本发明涉及一种除臭菌剂的制备方法及其应用。
背景技术：
当前，随着国民经济的发展、人民生活水平的不断提高以及城市化进程的快速发展，我国城市生活垃圾产量也呈快速增长的趋势。据统计，我国城市每年的垃圾堆存量就高达60亿吨左右，而且城市生活垃圾产量正以每年8％-10％的速度不断递增。我国总共600多个大中型城市中，已经有超过半数城市陷入垃圾的重围。如果不能将这些垃圾作及时有效地处理。天长日久，势必会对人类赖以生存和发展的生态环境带来难以估计的重大损失，所以城市生活垃圾的处置和利用已经成为当前人们迫切需要解决的环境问题之一。
我国广泛采用卫生填埋法对垃圾进行处理，在相当长的时间内垃圾卫生填埋技术仍将是我国城市生活垃圾处理的主要方式之一。卫生填埋技术由于适用范围广、工艺简单、技术可靠、投资少、管理方便、运行费用低、可回收甲烷气体等一系列优点，因而得到较广泛的应用，是我国和大多数国家主要采用的垃圾处置手段之一。
在垃圾处理各个环节(如压实、平铺、中转等)过程中，垃圾中的有机物在发酵和腐烂过程中所产生的恶臭气体，严重危害着人类赖以生存的生态环境和人类的身体健康。随着国家对环保的重视和大众环保意识的不断增强，人们对所居住的环境质量要求也越来越高，对环境中恶臭物质所带来的污染也更加敏感。恶臭物质不仅使人产生不快和厌恶感，同时许多恶臭物质还危及着人类的身体健康甚至生命，所以国外有些国家很早地就开始了这方面的科学研究。对大气中的恶臭物质实行专项立法，把恶臭物质的污染从气体污染中单独分离出来作为公害的一种。目前，除臭方法主要采用物理方法、化学方法和物化法。如稀释扩散法、掩蔽法、吸收法、氧化法、吸附法、燃烧法等。这些方法各有各的特点，但是也存许多问题。对设备要求高、管理和运行费用高、容易产生二次污染等问题。
技术实现要素：
本发明为了解决目前的除臭技术成本高、容易产生二次污染的问题，而提供了一种复合微生物除臭菌剂的制备方法及其应用。
本发明复合微生物除臭菌剂的制备方法按照以下步骤进行：
一、筛选除臭微生物菌株：养鸡场的鸡粪、圾填埋场渗滤液或垃圾填埋场堆肥成品中进行分离纯化、初筛、复筛，复筛后的菌株进行硫化氢和氨气的去除率的测定，得到n株具有除臭功能的除臭菌株，其中15天后硫化氢的去除率达到83％以上、氨气的去除率达到78％以上的菌株为具有除臭功能的除臭菌株，n株具有除臭功能的除臭菌株中至少包括1株细菌、1株酵母菌和1株除酵母菌以外的其他真菌；
二、除臭复合微生物菌剂的扩大培养：将步骤一得到的n株具有除臭功能的除臭菌株分别进行活化，然后再分别进行发酵培养，分别得到n个菌株的发酵液；
三、制备混合菌剂：将步骤二得到n个菌株的发酵液按照等体积比例进行混合得到混合菌剂；
四、将步骤三的混合菌剂接种于糖蜜培养基中，混合菌剂的接种量为1-3％，在25-30℃条件下培养5-10天，然后调节ph到3.5-4.5，即得到复合微生物除臭菌剂。
上述复合微生物除臭菌剂在除臭中的应用，特别是用于城市生活垃圾填埋场、城市污水处理厂的除臭。
