一种用于立夏红桃树品种鉴定的SNP分子标记引物及其鉴定与应用方法

本发明涉及桃树育种及植物分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于立夏红桃树品种鉴定的snp分子标记引物及其鉴定与应用方法。

背景技术：

桃起源于我国西北地区昆仑山-塔里木盆地一带。桃在我国的栽培和驯化可追溯到4000年前，之后在罗马帝国时期通过丝绸之路传到欧洲，现已成为世界温带地区最重要的经济果树之一。近年来，我国桃栽培面积和产量稳步上升，据世界粮农组织(fao)统计，2017年我国桃栽培面积已达1100万亩，总产量1430万吨，分别占世界总量的48.72％和65.03％，均居世界首位。

桃不耐贮运，通过不同成熟期品种的搭配种植是满足市场供应的重要方式，因此在实际生产中桃的品种繁多。由此而来产生的一个问题是，桃品种的鉴定与资源保护成为亟待解决的一大难题。

目前，对桃品种的鉴定多是通过果实外观、成熟期、口感、花期、树势等传统手段进行，但该手段一是容易受环境和人为因素影响判断，二是难以区分遗传背景相近的品种。而对桃品种鉴定的不准确性，易造成育苗不纯导致果农经济效益受损，同时不利于对新优品种权益的保护，限制产业的健康、绿色发展。

通过分子标记技术鉴定品种具有高效、准确的优点，因而逐渐在作物品种鉴定和资源保护工作中受到重视。对于果树而言，建立适宜的分子标记搭配便捷的配套检测技术成为识破伪劣种苗、保护品种权益和农民利益的迫切需要。分子标记技术的核心是开发能够精确识别品种特征的分子标记，经过了上个世纪使用较多的aflp、rflp和rapd等难以鉴定片段来源的分子标记，目前多使用能够精确确定多态性物理位置的ssr和snp分子标记。相对于ssr标记的低密度特点，snp标记密度大，更有可能开发出与目标品种紧密连锁的分子标记。目前，snp标记已在苹果、梨和猕猴桃等多种果树资源鉴定与保护中使用。

“立夏红”系“中油4号”芽变，是一果农于2008年在自家园中的“中油4号”桃树上发现，2012年开始嫁接繁殖，2013、2014、2015年三次继代高接，现场观察嫁接和高接的“立夏红”整齐一致，性状稳定。“立夏红”果实近圆形，表面光洁，颜色亮丽，粘核，平均单果重169g，可溶性固形物含量13.59％，果实去皮硬度7.8kg/c㎡，果实成熟期比“中油4号”提前15～18天，丰产性好，适应性强。2016年顺利通过品种认定。因此，开发适用于“立夏红”品种的分子鉴定标记，将有利于从分子上明确、裁定品种身份，有利于对桃品种的推广和资源保护。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于立夏红桃树品种鉴定的snp分子标记引物及其鉴定与应用方法。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种用于立夏红桃树品种鉴定的snp分子标记引物，包括四对引物，分别为aaas1、aaas2、aaas3和aaas4；

其中，所述aaas1的正向引物序列如seqidno.1所示，aaas1的反向引物序列如seqidno.2所示；所述aaas2的正向引物序列如seqidno.3所示，aaas2的反向引物序列如seqidno.4所示；所述aaas3的正向引物序列如seqidno.5所示，aaas3的反向引物序列如seqidno.6所示；所述aaas4的正向引物序列如seqidno.7所示，aaas4的反向引物序列如seqidno.8所示。

一种利用上述snp分子标记引物进行立夏红桃树品种鉴定的方法，包括如下步骤：

(1)使用ctab法对“立夏红”、其母树“中油4号”以及待测桃品种分别提取dna；

(2)以步骤(1)提取的各dna产物为模板，以所述aaas1、aaas2、aaas3、aaas4为引物，分别进行pcr扩增；

(3)对步骤(2)中的各pcr产物进行电泳分离，检测pcr是否成功以及条带是否单一；

(4)对步骤(3)中检验合格的pcr产物进行sanger测序，并根据每个pcr扩增产物中的特定位点的多态性进行统计；如果待测桃品种的pcr扩增产物的多态性与“立夏红”桃品种的pcr扩增产物的多态性一致，即判定该待测桃品种为“立夏红”桃品种；如果不一致，则表明待测桃品种并非“立夏红”桃品种。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，进行pcr扩增时，pcr酶选用mix(green)，循环内退火温度58℃，延伸时间30s，共35个循环。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，具体获得以下十二种pcr产物：“立夏红”桃品种aaas1-pcr产物、“立夏红”桃品种aaas2-pcr产物、“立夏红”桃品种aaas3-pcr产物、“立夏红”桃品种aaas4-pcr产物、“中油4号”桃品种aaas1-pcr产物、“中油4号”桃品种aaas2-pcr产物、“中油4号”桃品种aaas3-pcr产物、“中油4号”桃品种aaas4-pcr产物以及待测桃品种aaas1-pcr产物、待测桃品种aaas2-pcr产物、待测桃品种aaas3-pcr产物、待测桃品种aaas4-pcr产物。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，检验合格的pcr产物具体指条带清晰且单一pcr产物。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，进行sanger测序时，测序引物使用aaas1-aaas4的正向引物。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，所述pcr扩增产物中的特定位点的多态性具体根据相应pcr产物目标位置的测序峰图进行观察判断。

