一个结核易感性筛查的生物标志物及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一个结核易感性筛查的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.结核病(tuberculosis,tb)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, mtb)感染引起可侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏为主的慢性传染性疾病。目 前结核病仍然是全球面临重大公共卫生问题之一，是十大致死因素之一。最新的who 报道全球约有1/4人口感染结核，同时每年有1000万人罹患结核病，并有约141万人 死于结核病。巨噬细胞是mtb感染人体的主要宿主细胞，可以通过促炎和抗炎、促进 吞噬体成熟、凋亡、自噬等途径对mtb进行早期清除。
3.而最新研究表明，在长期且大量暴露于结核分枝杆菌环境中的密切接触者(比如 结核病医院的医护人员等)，存在部分能够将入侵的mtb完全清除的人群，这类人群 被称为“结核抵抗者”(resister)，巨噬细胞可能是结核抵抗者早期清除mtb的主 要产生机制，但是目前在巨噬细胞中尚没有具有抗结核感染生物标志物用于人群中结 核易感性诊断。


技术实现要素：

4.本发明一个目的是提供用于外周血单核细胞诱导为巨噬细胞的系统、用于检测 hdac6基因mrna表达水平的系统和结核分枝杆菌的用途。
5.本发明提供了用于外周血单核细胞诱导为巨噬细胞的系统、用于检测hdac6基因 mrna表达水平的系统和结核分枝杆菌在如下1)-3)中至少一种中的应用：
6.1)制备预测或检测受试者对结核分枝杆菌的易感程度产品；
7.2)制备筛查结核分枝杆菌的易感程度低的人产品；
8.3)制备筛查结核分枝杆菌易感的人产品。
9.上述应用中，所述用于外周血单核细胞诱导为巨噬细胞的系统包括重组人m-csf；
10.所述用于检测hdac6基因mrna表达水平的系统为特异结合hdac6基因的探针或用 于扩增hdac6基因的引物对。
11.作为第一个用途的应用为所述hdac6基因mrna表达量高对应的受试者对结核分枝 杆菌的易感程度低于hdac6基因mrna表达量低对应的受试者。
12.作为第二个用途的应用为选取感染结核分枝杆菌后巨噬细胞中hdac6基因mrna 表达量高对应的受试者为结核分枝杆菌的易感程度低的人。
13.作为第三个用途的应用为选取感染结核分枝杆菌后巨噬细胞中hdac6基因mrna 表达量高对应的受试者为结核分枝杆菌易感的人。
14.本发明另一个目的是提供一种产品。
15.本发明提供的产品，包括用于外周血单核细胞诱导为巨噬细胞的系统、用于检测 hdac6基因mrna表达水平的系统和结核分枝杆菌。
16.上述产品具有如下1)-3)中至少一种功能：
17.1)预测或检测受试者对结核分枝杆菌的易感程度；
18.2)筛查结核分枝杆菌的易感程度低的人；
19.3)筛查结核分枝杆菌易感的人。
20.上述产品还包含数据处理装置；所述数据处理装置内设模块；
21.所述模块具有如下(a1)-(a5)所示的功能：
22.(a1)获得受试者外周血单核细胞；
23.(a2)将所述受试者外周血单核细胞诱导得到巨噬细胞，通过用于外周血单核细 胞诱导为巨噬细胞的系统诱导；
24.(a3)用结核分枝杆菌感染所述巨噬细胞；
25.(a4)检测所述结核分枝杆菌感染巨噬细胞后细胞中hdac6基因mrna表达水平，通 过用于检测hdac6基因mrna表达水平的系统检测；
26.(a5)按照如下标准确定：
27.感染后巨噬细胞中hdac6基因mrna表达量高对应的受试者对结核分枝杆菌的易感 程度低于感染后巨噬细胞中hdac6基因mrna表达量低对应的受试者；
28.或，选取感染后巨噬细胞中hdac6基因mrna表达量高对应的受试者，为结核分枝杆 菌的易感程度低的人；
29.或，选取感染后巨噬细胞中hdac6基因mrna表达量低对应的受试者，为结核分枝杆 菌易感的人。
