Rassf2调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用

本发明涉及内耳干细胞领域，具体的是rassf2调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用。

背景技术：

听觉是人类最重要的知觉之一，也是语言交流的基础。听觉感知作为语言识别和理解的基础，在人类社会活动起着重要的作用。由于社会经济和工业化的快速发展、人口老龄化不断加剧、耳毒性药物滥用和噪音等环境污染因素，患有不同程度上的耳疾病的人数逐年增长。据who2019年的统计显示全球大约有5％的人口，也就是4.66亿人，患有残疾性听力损失，其中3400万是儿童。

听力损失和耳聋已成为严重威胁人类健康和影响人们的生活质量的全球性问题，其中感音神经性耳聋约占耳聋患者的63％。感音神经性耳聋源于耳蜗前庭蜗神经或中枢听觉系统的异常，其主要特征为耳蜗高频区域听力易损性和外毛细胞损伤。目前治疗感音神经性耳聋的方法主要有人工耳蜗、小分子药物以及干细胞治疗、基因治疗等等，随着对听力受损机制研究的不断深入，越来越多的研究显示干细胞移植治疗感应神经性耳聋具有潜在的可行性。干细胞是具有自我更新、高度增值和多向分化潜能的细胞群体，其可以根据周围的环境而分化为组织特异性细胞。通过向受体组织植入干细胞或激活内源性干细胞可以修复或替代受损或退行性的受体组织，另一方面，干细胞还可以作为治疗基因载体细胞应用于基因治疗。如何调控干细胞再生毛细胞对于治疗感音神经性耳聋具有重大意义。目前医疗手段主要是通过人工耳蜗辅助患者恢复一定的听觉功能，但这也只是治标不治本，此外人工耳蜗植入效果因人而异，但只有部分人可以达到或者接近正常人听力水平。因此如何使内耳毛细胞在损伤和丢失后修复和再生，是近年来听觉领域研究的重点。

hedgehog通路是高度保守的信号通路，在内耳发育的早期阶段起着至关重要的作用，包括祖细胞的增殖及其随后的细胞命运确定和分化。大多数脊椎动物物种具有三个hedgehog基因(sonichedgehog(shh)，indianhedgehog(ihh)和deserthedgehog(dhh)。形态发生子shh由脊索和底板分泌，在神经管和近轴结构的背/腹轴构图中起重要作用。在缺乏shh功能的小鼠胚胎中，耳蜗和听神经节细胞无法发育，这表明shh对腹侧内耳结构的发育至关重要。

rassf2(ras关联域家族成员2)是一个ras家族成员之一。rassf家族(ras相关区域家族)，由rassf1—rassf10十个成员组成，他们都包含着一个特色ras相关区域(ra域)，rassf2可以通过ras效应域以gtp依赖的方式直接与k-ras结合。因此，rassf2显示了ras效应子的基本特征。rassf2与ras的相互作用似乎是针对k-ras的，因为与h-ras只能检测到微弱的相互作用。过表达rassf2抑制肺肿瘤细胞生长，而不是促进转化。激活的k-ras可增强rassf2介导的生长抑制，似乎涉及细胞凋亡和细胞周期阻滞。rassf2蛋白在一系列人肺肿瘤细胞系中的表达分析显示，该蛋白经常下调。rassf2蛋白结构中除了含有rassf家族成员共同的ra结构域外，还有sarah结构域，这一结构域使得rassf2能够调控hippo通路中的mst1和mst2的活性和稳定性。mst1和mst2具有抑制细胞过生长和促凋亡功能。ras蛋白通过与各种效应蛋白相互作用来调节广泛的生物学过程。尽管激活形式的ras通常与肿瘤发生有关，但它们也可能引起生长拮抗作用。这些包括衰老，细胞周期停滞，分化和凋亡。这些抑制生长活动的基础机制了解得很少。因此通过抑制rassf2的表达，可能解除细胞周期停滞，促进分化和增殖。本发明则通过调控rassf2与hippo通路协调促进毛细胞再生，从而为治疗感音神经性耳聋提供分子机制的依据。

现有技术中存在的缺点：

1：内耳干细胞很难获取，分选的效率低：因为小鼠耳蜗干细胞主要存在于毛细胞下面的支持细胞中，但并不是所有的支持细胞都是干细胞，只有部分可以具有再生或者分化为毛细胞的潜能。因此精确并高效的分离获得内耳干细胞是目前的难题。目前单纯的调控wnt或者notch通路存在毛细胞分化率低，且对内耳毛细胞再生的调控基因bhlh、atoh及egf等已经有了大量研究，但是其他分子机制并不完善。

2：目前研究领域中，针对shh或hippo和rassf2在听觉领域相关作用的研究基础很少，因此相应的专用试剂和药物缺乏。

3：目前临床上常用的人工耳蜗(cochlearimplant，ci)是目前耳聋的人听力恢复的主要神经修复治疗方法，它通过直接刺激螺旋神经节神经元来起作用。但由于内耳感觉细胞或螺旋神经节神经元(sgn)中的任一细胞的丢失或受损，或两者同时受损，导致感音神经性听力损失(snhl)的完全恢复仍相当有限，这也是限制了大多数听力受损患者的康复的原因，所以其效果完全依赖于残存毛细胞的数量和质量，治标不治本。