本发明的方法利用养鸡场的鸡粪、圾填埋场渗滤液或垃圾填埋场堆肥成品，本发明从这些废物中获得除臭能力较强的菌株，硫化氢的去除主要是由于硫化细菌将还原态的硫化氢氧化成单质硫或硫酸盐以及多种微生物的协同作用；氨气的去除主要通过亚硝化细菌和硝化细菌的硝化作用将填埋场中的氨转化成为no2-和no3-，从而避免硫化氢和氨气扩散到大气中，本发明的方法，筛选出多个菌株，菌剂中的多个菌株协同作用，极大的增强了除臭能力，对于各种复杂的环境都能达到除臭的效果，应用范围更广。本发明还利用了糖蜜作为混合混合菌剂的培养基，蜜糖是食用糖生产工业的副产物，含有大量的蔗糖，具有产量多、价格低廉、营养丰富、发酵应用广泛等特点，糖蜜含有丰富的可发酵糖、蛋白质、微量元素及无机盐等有利于微生物发酵的成分，可以避免混合菌种扩大培养中加入人工培养基，降低了复合微生物除臭菌剂扩大培养的成本。本发明利用实现了废物利用，成本低，实现了废物的循环利用。本发明的复合微生物除臭菌剂无毒害、无残留、无腐蚀、无刺激性气体产生，不会对环境产生二次污染；用量小，见效快，在短时间内迅速去除臭味，除臭技术成本低，抑制臭气的产生，可广泛应用于城市生活垃圾填埋场、城市污水处理厂等除臭。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式复合微生物除臭菌剂的制备方法按照以下步骤进行：
一、筛选除臭微生物菌株：养鸡场的鸡粪、圾填埋场渗滤液或垃圾填埋场堆肥成品中进行分离纯化、初筛、复筛，复筛后的菌株进行硫化氢和氨气的去除率的测定，得到n株具有除臭功能的除臭菌株，其中15天后硫化氢的去除率达到83％以上、氨气的去除率达到78％以上的菌株为具有除臭功能的除臭菌株，n株具有除臭功能的除臭菌株中至少包括1株细菌、1株酵母菌和1株除酵母菌以外的其他真菌；
二、除臭复合微生物菌剂的扩大培养：将步骤一得到的n株具有除臭功能的除臭菌株分别进行活化，然后再分别进行发酵培养，分别得到n个菌株的发酵液；
三、制备混合菌剂：将步骤二得到n个菌株的发酵液按照等体积比例进行混合得到混合菌剂；
四、将步骤三的混合菌剂接种于糖蜜培养基中，混合菌剂的接种量为1-3％，在25-30℃条件下培养5-10天，然后调节ph到3.5-4.5，即得到复合微生物除臭菌剂。
本实施方式步骤一中的分离纯化：在无菌操作的条件下，利用选择性培养基和稀释平板分离法，从养鸡场的鸡粪、圾填埋场渗滤液或垃圾填埋场堆肥成品中获取单个微生物菌落；单个菌落进行划线分离，直至获得纯培养物。
本实施方式步骤一中的初筛：将获得的纯培养物扩大培养制备成菌液，接种到鸡粪中，经过培养后，分别测定臭味等级，获得具有除臭功能的单个菌株。
本实施方式步骤一中的复筛：将初筛得到的具有除臭功能的单个菌株成发酵液，接种到鸡粪中，利用吸收液定量测定鸡粪中硫化氢、氨气的释放量，确定除臭能力较强的菌株。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中的分离纯化方法是：称取5g养鸡场的鸡粪、圾填埋场渗滤液或垃圾填埋场堆肥成品放入到45ml无菌水中稀释，用选择性培养基和稀释平板分离法对浓度梯度为10-3-10-8样品分别接种，培养得到单个菌落；挑取单个菌落，利用选择性培养基平板划线2～5次，获得纯培养物。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中的初筛的方法是：将分离纯化后得到菌株按照10％的接种量接种到50g鸡粪中进行发酵培养，然后分别在第5、10、15d采用感官测定法评定臭味等级，初筛获得具有除臭功能的单个菌株。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