30.上述产品中，所述用于外周血单核细胞诱导为巨噬细胞的系统包括重组人m-csf；
31.所述用于检测hdac6基因mrna表达水平的系统为特异结合hdac6基因的探针或用 于扩增hdac6基因的引物对。
32.在本发明的实施例中，用于扩增hdac6基因的引物对由序列1所示的引物和序列 2所示的引物组成。
33.用于外周血单核细胞诱导为巨噬细胞的系统、用于检测hdac6基因mrna表达水平 的系统、结核分枝杆菌和上述产品中的所述数据处理装置在如下1)-3)中至少一种 中的应用也是本发明保护的范围：
34.1)制备预测或检测受试者对结核分枝杆菌的易感程度产品；
35.2)制备筛查结核分枝杆菌的易感程度低的人产品；
36.3)制备筛查结核分枝杆菌易感的人产品。
37.上述hdac6蛋白或其编码基因在制备提高结核分枝杆菌的易感程度低的受试者抗 结合分枝杆菌感染能力产品中的应用也是本发明保护的范围；
38.或，hdac6蛋白或其编码基因在制备提高结核分枝杆菌的易感程度低的受试者外 周血诱导巨噬细胞中促炎细胞因子的表达产品中的应用也是本发明保护的范围；
39.或，hdac6蛋白或其编码基因在制备提高结核分枝杆菌的易感程度低的受试者外 周血诱导巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除能力产品中的应用也是本发明保护的范围。
40.本发明另一个目的是提供抑制hdac6基因表达的物质的用途。
41.本发明提供的抑制hdac6基因表达的物质在制备降低结核分枝杆菌的易感程度低 的受试者抗结合分枝杆菌感染能力产品中的应用；
42.或，抑制hdac6基因表达的物质在制备降低结核分枝杆菌的易感程度低的受试者 外周血诱导巨噬细胞中促炎细胞因子的表达产品中的应用；
43.或，抑制hdac6基因表达的物质在制备降低结核分枝杆菌的易感程度低的受试者 外周血诱导巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除能力产品中的应用。
44.上述hdac6蛋白或其编码基因作为抗结核分枝杆菌感染易感性诊断的生物标志物 也是本发明保护的范围；
45.或hdac6蛋白或其编码基因作为靶标在结核药物筛选或研发中的应用也是本发明 保护的范围；
46.或hdac6蛋白或其编码基因作为靶标在对结核病的诊断、预防和/或治疗中的应用 也是本发明保护的范围。
47.上述感染为mtb感染早期。
48.本发明首次发现了结核抵抗者外周血巨噬细胞在mtb感染早期，hdac6基因高表 达。本发明通过naive未感染结核者、结核潜伏感染者，活动性肺结核患者为实验对 照，检测外周血巨噬细胞在mtb感染下hdac家族mrna的表达情况，发现resister 的hdac6 mrna水平高表达，进一步验证hdac6在resister外周血巨噬细胞可以促进 促炎细胞因子的表达和对mtb的清除，本研究表明hdac6可作为抗结核分枝杆菌感染 易感性诊断的生物标志物以及结核药物筛选研发的靶标，对结核的诊断、预防、治疗 方面将有着广阔的应用前景。
附图说明
49.图1为hdac家族mrna表达水平；其中，hc为naive未感染结核的健康者；resister 为结核抵抗者；ltbi为结核潜伏感染者；tb为结核患者；(a)hdac i家族；(b) hdac ii家族；(c)hdac iv家族。
50.图2为hdac6 mrna表达水平；其中，hc为naive未感染结核的健康者；resister 为结核抵抗者；ltbi为结核潜伏感染者；tb为结核患者。
51.图3为hdac6抑制剂作用下，促炎细胞因子表达水平和对mtb清除能力；其中， hc为naive未感染结核的健康者；resister为结核抵抗者；ltbi为结核潜伏感染者； tb为结核患者；(a)促炎细胞因子；(b)mtb菌落计数。
具体实施方式
52.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