一种上述利用snp分子标记引物进行立夏红桃树品种鉴定的方法在桃育种方面的应用。

本发明相比现有技术的优点在于：

(1)关于桃品种的鉴别，传统的“形态标记”虽然直观，但是存在多态性差、准确度偏低，且受季节影响的因素；而本发明通过使用分子标记进行品种鉴定，不受季节限制，且准确度高；

(2)本发明通过研究“立夏红”由“中油4号”变异的关键原因开发分子标记，检测结果更可靠；

(3)本发明找到的用于“立夏红”品种鉴定的分子标记，可以用于指导桃的杂交育种，能提前进行筛选，节约育种时间，提高育种效率。

附图说明

图1是实施例3中母树“中油4号”和芽变“立夏红”在不同发育时期的外观对比图；

图2是实施例3中“中油4号”与“立夏红”转录组测序snp分布图(图中，纵坐标lg1～8表示：1号～8号染色体；横坐标表示：snp数目)；

图3是实施例3中“立夏红”的等位不平衡表达snp分布图(图中，纵坐标表示：非同义或同义snp数目；横坐标lg1～8表示：1号～8号染色体)；

图4是实施例3中以aaas1为引物时的分子标记分型图；(图中，位于上方的峰谱为“中油4号”，位于下方的峰谱为“立夏红”)；

图5是实施例3中以aaas2为引物时的分子标记分型图；(图中，位于上方的峰谱为“中油4号”，位于下方的峰谱为“立夏红”)；

图6是实施例3中以aaas3为引物时的分子标记分型图；(图中，位于上方的峰谱为“中油4号”，位于下方的峰谱为“立夏红”)；

图7是实施例3中以aaas4为引物时的分子标记分型图；(图中，位于上方的峰谱为“中油4号”，位于下方的峰谱为“立夏红”)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种用于立夏红桃树品种鉴定的snp分子标记引物，包括四对引物，分别为aaas1、aaas2、aaas3和aaas4。

其中，aaas1的正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示；aaas2的正向引物序列如seqidno.3所示，反向引物序列如seqidno.4所示；aaas3的正向引物序列如seqidno.5所示，反向引物序列如seqidno.6所示；aaas4的正向引物序列如seqidno.7所示，反向引物序列如seqidno.8所示。

本实施例的用于立夏红桃树品种鉴定的snp分子标记引物具体通过以下方式获得：

(1)转录组测序文库构建和数据处理

转录组测序文库构建：首先利用trizol方法提取“中油4号”与“立夏红”桃品种果肉总rna，经过质控检测合格后进入文库构建流程；接着，将rna与mrna吸附磁珠结合2次，纯化后打断；然后合成cdna第一条链和第二条链，并进行二链产物的纯化；接着，完成产物末端修复并加a、加接头以及user酶消化；下一步进行片段选择、pcr扩增以及扩增产物的纯化；最后，经检测文库质量合格后，利用illumina测序仪进行测序。

数据处理：下机原始数据(rawdata)经去接头、除杂后的干净序列(cleanreads)与参考基因组序列进行比对，将“立夏红”和“中油4号”的所有文库分别合并，然后利用snp检测软件samtools进行snp分型检测，发掘差异snp位点。

(2)illumina重测序文库构建和数据处理

文库制备：首先使用ctab法从桃幼嫩叶片中提取高质量基因组dna，检测合格后按照illumina标准建库方案实施，包括样品质量检测、文库构建、文库质量检测和文库测序等流程；样品基因组dna检测合格后，用机械打断的方法(超声波)将dna片段化，然后对片段化的dna进行片段纯化、末端修复、3′端加a、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行pcr扩增形成测序文库；建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用illumina高通量测序仪进行测序；然后对测序得到的原始reads(双端序列)进行质量评估并过滤得到cleanreads，用于后续生物信息学的分析。

数据处理：将cleanreads与参考基因组序列进行比对，最后，基于比对结果进行snp、indel等变异检测和注释，并实现dna水平差异基因挖掘和差异基因功能注释等。软件信息如下：质控，fastp软件；与参考基因组比对，bwa软件；snp检测，gatk软件。

(3)分子标记的开发

通过比较“立夏红”和“中油4号”重测序数据，在4号染色体染色体印记区域发掘了4个特异的位点，据此开发所述snp分子标记，且分别命名为aaas1-aaas4，引物序列如前文所述。

