一种针对ET

一种针对et
a
r
‑
rhoe通路的免疫原性短肽及其疫苗和改善心脏重塑的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及改善心脏重塑的短肽及其制药应用，尤其是一种针对et
a
r
‑
rhoe通路的免疫原性短肽及其疫苗和改善心脏重塑的应用。


背景技术：

2.心脏重塑包括心肌肥厚与纤维化、心脏组织的炎性细胞浸润、心肌细胞线粒体损伤、心肌自噬功能障碍与细胞凋亡，引起心力衰竭的发生、发展，最终进展到终末期心衰而死亡(sposato luciano a.j am collcardiol,2020,76:2768
‑
2785)。在临床工作中，针对心脏重塑的常规药物治疗给患者造成沉重的经济负担(emdinmichele.j am collcardiol,2020,76:1795
‑
1807)。然而，尽管acei、arbs、诺欣妥和螺内酯等对抗心脏重塑的药物在心血管内科长期、规范的使用且在治疗心脏重塑方面取得一定的效果；由于心肌细胞膜上各种受体及其下游信号分子间存在复杂的激活、交互作用和上下游通路之间存在各种复杂的正反馈的调节网络，限制了上述针对血管紧张素ii受体、醛固酮受体治疗心脏重塑的药物疗效，表现为尽管在临床上规范、联合的使用上述药物，患者心脏重塑的发生率仍居高不下，每年仍有大量患者因心脏重塑进展到终末期心衰而死亡(cohn j n.n engl j med,2001,345:1667
‑
75)。
3.现有技术表明血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素ii的1型受体拮抗剂由于阻滞ang ii的1型受体而抑制心肌细胞胞浆内具有正常生理功能的自噬流，这也反映血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素ii的1型受体拮抗剂在治疗心脏重塑方面具有其局限性(cheng zheng.j mol cell cardiol,2018,125:117
‑
128)。此外，临床上联合、大剂量使用血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素ii 1型受体拮抗剂和醛固酮受体拮抗剂抗心脏重塑治疗虽然可以部分程度的改善心脏重塑患者的入院率和死亡率，但是上述药物引起的低血压、肾脏功能损害、高尿酸血症等并发症的发生率显著升高；恼人的“醛固酮逃逸现象”也限制了联合运用血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素ii 1型受体拮抗剂和醛固酮受体拮抗剂抗心脏重塑的疗效(konstam marvin a.lancet,2009,374:1840
‑
8；kang seok
‑
min.[j].lancet,2010,375:1079；satoatsuhisa.hypertension,2003,41:64
‑
8；terietluuk.circ res,2015,116:960
‑
75；pitt b.n engl j med,1999,341:709
‑
17；juurlink david n.n engl j med,2004,351:543
‑
51)。因此，进一步研究不依赖于血管紧张素ii 1型受体与醛固酮受体的、能够有效调控心脏重塑的新靶点，并据此探索抗心脏重塑新途径变得迫在眉睫。
[0004]
内皮素1(endothelin1,et
‑
1)是生物体内存在的、作用效果最强的缩血管因子，主要在血管内皮细胞产生，与et
a
受体(et
a
r)、et
b
受体(et
b
r)结合发挥其生物学效应(markus p.annu rev pharmacoltoxicol,2007,47:731
‑
759)。在脉管系统中，et
a
受体(et
a
r)主要分布于血管平滑肌细胞，et
b
受体(et
b
r)主要存在于内皮细胞和平滑肌细胞。et
‑
1与血管平滑肌细胞膜上的et
a
r结合后发挥强烈的缩血管效应，而与血管内皮细胞膜上的et
b
r结合后则能够促使et
‑
1的血浆清除、刺激血管内皮细胞释放no和前列腺素等、抑制血管的收缩，拮抗
et
a
r生物学作用(gali
é
n,cardiovascular research,2004feb 1,61(2):227
‑
237)。除了在脉管系统中发挥强烈的缩血管效应，内皮素1在心脏中也具有重要作用。临床患者以及实验动物的病理模型中均发现：心衰患者以及动物的心脏组织以及血浆中et
‑
1浓度水平显著升高，且心脏组织和血浆中et
‑
1的浓度水平与心力衰竭的严重程度呈正相关(spieker l e.j am collcardiol,2001,37:1493
‑
505；mcmurray j j.circulation,1992,85:1374
‑
9；wei c m.circulation,1994,89:1580
‑
6；pacher r.j am collcardiol,1996,27:633
‑
41)。以上结果均暗示et
‑
1可能在心脏重塑的发生、发展中发挥着重要作用，最终诱导心衰的加重(ceylanaslif.biochimbiophysactamol basis dis,2018,1864:3339
‑
3352；ceylan
‑
isikasli f.basic res cardiol,2013,108:335；hirt marc n.basic res cardiol,2012,107:307)。当前，通过化学药物研发内皮素受体的选择性与非选择性拮抗剂应用于临床治疗心力衰竭的rcts实验提示：拮抗内皮素受体的化学类药物能够在不增加心率的情况下显著增加心脏输出量(s