技术实现要素：

为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供rassf2调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用，解决了内耳干细胞难获取、分选效率低的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

rassf2调控内耳干细胞增殖分化方法，包括以下步骤：

一、在野生型小鼠中检测shh或hippo和rassf2在耳蜗中的表达情况；

二、在离体实验中研究shh或hippo和rassf2对流式分选出的内耳干细胞增殖分化的作用；

三、在活体毛细胞新霉素损伤模型上，研究shh或hippo和rassf2的作用。

进一步地，所述步骤一的检测方法为：使用rt-pcr、westernblotting、immunohistochemistry技术方法，在基因和蛋白水平定性定量的检测shh或hippo和rassf2的表达。

进一步地，所述步骤二的研究方法为：解剖出lgr5-egfp-creert2小鼠耳蜗，制成单细胞悬液后经流式细胞仪筛选出lgr5阳性内耳干细胞，在筛选的内耳干细胞中应用小分子或者构建shh或hippo和rassf2的敲减或过表达病毒，调控shh或hippo和rassf2的活性，从而调节内耳干细胞的增殖与分化，促进毛细胞再生。

进一步地，所述步骤三的研究方法为：通过筛选的小分子或者构建shh和rassf2敲减或过表达病毒，在体外培养的耳蜗组织胞中调控shh或hippo和rassf2的活性，从而促进损伤的耳蜗组织中毛细胞的再生。

rassf2在毛细胞再生中的应用，包括所述的rassf2，将rassf2应用在毛细胞再生中。

本发明的有益效果：

本发明使用lgr5-egfp-creert2工具鼠可使得内耳干细胞(lgr5阳性细胞)的分离准确且大量，可达到较好的研究前提：分选出的小鼠lgr5阳性内耳干细胞。此外，在离体实验中研究shh、hippo和rassf2对分选出的内耳干细胞进行成球和分化实验后，可以深入探究shh、hippo和rassf2在调控内耳干细胞增殖分化及毛细胞再生中的具体作用机制。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是本发明shh信号在体外增强了内耳祖细胞的毛细胞(hc)分化示意图；

图2是本发明未经新霉素治疗，shh信号的激活没有触发支持细胞增殖或新的hc形成示意图；

图3是本发明敲除rassf2抑制lgr5阳性细胞的增殖示意图；

图4是本发明敲除rassf2抑制lgr5阳性细胞的分化示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明从shh、hippo和rassf2调控方面着手研究其对内耳毛细胞再生的作用：首先，从lgr5-egfp-creert2小鼠耳蜗基底膜消化制成的单细胞悬液中，利用流式细胞仪分选出lgr5阳性内耳干细胞进行培养，再通过细胞转染技术上调或者下调细胞中shh和rassf2的表达水平，最后在小鼠活体毛细胞新霉素损伤模型中，通过病毒感染的方式调控组织中shh和rassf2的表达水平，研究shh和rassf2调控毛细胞再生的作用及其机制。

调控内耳干细胞增殖分化的shh和rassf2在毛细胞再生中的应用具体研究内容包括以几个方面：

一、在野生型小鼠中检测shh或hippo和rassf2在耳蜗中的表达情况

实验内容：

1、rt-pcr检测：

取15～20只p3的野生型小鼠，取出耳蜗基底膜，使用trizol法提取总rna；以提取的rna作为模板，加入oligo(dt)及逆转录酶等组分，进行逆转录反应，使用特异性引物进行pcr反应，扩增目的条带。通过琼脂糖凝胶电泳，鉴定shh或hippo和rassf2在小鼠耳蜗中的表达情况；

2、westernblotting检测：

取15～20只p3的野生型小鼠，取出耳蜗基底膜，加入适量的蛋白裂解液及相应的蛋白酶抑制剂，在冰上充分研磨，以保证蛋白充分释放，离心后弃去未充分裂解的组织碎片，加入sds并煮沸使蛋白变性；使用shh或hippo和rassf2特异性抗体，进行westernblotting实验，鉴定shh和rassf2在小鼠耳蜗中的表达情况；

3、immunohistochemistry检测：

取2～3只p3的野生型小鼠，取出完整的耳蜗基底膜，按照其原有的形态铺在包被有cell-tak的玻片上；加入4％pfa溶液，于室温下进行固定1h后，用含0.1％tritonx-100的pbs溶液洗涤数遍，再用封闭液于室温下封闭1h；使用shh或hippo和rassf2特异性抗体及相应的二抗进行孵育，洗涤后加入抗荧光猝灭封片液，进行封片。在激光共聚焦显微镜下进行观察，鉴定shh或hippo和rassf2蛋白在小鼠耳蜗中的表达情况。

