一种COVID-19假病毒及其制备方法和用途与流程

一种covid
‑
19假病毒及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种covid
‑
19假病毒及其制备方法和用途。


背景技术：

2.covid
‑
19是一种新型的冠状病毒，具有极强的传播能力。covid
‑
19是一种有包膜的单链rna病毒，rna长度达到近30kb，n蛋白（nucleocapsid）外壳的包膜中含有s（spike protein，刺突蛋白）、m（membrane protein，膜蛋白）和e（envelope protein，包膜蛋白）三种蛋白。目前发现的最主要的感染途径是病毒的s蛋白的rbd（receptor binding domain，受体结合区）与细胞膜表面的ace2蛋白结合，导致细胞膜与病毒包膜融合，最终病毒感染宿主细胞。
3.药物治疗和疫苗预防两种途径降低新型冠状病毒的危害。目前已经有超过5款疫苗三期临床结束，已经上市或将要上市，还有更多的疫苗处在临床阶段，中和抗体的新药研究也已经进入临床阶段。而如何评价药物和疫苗的作用，成为接下来研究的重点。
4.疫苗的评价除了临床实验外，如何更好的跟踪接种后中和抗体的产生，是目前亟待解决的问题。疫苗接种后的体外评价主要有三种方式，第一种是对抗真病毒的感染，第二种是拮抗ace2与s蛋白（特别是rbd）的结合，第三种是对抗假病毒的感染。第一种方式是最接近真实的，但是对于实验环境有较高的要求，无法作为普及性检测方法；第二种只是评价了rbd与ace2的结合抑制，对于病毒感染过程中的拮抗无法检测到；而第三种用假病毒的方式克服了前两种的弊端，因为不是真病毒，不具备感染能力，普通实验室即可操作，模拟了病毒感染宿主细胞的过程，比阻断蛋白之间的结合更真实。
5.目前大多数实验室做的假病毒外壳蛋白主要选择s蛋白，s蛋白和ace2结合是感染的必要条件，但是现有技术中忽略了m蛋白和e蛋白的辅助作用。


技术实现要素：

6.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种covid
‑
19假病毒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种covid
‑
19假病毒，所述covid
‑
19假病毒由外壳蛋白质粒与辅助质粒经病毒包装而成，所述外壳蛋白质粒包括表达covid
‑
19 s蛋白的质粒、表达covid
‑
19 m蛋白的质粒和表达covid
‑
19 e蛋白的质粒。
8.本发明还提供所述的covid
‑
19假病毒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将外壳蛋白质粒与辅助质粒混合，转染宿主细胞，转染后收集的细胞上清中即含有假病毒，其中所述外壳蛋白质粒包括表达covid
‑
19 s蛋白的质粒、表达covid
‑
19 m蛋白的质粒和表达covid
‑
19 e蛋白的质粒。
9.本发明还提供所述covid
‑
19假病毒在筛选或评价covid
‑
19预防、治疗药物中的用途。
10.本发明还提供用于筛选或评价covid
‑
19预防、治疗药物的组合物，所述组合物的有效物质包括所述的covid
‑
19假病毒。
11.本发明还提供一种用于体外检测covid
‑
19预防、治疗药物疗效的方法，所述方法包括以下步骤：将所述covid
‑
19假病毒与covid
‑
19的靶标样本、预防或治疗药物共同孵育，孵育结束后检测发光强度。
12.如上所述，本发明的covid
‑
19假病毒及其制备方法和用途，具有以下有益效果：本发明的covid
‑
19假病毒采用三质粒系统包装，以s/m/e蛋白替代表达vsv
‑
g蛋白，比仅含有s蛋白的假病毒感染能力更强、灵敏度更高。而且，covid
‑
19假病毒携带两种荧光报告基团，不同的荧光报告基团可应用于不同的场景，使得covid
‑
19假病毒应用时更简便。
附图说明
13.图1显示为本发明的s/m/e蛋白表达检测图。
14.图2显示为本发明的sme假病毒感染ace2阳性和阴性细胞荧光对比图，左图中白色细胞为绿色荧光阳性细胞。
15.图3显示为本发明的sme假病毒感染ace2+细胞流式结果。
16.图4显示为本发明的sme和s假病毒感染能力比较。
17.图5显示为本发明的sme和s假病毒在评价中和抗体时的比较。
18.图6 显示为本发明的中和抗体da034抑制covid
‑
19假病毒感染。
19.图7 显示为本发明的用假病毒评价疫苗汇总结果。