ü
tschg.circulation,1998,98:2262
‑
8.)。但令人遗憾的是，进一步的大规模临床随机、对照、双盲试验揭示：尽管拮抗内皮素受体的化学类药物能够有效改善心衰患者的血流动力学状况、减轻神经、体液因素导致的心脏损害，但是心衰患者的远期预后并没有因此得到有效改善(mcmurray john.circulation,2002,105:2099
‑
106)。化学类药物的治疗靶点选择性通常较差；即使部分化学类药物具有一定的靶向选择性，其对同一通道家族不同成员的特异性识别能力亦较差，比如特异性结合et
a
r但是不结合et
b
r。同时，拮抗内皮素受体的化学类药物半衰期短，难以通过平稳、持久的阻断心肌组织与血浆中的内皮素受体来发挥高效、持久的抑制心脏重塑的作用。另一方面，由于内皮素1在血浆中的浓度非常低，且在心脏中绝大多数内皮素1通过自分泌与旁分泌作用于周边心肌组织发挥其生物学效应(remuzzi g,perico n,benigni a.new therapeuticsthat antagonize endothelin:promises and frustrations.nat rev drug discov.2002dec；1(12):986
‑
1001)。因此，拮抗内皮素受体的化学类药物由于难以达到有效血药浓度、亦无法抑制心肌组织内皮素
‑
1的旁分泌作用，难以发挥有效的抑制心脏重塑的作用(remuzzigiuseppe.nat rev drug discov,2002,1:986
‑
1001)。
[0005]
与当前常用的化学类药物相比，治疗性短肽则具有上述优势，其免疫机体产生的目的抗体能够高效、有针对性的同细胞膜上相应的受体结合，且目的抗体持续时间长、血浆滴度水平高，因此，容易克服上述化学类药物的局限性、发挥其抗心脏重塑的作用。由于相对于传统化学类药物，治疗性短肽具备上述优势，针对疑难疾病研发短肽疫苗已经成为目前临床慢性疾病探索、研究的全新领域。如针对疑难疾病的治疗性短肽研制成功，其与传统的化学类合成药物相比，免疫机体发挥作用的持续时间长、每间隔1～3月甚至更长时间给药一次即可保持长期、平稳、高效的生物学效应；还能够降低患者治疗费用、改善治疗的依从性。当前，针对难治性高血压的治疗短肽：抗at1受体胞外肽段短肽、l型钙离子通道治疗性短肽已研制成功并准备开展i期临床试验(dai yong,j am collcardiol,2019,73:2567
‑
2580；chen xiao,hypertension,2013,61:408
‑
16)。这说明针对疾病特异性靶点的治疗性短肽有可能成为临床疑难疾病的全新治疗手段，具有重大的研发潜力。考虑到内皮素系统，特别是et
‑
1和et
a
r在心脏重塑的发生、发展中发挥着重要作用，且针对内皮素系统的化学类药物由于其时空分布、浓度限制等因素导致远期抗心脏重塑的效果不佳，理论上能够突破化学类药物上述局限性的针对内皮素受体的治疗性短肽可能成为抗心脏重塑的新治疗
途径。近来，在自身免疫性疾病患者的血浆中发现存在针对内皮素受体的自身抗体，这暗示内皮素受体具有抗原性，有可能成为研发短肽疫苗治疗慢性疾病的理想靶点(riemekasteng.ann rheum dis,2011mar,70(3):530
‑
536)。
[0006]
但是，目前尚无任何通过构建针对内皮素受体的治疗性短肽抗心脏重塑的研究报道及相关的发明专利。


技术实现要素：

[0007]
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种改善心脏重塑的治疗性短肽及其制药应用。
[0008]
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0009]
本发明公开了一种针对et
a
r
‑
rhoe通路的免疫原性短肽，该短肽的氨基酸序列如seq id no：1所示。
[0010]
优选地，所述短肽的最佳抗原表位为针对et
a
r ec1的145rwpfdhndfg154氨基酸序列：145arg trp pro phe asp his asn asp phe gly 154。
[0011]
优选地，所述短肽包含若干带负电的天冬氨酸残基，能够提供被包埋的巯基作为连接位点。
[0012]
本发明还公开了一种针对et
a
r
‑
rhoe通路的免疫原性载体疫苗，由上述的针对et
a
r
‑
rhoe通路的免疫原性短肽与载体偶联而成。
[0013]
优选地，该疫苗是由所述针对et
a
r
‑
rhoe通路的免疫原性短肽与载体血蓝蛋白klh或者破伤风类毒素通过戊二醛耦联法耦联成的短肽半抗原
‑
耦联蛋白。
[0014]
本发明还公开了上述的针对et
a
r
‑
rhoe通路的免疫原性短肽或针对et
a
r
‑
rhoe通路的免疫原性载体疫苗在制备改善心脏重塑的药物中的应用。
[0015]
优选地，所述的药物为通过抑制et
a
r的活化激活rhoe通路改善心脏重塑的药物。
[0016]
进一步优选地，所述的药物为通过特异性结合et
a
r的ec1，阻滞et
‑
1与et
a
r的结合，抑制et
‑
1活化后的et
a
r对rhoe的招募，释放rhoe至胞浆，从而激活rhoe及其下游通路的药物。
[0017]
本发明还公开了一种改善心脏重塑的药物，由针对et
a
r
‑
rhoe通路的短肽耦联载体成为上述的针对et
a
r
‑
rhoe通路的免疫原性载体疫苗并且添加药学上可接受的辅料制成。
[0018]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0019]
本发明公开了一种针对et
a
