一种特异性结合RIPK3的多肽及其用途的制作方法

一种特异性结合ripk3的多肽及其用途
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特异性结合ripk3的多肽及其在制备药物中的应用。


背景技术：

2.急性肺损伤是一种威胁生命的呼吸系统疾病，在世界范围内具有高发病率以及高死亡率。急性肺损伤的特征是肺部炎症，包括肺泡上皮细胞以及内皮细胞的损伤、肺水肿以及中性粒细胞的浸润。严重的急性肺损伤会发展成为急性呼吸窘迫综合征。随着急性呼吸窘迫综合征的疾病进展，它会导致许多肺部并发症，最终将导致气体交换困难以及呼吸衰竭。因此，在早期对急性肺损伤病程的缓解对于控制急性呼吸窘迫综合征至关重要。尽管在过去十几年里，有许多关于急性肺损伤的病理生理学研究，但是还是缺少针对急性肺损伤以及急性呼吸窘迫综合征的具体治疗方法，急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征的治疗策略必须考虑3个因素：1.潜在疾病的治疗；2.机械通气，确保氧气的畅通以及二氧化碳的消除；3.更改对于治疗特定肺部疾病的辅助程序。
3.肺泡上皮细胞损伤与急性肺损伤的发病机制密切相关，当发生损伤时，存在明显的肺泡上皮细胞损伤，损伤后的上皮细胞修复机制会遭到破坏，与此同时肺部会伴随肌成纤维细胞过度活化(即肺纤维化)和细胞外基质沉积。肺泡上皮细胞包括i型肺泡上皮细胞(aec i)以及ii型上皮细胞(aec ii)两种。aec i覆盖了肺泡95％的表面积，呈扁平状结构，aec i直接与肺部毛细血管接触，它们构成了机体与外界进行气体交换的气血屏障。aec ii是肺泡微环境中的干细胞，呈方形，具有自己独特的亚细胞结构如板层小体，在正常的生理状况下，aec ii能够合成表面活性物质，通过板层小体与细胞膜的融合释放表面活性物质到肺泡腔中维持表面张力确保肺泡微环境的稳态。肺表面活性物质主要由脂质以及蛋白质组成，其中脂质占比90％。目前治疗急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征的药物多为抗生素以及皮质醇类药物，暂无针对肺部细胞生物学功能的药物。临床用治疗肺纤维化的药物包括吡非尼酮和尼达尼布等，但这些药物治疗效果差强人意，仅能延缓轻到中度肺纤维化患者疾病进程。
4.当发生急性肺损伤时，肺泡上皮受损，上皮细胞会发生坏死性凋亡，坏死性凋亡的两个关键蛋白，ripk3(receptor interacting protein kinase 3，受体相互作用蛋白激酶)以及mlkl(mixed lineage kinase domain-like protein)及其磷酸化形式表达上调。aec i细胞本无增殖能力，肺损伤后的aec i主要由aec ii增殖分化来补充，而当aec ii发生肺损伤时，不仅肺表面活性物质显著减少，肺泡微环境稳态失衡，同时其向aec i分化的能力丧失，也促进了急性肺损伤的疾病进展。因此抑制上皮细胞的坏死性凋亡，恢复其原有的功能，可能在急性肺损伤的转归以及药物开发中具有重要意义。
5.坏死性凋亡的主要分子机制是：活化的ripk3能够使mlkl磷酸化，而磷酸化的mlkl会发生寡聚化，随后从胞浆移位到胞膜上结合特定的脂质，进而对胞膜进行打孔，之后钙离子、钠离子会内流，最终会使细胞膜涨裂，引起细胞坏死性凋亡。因此mlkl在坏死性凋亡时
起到了一个“行刑者”的角色。因此急需研究和开发阻断ripk3磷酸化mlkl的抑制剂等药物，以能够预防或治疗急性肺损伤等呼吸系统疾病。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中缺乏能够有效预防或治疗急性肺损伤等呼吸系统疾病的药物的缺陷，提供了一种能够特异性结合ripk3蛋白的多肽、融合蛋白及其应用。本发明所述的多肽、融合蛋白与ripk3蛋白特异性结合且具有较高的亲和力，能够阻断ripk3蛋白和mlkl蛋白的结合，能够与mlkl竞争性地结合ripk3，抑制ripk3介导的mlkl信号轴。将本发明所述的多肽、融合蛋白应用于制备预防和/或治疗疾病的药物特别是制备预防或治疗呼吸系统疾病例如肺纤维化、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等的药物中时，能够显著改善肺功能，疗效显著，包括能够显著抑制上皮细胞的坏死性凋亡、显著恢复急性肺损伤动物的肺功能、改善肺纤维化的程度、降低肺组织的羟脯氨酸含量等优点。
