%，琼脂2%，ph自然，所述百分含量均为质量百分含量。实施例中所使用的pd培养基成分：马铃薯200g，葡萄糖12g，ph自然，蒸馏水1000ml。制备方法：马铃薯洗净去皮切块，加水1000ml煮沸15min，用纱布过滤，过滤后加水补足至1000ml，再加入12克葡萄糖，煮沸至葡萄糖充分溶解，随后121℃，灭菌20min.分离纯化菌株本实施例是对原始红曲霉菌进行分离和纯化，用于筛选洛伐他汀的产量高的红曲菌株。具体实施方法如下：取少许江苏南京地区的红曲米酒，用接种环蘸取少量红曲米酒接种在察氏培养基平板上，培养温度：28℃，培养时间5d，得到红曲霉菌；用接种环刮取新长出的孢子在新的pda平面培养基上进行划板操作，将新划的板子倒置培养，培养温度：28~30℃，培养时间：3~5d；选取孢子长势快、孢子分布面积大、表面有细密辐射状褶皱和致密气生菌丝、边缘不光滑、红色素含量高的菌落进行第二次划板，划板后倒置培养，培养温度：28~30℃，培养时间：3~5d；重复上一步骤进行第三次划板，划板后倒置培养，培养温度：28~30℃，培养时间：3~5d；选取长势好、表面有褶皱和气生菌丝、边缘不光滑、红色素含量高的菌落点接至新的pda平面培养基上进行培养，培养温度：28~30℃，培养时间：10~12d。
15.诱变育种本实施例利用氦气常压室温等离子体诱变育种技术对分离纯化得到的红色红曲霉菌进行诱变处理获得突变株。具体实施方法如下：用接种棒挑2环分离纯化后红色红曲霉菌的菌苔转接于pd培养基中，转速220r/min，30℃~32℃震荡培养1~2h，过滤除去菌丝，制成孢子悬液，稀释至浓度为105~106个/ml备用；移液枪移取10ul孢子悬液均匀涂抹在无菌金属垫片上，并置于无菌平皿内，后置于artp诱变机中，处理距离设置为2mm，工作气流量设置为10l/min，入射功率为100w，诱变时间设置为0s、30s、60s、90s、120s、150s；诱变处理结束后，将金属垫片放入无菌水中震荡1min，洗下诱变后的孢子，将诱变后的孢子液稀释，然后涂平板，平板倒置培养，培养温度为30℃，培养时间为3~5d。
16.高汀红曲霉菌的筛选本实施例是经过形态学初筛、抑菌圈复筛、洛伐他汀检测验证，获得表现良好的优化菌株，最后传代培养，筛选出可以稳定遗传的最优突变菌株，现保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号是：cgmcc no.20278。具体实施方法如下：初筛：选取孢子长势快、孢子分布面积大、表面有褶皱和气生菌丝、边缘不光滑、红色素含量高的菌落点接至新的pda平面培养基上进行培养，培养温度：28~30℃，培养时间：10~12d；将粗糙脉孢菌的菌液平铺到新鲜的pda平面培养基上，用打孔器取直径1cm大小的红曲菌饼倒放到含粗糙脉孢菌菌液的pda固体培养基的中央，进行抑菌圈实验，对突变株进行复筛，选择抑菌圈较大的菌株；分别刮取复筛出的突变株接种至摇瓶中，置于转速为200r/min，温度为30~32℃的摇床上培养7~10天，将菌液过滤接种至大米培养基上，30~35℃培养5~7天之后转至25~27℃培养14~19天得到红曲米；红曲米磨粉经甲醇处理后，用hplc测洛伐他汀的含量，选出洛伐他汀含量高的红曲米对应的红色红曲霉菌突变株；选出的高汀突变株传代培养，每一代检测其发酵生产洛伐他汀的能力，最终选出遗传稳定的突变株，其发酵后红曲米中洛伐他汀的产量为14.8~20mg/g，相对于出发菌株提高了2.03~2.74倍。
17.如图1所示，诱变时间为90
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120s时，致死率在80%
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90%，其诱变效果最佳。
18.本实施例利用氦气常压室温等离子体诱变育种技术对红色红曲霉菌进行诱变处理获得突变株，通过生物学菌落形态初筛、抑菌圈法复筛、hplc法验证，选育出一株稳定高产的突变株。该菌株遗传性状稳定，可以生产较高洛伐他汀含量的红曲米，其洛伐他汀的产量为14.8~20mg/g，相对于出发菌株提高了2.03~2.74倍。后经检测发现该菌株的多糖产量为6.4%~6.9%，该菌株发酵生产的红曲米色价可达1200~1600u/g左右。
19.图2左为初始未突变红曲菌株的抑菌圈，图2右为正突变株的抑菌圈，可以看出，正突变株的抑菌圈明显比初始菌株的抑菌圈大，说明诱变之后洛伐他汀的产量提高了。