r
‑
rhoe通路的短肽：rg10，构建该短肽的氨基酸序列为：145rwpfdhndfg154，合成、包被巯基并且纯化获得。将该短肽与载体血蓝蛋白klh或者破伤风类毒素通过戊二醛耦联法相耦联成为半抗原短肽—载体蛋白(完全抗原，即rg10治疗性短肽)。该治疗性短肽辅以佐剂可刺激机体产生抗体滴度效价高且滴度持久的目的抗体。
[0020]
从效果来看：第一，在离体水平上：所述治疗性短肽rg10的目的抗体能够特异性的与心肌细胞膜上et
a
r结合，有效阻滞et
‑
1与et
a
r的结合，从而抑制et
‑
1诱发心室细胞肥厚、纤维化、凋亡的生物学效应，改善心室细胞的重塑。第二，在体水平上：所述治疗性短肽rg10免疫机体后能够显著缓解心脏重塑、在不影响心率的情况下提高心脏输出量，有效改善心功能。第三，在分子机制水平上，治疗性短肽rg10的目的抗体通过高效的结合et
a
r、阻滞et
‑
1与et
a
r的结合，从而抑制et
a
r的活化、解除活化后的et
a
r对rhoe的招募、释放rhoe至胞浆，从而激活rhoe通路，改善心脏重塑。本发明的治疗性短肽rg10的目的抗体对心脏、肾脏、肝脏、脾脏、肺部、脑组织等重要组织器官无明显免疫损伤，其在体应用具有远期安全性。
[0021]
进一步地，本发明的短肽rg10氨基酸序列为145rwpfdhndfg154，其包含较多的带负电天冬氨酸(d)残基，其包被巯基作为结合位点的合成速度快且合成、纯化的成本低廉，与载体血蓝蛋白klh或破伤风类毒素通过戊二醛耦联法相耦联可高效、快捷的获取完全抗原：短肽rg10—耦联蛋白(特异性针对et
a
r
‑
rhoe通路的载体疫苗，即治疗性短肽rg10)。该完全抗原予以福氏佐剂可诱导机体产生滴度高且持久的目的抗体。
[0022]
因此，治疗性短肽rg10可能开发作为临床上改善心脏重塑的高效、全新的治疗手段，其具有较大的未来应用潜力。
附图说明
[0023]
图1为本发明的et
‑
1氨基酸序列的示意图；
[0024]
图2为et
a
r的氨基酸序列以及跨膜结构；
[0025]
图3为et
a
r ec1上直接结合et
‑
1、具有高度亲水性的氨基酸序列中包含5个特异性的氨基酸：149dhndf153，在et
a
r ec1这5个氨基酸与et
b
r对应结构的氨基酸完全不同；
[0026]
图4为et
a
r/et
b
r的ec1 142
‑
166氨基酸序列是et
a
r/et
b
r直接结合et
‑
1的部位；
[0027]
图5为治疗性短肽rg10免疫兔的抗体滴度测定；
[0028]
图6为治疗性短肽rg10的对照抗体、目的抗体、中和化的抗体与心肌细胞膜上et
a
r的结合情况；
[0029]
图7为治疗性短肽rg10的目的抗体在细胞膜上的定位情况；
[0030]
图8为治疗性短肽rg10的目的抗体能够显著改善et
‑
1(10
‑9m)诱导的原代心室肌细胞肥厚；
[0031]
图9为治疗性短肽rg10的目的抗体能够显著改善ang ii(10
‑7m)诱导的心室纤维化，α
‑
sma的表达水平反映心室纤维化的程度；
[0032]
图10为hoechst33258染色结果；
[0033]
图11为治疗性短肽rg10的目的抗体能够显著阻滞et
a
r对rhoe的招募；
[0034]
图12为治疗性短肽rg10通过阻滞et
‑
1与et
a
r的结合、抑制et
a
r的活化进而激活rhoe及其下游通路、改善心脏重塑的机制图；
[0035]
图13为治疗性短肽rg10能够显著缓解et
‑
1、angii以及1型糖尿病诱导的balb/c小鼠左室短轴缩短率降低；
[0036]
图14为治疗性短肽rg10能够显著改善et
‑
1、angii以及1型糖尿病诱导的balb/c小鼠左室射血分数下降；
[0037]
图15为治疗性短肽rg10能够有效改善血管紧张素ii诱导的balb/c小鼠心脏纤维化；
[0038]
图16为治疗性短肽rg10能够有效缓解et
‑
1诱导的balb/c小鼠心肌肥厚；
[0039]
图17为治疗性短肽rg10能够显著改善1型糖尿病诱导的balb/c小鼠心肌细胞凋亡；
[0040]
图18为治疗性短肽rg10不会诱发单核—巨噬细胞浸润心脏组织；
[0041]
图19为治疗性短肽rg10不会加重炎性细胞对肝脏组织的浸润；
[0042]
图20为治疗性短肽rg10不会诱发肾脏的免疫炎性损伤；
[0043]
图21为治疗性短肽rg10不加重肺部的免疫炎性反应。
具体实施方式
[0044]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
[0045]
本发明对et
a
r的分子结构进行分析：et
a
r与et
b
r均属于g蛋白偶联受体，其氨基酸序列在哺乳动物中具有高度的同源性。作为典型的7次跨膜受体，et
a
r与et
b
r结构均包括：细胞外n端、细胞内c端、7次跨膜结构域、3个胞外环(ec1、ec2和ec3)和3个胞内环。特别重要的是：内皮素受体的第一跨膜结构域和第一胞外环(ec1)参与et
‑
1的结合。其中，第一胞外环(ec1)的142
‑
166氨基酸序列是et
a
r与et
‑
1直接结合的部位。另外，在机体内，et
b
r与et
a
r发挥着相反的作用，et
b
r不仅能够拮抗et
‑
1与et
a
r结合后发挥的生物学效应，还能够促进血浆、组织中et
‑
1的清除。因此，申报者旨在构建治疗性短肽，其免疫机体产生的目的抗体能够特异性的与et
a
r结合，阻断et
‑
1与et
a
r结合所发挥的诱导心脏重塑的作用；同时，该治疗性短肽免疫机体产生的目的抗体不与et
b
r结合，因此不会影响et
‑
1与et
b
r结合所发挥的清除血浆、组织过量的et
‑
1、拮抗et