本实施方式用感官测定法逐一进行初步筛选，臭气等级为：0-无臭气；1-很轻微臭气；2-明显臭气；3-较强臭气；4-强烈臭气；5-很强烈臭气；当初筛菌种臭气等级≤2，初步确定为具有除臭功能的微生物菌株。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中的复筛的方法是：将初筛得到的菌株按照10％的接种量接种到50g鸡粪中进行发酵培养，所得到的发酵液中分别进行15d的硫化氢和氨气的去除率的测定，得到除臭微生物菌株。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
本实施方式硫化氢和氨气的释放量的方法是：待测定的发酵液分别放入3个烧杯中，在第一个1000ml烧杯中，放入1个装有20ml吸收液(0.005mol/l的稀硫酸溶液)的小烧杯，用于吸收释放的氨气；在第二个1000ml烧杯中，放入1个装有20ml吸收液(碱性硫酸隔-聚乙烯醇磷酸铵溶液)的小烧杯，用于吸收释放的硫化氢气体；第三个1000ml烧杯用于感官测定法测定臭气等级，所以不用加入吸收液体(加入等量的无菌水作为对照)，为了保证实验结果的准确性，各类处理做3个平行实验；经过恒温培养后，分别在第15d测定硫化氢和氨气的去除率。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一得到4株具有除臭功能的，除臭菌株分别为细菌2株、酵母菌1株、真菌1株。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中的糖蜜培养基按照重量份数比为5-10份的糖蜜和90-95份水组成。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：具体实施方式一所述的复合微生物除臭菌剂在除臭中的应用。
本实施方式复合微生物除臭菌剂用于城市生活垃圾填埋场、城市污水处理厂的除臭。
实施例1复合微生物除臭菌剂的制备方法按照以下步骤进行：
一、筛选除臭微生物菌株：养鸡场的鸡粪、圾填埋场渗滤液或垃圾填埋场堆肥成品中进行分离纯化、初筛、复筛，测定硫化氢和氨气的去除率，经过15天的培养后，根据复筛结果得到4株具有除臭功能的菌株，其中细菌2株，真菌1株，酵母菌1株，根据硫化氢和氨气的测定结果，15天后2株细菌对硫化氢的去除率分别为：91％、94％；对氨气的去除率分别为：89％、82％，1株真菌对硫化氢和氨气的去除率分别为：84％、79％，1株酵母菌对硫化氢和氨气的去除率分别为：88％、84％；复筛最终得到4株菌株具有较强除臭能力的菌株，其中，两株细菌菌株编号为ba11、ba13；酵母菌1株，编号为ye8；真菌1株，编号为fu10；对2株细菌进行革兰氏染色、形态、生理生化鉴定(采用非发酵细菌生化编码鉴定法)；对酵母菌和真菌进行形态学鉴定；细菌：根据非发酵细菌生化鉴定编码册，鉴定编号为ba11的细菌菌株为假单胞菌属(pseudomonassp.)；编号为ba13的细菌菌株为假单胞菌属(pseudomonassp.)；酵母菌(编号为ye8)：在光学显微镜下观察到该酵母菌菌株的形态：细胞呈椭圆形、圆形、拉长型，无尖顶。根据光学显微镜下观察到的形态特征和《真菌鉴定手册》，鉴定为毕氏酵母属(pichiahansensp.)；真菌(编号为fu10)：光学显微镜下观察到形态，假根发达，分支较多，孢囊梗直立，几乎不弯曲，营养菌丝上产生匍匐枝，匍匐枝的节间形成特有的假根，顶端膨大形成圆形的孢子囊，孢子囊呈球形或近似球状。根据光学显微镜下观察到的形态和《真菌鉴定手册》鉴定为根霉属(rhizopussp.)；
