一种临床血液中快速检测创伤弧菌的方法

本发明属于医疗技术领域，尤其是涉及一种临床血液中快速检测创伤弧菌的方法。

背景技术：

创伤弧菌是一种嗜热嗜盐革兰氏阴性海洋细菌，可在世界各地的人群中引起严重感染，特别是沿海各州和岛屿的人群。许多创伤弧菌感染者需要重症监护或截肢，约五分之一的感染者死亡，有时在患病后一两天内死亡。如果患者不能在三天内接受抗生素治疗，病死率可能是100％。创伤弧菌是最常见的海洋病原体之一，可在牡蛎等海产品中发现，可使人因食用海鲜而感染。美国食品和药物管理局(fda)的一份报告显示，从1992年到2007年，共有459例病例，死亡率为51.7％。在北半球，大多数病例发生在5月至10月的暖水月。更糟糕的是，作为一种嗜热嗜盐细菌，随着全球变暖，其爆发区域正在扩大。鉴于此，迫切需要建立一种快速、准确的检测方法，以更好地控制其传播。

传统的创伤弧菌检测方法是基于生化分析的检测，需要经过长时间的预富集、形态初步鉴定和最后的生化确认。作为临床检测的金标准，这种方法虽然相对准确但太费时费力，通常需要3-4天才能得到最终的结果。考虑到创伤弧菌感染患者只能存活3天，及时诊断是抢救病人的关键，常规方法显然不适合临床样本的诊断。因此，为了减少检测时间，人们做了许多努力。核酸检测技术具有特异性强、分析时间短等特点，似乎更适合于创伤弧菌的快速检测。这其中，pcr已被广泛应用于创伤弧菌的快速检测，具有较高的特异性和敏感性。然而，该方法依赖于精密的热循环仪器和训练有素的人员，限制了其在现场检测场景中的应用。近期有报道称，lamp法对创伤弧菌快速敏感，但反应时间和温度约为1h,63℃。创伤弧菌感染的早期诊断仍需要一个简单、快速、准确的方法。

piepenburg和他的同事于2006年发明了一种新的等温基因扩增策略，重组酶聚合酶扩增(rpa)，并已证明是一种简单、快速、特异、敏感和经济有效的方法来鉴定不同的病原体。rpa是通过重组酶(t4uvsx)-引物复合物驱动的自主循环置换dna合成，从而完成核酸扩增，而不是像常规的pcr那样通过热循环来实现dna的扩增，这就使得pra可以在较低的温度(37～42℃之间)，更短的时间(10～20分钟)内完成核酸扩增。这大大降低了核酸检测系统本身所需的能耗和成本。rpa的扩增产物可以通过获取来自扩增产物的荧光信号来识别，荧光信号与核酸扩增过程同步，这进一步缩短了分析时间，同时也避免了核酸扩增检测中开管带来的污染问题。因此，实时荧光rpa在临床诊断中的优势更为凸显，引起众多研究者的关注。

技术实现要素：

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种检测迅速的临床血液中快速检测创伤弧菌的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种临床血液中快速检测创伤弧菌的方法，包括

在待测菌株dna中的vvha基因保守区域添加上游引物和下游引物以及荧光探针，并实时进行荧光rpa反应。

本发明旨在建立一种基于实时rpa的以vhha基因为靶点的创伤弧菌快速检测方法。在此基础上，对实时rpa法进行了优化，并通过对人工感染的血液样品的检测评价了该方法在实际应用中的重现性。

优选的，所述上游引物为rpa-f1，其中rpa-f1的序列为：cggcaaagtaggtgcggaagtgaacaaaga。

优选的，所述下游引物为rpa-r4，所述rpa-r4的序列为：ctcaatgatgaacggttgttgatgcgatag。

优选的，所述荧光探针为rpa-probe，所述rpa-probe的序列为：tggcgaagtcagtggctcatttacctacaac[fam-dt]a[thf]bc[bhq1-dt]ccgaagaccttggtgtt(c3spacer)d。

优选的，实时荧光rpa反应的反应体系为，在20μl反应体系中，包括11.8μl缓冲液,4.48μl去离子水,上下游引物各0.84μl,1μlmg2+,0.24μl的探针和0.8μl标准质粒。

优选的，实时进行荧光rpa反应的温度为35-40℃。

优选的，实时进行荧光rpa反应的温度为38℃。

优选的，所述荧光rpa反应的反应体系中，所述上下游引物的浓度均为10μm，所述荧光探针的浓度为10μm。

优选的，所述反应体系中，所述标准质粒的制备方法为，将待测菌株dna片段中的vvha基因498bp的片段用上游引物vvha-f和下游引物vvha-r进行扩增。扩增条件为，25μl2×goldstartaqman混合液，每条引物1μl(10μm)，22μlddh2o，2.5μl基因组模板，扩增循环条件为：95℃变性5min，95℃变性30s，52℃30s，72℃45s，共35个循环，72℃延伸7min，经过上述扩增循环反应之后的产物导入至pmd19-t载体中，并对其进行测序，以确定插入靶细胞。