‑
1的生物学效应。进一步评估et
b
r的分子结构发现：et
a
r与et
b
r仅有64％同源性，et
b
r与et
‑
1直接结合区域的部分氨基酸序列也与et
a
r不同。因此，可设计针对et
‑
1与et
a
r直接结合区氨基酸序列或调控et
‑
1与et
a
r结合的重要功能区氨基酸序列的治疗性短肽，其免疫机体后产生抗体能够与et
a
r特异性结合而不与etbr结合。进一步分析etar、et
b
r与配体et
‑
1直接结合的氨基酸序列：et
a
r ec1上asp(天冬氨酸)149
‑
his(组氨酸)150
‑
asn(天冬酰胺)151
‑
asp(天冬氨酸)152
‑
phe(苯丙氨酸)153。et
a
r ec1上这5个氨基酸与et
b
r相对应区域的氨基酸完全不同。因此，有可能通过构建包含et
a
r ec1上149dhndf153序列的短肽，使其诱导机体产生的目的抗体能够高效的结合et
a
r但是不结合et
b
r。
[0046]
据此，本发明针对et
a
r ec1设计短肽。利用iedb与pir软件，依据et
a
r与et
‑
1的直接结合位点、抗原表位设计原则以及et
a
r、et
b
r的ec1与et
‑
1直接结合区域的氨基酸差异构建治疗性短肽：简称rg10。据此利用多肽合成仪合成合适的短肽序列并且采用化学耦联法将该肽段包埋巯基作为第一连接位点。后续通过亲和层析与hplc法纯化与鉴定短肽rg10。
[0047]
与et
‑
1结合后被激活的et
a
r招募rhoe与细胞膜上，已知细胞膜上的rhoe处于不稳定、易被降解状态；位于胞浆中的rhoe处于稳定状态(gohliuhling.jbiolchem,2012,287:31311
‑
20；jiewei.comprphysiol,2015,6:169
‑
86)。因此，et
a
r的活化抑制了rhoe以及下游通路，引起心脏重塑的发生、发展。申报团队通过离体、在体实验确认：在离体水平，治疗性短肽rg10能有效抑制心肌细胞的肥厚与纤维化；在体水平，et
a
r能显著改善心脏重塑的发生、发展。在机制上，本发明发现：治疗性短肽rg10刺激机体产生的目的抗体能够充分阻滞et
‑
1与et
a
r的结合、抑制et
a
r的活化、解除活化的et
a
r通过招募rhoe至细胞膜上引发rhoe的清除和对rhoe下游通路的抑制。由于治疗性短肽rg10主要针对机体自身的胞膜受体et
a
r，免疫原性弱且容易导致免疫耐受。因此，设计、构建、合成、纯化后的rg10需要与蛋白质载体
相耦联并辅以佐剂诱导以打破机体的免疫耐受、使其能够诱导机体产生的高滴度、特异性强、效价持久的目的抗体。该目的抗体能够充分阻滞et
‑
1与et
a
r的结合、解除et
‑
1对et
a
r的活化、释放rhoe至胞浆、由此激活rhoe及其下游通路、改善心脏重塑。
[0048]
进一步的，本发明分别采用破伤风类毒素和钥孔血蓝蛋白klh作为载体蛋白，通过戊二醛耦联法制备短肽rg10的半抗原—耦联蛋白以合成短肽rg10—klh、短肽rg10—破伤风类毒素完全抗原(即治疗性短肽rg10)，以打破机体对短肽的免疫耐受。将本发明设计、构建、合成、纯化的短肽rg10与上述蛋白质载体耦联成为完全抗原后协同福氏佐剂通过皮下多点注射的方法分时多次免疫新西兰大白兔，产生特异性针对et
a
r ec1环、能够有效阻滞et
‑
1与et
a
r结合的目的抗体。2月后处死实验用大白兔，收集血浆。将富含目的抗体的血浆先后经硫酸铵沉淀、亲和沉析纯化以提纯目的抗体，并将获得的目的抗体与过量的短肽rg10孵育以获取相对应的中和化的抗体。随后，完成rg10治疗性短肽的离体功能验证并阐明机制。最后，在心脏重塑的在体动物模型中评估rg10治疗性短肽疫苗的生物学疗效并且评价该治疗性短肽的在体应用安全性。
[0049]
下面将结合具体的附图对本发明上述涉及的具体内容做进一步详细描述：
[0050]
1、et
a
r的氨基酸序列：endothelin
‑
1receptor isoform a precursor[homo sapiens],ncbi reference sequence:np_001948.1:(已知序列)如seq id no：2所示。
[0051]
metlclrasfwlalvgcvisdnperystnlsnhvddfttfrgtelsflvtthqptnlvlpsngsmhnycp
[0052]
qqtkitsafkyintvisctifivgmvgnatllriiyqnkcmrngpnaliaslalgdliyvvidlpinvfk
[0053]
llagrwpfdhndfgvflcklfpflqkssvgitvlnlcalsvdryravaswsrvqgigiplvtaieivsiw
[0054]
ilsfilaipeaigfvmvpfeyrgeqhktcmlnatskfmefyqdvkdwwlfgfyfcmplvctaifytlmtc
[0055]
emlnrrngslrialsehlkqrrevaktvfclvvifalcwfplhlsrilkktvynemdknrcellsflllm
[0056]
dyiginlatmnscinpialyfvskkfkncfqsclccccyqskslmtsvpmngtsiqwknhdqnnhntdrs
[0057]
shkdsmn
[0058]
2、针对et
a
r短肽的设计、构建与合成
[0059]
抗原表位的设计原则：要求具有1.良好亲水性2.处于通道蛋白表面3.尽量选择靠近蛋白的n、c两端4.保证该序列不形成α
‑
螺旋5.序列长度在8
‑
20个氨基残基之间为宜。抗原表位预测思路：1.亲水性2.可及性3.抗原性4.可塑性5.电荷分布平衡6.二级结构预测方案7.同源比对。