二、除臭复合微生物菌剂的扩大培养：将步骤一得到的四株菌株分别进行活化，然后将细菌菌株ba11和细菌菌株ba13分别接种于细菌液体培养基中、酵母菌ye8接种于酵母菌液体培养基中、真菌fu10接种真菌液体培养基中进行发酵培养，分别得到ba11细菌发酵液、ba13细菌发酵液、ye8酵母菌发酵液和fu10真菌发酵液；
三、制备混合菌剂：将步骤二得到的ba11细菌发酵液、ba13细菌发酵液、ye8酵母菌发酵液和fu10真菌发酵液按照体积比为1:1:1:1的比例混合得到混合菌剂；
四、将步骤三的混合菌剂接种于糖蜜培养基中，糖蜜培养基按照重量份数比为5-10份的糖蜜和90-95份水组成，混合菌剂的接种量为1-3％，在25-30℃条件下培养5-10天，然后调节ph到3.5-4.5，即得到复合微生物除臭菌剂。
本实施例步骤一中的分离纯化：在无菌操作的条件下，利用选择性培养基和稀释平板分离法，从养鸡场的鸡粪、圾填埋场渗滤液或垃圾填埋场堆肥成品中获取单个微生物菌落；单个菌落进行划线分离，直至获得纯培养物；具体的分离纯化方法：称取5g养鸡场的鸡粪、圾填埋场渗滤液或垃圾填埋场堆肥成品放入到45ml无菌水中稀释，稀释到浓度梯度为10-10，用选择性培养基和稀释平板分离法对浓度梯度为10-3-10-8样品分别接种，培养得到单个菌落；挑取单个菌落，利用选择性培养基平板划线3次，获得纯培养物。
本实施例步骤一中的初筛：将获得的纯培养物扩大培养制备成菌液，接种到鸡粪中，经过培养后，分别测定臭味等级，获得具有除臭功能的单个菌株。具体的初筛方法是：将分离纯化后得到菌株按照10％的接种量接种到50g鸡粪中进行发酵培养，然后分别在第5、10、15d采用感官测定法评定臭味等级，初筛获得具有除臭功能的单个菌株。
本实施例步骤一中的复筛：将初筛得到的具有除臭功能的单个菌株成发酵液，接种到鸡粪中，利用吸收液定量测定鸡粪中硫化氢、氨气的释放量，确定除臭能力较强的菌株；具体的复筛方法是：将初筛得到的菌株按照10％的接种量接种到50g鸡粪中进行发酵培养，所得到的发酵液中分别进行5、10、15d的硫化氢和氨气的释放量测定，得到4株除臭微生物菌株，其中硫化氢和氨气的释放量的方法是：待测定的发酵液分别放入3个烧杯中，在第一个1000ml烧杯中，放入1个装有20ml吸收液(0.005mol/l的稀硫酸溶液)的小烧杯，用于吸收释放的氨气；在第二个1000ml烧杯中，放入1个装有20ml吸收液(碱性硫酸隔-聚乙烯醇磷酸铵溶液)的小烧杯，用于吸收释放的硫化氢气体；第三个1000ml烧杯用于感官测定法测定臭气等级，所以不用加入吸收液体(加入等量的无菌水作为对照)，为了保证实验结果的准确性，各类处理做3个平行实验；经过恒温培养后，分别在第5、10、15d测定硫化氢和氨气的去除率，而根据15天的的测定结果，复筛得到4株具有除臭功能的菌株，其中细菌2株，真菌1株，酵母菌1株。
本实施例步骤二中的细菌液体培养基按照重量份数由3.0份的牛肉膏、10份的蛋白胨、5.0份的nacl和1000蒸馏水组成；ph为7.2-7.4。
本实施例步骤二中的酵母菌液体培养基按照重量份数由20份的葡萄糖、20份的蛋白胨、10份的酵母膏和1000份的蒸馏水组成。
本实施例步骤二中的的真菌液体培养基组成按照重量份数由2份的nano3、2份的k2hpo4、5份的kcl、0.5份的mgso4.7h2o、0.01份的feso4.7h2o:、30份的蔗糖:30.0g和1000份的蒸馏水组成。