53.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
54.实施例1、结核易感性筛查的生物标志物的发现及检测方法的建立
55.一、受试者pbmcs分离和外周血巨噬细胞诱导
56.(1)人群纳入标准：
57.naive未感染结核的健康者(hc)组：未接触过mtb；inf-γ释放试验(igra)阴 性，无其他严重病史；
58.resister结核抵抗者组：有效的高暴露在mtb的危险因素；接触期间累积暴露(按 照工龄进行判断)；igra持续两年以上为阴性。
59.ltbi结核潜伏感染者组：接触过mtb；无tb症状；igra阳性，无结核治疗史。
60.tb组：临床上确诊的活动性肺结核患者。
61.排除标准：hiv合并感染以及合并其他疾病个体，以及表现出不确定igra反应的 任何人。
62.(2)分离pbmcs
63.分别取四组人群中各个受试者外周血3-4ml，置于含edta抗凝剂的紫帽采血管中， 利用tbd人全血单个核细胞分离液(lds1075，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司) 进行单个核细胞分离，得到pbmcs。
64.(3)pbmcs诱导得到巨噬细胞
65.将上述(2)得到的单个核细胞铺入24孔细胞培养板，每孔加入2
×
106个细胞， 每孔加入500μl含有10％fbs、1％青霉素-链霉素(invitrogen)、50ng/ml重组 人m-csf(cat#phc9501；gibco)和4mm 1-谷氨酰胺的rpmi1640培养基培养6天， 在第2和4天进行细胞换液，同样加入500μl含有10％fbs、1％青霉素-链霉素、 50ng/ml重组人m-csf和4mm 1-谷氨酰胺的rpmi1640培养基培养基，得到巨噬细胞。
66.二、实时荧光定量(qrt)pcr检测hdac家族mrna表达水平
67.(a)mtb感染
68.(1)将标准株h37rv(atcc 27294)在中性罗氏培养基培养2-3周，利用一次性 接种环把细菌刮取下来，放于含3-4滴5％吐温-80的磨菌瓶中，振荡后静置15min。
69.(2)向(1)中加入5ml 7h9培养液(7h9粉末溶于水配制：bd-271310；bd)于 磨菌瓶中，混匀后，吸出含菌培养液于15ml离心管进行相应稀释，利用比色皿测od600 值，约1
×
108cfu/ml。
70.(3)4500rpm低速离心5min，沉淀重悬浮于体积百分含量10％fbs的rpmi1640 培养基中，加入一定量培养基，颠倒混匀，得到h37rv菌悬液。
71.(4)用moi＝5将h37rv菌悬液在37℃，5％co2下感染巨噬细胞(上述步骤一得到的) 0、2、4、8、24小时，设感染时为0小时。
72.(b)细胞总rna提取
73.(1)以(a)感染细胞为实验对象，到每一个感染时间点去掉培养基，加入500μl 1
×
pbs(p1020-500；索莱宝)，利用细胞刮刮取每个感染时间点的细胞。
74.(2)把细胞收集在无rna酶的1.5ml ep管中，5000rpm，离心5min，吸弃上清。
75.(3)利用细胞/细菌总rna提取试剂盒(r1061，广州东盛生物科技有限公司)提 取细胞的总rna。
76.(c)cdna合成(翊圣生物试剂盒，hifair
tm
ⅱꢀ
1st stand cdna synthesis supermix for qpcr，产品编号11123es50)
77.(1)逆转录反应体系配制(20μl)：在rnase free的八排管中加入2xhifair
tmⅱsupermix plus，再加入步骤(b)提取的总rna 10μl，用移液枪轻轻吹 打混匀。
78.(2)逆转录程序设置：25℃ 5min；42℃ 30min；85℃ 5min，得到cdna。
79.(3)利用无菌水将逆转录的cdna稀释5倍。
80.(d)qpcr反应(翊圣生物试剂盒，qpcr sybr green master mix(low rox plus))