[0060]
首先针对et
‑
1的氨基酸序列以及et
a
r的跨膜结构以及氨基酸序列进行分析与评估：通过分析et
a
r/et
b
r、et
‑
1的分子结构以及et
a
r/et
b
r与et
‑
1的结合部位，基于生物信息学技术，依据iedb(immune epitope database)以及pir(the protein inforamtion resource)软件对et
a
r进行线性抗原表位预测并且打分，抗原表位的预测结果如下：
[0061]
(1)亲水性预测：在机体内，疏水性残基一般埋在蛋白质内部，而亲水性残基位于
蛋白质表面。蛋白的亲水部位与蛋白抗原表位有着密切的联系。因此，受体的亲水性残基所在区域与该受体蛋白具备的抗原表位有着密切的联系，直接决定了配体与受体蛋白的结合。
[0062]
et
a
r胞外区的亲水性预测结果：
[0063]
ec1符合亲水性筛选条件的肽段：143agrwpfdhndfgvf156(如seq id no：3所示)，共14个氨基酸。优选肽段146wpfdhndfgv155(如seq id no：4所示)，共10个氨基酸。
[0064]
ec2符合亲水性筛选条件的肽段：
[0065]
227vpfeyrgeqhktcmlnatskfmef250(如seq id no：5所示)，共24个氨基酸；进一步优选肽段：230eyrgeqhktcm240(如seq id no：6所示)，共11个氨基酸。
[0066]
ec3符合亲水性筛选条件的肽段：328lkktvynemdknrcells345(如seq id no：7所示)，共18个氨基酸；进一步优选肽段：334nemdknrcel343(如seq id no：8所示)，共10个氨基酸。
[0067]
特别注意到et
a
r的ec1上具有高度亲水性的氨基酸序列中包括5个特异性的氨基酸：asp(天冬氨酸，d)149
‑
his(组氨酸，h)150
‑
asn(天冬酰胺，n)151
‑
asp(天冬氨酸，d)152
‑
phe(苯丙氨酸，f)153。更加重要的是：et
a
r ec1上的这5个氨基酸序列与et
b
r对应结构的氨基酸序列完全不同。因此，通过构建包括et
a
r ec1上asp149
‑
his150
‑
asn151
‑
asp152
‑
phe153(149dhndf153，如seq id no：9所示)序列的短肽能够高效的结合et
a
r但是不结合et
b
r，如图3所示。
[0068]
(2)线性表位预测：短肽如果能够诱发细胞免疫应答，其结合的受体所对应的抗原表位应该符合线性表位的特点，受体上具备典型线性表位的区域易于同配体高度结合。因此，针对线性表位设计的短肽容易诱发机体产生高效的体液免疫应答，形成高效价、特异性的抗体。基于et
a
r氨基酸序列的线性表位筛选：ecl1的147pfd149(seq id no：10)，ecl2的231yrgeqh236(seq id no：11)，ecl3的334nemdk338(seq id no：12)。
[0069]
(3)抗原性预测：对20个已研究得很透的蛋白质的69个连续位点的606个氨基酸统计分析并由此建立抗原性刻度。每个氨基酸用出现在抗原区的频率描述，此频率除以各氨基酸在所有蛋白质中的频率就可推出此刻度值。从整个et
a
r进行比较：ecl1中的153fgvfck159(如seq id no：13所示)，ecl2中的236hktcmln242(如seq id no：14所示)，ecl3中的341cellsfl347(如seq id no：15所示)抗原性较强。在ecl1范围内进行比较，133dlpinvfkllagrw146(如seq id no：16所示)和150hndfgvflck159(如seq id no：17所示)的抗原性在平均水平之上。在ecl2范围内进行比较，233geqhktcmlnats245(如seq id no：18所示)和248mefyqdvkd256(如seq id no：19所示)的抗原性在平均水平之上。在ecl3范围内，336dknrcellsfl347(如seq id no：20所示)在平均水平之上。
[0070]
(4)可及性预测以及可塑性预测
[0071]
可及性预测是指蛋白质抗原中的氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性。可塑性预测是指蛋白质抗原的空间构象不是刚性不变的，其多肽链骨架有着一定程度的活动性，活动性强的氨基酸残基即可塑性强的位点，易于形成抗原表位。
[0072]
对et
a
r上整个氨基酸序列进行可及性以及可塑性评估，依据抗原的可及性以及可塑性原则优选的肽段为：
[0073]
ec1：肽段147pfdhnd152(如seq id no：21所示)。
[0074]
ecl2：肽段230eyrgeqhktc239(如seq id no：22所示)和肽段251yqdvkd256(如seq id no：23所示)。
[0075]
ecl3：肽段333ynemdknr340(如seq id no：24所示)。
[0076]
综合以上各组氨基酸序列进行抗原表位的亲水性预测、线性抗原表位预测、抗原性预测、可及性以及可塑性预测的结果，再结合et
‑
1与et
a
r/et
b
r的直接结合位点以及et
a
r、et
b
r与et
‑
1相应的结合位点氨基酸序列的差异，最终筛选出能够针对endothelin1—et
a
r且具有良好抗原表位的理想短肽序列如图4所示：其中，et
a
r的149dhndf153氨基酸序列在et
a
r与et
b
r完全不同。因此，构建包括et
a
r ec1上149dhndf153氨基酸的短肽序列产生的目的抗体能够高效的结合et