本实施例步骤三中的细菌液体培养基、酵母菌液体培养基和真菌液体培养基的灭菌条件分别是在121℃灭菌30min；发酵培养条件分别为：培养温度30℃，培养时间是48-96h。
实施例2实施例1所述的复合微生物除臭菌剂在除臭中的应用，具体步骤如下：
一、本发明模拟准好氧型生物反应器进行除臭，主体形状为圆柱体，总体高度为1000mm，主要由底部渗滤液收集池和上部垃圾填埋区所组成，内径为300mm。底部渗滤液收集池高250mm，底座支架高250mm，上部的垃圾填埋区高500mm。
二、本次除臭的对象是城市生活垃圾，来自于居民小区垃圾中转站和附近的菜市场。填埋前通过人工筛选方式，对其中较大的石块、砖头、木材、玻璃进行剔除，同时剔除了很难生物降解的大部分塑料袋；主要为植物树叶及厨余垃圾，垃圾组成稳定性好，有机成分含量高。有利于研究生物除臭及臭气变化规律和垃圾稳定化进程。
三、垃圾装填进之前，事先做好装置的清理和洗涤工作。主要检查通风孔、通风管道、水流管道及其阀门是否完好，如有损坏，应及时更换。待检查完毕后，在反应器活动挡板上面铺一个圆形的铁丝网作为格栅，防止堵塞，再铺设一层厚度为30-50mm的小石子(直径以10-20mm为最佳)，该小石子主要对渗滤液中的固体残渣起过滤作用。在小石子的上面进行垃圾填装，为了保证一定的压实度和垃圾成分的均匀性，应每次填装5kg垃圾后分层压实。垃圾填装完毕后，在垃圾体的上方铺设一层厚度为30-50mm的小石子，作为填埋场的覆盖层。装填工作完成以后，将反应器的自然通风管阀门开启，以保证垃圾体内的通风管道与外界的大气连通形成对流，从而达到准好氧的条件。
四、垃圾装填完毕等待2天后，按照投加垃圾总量的1％加入实施例1制备得到的复合微生物除臭菌剂，同时投加纯液体培养基作为对比，投加除臭菌剂及纯培养基15h后采样分析，采用亚甲基蓝分光光度计法测定硫化氢气体，次氯酸-水杨酸分光光度计法测定氨气，除臭效果如表1所示。
实施例3实施例1所述的复合微生物除臭菌剂在除臭中的应用，具体步骤如下：
一、本实施例通过模拟准好氧型生物反应器进行除臭，反应器主体形状为圆柱体，总体高度为1000mm，主要由底部渗滤液收集池和上部垃圾填埋区所组成，内径为300mm。底部渗滤液收集池高250mm，底座支架高250mm，上部的垃圾填埋区高500mm。
二、本实施例所处理的城市生活垃圾来，自于居民小区垃圾中转站和附近的菜市场。填埋前通过人工筛选方式，对其中较大的石块、砖头、木材、玻璃进行剔除，同时剔除了很难生物降解的大部分塑料袋；主要为植物树叶及厨余垃圾，垃圾组成稳定性好，有机成分含量高。有利于研究生物除臭及臭气变化规律和垃圾稳定化进程。
三、垃圾装填之前，事先做好装置的清理和洗涤工作。主要检查通风孔、通风管道、水流管道及其阀门是否完好，如有损坏，应及时更换。待检查完毕后，在反应器活动挡板上面铺一个圆形的铁丝网作为格栅，防止堵塞，再铺设一层厚度为30-50mm的小石子(直径以10-20mm为最佳)，该小石子主要对渗滤液中的固体残渣起过滤作用。在小石子的上面进行垃圾填装，为了保证一定的压实度和垃圾成分的均匀性，应每次填装5kg垃圾后分层压实。垃圾填装完毕后，在垃圾体的上方铺设一层厚度为30-50mm的小石子，作为填埋场的覆盖层。装填工作完成以后，将反应器的自然通风管阀门开启，以保证垃圾体内的通风管道与外界的大气连通形成对流，从而达到准好氧的条件。
四、垃圾装填完毕等待2天后，投加垃圾总量的3％实施例1制备得到的复合微生物除臭菌剂，同时投加纯液体培养基作为对比，投加除臭菌剂及纯培养基15h后采样分析，采用亚甲基蓝分光光度计法测定硫化氢气体，次氯酸-水杨酸分光光度计法测定氨气，除臭效果如表1所示。