81.以上述c得到稀释5倍的cdna为模板，分别用不同基因的扩增引物(表3)进行 qpcr
hdac9-反向5
’‑
ggagtgtctttcgttgctgat-3’hdac10-正向5
’‑
agtgccctagagtccatccag-3’hdac10-反向5
’‑
cacagcggtcacatcttgct-3’hdac11-正向5
’‑
acccagacaggaggaaccata-3’hdac11-反向5
’‑
tgatgtccgcataggcacag-3’gapdh-正向5
’‑
ggagcgagatccctccaaaat-3’gapdh-反向5
’‑
ggctgttgtcatacttctcatgg-3’[0090] 图1为不同感染时间hdac家族mrna表达水平检测结果，其中每组例数为hc(n＝7)， resister(n＝7)，ltbi(n＝6)和tb(n＝7)个样本，可以看出，在h37rv感染早期 (感染4小时)，与hc组、ltbi组和tb组相比，resister组的外周血巨噬细胞中 hdac6 mrna(nm_001321225.2；2019年5月31日)维持表达。
[0091]
下面扩大样本量进行验证。
[0092]
三、实时荧光定量(qrt)pcr检测hdac6mrna表达水平
[0093]
将上述一中的4组人群，每组例数为hc(n＝11)，resister(n＝10)，ltbi(n＝8) 和tb(n＝12)个样本，按照上述一的方法进行巨噬细胞诱导，再按照上二的方法进行 mtb感染和hdac6mrna表达水平检测。
[0094]
mtb感染4小时后的结果如图2所示，可以看出，与hc组、ltbi组和tb组相比， resister组人群的外周血巨噬细胞中的hdac6 mrna在mtb感染早期高表达。
[0095]
上述结果表明，对mtb临床抵抗者resister和ltbi外周血单核细胞在mtb感染 其诱导的巨噬细胞中，hdac6基因在mtb临床抵抗者中高表达。
[0096]
因此，检测未感染结核人群中外周血巨噬细胞在mtb感染下hdac6 mrna表达量 可作为诊断对结核感染易感性的指标，面对易感人群采取相应措施尽早预防，特别在 高暴露mtb环境下工作人群和生活人群。
[0097]
hdac6基因可作为结核易感性筛查的生物标志物，可以通过检测受试者外周血单 核细胞诱导的巨噬细胞在感染结核分枝杆菌后细胞中hdac6基因mrna表达水平预测受 试者对结核分枝杆菌的易感程度；
[0098]
具体方法如下：
[0099]
1)分离待测者的外周血单核细胞，并诱导得到巨噬细胞；
[0100]
2)用结核分枝杆菌感染所述巨噬细胞，检测感染后巨噬细胞中hdac6基因mrna 表达量；
[0101]
感染后巨噬细胞中hdac6基因mrna表达量高对应的待测者对结核分枝杆菌的易感 程度低于感染后巨噬细胞中hdac6基因mrna表达量低对应的待测者；
[0102]
或，通过检测感染后巨噬细胞中hdac6基因mrna表达量筛查结核分枝杆菌的易感 程度低的人，具体为：选取感染后巨噬细胞中hdac6基因mrna表达量高对应的待测者， 为结核分枝杆菌的易感程度低的人。
[0103]
或，通过检测感染后巨噬细胞中hdac6基因mrna表达量筛查结核分枝杆菌易感的 人，具体为：选取感染后巨噬细胞中hdac6基因mrna表达量低对应的待测者，为结核 分枝杆菌易感的人。
[0104]
实施例2、hdac6作为筛选靶标筛查对结核分枝杆菌的易感程度低的人
[0105]
一、hdac6抑制剂作用下，实时荧光定量(qrt)pcr检测促炎细胞因子mrna表达 水平
[0106]
(a)mtb感染
[0107]
hdac6i(+)组：在实施例1二的步骤(a)的(3)中，配置体积百分含量10％fbs 的rpmi1640培养基中同时加入浓度为10μm hdac6抑制剂(tubastatin a，s8049， selleckchem，germany)。
[0108]