a
r但是不结合et
b
r。进一步对相应的氨基酸序列进行抗原表位评估，最终选择理想的氨基酸序列作为候选短肽。
[0077]
表1
[0078]
[0079][0080]
基于上述etar的氨基酸序列抗原表位筛选，结合et
‑
1与etar结合的区域以及etar/etbr结构的差异，本发明最终筛选出的氨基酸序列为：145rwpfdhndfg154(如seq id no：1所示)。该短肽序列有望成为针对etar—rhoe通路的理想治疗性短肽。进一步对该短肽进行负电荷评估：该短肽序列不仅通过上述的iedb以及pir等生物信息学软件预测具有良好的亲水性、抗原性，具备线性表位特点，而且有良好的可及性以及可塑性。同时，该短肽序列包含较多的带负电天冬氨酸(d)残基。进一步通过化学耦联技术使该肽段包埋巯基作为第一连接位点。确定短肽序列后，本发明采用动态固相合成法，利用多肽合成仪合成该短肽序列：并采用层析法以及高压液相色谱提纯法对合成的短肽进行提纯以及后续的肽段纯度
分析。纯度分析显示合成短肽的纯度>91％。本发明专利所合成并纯化后获得的短肽编号简称为：rg10。
[0081]
3、将合成、包埋巯基且经过纯化后的短肽rg10与载体：破伤风类毒素或者钥孔血蓝蛋白klh通过戊二醛耦联法进行耦联，耦联成为短肽半抗原—耦联蛋白的完全抗原(即：治疗性短肽rg10)。耦联的方法如下：
[0082]
1)利用多肽合成仪合成并且包埋巯基作为第一连接位点。纯化短肽rg10。将短肽完全溶入等体积ph＝8.9的1x硼酸缓冲液中。2)向硼酸缓冲液中加入载体血蓝蛋白klh或者破伤风类毒素。载体血蓝蛋白klh/破伤风类毒素的质量是短肽rg10质量的9倍。3)将缓冲液振荡混匀，加入新配的0.35％戊二醛缓冲液1ml。37℃孵育4小时，孵育过程中将短肽rg10与载体充分混匀。4)孵育结束后，加入足量甘油充分封闭溶液中未发生反应的戊二醛。37度封闭2小时。5)甘油封闭结束后，将缓冲液置入透析袋中，将其浸入ph＝8.6的硼酸缓冲液中，4℃环境中过夜，期间多次更换硼酸缓冲液。6)透析过夜，获取耦联的短肽rg10半抗原—耦联蛋白(完全抗原：rg10治疗性短肽)。载体蛋白与短肽rg10的耦联效率≥80％。将完全抗原rg10治疗性短肽放入ep管中，负70度低温储存以长期备用。
[0083]
4、向96孔板中包被et
a
r ec1环145rwpfdhndfg154序列的短肽片段，制作用于测定目的抗体滴度的elisa板。
[0084]
5、将治疗性短肽rg10辅以佐剂通过多次、多点皮下注射的方式免疫新西兰兔：分别于第1、20、40天免疫新西兰兔。期间从兔耳缘静脉中取血，离心分离血清。使用包被et
a
r ec1环145rwpfdhndfg154序列短肽片段的96孔板，通过elisa法分别于第15、30、45、60、75天测定治疗性短肽rg10目的抗体的滴度水平，结果显示基于rg10治疗性短肽(完全抗原)辅以佐剂免疫新西兰兔能够产生滴度水平高且滴度维持持久的目的抗体，如图5所示，统计学采用均数
±
标准误表示，n＝9。
[0085]
6、80天后处死经治疗性短肽rg10免疫的新西兰兔以及经生理盐水皮下注射的对照组新西兰兔，离心后采集血清，获取并纯化目的抗体以及对照抗体。
[0086]
采用饱和硫酸铵盐析法提取抗体的方法如下：
[0087]
1)将采集的血清以1500rpm/min离心35分钟以弃去纤维蛋白。2)将获取的血清、生理盐水、饱和的硫酸铵溶液按1:1:2的体积加入分别加入生理盐水、饱和的硫酸铵溶液，稀释后硫酸铵溶液的浓度为50％。4度环境下孵育过夜以充分沉淀。孵育结束后再次以1500rpm/min离心35分钟。弃上清、保留沉淀。3)加入足量的生理盐水充分溶解沉淀。随后加入饱和硫酸铵溶液，调整硫酸铵的终浓度为40％。4度孵育过夜。孵育结束后以1500rpm/min离心35分钟。弃上清、保留沉淀。4)继续加入足量生理盐水充分溶解沉淀，向悬液中加入饱和硫酸铵溶液，调整硫酸铵溶液的终浓度为33.3％。重复3)中的孵育过夜以及离心、弃上清、保留沉淀等操作。5)重复4)中的实验步骤。加入0.8ml pbs缓冲液、完全溶解沉淀。将混悬液加入经过预处理的透析袋中。用缓冲液完全浸没透析袋。4℃静置透析24小时，期间更换透析液3
‑
5次。6)透析结束后，收集到针对et
a
r ec1 145rwpfdhndfg154线性抗原表位的目的抗体。
[0088]
进一步通过亲和层析法纯化以及浓缩治疗性短肽rg10的目的抗体。将盐析后获取的目的抗体经层析仪(bio
‑
rad公司)的protein a层析柱进行充分层析，去除粗提的目的抗体中残留的离子与免疫球蛋白杂质。向经预处理的透析袋中加入经层析纯化后的目的抗
体，将透析袋浸没入pbs缓冲液中，4度透析24小时，期间注意多次更换透析液。通过millipore centriplus10000超滤、浓缩目的抗体以获得纯度和浓度理想的治疗性短肽rg10的目的抗体。
[0089]
将治疗性短肽rg10的目的抗体与过量的短肽rg10孵育以获取治疗性短肽rg10的中和化的抗体。
[0090]
7、离体水平确认治疗性短肽rg10目的抗体的特异性、有效性
[0091]
首先利用乳鼠心室成纤维细胞与乳鼠原代心室肌细胞差速贴壁时间的不同，采用酶解法联合差速贴壁法分离、培养、鉴定乳鼠心室成纤维细胞与原代心室肌细胞。
[0092]
通过免疫荧光法(if)与免疫印迹法(wb)评估治疗性短肽rg10的目的抗体与心肌细胞膜上et
a
r的结合情况。参见图6，目的抗体(anti
‑
et
a
r)的稀释比例为1：400、1：800和1：1600；对照抗体(control
‑
anti)的稀释比例为1：400；中和化的抗体(neutralized
