促进心脏损伤后修复的一类新型成纤维细胞及其标识方法

1.本发明属于细胞生物学技术领域，涉及促进心脏损伤后修复的一类新型成纤维细胞及其标识方法。


背景技术：

2.心肌成纤维细胞(cf)在与不同类型的纤维化相关的心室重构过程中发挥核心作用。目前，farbehi，patrick等人运用单细胞rna
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seq技术已经发现了心肌梗死小鼠心肌组织中诸多细胞亚群(farbehi n,patrick r,dorison a,xaymardan m,janbandhu v,wystub
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lis k,ho jw,nordon re,harvey rp.single
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cell expression profiling reveals dynamic flux of cardiac stromal,vascular and immune cells in health and injury.elife.2019；8:e43882.)。最近的研究表明，成纤维细胞对心脏损伤的反应并不均匀。由于真实成纤维细胞标记物是有限的，成纤维细胞群体异质性对心脏损伤的反应仍缺乏恰当的表征。


技术实现要素：

3.针对以上问题，本发明的目的在于提供促进心脏损伤后修复的一类新型成纤维细胞及其标识方法，运用单细胞atac
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seq技术，通过高通量测序的染色质开放性研究，探索小鼠心肌梗死疾病模型中表观遗传和基因调控方面的差异变化。
4.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
5.促进心脏损伤后修复的一类新型成纤维细胞的标识方法，包括：
6.1)构建小鼠心肌梗死疾病模型；
7.2)采集组织样本进行单细胞atac
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seq及后续数据的处理、校准和聚类分析得出差异表达的转录因子；
8.3)免疫荧光定位两组小鼠心脏组织中特异表达的蛋白或新型的成纤维细胞。
9.优选地，步骤1)中，选取spf级8
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10周龄c57bl/6j雄性黑鼠用于构建小鼠心肌梗死疾病模型。
10.优选地，步骤2)包括基于染色质开放性富集峰或富集基序的细胞群聚类分析以及gata5的足迹分析。
11.优选地，步骤3)包括：冰冻组织切片用4％多聚甲醛固定10min，0.3％triton x
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100渗透10min，10％山羊血清封闭1h，cola1和gata5两个非同一种属来源的一抗同时4℃孵育过夜；玻片用0.3％tween 20洗涤3次，相应的二抗goat anti
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rabbit igg h&l和goat anti
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mouse igg h&l在室温下孵育1h；用0.3％tween 20洗涤3次后，将isl1直标一抗在室温下孵育1h。
12.本发明还提供了通过上述标识方法获得的成纤维细胞，其亚群表达成纤维细胞特征性基因col1a1，同时还表达gata5和isl1。
13.本发明的有益效果如下：
14.(1)通过构建小鼠心肌梗死疾病模型，在心肌梗死组和假手术组左心室组织的单细胞atac
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seq的结果中显示，除了检测到farbehi，patrick等人通过scrna
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seq发现的大部分成纤维细胞亚群，我们也发现了一个未报道过的成纤维细胞亚群；该亚群表达成纤维细胞特征性基因如col1a1，同时还表达gata5和isl1，两者已被证明与心脏祖细胞的分化与识别相关，我们推测此类成纤维细胞与心肌梗死所致心脏损伤后的修复相关。
15.(2)基于染色质开放性富集峰或富集基序的细胞群聚类分析表明，新型成纤维细胞同时具有心肌细胞和成纤维细胞的特征。
16.(3)gata5的足迹分析表明，gata5在新型成纤维细胞和心肌细胞中的结合上调。
17.本发明发现了心肌梗死疾病模型中的新型成纤维细胞，它同时具有心肌细胞和成纤维细胞的特征，这对于我们研究其在病理过程中发挥的对心脏修复作用具有深远的意义。
附图说明
18.图1显示本发明心肌梗死组和假手术组左心室组织的单细胞atac
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seq结果。
19.图2a browser track显示不同细胞群中gata5的scatac
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seq信号，图2bbrowser track显示不同细胞群中isl1的scatac
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seq信号。
20.图3uamp结果显示gata5+成纤维细胞亚群同时表达成纤维细胞和心肌细胞标记基因。
21.图4显示gata5+成纤维细胞亚群标记基因的go分析。
22.图5显示用col1a1标记心肌组织中的成纤维细胞，同时定位表达gata5的细胞。
23.图6显示用col1a1标记心肌组织中的成纤维细胞，同时定位表达gata5和isl1的细胞。
具体实施方式
24.为了更清楚地说明本发明的技术方案，通过以下实施例对本发明作进一步的描述，以便本领域的技术人员进一步本发明，但以下实施例不对本发明构成任何形式限制。
25.如未有特殊说明，本申请采用的材料均为现有的材料，可从市面上直接购买得到，所采用的方法亦可通过常规技术手段实现。
26.实施例
27.本实施例的实现过程如下：
28.1、建立小鼠心肌梗死疾病模型
29.选取spf级8
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10周龄c57bl/6j雄性黑鼠6只，随机分为心肌梗死组(n＝3)和假手术组(n＝3)。术前备皮、术中吸入异氟烷，于剑突左侧作平行于肋弓的2cm的斜行切口，左手拇指将心脏轻轻推向小鼠右侧，同时左手食指和中指向左固定心脏，用弯头止血钳向第四五肋间稍用力，弯头止血钳进入心腔的同时左手食指和中指向左下挤压心脏，使心尖部分暴露体外，找到左心耳向心尖的延续线与心脏中下1/3的交界处即左前降支所在的大致位置，用6
‑
0丝线进针，进针厚度2
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3mm，而后结扎。待充分排空胸腔气体后缝合小鼠皮肤切口，将小鼠置于恒温台上直至苏醒。除了不结扎，假手术组与心肌梗死组同样的操作。于左前降支结扎术后14天将小鼠处以安乐死，心肌梗死组取左心室梗死区组织，假手术组取左心室组
20清洗切片3次。在室温下放置5min后，将玻片放入4℃的冰箱中，直到在激光共聚焦显微镜下观察。免疫荧光结果如图5图6所示。
39.图5中，用col1a1标记心肌组织中的成纤维细胞，定位同时表达gata5的细胞即为新型成纤维细胞。图6中，用col1a1标记心肌组织中的成纤维细胞，定位同时表达gata5和isl1的细胞即为新型成纤维细胞。