本发明相比较于现有技术，本发明具有极高的特异性和灵敏度以及快捷性，在低至1.2×10²cfu/ml的感染浓度下，实时荧光rpa法可在16min内检测到创伤弧菌，而传统的实时荧光pcr检测需要约45min。并且检测时间随着细胞数量的增加而减少。在较高浓度下(1.2×10⁶cfu/ml)实时荧光rpa法可以在最短3.44min获得阳性结果。同时，我们发明的这种实时rpa方法可以和便携式设备相结合，在创伤弧菌暴发现场的临床诊断中，特别是在资源有限的情况下，将是监测创伤弧菌感染的一种非常有用的方法。

附图说明

图1实时荧光rpa检测弧菌的最佳引物和探针组合分析。用7个候选引物组合和1个探针筛选出最佳组合。ntc代表阴性对照。

图2温度优化实验的荧光曲线。实时荧光rpa分别在37、38、39℃进行。ntc代表阴性对照。

图3.实时荧光rpa特异性检测。1.创伤弧菌atcc27562；2.创伤弧菌hmo2；3.创伤弧菌hmyj；4.河流弧菌lmg7894；5.副溶血弧菌cgmcc1.1997；6.哈维弧菌cgmcc1.1599；7.哈维弧菌nbv269；8.哈维弧菌9-s29；9.鳗利斯顿氏菌atcc19264；10.迟缓爱德华菌atcc15947；11.铜绿假单胞菌cgmcc1.1785；12.大肠杆菌atcc25922；13.大肠杆菌hm7039；14.大肠杆菌hm11022；15.大肠杆菌hm4769；16.单增李斯特氏菌atcc19115；17.鼠伤寒沙门氏菌atcc13311；18.肺炎克雷伯菌atcc33495；19.肺炎克雷伯菌hm7837；20肺炎克雷伯菌hm9872；21.肺炎克雷伯菌hm10474；22.无模板阴性对照。

图4.实时荧光rap检测创伤弧菌的灵敏度分析。a.实时聚合酶链式反应与logdna浓度的平均cq值(n＝3)，r²＝0.9859(线性回归)。b.rpa与logdna浓度实时反应的平均cq值(n＝3)，r²＝0.9227(线性回归)和0.9962(二次多项式回归)。c.与标准质粒对数拷贝数(n＝8)的实时rpa反应的平均cq值，r²＝0.8386(线性回归)和0.9816(二次多项式回归)

图5.使用r.triangle中的“glm”软件包对不同浓度梯度的8次重复测试的数据进行probit回归，计算出95％的阳性检测出的检测限。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

实施例一，一种临床血液中快速检测创伤弧菌的方法包括

步骤一，从待测样品中提取出待测菌株的dna，然后用引物vvha-f和vvha-r对待测菌株dna进行循环扩增，进而可以扩增出待测菌株vvha基因498bp的片段，然后将循环扩增的产物导入至pmd19-t载体中，并通过测序以确定靶基因是否插入,以获得标准质粒。

步骤二，将步骤二中所获得标准质粒进行实时荧光rpa反应，具体的，实时荧光rpa反应的反应体系为，20μl反应体系包括：11.8μl缓冲液,4.48μl去离子水,上下游引物各0.84μl(10μm),1μlmg²⁺,0.24μl的探针(10μm)和0.8μl标准质粒。其中，在该步骤中，上游引物为rpa-f1，下游引物为rpa-r4，探针为rpa-probe。在本实施例中，上游引物选择rpa-f1，下游引物选择rpa-r4，在其余实施例中，进行实时荧光rpa反应的引物可以选择，表2中所示的引物。

进一步的，所述步骤二中，实时荧光rpa反应的反应温度为35-40℃，经优化之后，38℃为最佳反应温度。进而，可以发现实时荧光rpa反应的反应温度，在35-40℃之间均可以进行，所以可以预见，本方法可以运用到手提式的检测设备当中，进而将对创伤弧菌的检测不需要再拘泥于实验室或者需要专业检测环境的条件。