‑
et
a
r)的稀释比例为1：400。从图中可以看出，免疫印迹实验揭示：治疗性短肽rg10的目的抗体能够与心肌细胞膜上的et
a
r特异性结合，对照抗体和中和化的抗体不能与心肌细胞膜上的et
a
r特异性结合。进一步通过激光共聚焦显微镜行免疫荧光双标共定位实验，评估治疗性短肽rg10的目的抗体(红色荧光)与et
a
r的结合情况。免疫荧光实验揭示：治疗性短肽rg10的目的抗体能够与原代心肌细胞膜上的et
a
r特异性结合，如图7所示：control
‑
anti表示rg10治疗性短肽的对照抗体，对照抗体的稀释比例为1:400；anti
‑
et
a
r表示rg10治疗性短肽的目的抗体，目的抗体的稀释比例为1:400；neutralized
‑
et
a
r表示rg10治疗性短肽的中和化的抗体，中和化的抗体的稀释比例为1:400。cy3标记的山羊抗兔荧光二抗；dapi染细胞核。进一步在离体水平评估治疗性短肽rg10对et
‑
1诱导心肌肥厚的影响。专利申报团队发现：10
‑9m的et
‑
1能够诱发乳鼠原代心室肌细胞肥厚；治疗性短肽rg10的目的抗体能够显著改善et
‑
1诱导的心室肌细胞肥厚，如图8所示。wga表示心肌细胞的面积，采用cy3作为荧光标记wga；dapi染细胞核。
[0093]
离体实验进一步揭示：治疗性短肽rg10的目的抗体能够有效抑制血管紧张素ii(angii，10
‑7m)诱导的心室成纤维细胞的增殖与迁移。利用α
‑
sma的表达水平反映心室细胞的纤维化程度，结果发现：治疗性短肽rg10的目的抗体能够显著缓解血管紧张素ii(10
‑7m)诱发的心室纤维化，如图9所示。α
‑
sma表示心室细胞纤维化程度，α
‑
sma的稀释比例为1:150，采用fitc作为荧光标记的山羊抗兔二抗；dapi染细胞核。治疗性短肽rg10的目的抗体能够有效缓解高糖(33mmol/l)诱导的乳鼠原代心室肌细胞凋亡。采用4％福尔马林固定原代心肌细胞，用hoechst33258染液染细胞核。于荧光显微镜下，通过340nm激发光观察：活细胞的细胞核呈弥散、均一的蓝色荧光；凋亡细胞的细胞核或胞浆内可见浓染致密的块状蓝色荧光或者固缩成团块状的蓝色荧光，如图10所示。细胞凋亡率采用均数
±
标准误表示，p<0.05视为有统计学差异，*<0.05vs高糖组。
[0094]
8、离体水平阐明治疗性短肽rg10改善心脏重塑的作用机制
[0095]
本发明通过离体研究进一步阐明治疗性短肽rg10改善心脏重塑的作用机制：治疗性短肽rg10的目的抗体通过特异性的结合et
a
r，阻滞et
‑
1与et
a
r的结合，从而抑制et
‑
1对et
a
r的活化，解除活化的et
a
r对rhoe的招募。通过coip实验加以验证，具体的实验步骤如下：
[0096]
1)弃去细胞培养瓶中的完全细胞培养基，用预冷后的pbs反复洗涤细胞培养瓶多次，弃去沉渣。加入proteintech公司的免疫共沉淀试剂盒中提供的蛋白质裂解液，在冰上
用细胞刮反复、用力的刮细胞培养瓶的瓶底，重复6次，每次刮3分钟，静置。2)采用超声探头在冰上充分裂解蛋白液。3)收集裂解液至ep管并将ep管封口，置于4度预冷过的离心机中，13000转高速离心25分钟。4)弃去沉淀，保留上清。5)根据proteintech公司的免疫共沉淀(ip)试剂盒(immunoprecipitation kit)提供的试剂以及进行免疫沉淀操作。采用proteintech的et
a
r抗体作为ip的抗体(货号：12191
‑1‑
ap)，购买同种属来源的igg作为阴性对照igg。注意ip过程中转子始终处于4度环境，且转子的转速不宜过快。6)向ip液中加入immunoprecipitation kit自带的上样缓冲液。将蛋白质上样液装入ep管中，封口。7)在水浴锅中煮5分钟，注意水浴锅的液面不要浸没ep管。8)后续通过western
‑
blotting法检测收集到的各组ip裂解液中的蛋白质成分。coip实验结果的如图11所示：anti
‑
et
a
r代表治疗性短肽rg10的目的抗体；control
‑
anti代表治疗性短肽rg10的对照抗体；ip：et
a
r表示采用proteintech的et
a
r抗体作为ip的抗体；ip：igg表示采用同种属来源的igg作为阴性对照igg。
[0097]
本发明通过离体研究揭示治疗性短肽rg10改善心脏重塑的机制：治疗性短肽rg10的目的抗体通过特异性的结合et
a
r，阻滞et
‑
1与et
a
r的结合，从而抑制et
‑
1对et
a
r的活化，解除活化的et
a
r对rhoe的招募。由于已知细胞膜上的rhoe处于不稳定、易被降解状态；位于胞浆中的rhoe处于稳定状态(gohliuhling.jbiolchem,2012,287:31311
‑
20；jiewei.comprphysiol,2015,6:169
‑
86)。治疗性短肽rg10的目的抗体通过阻滞et
a
r对rhoe的招募，释放rhoe至胞浆，激活rhoe及其下游通路，由此缓解心脏重塑的发生、发展，改善心功能，治疗心力衰竭。机制图如图12所示：
[0098]
9、在体实验验证治疗性短肽rg10改善心脏重塑的作用
[0099]
分别通过皮下填埋灌注了et
‑
1或者ang ii的alzet渗透压微量泵构建et
‑
1与ang ii诱导的心脏重塑病理模型、予以stz干预构建1型糖尿病诱导的sprague dawley大鼠、balb/c小鼠心脏重塑病理模型。病理模型构建成功后将耦联完全的治疗性短肽rg10辅以佐剂分时、多点皮下注射免疫模型sprague dawley大鼠、balb/c小鼠。
[0100]