具体实施方式
20.本发明提供一种covid
‑
19假病毒，所述covid
‑
19假病毒由外壳蛋白质粒与辅助质粒经病毒包装而成，所述外壳蛋白质粒包括表达covid
‑
19 s蛋白的质粒、表达covid
‑
19 m蛋白的质粒和表达covid
‑
19 e蛋白的质粒。
21.所述假病毒是指非病毒rna与病毒的蛋白质外壳包裹成的微生物颗粒。
22.所述covid
‑
19假病毒中covid
‑
19 s蛋白、covid
‑
19 m蛋白或covid
‑
19 e蛋白为完整的蛋白。
23.所述s蛋白、m蛋白或e蛋白选自野生型或突变型。
24.在一种实施方式中，s蛋白选自d614g突变的蛋白，突变后的s蛋白的核苷酸序列如seq id no.4所示。
25.在一种实施方式中，所述m蛋白或e蛋白选自野生型或突变型。
26.在一种实施方式中，所述m蛋白和e蛋白分别融合有不同标签。所述标签例如为有his标签、flag标签。
27.所述辅助质粒为编码gag、pol、rev蛋白的一个或者多个核苷酸序列以及其它必需的病毒包装组件核苷酸序列。
28.所述荧光报告质粒为能表达荧光蛋白或荧光素酶（luciferase）的质粒。
29.在一种实施方式中，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白（gfp或egfp）、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白中的一种或几种。
30.covid
‑
19假病毒因由荧光报告质粒包装而成，因此covid
‑
19假病毒能表达荧光报
告基团。
31.在一种实施方式中，所述荧光报告质粒中包括用于表达egfp和luciferase的基因序列，二者通过2a序列连接。荧光报告基团的氨基酸序列如seq id no.5所示。
32.外壳蛋白质粒以及荧光报告质粒的载体可以选自现有技术中常用的慢病毒载体。所述慢病毒载体可以选自：pcdna3.3、plko.1
‑
puro、plko.1
‑
cmv
‑
tgfp、plko.1
‑
puro
‑
cmv
‑
tgfp、plko.1
‑
cmv
‑
neo、plko.1
‑
neo、plko.1
‑
neo
‑
cmv
ꢀ‑
tgfp、plko.1
‑
puro
‑
cmv
‑
tagcfp、plv、plko.1
‑
puro
‑
cmv
‑
tagyfp、plko.1
ꢀ‑
puro
‑
cmv
‑
tagrfp、plko.1
‑
puro
‑
cmv
‑
tagfp635、plko.1
‑
puro
‑
ubc
‑ꢀ
turbogfp、plko.1
‑
puro
‑
ubc
‑
tagfp635、plko
‑
puro
‑
iptg
‑
1xlaco、plko
‑
puro
‑ꢀ
iptg
‑
3xlaco、plp1、plp2、pentr/u6、plenti6/block
‑
it
‑
dest、plenti6
‑ꢀ
gw/u6
‑
laminshrna、pcdna1.2/v5
‑
gw/lacz、plenti6.2/n
‑
lumio/v5
‑
dest、pgcsil
‑
gfp或plenti6.2/n
‑
lumio/v5
‑
gw/lacz、plv
‑
neo、plv
‑
puro中的任一。
33.本发明的covid
‑
19假病毒用covid
‑
19 s/m/e蛋白代替原先慢病毒包膜的vsvg，同时含有gfp
‑
luciferase双报告基团；covid
‑
19假病毒通过各质粒按照一定比例转染293t细胞后制备得到。covid
‑
19假病毒感染ace2阳性的细胞，被感染的细胞会发出绿色荧光，用荧光素酶底物检测，可以检测到化学发光信号，通过荧光或化学发光的强度反应病毒的感染能力。用中和抗体和已经接种新冠疫苗的志愿者血清阻断病毒的感染，通过荧光或化学发光的减弱程度，反应抗体阻断病毒感染的能力。
34.本发明还提供所述假病毒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将外壳蛋白质粒、荧光报告质粒与辅助质粒混合，转染宿主细胞，转染后收集的细胞上清中即含有假病毒，其中所述外壳蛋白质粒包括表达covid
‑
19 s蛋白的质粒、表达covid
‑
19 m蛋白的质粒和表达covid
‑
19 e蛋白的质粒。
35.转染前，先将表达covid
‑
19 s蛋白的质粒、表达covid
‑
19 m蛋白的质粒和表达covid
‑