实施例4实施例1所述的复合微生物除臭菌剂在除臭中的应用，具体步骤如下：
一、本实施例通过模拟准好氧型生物反应器进行除臭，反应器主体形状为1000mm，主要由底部渗滤液收集池和上部垃圾填埋区所组成，内径为300mm。底部渗滤液收集池高250mm，底座支架高250mm，上部的垃圾填埋区高500mm。
二、本实施例所处理的是城市生活垃圾，来自于居民小区垃圾中转站和附近的菜市场。填埋前通过人工筛选方式，对其中较大的石块、砖头、木材、玻璃进行剔除，同时剔除了很难生物降解的大部分塑料袋；主要为植物树叶及厨余垃圾，垃圾组成稳定性好，有机成分含量高。有利于研究生物除臭及臭气变化规律和垃圾稳定化进程。
三、垃圾装填之前，事先做好装置的清理和洗涤工作。主要检查通风孔、通风管道、水流管道及其阀门是否完好，如有损坏，应及时更换。待检查完毕后，在反应器活动挡板上面铺一个圆形的铁丝网作为格栅，防止堵塞，再铺设一层厚度为30-50mm的小石子(直径以10-20mm为最佳)，该小石子主要对渗滤液中的固体残渣起过滤作用。在小石子的上面进行垃圾填装，为了保证一定的压实度和垃圾成分的均匀性，应每次填装5kg垃圾后分层压实。垃圾填装完毕后，在垃圾体的上方铺设一层厚度为30-50mm的小石子，作为填埋场的覆盖层。装填工作完成以后，将反应器的自然通风管阀门开启，以保证垃圾体内的通风管道与外界的大气连通形成对流，从而达到准好氧的条件。
四、垃圾装填完毕等待2天后，投加垃圾总量的5％实施例1制备得到的复合微生物除臭菌剂，同时投加纯液体培养基作为对比，投加除臭菌剂及纯培养基15h后采样分析，采用亚甲基蓝分光光度计法测定硫化氢气体，次氯酸-水杨酸分光光度计法测定氨气，除臭效果如表1所示。
实施例5实施例1所述的复合微生物除臭菌剂在养鸡场中的应用，具体步骤如下：
一、在某养鸡场设置长×宽×高＝4×3×2m的密封棚2个，在密封鹏中平铺相同质量的鸡粪密封2天后，喷洒鸡粪质量5％的实施例1制备得到的复合微生物除臭菌剂稀释液(5份菌液加95份水稀释液)，同时在另一个密封棚中喷洒相同质量的液体培养基作为对比，喷洒菌剂及培养基12h后采样分析，然后采用亚甲基蓝分光光度计法测定硫化氢气体，次氯酸-水杨酸分光光度计法测定氨气，除臭效果如表1所示。
实施例6实施例1所述的复合微生物除臭菌剂在污水处理厂中的应用，具体步骤如下：
一、在某污水处理厂污泥脱水间设置长×宽×高＝3×2×1m的密封棚2个，在密封鹏中平铺相同质量的存放3天后脱水污泥，喷洒污泥质量5％的实施例1制备得到的复合微生物除臭菌剂稀释液(5份菌液加95份水稀释液)，同时在另一个密封棚中喷洒相同质量的液体培养基作为对比，喷洒菌剂及培养基10h后采样分析，然后采用亚甲基蓝分光光度计法测定硫化氢气体，次氯酸-水杨酸分光光度计法测定氨气，除臭效果如表1所示。
表1复合微生物除臭菌剂除臭效果
从表1的数据可以看出，本发明的复合微生物除臭菌剂用量小，见效快，在短时间内迅速去除臭味，同时抑制臭气的产生，硫化氢的去除主要是由于硫化细菌将还原态的硫化氢氧化成单质硫或硫酸盐以及多种微生物的协同作用；本发明的复合菌剂可以通过亚硝化细菌和硝化细菌的硝化作用将填埋场中的氨转化成为no2-和no3-，实现了氨气的去除，避免硫化氢和氨气扩散到大气中。本发明的菌剂能用于各种复杂的环境，可广泛应用于城市生活垃圾填埋场、城市污水处理厂等除臭。