下面结合实际情况，对上述一种临床血液中快速检测创伤弧菌的方法进行验证。

1.材料与方法

1.1菌株与培养条件

本发明中共涉及21菌株包括3株创伤弧菌，5株其他弧菌和其他13个菌株。参考菌株(ref)购买至中国普通微生物菌种保藏管理中心或中国海洋微生物菌种保藏管理中心。其他菌株从临床样本或养殖水体中分离，并经16srrna测序确认。弧菌和鳗利斯顿氏菌用2216e培养基培养，其余菌株培养于lb肉汤培养基中。各种菌株在37℃摇床上过夜培养18h。

表1本研究中涉及到相关菌株

1.2基因组dna抽提与质粒标准品构建

各种菌株基因组dna用专用细菌基因组dna抽提试剂(omegabio-tek,inc.,norcross,美国)提取。用核酸浓度测定仪nanodropnd-1000(thermofisherscientific,waltham,mausa)测量抽提的各种菌株dna数量与质量(a260/a280)。各种菌株dna样品的a260/a280的比值均在1.8–2.0，样品保存-20℃冰箱。

为了获得标准质粒，我们用引物对vvha-f和vvha-r扩增出创伤弧菌vvha基因498bp的片段(genebank登录号：kc821520.1；位置：375-872bp)(表2)。扩增条件为：

25μl2×goldstartaqman混合液，每条引物1μl(10μm)，22μlddh2o，2.5μl基因组模板，扩增循环条件为：95℃变性5min，95℃变性30s，52℃30s，72℃45s，共35个循环，72℃延伸7min。扩增产物被导入pmd19-t载体中，通过测序以确认靶基因是否正确插入。用nanodropnd-1000分光光度计(美国thermoscience)对标准质粒进行定量。质粒拷贝数的计算如前所述。然后将制备的标准质粒从10⁰-10⁶copies/μl连续稀释并保存在-20℃下。

表2本研究中设计的引物与探针

fam-dt,6羧基荧光素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；thf,四氢呋喃间隔；bhq1-dt,淬灭基团.c3-spacer,c3间隔臂修饰的阻断基团

1.3创伤弧菌的实时荧光pcr检测

对于创伤弧菌的实时pcr，参考相关文献并对反应条件做了一些小的改进。简单地说，使用引物p-vvha-f和p-vvha-r(表2)在roche480热循环仪(美国罗氏)上进行实时pcr。反应体系为25μl，该体系含有12.5μl2×sygbgreeni混合液、0.6μl的每个引物(10μm)、2μl的连续稀释的基因组dna(或2μl的无核酸水作为空白对照)。反应条件为：95℃变性10min，然后95℃变性15s，60℃变性90s，共40个循环。

1.4实时荧光rpa检测创伤弧菌的条件优化

在vvha基因保守区域内设计了上下游引物各4条以及1条荧光探针(表2)，由上海生工生物合成有限公司(上海)合成。通过twistampexokit试剂盒筛选出最佳的引物对，以用于后续的反应体系的优化。实时荧光rpa反应条件为：20μl反应体系包括：11.8μl缓冲液,4.48μl去离子水,上下游引物各0.84μl(10μm),1μlmg²⁺,0.24μl的探针(10μm)和0.8μl标准质粒。以去离子水替代dna模板，作为阴性对照组。用罗氏荧光定量pcr仪采集荧光信号，并分别设置37℃,38℃和39℃三个反应温度对实时荧光rpa的反应温度进行筛选。

1.5实时荧光rpa和pcr检测创伤弧菌的特异性和灵敏度的比较分析

为了评价实时荧光rpa检测创伤弧菌的特异性，实时荧光定量rpa分别扩增表1中所罗列的菌株(包含创伤弧菌和其他非创伤弧菌)。为了分析实时荧光rpa的灵敏度，分别制备了创伤弧菌基因组dna和标准质粒的10倍稀释液。以基因组dna含量在10ng～0.1pg范围内为模板，在每次反应中(20μl)建立回归曲线，进行实时荧光定量分析。采用相同系列稀释度的基因组dna进行荧光定量pcr。所有的测试都重复3次进行的。于此同时，以不同浓度梯度的质粒标准品为模板(10⁰-10⁶copies/μl)，进行实时rpa检测，每个浓度梯度8组平行，用以分析。

1.6人工感染创伤弧菌的血浆样品检测

为评价实时荧光rpa法在临床标本中创伤弧菌的检测效果，将实时荧光定量rpa法与实时荧光定量pcr法对人工污染血浆标本的诊断效果进行比较。血浆标本经实时荧光定量pcr检测为阴性后，将制备不同浓度(1.2×10⁰～1.2×106cfu/ml)的创伤弧菌100μl加入的900μl的确认为阴性的血浆样品中，形成不同浓度创伤弧菌感染后的血浆样品。然后使用细菌dna试剂盒(omega,usa)从每个血浆样本中提取dna，并进行后续的实时荧光定量rpa法或实时荧光定量pcr法扩增检测。