19 e蛋白的质粒混合，再将上述混合的质粒与荧光报告质粒、辅助质粒混合。较佳的，表达covid
‑
19 s蛋白的质粒、表达covid
‑
19 m蛋白的质粒和表达covid
‑
19 e蛋白的质粒按照质量比为5:4:1混合。
36.所述宿主细胞可以为生产慢病毒的细胞，例如可以为293t细胞。
37.在一种实施方式中，转染48小时后再收集细胞上清。
38.在一种实施方式中，还可以将收集的细胞上清进行浓缩、纯化。
39.本发明还提供所述假病毒在筛选或评价covid
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19预防、治疗药物中的用途。
40.所述预防药物例如为疫苗。
41.药物评价包括药理毒理学评价、安全性评价等。
42.本发明还提供一种用于筛选或评价covid
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19预防、治疗药物的组合物，所述组合物的有效物质包括所述假病毒。
43.在一种实施方式中，所述组合物中还可以包括溶剂等其他物质。
44.本发明还提供一种用于体外检测covid
‑
19预防、治疗药物疗效的方法，所述方法包括以下步骤：将所述covid
‑
19假病毒与covid
‑
19的靶标样本、预防或治疗药物共同孵育，孵育结束后检测发光强度。
45.所述靶标样本来源于各种分离或获至对象的生物样本。具体的，所述靶标样本包括表达covid
‑
19靶标以下物质：细胞、组织、血液或血液制品、羊水、脐带血、绒毛、脑脊液、
脊髓液中的一种或几种。所述covid
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19靶标例如为ace蛋白。
46.具体的，所述预防或治疗药物选自covid
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19中和抗体、covid
‑
19疫苗等。
47.具体的，孵育结束后，检测covid
‑
19的靶标样本的发光强度，若发光强度较高则表明假病毒与covid
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19的靶标样本结合能力较强，预防或治疗药物的疗效较差；若发光强度较低，则表明假病毒与covid
‑
19的靶标样本结合能力较差，预防或治疗药物的疗效较强。
48.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
49.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
50.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
51.实施例1假病毒相关组分的构建策略和序列信息将s蛋白（氨基酸序列如seq id no.1所示）、m蛋白（氨基酸序列如seq id no.2所示）和e蛋白（氨基酸序列如seq id no.3所示）分别构建到pcdna3.3载体.topo（购自invitrogen，k830001）上分别获得pcdna
‑
s、pcdna
‑
m和pcdna
‑
e质粒，s蛋白包含d614g突变，其余位点参考ncbi报道序列，突变后的s蛋白的核苷酸序列如seq id no.4所示，m蛋白和e蛋白参考ncbi报道序列（m蛋白gene id: 43740571，e蛋白gene id: 43740570），m蛋白和e蛋白在c端分别含有his和flag标签。将egfp和luciferase野生型序列（参考ncbi）用2a sequence串联后构建到慢病毒载体plv（购自英茂盛业，cr2002）上，获得plv
‑
egfp
‑
luc质粒，egfp
‑
2a
‑ꢀ
luciferase串联后的氨基酸序列如seq id no.5所示。
52.所需引物序列如seq id no.6~ seq id no.15，m蛋白的f端引物可简称为mp
‑
f， m蛋白的r端引物可简称为mp
‑
r，e蛋白的f端引物可简称为ep
‑
f，e蛋白的r端引物可简称为ep
‑
r，s蛋白的f端引物可简称为sp
‑
f，s蛋白的r端引物可简称为sp
‑
r，egfp的f端引物可简称为e2al
‑
f，egfp+2a的r端引物可简称为e2al
‑
r1， egfp+2a
‑
luciferase的f端引物可简称为e2al
‑
f1，2a
‑
luciferase的r端引物可简称为e2al
‑
r。
