一株降解黄曲霉毒素B1的菌株S262及其应用

一株降解黄曲霉毒素b1的菌株s262及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一株降解黄曲霉毒素b1的菌株s262及其应用。


背景技术：

2.黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉(aspergillus flavus)和寄生曲霉(aspergillus parasiticus)产生的次级代谢产物。其中，黄曲霉毒素b1(afb1)毒性最强，具有致癌、致畸和引起肝脏损伤的作用。黄曲霉对农作物如玉米、花生、小麦等具有很强的侵染性，可发生在作物生长、收获及其籽粒储藏、运输等过程。这些被黄曲霉侵染的作物如被加工成动物饲料，毒素不仅很难被消除，反而会被放大，甚至进一步对动物及其产品造成二次污染。因此，黄曲霉毒素b1在饲料中广泛存在。鉴于毒素的广泛存在，如何快速高效的进行毒素降解是当前乃至今后相当时间内研究的热点。目前，黄曲霉毒素的降解主要采取物理化学手段，如臭氧处理、物理吸附、强碱处理等。但采用理化法脱毒，不论是单独使用或者联合使用都难以达到预期的安全、高效、低成本和不破坏营养成分等效果。生物法脱除毒素具备高效、清洁、低成本、稳定、作用范围广泛、解毒彻底等优点，表现出独有的优势和广阔的研究前景。
3.目前报道的生物脱除毒素的机理主要包括生物吸附和生物降解两类。酵母细胞壁中β
‑
葡聚糖在吸附作用中扮演着重要的角色，细胞壁中的糖蛋白也可能参与了毒素的吸附。亦有研究表明：鼠李糖乳杆菌、乳酸菌细胞、热致死的乳酸菌及乳酸菌的细胞壁均可吸附黄曲霉毒素。但这些吸附作用多数不稳定，存在可逆反应，无法彻底消除afb1。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了一株降解黄曲霉毒素b1的菌株s262，该菌株对黄曲霉毒素b1的降解活性强，适应性强，降解温度范围大，应用范围广。
5.本发明提供了一株降解黄曲霉毒素b1的菌株s262，所述菌株s262的保藏日期为2020年10月19日，保藏编号为cgmcc no.20913，该菌株分类命名为索诺拉沙漠芽孢杆菌(bacillus sonorensis)。
6.本发明还提供了上述菌株s262在降解黄曲霉毒素b1中的应用。
7.本发明还提供了由上述菌株s262制备的发酵液。
8.本发明还提供了所述发酵液在降解黄曲霉毒素b1中的应用。
9.本发明还提供了所述菌株s262制备的用于降解黄曲霉毒素b1的降解活性物质。
10.本发明还提供了所述降解活性物质的制备方法，包括如下步骤：
11.首先将菌株s262于nb斜面培养基中活化，然后转接于nb液体种子培养基，36
‑
38℃、160
‑
200r/min摇床培养22
‑
26h，制成种子液，以4.5
‑
5.5％的接种量转接到100ml nb培养基中，36
‑
38℃、160
‑
200r/min继续培养46
‑
50h获得发酵液，发酵液通过冷冻真空干燥可制成粉状浓缩物，即为降解活性物质。
12.优选的，制备所述种子液的培养条件为37℃、180r/min摇床培养24h。
13.优选的，所述种子液的接种量为体积分数5％。
14.优选的，制备所述发酵液的培养条件为37℃、180r/min摇床培养48h。
15.本发明还提供了所述降解活性物质在制备降解黄曲霉毒素b1降解制剂中的应用。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
17.1、本发明分离获得的菌株s262对黄曲霉毒素b1的降解活性强，适应性强，降解温度范围大，应用范围广。
18.2、本发明分离获得的菌株s262发酵液在37℃下对黄曲霉毒素b1的降解率最高可达92.85％，在60
‑
80℃之间，菌株s262发酵液对黄曲霉毒素b1的降解率最高可达100％。
19.3、本发明分离获得的菌株s262制得的降解活性物质加热处理，几乎不影响其降解效果，热稳定性强。
20.生物材料保藏信息说明
21.s262，在本技术中称作s262，已于2020年10月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.20913，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，该菌株分类命名为索诺拉沙漠芽孢杆菌(bacillus sonorensis)。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为本发明中菌株s262的显微形态图；
24.图2为本发明中菌株s262在37℃、60℃、70℃、80℃条件下对afb1的降解效果图；
25.图3为本发明中空白对照1黄曲霉毒素b1的hplc图；