二、在离体实验中研究shh或hippo和rassf2对流式分选出的内耳干细胞增殖分化的调控机制

实验内容：

1、成球实验(sphereassay)：

在lgr5-egfp-creert2小鼠耳蜗中分选出lgr5阳性内耳干细胞，并进行培养，然后用shh和rassf2的sirna转染细胞，使细胞内的shh或hippo和rassf2表达受到抑制。在培养的第2、3、4天的培养液中加入edu来检测lgr5阳性内耳干细胞的增殖情况，同时，通过细胞成球实验、传代实验，观察shh或hippo和rassf2敲降后对细胞成球能力及其传代能力的影响。在lgr5-egfp-creert2小鼠耳蜗中分选出lgr5阳性内耳干细胞，并进行培养，然后用质粒来转染细胞，使细胞过表达shh或hippo和rassf2。在培养的第2、3、4天的培养液中加入edu来检测lgr5阳性内耳干细胞的增殖情况，同时，通过细胞成球实验、传代实验，观察shh或hippo和rassf2过表达后对细胞成球能力及其传代能力的影响；

2、分化实验(differentiationassay)：

在lgr5-egfp-creert2小鼠耳蜗中分选出lgr5阳性内耳干细胞，并进行培养，然后用shh或hippo和rassf2的sirna转染细胞，使细胞内的shh和rassf2的表达受到抑制。在培养的第2、3、4天的培养液中加入edu来检测lgr5阳性内耳干细胞的增殖情况，同时，通过分化实验，观察shh和rassf2敲降后，毛细胞数目、细胞球数目、edu+/myo7a+毛细胞数目有何变化。在lgr5-egfp-creert2小鼠耳蜗中分选出lgr5阳性内耳干细胞，并进行培养，然后用质粒来转染细胞，使细胞过表达shh或hippo和rassf2。在培养的第2、3、4天的培养液中加入edu来检测lgr5阳性内耳干细胞的增殖情况，同时，通过分化实验，观察shh或hippo和rassf2过表达后，毛细胞数目、细胞球数目、edu+/myo7a+毛细胞数目有何变化。图1所示为shh信号在体外增强了内耳祖细胞的毛细胞(hc)分化。

三、在活体毛细胞新霉素损伤模型中研究shh和rassf2如何调控内耳干细胞，从而促进毛细胞再生

实验内容：

1、取2～3只p3的野生型小鼠，在解剖镜下进行解剖，取出完整的耳蜗基底膜进行培养，同时在培养液中加入适量的新霉素，特异性的损伤毛细胞；

2、在培养液中加入诱导或抑制shh或hippo和rassf2的表达的病毒载体，感染耳蜗组织后使耳蜗细胞上调或下调shh或hippo和rassf2的表达。(注：此处可基于以上两部分步骤1和步骤2的实验结果，选择诱导或抑制shh或hippo和rassf2表达的病毒载体进行实验)

3、在培养的第2、3、4天的培养液中加入edu来检测lgr5阳性内耳干细胞的增殖情况，并通过myo7a染色来观察毛细胞的再生情况。

如图2所示为未经新霉素治疗，shh信号的激活没有触发支持细胞增殖或新的hc形成。图3所示为敲除rassf2抑制lgr5阳性细胞的增殖示意图，图4所示为敲除rassf2抑制lgr5阳性细胞的分化示意图。

综上，本发明的方案可以概括如下：

一：在野生型小鼠耳蜗中检测shh或hippo和rassf2的表达：使用rt-pcr、westernblotting、immunohistochemistry技术方法，在基因和蛋白水平定性定量的检测shh和rassf2的表达；

二：在流式分选出的lgr5阳性内耳干细胞中shh或hippo和rassf2的作用：解剖出lgr5-egfp-creert2小鼠耳蜗，制成单细胞悬液后经流式细胞仪筛选出lgr5阳性内耳干细胞，在筛选的内耳干细胞中应用小分子或者构建shh或hippo和rassf2的敲减或过表达病毒，调控shh或hippo和rassf2的活性，从而调节内耳干细胞的增殖与分化，促进毛细胞再生；

三：在活体毛细胞新霉素损伤模型上，研究shh或hippo和rassf2的作用：通过筛选的一些小分子或者构建shh和rassf2敲减或过表达病毒，在体外培养的耳蜗组织胞中调控shh或hippo和rassf2的活性，从而促进损伤的耳蜗组织中毛细胞的再生。

通过上述技术方案，在体外实现通过小分子和病毒感染技术，促进内耳毛细胞的再生。为临床上由于毛细胞损伤导致的听觉障碍提供新的治疗思路和方法。

本发明使用lgr5-egfp-creert2工具鼠可使得内耳干细胞(lgr5阳性细胞)的分离准确且大量，可达到较好的研究前提：分选出的小鼠lgr5阳性内耳干细胞。此外，在离体实验中研究shh、hippo和rassf2对分选出的内耳干细胞进行成球和分化实验后，可以深入探究shh、hippo和rassf2在调控内耳干细胞增殖/分化及毛细胞再生中的具体作用机制。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。