53.实施例2 假病毒制备和质控假病毒制备将构建完成的质粒pcdna
‑
s、pcdna
‑
m和pcdna
‑
e分别按照质量比（5：4：1）混合成s/m/e质粒（或称外壳蛋白质粒），按照pmdlg/prre（购自addgene，12251）：s/m/e质粒：prsv
‑
rev（购自addgene，12253）：plv
‑
egfp
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luc=5：3：2：10的比例转染293t细胞，72h收集细胞上清，
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80℃保存备用。
54.假病毒外壳蛋白表达elisa检测用5μg/ml s蛋白中和抗体（da035，anti
‑
2019
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ncov s
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migg1 neutralizing antibody ，novoprotein）包板，加入制备好的假病毒悬液，37℃孵育1h，pbs清洗后分别加入s配对蛋白抗体（da041，anti
‑
2019
‑
ncov s antibody ，novoprotein）、anti
‑
his
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hrp（购自biolegend，652504）和anti
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flag
‑
hrp（购自genscript，a01428），37℃孵育1h，清洗后s蛋白配对抗体组加入二抗，其余组加tmb显色。elisa检测得结果见图1，elisa的表达检测结果证明sme病毒包装成功。
55.假病毒感染ace2阳性细胞取假病毒20μl，加入在无血清环境下培养的3
×
104个293
‑
ace2细胞（xcc14，novoprotein）和hek 293细胞中，同时加入polyberene（购自sigma，tr
‑
1003 ）增强感染，感染后6h，添加5
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10%血清，感染48h后，荧光显微镜观察，并取细胞上流式细胞仪检测。感染的荧光图见图2，流式结果见图3。sme假病毒外壳能检测到s/m/e蛋白的表达，同时可以感染ace2阳性细胞，说明sme假病毒制备成功。
56.实施例3 s/m/e假病毒与s假病毒的比较将s/m/e质粒更换成pcdna
‑
s，利用与s/m/e假病毒相同的制备方法自主制备s假病毒，两种假病毒分别取5μl和10μl，感染293
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ace2细胞，48h后去细胞上流式细胞仪检测，读取mfi（mean fluorescence intensity，平均荧光强度），进行分析比较，结果见图4，sme假病毒展现出比单纯s假病毒更强的感染能力。
57.取5μl两种假病毒分别感染293
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ace2细胞，同时加入covid
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19中和抗体（da034，novoprotein）10μg/ml，结果见图5，sme假病毒在评价中和抗体时灵敏度更强。
58.实施例4 假病毒的应用用于评价中和抗体取5μl sme假病毒，感染293
‑
ace2细胞，同时加入梯度稀释的中和抗体da034，细胞培养48h后，裂解细胞，加入荧光素酶底物，立即在酶标仪读化学发光数值，数据统计分析得图6。
59.用于疫苗评价取5μl sme假病毒，感染293
‑
ace2细胞，同时加入5μl志愿者血清（分为接种疫苗和未接种疫苗的志愿者，志愿者来自浙江鼎晶，疫苗来自科兴生物），接种疫苗的血清对假病毒感染具有较强的抑制效果，需要多份未接种的志愿者作为阴性对照。培养培养48h后，裂解细胞，加入荧光素酶底物，立即在酶标仪读化学发光数值，数据统计分析得图7。
60.以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。