26.图4为本发明中80℃、24h发酵液降解黄曲霉毒素b1的hplc图；
27.图5为本发明中降解活性物质的稳定性示意图。
具体实施方式
28.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
29.本发明提供了一种玉米根际促生菌在促进植株生长中的应用。
30.具体实施例如下：
31.实施例1
32.一、供试材料和方法
33.1、菌株分离
34.从河南省济源市的瑞康养猪场的猪粪便样品中分离到一株黄曲霉毒素b1具有降
解作用的细菌s262，所采用培养基为香豆素培养基；
35.香豆素培养基配方(g/l)：香豆素1g，(nh4)2so
4 0.5g，kh2po
4 0.25g，cacl
·
2h2o 0.05g，mgso4·
7h2o 0.25g，kno
3 0.5g，琼脂20g。
36.根据菌株的细胞形态、生理生化特征、16s rrna基因序列等实验数据综合分析，所述菌株s262鉴定为索诺拉沙漠芽孢杆菌(bacillus sonorensis)。
37.2、菌株s262对黄曲霉毒素b1(afb1)降解实验研究
38.(1)菌株培养
39.将菌株s262培养于nb斜面培养基中，4℃冷藏保存备用。
40.(2)种子培养
41.将菌株s262转接于nb液体种子培养基，37℃、180r/min摇床培养24h，制成种子液。
42.(3)发酵培养
43.以5％的接种量转接到100ml nb培养基中，37℃、180r/min继续培养48h，取培养液于4℃条件下10000r/min离心10min，分离得到发酵液和菌体；
44.所述nb培养基配方为：每100ml培养基中，蛋白胨1g、牛肉膏0.3g、nacl 1g，ph自然。
45.(4)黄曲霉毒素b1的降解实验
46.在900μl发酵液加入afb1标品，使其质量浓度为1μg/ml。将样品放置于黑暗处37℃、60℃、70℃、80℃、180r/min振荡反应6
‑
96h后，用hplc检测各组分对afb1降解率，每组设置3个平行。发酵液组的空白对照组为无菌nb液体培养基。反应结束后用1.0ml二氯甲烷将细胞重复萃取3次，混合萃取液，在50℃水浴下氮气吹干，用1ml甲醇溶解残留，经0.22μm滤膜过滤，并用hplc检测afb1降解率。
47.降解率＝(1
‑
样品中afb1峰面积/空白对照afb1的峰面积)
×
100％
48.(5)转化效率的hplc检测
49.检测仪：岛津lc
‑
2030c；色谱柱：agilentzorbax
‑
sb
‑
c18(4.6mm
×
250mm，粒径5μm)
50.检测条件：柱温32℃；发酵液进样量10μl；流动相为甲醇∶水(60∶40，v/v)；流速0.8ml/min；运行时间11min；紫外检测器波长：365nm；进样量10μl。
51.37℃下afb1的降解效果较60℃、70℃、80℃下的降解效果低，具体如表1所示。
52.表1 37℃下不同时间afb1的降解效果
[0053][0054]
如表1和图1所示，在37℃下，本发明获得的菌株s262对于黄曲霉毒素b1的降解率在45.5％
‑
92.85％之间；
[0055]
如图2所示，在60℃、70℃、80℃，菌株s262发酵液对黄曲霉毒素b1的降解率最高均可达100％。
[0056]
(6)降解活性物质的保存
[0057]
发酵液通过冷冻真空干燥可制成粉状浓缩物保存，即为降解活性物质，使用时用去离子水溶解即可。
[0058]
(7)降解活性物质的稳定性分析
[0059]
取900μl上清液在沸水中反应15min；取800μl上清液，加入100μl(10mg/ml)蛋白酶k，37℃处理6h；sds组：取800μl上清液，加入100μl(10％)sds，37℃处理6h；上述两组蛋白酶k和sds的质量浓度均为1mg/ml。之后分别加入100μl(10μg/ml)afb1标准溶液，置于灭菌的离心管中。37℃、180r/min振荡反应96h，hplc检测上述样品中afb1的含量，每组设置3个平行，空白对照组为无菌nb液体培养基。
[0060]
结果表明降解活性物质经过上述处理后仍能保留较强的降解效果，尤其是加热处理，几乎不影响其降解效果。
[0061]
综上所述，本发明分离获得一株细菌s262，对黄曲霉毒素b1具有高效的降解作用，菌株s262发酵液在37℃下对于黄曲霉毒素b1的降解率最高达到92.85％，在高温(60
‑
80℃)下其降解率可达100％。该菌株培养离心后即得到发酵液，发酵液冷冻干燥物可作为降解活性物质降解效果好，热稳定性强。
[0062]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0063]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。