首先通过visual sonics vevo 770小动物高分辨率超声系统行m型心脏超声评估balb/c小鼠心脏的lvef和lvfs提示：rg10治疗性短肽能够显著缓解病理刺激诱发的小鼠心脏功能减退，治疗病理刺激诱发的小鼠心力衰竭，如图13、图14所示：图13lvef代表左室射血分数；图14lvfs代表左室短轴缩短率；统计学采用均数
±
标准误表示，
*
p<0.05vs control组；p<0.05vs et
‑
1组；p<0.05vs et
‑
1+rg10组；
§
p<0.05vsangii组；
#
p<0.05vsang ii+rg10组；p<0.05vs high glucose组，n＝6。后续分别采用masson染色、天狼星红染色评估rg10治疗性短肽对et
‑
1、ang ii以及1型糖尿病模型诱导的balb/c小鼠心脏纤维化的影响，结果显示：治疗性短肽rg10能够缓解病理刺激诱发的小鼠心脏纤维化。利用体式显微镜，通过偏振光评价balb/c小鼠不同干预组的心脏纤维化程度以及balb/c小鼠不同干预组心脏纤维组织中i型胶原纤维和iii型胶原纤维比例的天狼星红染色结果如图15所示，在偏振光下，i型胶原纤维呈现红色或黄色两种颜色；iii胶原纤维型呈现淡绿色。
[0101]
为进一步评估治疗性短肽rg10对balb/c小鼠心肌肥厚的影响，申报者通过h&e染色结合纵切四腔图进行评价，结果发现：治疗性短肽rg10能够有效缓解et
‑
1诱导balb/c小鼠的心肌肥厚，如图16所示。通过腹腔注射stz构建balb/c小鼠的1型糖尿病心肌病模型，结果发现：1型糖尿病心肌病组balb/c小鼠的心肌细胞凋亡率升高；治疗性短肽rg10能够改善
1型糖尿病诱导的balb/c小鼠心肌细胞凋亡，如图17所示。
[0102]
10、评价治疗性短肽rg10在体应用的安全性
[0103]
在体实验结束后，留取balb/c小鼠以及sprague dawley大鼠的心脏、肺部、肾脏、肝脏等重要组织器官，行组织病理学检测。选取表面抗原cd14作为单核—巨噬细胞的表面标记，采用免疫组化法评估各重要组织器官中单核—巨噬细胞的浸润情况，以此评估治疗性短肽rg10对机体各重要组织器官有无免疫相关的炎性损伤。在体应用安全性评价提示：治疗性短肽rg10对心脏、肝脏、肾脏、肺部无免疫相关的炎性损伤，如图18、19、20、21所示。
[0104]
综上，本发明通过分析et
a
r/et
b
r的分子结构以及氨基酸序列、et
a
r/et
b
r与配体et
‑
1的直接结合部位以及对结合配体et
‑
1有重要影响的部位、et
a
r/et
b
r直接结合et
‑
1部位的氨基酸差异性，结合生物信息学的iedb、pir软件进行抗原表位赋值评估以及后续离体的短肽筛选，确认本治疗性短肽针对et
a
r抗原表位的氨基酸序列为：et
a
r ec1的145rwpfdhndfg154。通过多肽合成仪合成短肽145rwpfdhndfg154(将其命名为：rg10)，包埋巯基作为连接位点、纯化该短肽。利用戊二醛耦联法将rg10短肽与载体血蓝蛋白klh或者破伤风类毒素相耦联，耦联成为短肽rg10—偶联蛋白的完全抗原(即：治疗性短肽rg10)，评价短肽与载体的耦联效率。
[0105]
将该治疗性短肽的全抗原辅以福氏佐剂多点、多次皮下免疫新西兰兔，获取持续时间较长且滴度高的目的抗体。处死家兔，取血清，经硫酸铵沉淀以及纯化后获得治疗性短肽rg10的目的抗体。将rg10的目的抗体与过量的短肽rg10孵育，获得针对rg10治疗性短肽的中和化的抗体。分离、培养乳鼠原代心室肌细胞与成纤维细胞，离体水平上分别予以et
‑
1、ang ii、高糖刺激构建细胞的肥厚、纤维化与凋亡模型；加入对照抗体、rg10的目的抗体、rg10的中和化的抗体与之孵育，在离体水平检验短肽rg10的目的抗体结合et
a
r的特异性及其由此阻滞et
‑
1生物学效应的有效性。离体评估rg10的目的抗体改善心室肌细胞肥厚、缓解心室纤维化、改善心室肌细胞凋亡的有效性。进一步评价rg10的目的抗体对于rhoe表达水平、胞内定位的影响以及对rhoe通路的激活、从而阐明短肽rg10改善心脏重塑的分子机制。rg10与蛋白质载体耦联成的全抗原(即：治疗性短肽rg10)辅以福氏佐剂免疫sprague dawley大鼠、balb/c小鼠，评估其在体改善心脏重塑的效果。最后，检验该短肽疫苗对心脏、肝脏、肾脏、肺部等机体重要组织器官的影响，检验上述组织器官有远期免疫损伤，进一步评估治疗性短肽rg10免疫机体的在体应用安全性。
[0106]
本发明通过设计、构建、合成的短肽rg10与载体klh蛋白或者破伤风类毒素通过戊二醛耦联法耦联并且包被巯基成为全抗原：治疗性短肽rg10。将该治疗性短肽辅以福氏佐剂即可诱导机体产生针对et
a
r的抗体滴度水平高且作用持久的目的抗体。在体以及离体研究进一步揭示：所述治疗性短肽rg10辅以福氏佐剂刺激机体产生的目的抗体通过特异性结合et
a
r的ec1，阻滞et
‑
1与et
a
r的结合，抑制et
‑
1活化后的et
a
r对rhoe的招募，释放rhoe至胞浆，从而激活rhoe及其下游通路，改善心脏重塑，如前述的机制图12所示。所述治疗性短肽rg10不仅能够在离体以及在体水平上显著改善病理干预诱发的心脏重塑。更重要的是，所述治疗性短肽rg10的目的抗体对机体重要组织器官无免疫相关的炎性损伤。因此，所述治疗性短肽rg10的在体应用安全性好，可能具有重大的临床开发前景。此外，本发明所述的短肽rg10作为短肽序列只有10个氨基酸的短肽，其合成、包被巯基、纯化的速度快捷且价格低廉，与载体klh蛋白或者破伤风类毒素的耦联效率高，辅以福氏佐剂免疫机体产生的目的抗
体针对et
a
r的特异性强。因此，治疗性短肽rg10作为改善心脏重塑的全新治疗途径，其未来临床开发、应用的潜力巨大。