1.7统计分析

为了分析灵敏度，对实时荧光rpa法和实时荧光pcr法扩增结果分别进行线性回归。为了进一步提高回归精度，对实时荧光rpa在原本的线性回归的基础上进一步进行了二阶多项式回归。所有回归均在microsoftexcel(microsoft,usa)中进行计算。对以标准质粒中6个浓度梯度所获得的数据使用r.的“glm”软件包进行probit进行回归分析，以获得实时荧光rpa法在检测创伤弧菌时，总体准确度达到95％时所对应的拷贝数。

2.实验结果

2.1实时荧光rpa检测创伤弧菌的引物对和反应条件的确定

筛选了表2中7组引物对和探针的组合。在20分钟中所有的组合程度不同地对反应体系中创伤弧菌的dna均能进行扩增。比较之下，引物组合(rpa-f1/rpa-r4)能在最短的时间内产生最强的荧光信号(图1)。因此，我们选择该引物组进行后续的相关实时荧光rpa的创伤弧菌检测。对于反应温度，我们设置了37℃,38℃和39℃三个反应温度，结果显示相对于37℃和39℃，实时荧光rpa在38℃时有更好的扩增效果(图2)。

2.2实时荧光rpa检测创伤弧菌的特异性分析

利用实时荧光定量rpa分别扩增创伤弧菌和其他细菌的基因组dna。结果如图3所示，未观察到与其他细菌菌株dna的交叉反应。事实上，只有当三种创伤弧菌中的一种被检测时，才会产生阳性信号。这说明我们选择的引物/探针组合是本研究中创伤弧菌的特异性引物/探针组合。

2.3实时荧光rpa检测创伤弧菌的灵敏度分析

我们分别对实时荧光rpa和实时荧光pcr检测不同浓度梯度的创伤弧菌的数据进行了回归分析。结果显示，实时荧光pcr和实时荧光rap检测的对数dna浓度与cq值呈线性相关性，相关系数分别为r²＝0.9859和r²＝0.9227(图4a和图b)。用实时荧光rpa检测10⁶～10¹拷贝/μl的标准质粒，对数拷贝数与cq值呈线性相关性，相关系数r²＝0.8386。为了进一步提高回归精度，对实时rpa进行了二次多项式回归。不出所料，logdna浓度与cq值的相关系数r²提高到0.9962。同样，标准质粒的对数拷贝数与cq值的相关系数r²提高到0.9816。在灵敏度方面，图4生动地显示了实时荧光rpa的最低检测下限与实时荧光pcr反应一致，均达到0.1pg/μl(图4a和图4b)。同时，根据图4c所示结果，标准质粒对实时rpa的灵敏度为10拷贝/μl。利用本研究中不同标准质粒浓度的8次重复实验结果进行概率回归预测显示，实时荧光rpa检测创伤弧菌的lod在95％的情况下标准质粒拷贝浓度约为1.58×10²拷贝(图5)。

2.4对人工感染的血液样品的检测评价分析

为了评价荧光实时rpa检测弧菌在临床中的实际应用，我们人工感染了不同浓度的血液样品，比较了实时rpa法和实时pcr法检测人工感染后的血浆样品的阳性检出结果。结果显示，实时荧光rpa检测结果与实时荧光pcr检测结果一致(表3)。但是，实时rpa在节省时间方面具有压倒性优势。在低至1.2×10²cfu/ml的添加浓度下，实时rpa可在16min内检测到创伤弧菌，而实时荧光pcr检测需要约45min。检测时间随着细胞数量的增加而减少。在较高浓度下实时荧光rpa法可以在最短3.44min获得阳性结果(表3)。这些结果有力地说明了实时rpa技术具有快速、灵敏的显著优势。

表3.实时荧光rpa和实时pcr检测人工感染样品的比较。

总体而言，本发明是一种基于荧光实时rpa技术快速检出临床血浆样品中创伤弧菌的方法。该方法具有极高的特异性和灵敏度以及快捷性，在低至1.2×10²cfu/ml的感染浓度下，本实时荧光rpa法可在16min内检测到创伤弧菌，而传统的实时荧光pcr检测需要约45min。并且检测时间随着细胞数量的增加而减少。在较高浓度下(1.2×10⁶cfu/ml)实时荧光rpa法可以在最短3.44min获得阳性结果。同时，我们发明的这种实时rpa方法可以和便携式设备相结合，在创伤弧菌暴发现场的临床诊断中，特别是在资源有限的情况下，将是监测创伤弧菌感染的一种非常有用的方法。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。