dmso(+)组：在实施例1二的步骤(a)的(3)中，配置体积百分含量10％fbs的 rpmi1640培养基中同时加入同体积dmso作为阴性对照dmso(+)；
[0109]
hdac3i(+)组：实施例1二的步骤(a)的(3)中，配置体积百分含量10％fbs的 rpmi1640培养基中同时加入浓度为10μm hdac3抑制剂(rgfp966)(s7229， selleckchem，germany)组作为阴性对照。
[0110]
(b)细胞总rna提取：收集感染0、4、8、24小时的巨噬细胞进行总rna提取， 与实施例1二相同；
[0111]
(c)cdna合成：与实施例1二相同；
[0112]
(d)qpcr反应：与实施例1二基本相同，不同的是qpcr反应采用的引物为如下 表4所示。
[0113]
表4为qpcr引物序列
[0114]
引物名称基因序列tnfα-正向5
’‑
cctctctctaatcagccctctg-3’tnfα-反向5
’‑
gaggacctgggagtagatgag-3’il1β-正向5
’‑
gtcggagattcgtagctgga-3’il1β-反向5
’‑
cctctctctaatcagccctctg-3’il6-正向5
’‑
actcacctcttcagaacgaattg-3’il6-反向5
’‑
ccatctttggaaggttcaggttg-3’gapdh-正向5
’‑
ggagcgagatccctccaaaat-3’gapdh-反向5
’‑
ggctgttgtcatacttctcatgg-3’[0115]
结果如图3a所示，可以看出，在不加入hdac6抑制剂的hdac3i(+)组和dmso (+)组中，在mtb感染早期(4小时)下，resister外周血巨噬细胞中tnfαmrna 高表达，在感染8小时，resister外周血巨噬细胞中il-1βmrna和il-6 mrna高表 达；在加入hdac6i的hdac6i(+)组中，在mtb感染早期(4小时)下，resister外 周血巨噬细胞中tnfαmrna减低表达，在感染8小时，resister外周血巨噬细胞中 il-1βmrna和il-6 mrna降低表达；表明，在mtb感染情况下，resister外周血巨 噬细胞通过hdac6促进巨噬细胞tnfαmrna、il-1βmrna和il-6 mrna高水平表达， 每组人群例数为3个人。
[0116]
二、hdac6抑制剂作用下，菌落形成单位计数法(cfu)实验检测对mtb清除能 力
[0117]
(a)菌落形成单位计数：
[0118]
(1)利用上述一的(a)中感染的2、4、8、24h巨噬细胞，加入含有0.05％sds 的500μl 1
×
pbs吹打混匀，裂解巨噬细胞10min，收集裂解液。
[0119]
(2)取100ul裂解液用7h9溶液进行10倍梯度稀释，稀释102、103倍时，分别 各取100ul涂布在含10％oadc的7h10琼脂平板上，置于37℃，5％co2培养3-4周。 进行mtb的cfu
计数。
[0120]
(b)实验结果分析
[0121]
结果如图3b所示，可以看出，在不加入hdac6抑制剂的hdac3i(+)组和dmso (+)组中，在mtb感染早期(4小时)下，resister外周血巨噬细胞中的mtb菌落形 成单位计数低于其他组；在加入hdac6i的hdac6i(+)组中，在mtb感染早期(4小 时)下，resister外周血巨噬细胞中的mtb菌落形成单位计数与其他组无差别，每组 人群例数为5个人；
[0122]
上述结果表明，在mtb感染情况下，resister外周血巨噬细胞可通过hdac6促进 巨噬细胞对mtb的清除。
[0123]
结合上述图2、图3a和图3b的结果，表明，resister外周血巨噬细胞可通过高 表达hdac6促进促炎因子的释放，从而对mtb实现早期清除。hdac6蛋白或其编码基 因作为靶标筛选或研发结核药物。
[0124]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的 保护范围应该以权利要求书所界定的为准。