实施例2

本实施例的一种利用上述snp分子标记引物进行立夏红桃树品种鉴定的方法，包括如下步骤：

(1)使用ctab法对“立夏红”、其母树“中油4号”以及待测桃品种分别提取dna；

(2)以步骤(1)提取的各dna产物为模板，以所述aaas1、aaas2、aaas3、aaas4为引物，分别进行pcr扩增；pcr酶选用擎科生物金牌mix(green)，循环内退火温度58℃，延伸时间30s，共35个循环。

(3)待pcr结束，使用1％的琼脂糖胶对步骤(2)中的各pcr产物进行电泳分离，检测pcr是否成功以及条带是否单一；

(4)对步骤(3)中检验合格(即，条带清晰且单一)的pcr产物进行sanger测序，测序引物使用aaas1-aaas4的正向引物；同时，根据每个pcr扩增产物目标位置的测序峰图判断相应特定位点的多态性，并进行统计；如果待测桃品种的pcr扩增产物的多态性与“立夏红”桃品种的pcr扩增产物的多态性一致，即判定该待测桃品种为“立夏红”桃品种；如果不一致，则表明待测桃品种并非“立夏红”桃品种。

据此，采用本实施例方法可进行立夏红桃树品种的精准鉴定，从而广泛的应用于桃育种领域。

实施例3

本实施例用以说明上述实施例1～2中技术方案的探究过程、原理及最终的可行性分析：

一、“立夏红”桃芽变机理解析：

采用2018年母树品种“中油4号”与果实成熟期芽变品种“立夏红”不同发育时期桃果实样品为试材。“立夏红”成熟期较“中油4号”早16天(图1)。

对“中油4号”与“立夏红”不同发育时期果实进行转录组测序，每个品种每个时期两个生物学重复，共获得197.03gb二代转录组数据，平均每个样品数据在7gb以上。将二代转录组数据回贴到桃基因组后进行单碱基核苷酸多态性(snp)分析。如图2所示，二者的snp(与参考基因组对比)数目在多数染色体上差异不大，而在4号染色体(即，图中的lg4)上差异悬殊，“中油4号”约为“立夏红”的1.6倍。进一步的对“中油4号”与“立夏红”之间的差异snp进行分析，如图3所示，“立夏红”4号染色体snp数目的大幅下降与4号染色体0.2mb至16.8mb区间内连续出现等位基因不平衡表达(或称为基因表达多态性缺失)现象有关。等位不平衡表达snp绝大部分分布在4号染色体上，其中非同义(non-synonymous)和同义(synonymous)snp分别为982和1160个。大规模连续等位基因不平衡表达现象很有可能是某段染色体印记改变，即染色体区域开放程度降低。

二、“立夏红”品种特异分子标记开发及引物设计

“染色体印记改变”可能会影响等位基因在提取的dna中的分布频率，印记等位基因比例会上升。为了验证这一设想，本申请提取“立夏红”和“中油4号”叶片dna(ctab法)，然后根据转录组数据设计引物扩增包含snp的片段，其中引物设计过程如下：通过比较“立夏红”和“中油4号”重测序数据，在4号染色体印记区域发掘了4个特异的位点，开发snp分子标记，分别命名为aaas1-aaas4。这些位点具有如下特征：①在母树“中油4号”中存在一对等位snp；②在“立夏红”桃品种中该位点的等位snp不平衡(测序结果一高一低)。

待扩增结束，将pcr产物进行sanger测序。结果如图4～7所示，在“中油4号”中snp位点双峰峰值接近，而在“立夏红”中虽然snp并未失去多态性，两个等位碱基都存在(双峰)，但其中一个峰值较低，这种差异性可以用于进行品种分子鉴定。

为了判断这种鉴定方法的可靠性和稳定性，本实施例从以下两个方面进行论证：

一是使用“中油4号”和“立夏红”叶片dna建库进行二代重测序。结果与pcr测序结果一致，“立夏红”在这4个位点的snp分型结果中都是“一种等位基因远远低于另一种等位基因的频率”。

二是对其它桃品种进行基因组重测序，包括“萧国圣桃”、“锦花”、“霜红”、“瑞蟠20号”、“njc83”、“金秋”、“燕红”、“黄金蜜4号”、“初秋”、“晚蜜”、“早美脆”、“梦富士”、“黄金蜜1号”、“中桃2号”、“源东白桃”、“春雪”、“春美”、‘春瑞’、“早露蟠桃”、“春蕾”、“早美”、“金星”、“早熟有名”、“油蟠9号”、“中油6号”、“曙光”、“中蟠11号”。结果表明，这些桃品种中均未出现与“立夏红”相同的分型结果。这表明，本发明的鉴定方法具备可靠性和稳定性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>安徽省农业科学院园艺研究所

<120>一种用于立夏红桃树品种鉴定的snp分子标记引物及其鉴定与应用方法

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