7.本发明人在研究靶向抑制ripk3/mlkl信号通路的过程中，发现制备ripk3/mlkl相互作用的干扰肽存在极大困难。蛋白与蛋白之间相互作用界面的确定需要通过反复的分子生物学实验确认才可知晓，在确定ripk3/mlkl相互作用结构域后需要进一步通过计算机建模等手段分析这些结构域的蛋白质二级结构，在这些二级结构中本发明人经过大量验证、筛选出众多序列后，发现最终筛选出的8条α螺旋序列的效果较佳，本发明人进一步通过成功合成这些序列中部分或全部氨基酸后才可以进一步测试多肽与靶点的亲和力后发现，使用本发明所述的多肽、融合蛋白与ripk3蛋白特异性结合且具有较高的亲和力，能够阻断ripk3蛋白和mlkl蛋白的结合，能够与mlkl竞争性地结合ripk3，抑制ripk3介导的mlkl信号轴，进而将其用于预防和/或治疗例如肺纤维化、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等呼吸系统疾病时疗效显著。
8.为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种特异性结合ripk3的多肽，所述多肽的氨基酸序列如seq id no:1或其变体所示；
9.所述变体为在如seq id no:1所示氨基酸的任何位置，可适当引入一些氨基酸替换、缺失或添加，只要改变后的氨基酸序列仍能形成与ripk3蛋白特异性结合的多肽且该多肽依然能够保持改变前的活性，从而能够靶向抑制ripk3/mlkl信号通路即可；优选与如seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，更优选为至少90％序列同一性，进一步更优选为至少95％、96％、97％、98％序列同一性，最优选为至少99％序列同一性。
10.在某一较佳实施例中，所述变体为将如seq id no:1所示氨基酸中的不为丙氨酸的任一氨基酸单突变为丙氨酸(a)，且所述变体具有特异性结合ripk3的活性。在某一较佳实施例中，所述变体为将如seq id no:1所示氨基酸中的任一丙氨酸(a)单突变为甘氨酸(g)，且所述变体具有特异性结合ripk3的活性。例如所述变体的氨基酸序列可以如seq id no:11-29任一所示，例如优选如seq id no:15、23或26所示。
11.为解决上述技术问题，本发明第二方面提供了一种融合蛋白，其包括如本发明第一方面所述的多肽，和细胞穿膜肽。
12.本发明所述的细胞穿膜肽为本领域的常规细胞穿膜肽，只要所述的细胞穿膜肽能够辅助将所述多肽送入细胞发挥作用即可，一般而言，所述的细胞穿膜肽为10-30个氨基酸组成的短肽分子。所述的多肽衍生物较佳地是将细胞穿膜肽的c端连接mk-1序列所形成的
嵌合肽。所述的细胞穿膜肽较佳地连接在上述多肽的n端或者c端，更佳地为上述多肽的n端。在某一较佳实施例中，所述细胞穿膜肽的氨基酸序列如seq id no:3所示。在某一较佳实施例中，连接了穿膜肽的所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
13.为解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种基因，其编码如本发明第一方面所述的多肽，或编码如本发明第二方面所述的融合蛋白。
14.为解决上述技术问题，本发明第四方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体中含如本发明第三方面所述的基因。
15.为解决上述技术问题，本发明第五方面提供了一种转化体，其包括如本发明第三方面所述的基因或者如本发明第四方面所述的重组表达载体。
16.为解决上述技术问题，本发明第六方面提供了一种多肽、或融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：
17.(1)获得如本发明第五方面所述的转化体；
18.(2)筛选所述转化体，表达并纯化所述融合蛋白。
19.为解决上述技术问题，本发明第七方面提供了一种药物组合物，其活性成分含有如本发明第一方面所述的多肽、或如本发明第二方面所述的融合蛋白。
20.较佳地，所述活性成分为单一活性成分。
21.较佳地，所述活性成分还包括其它。在所述药物组合物中，所述特异性结合ripk3的多肽、或所述融合蛋白可以作为单一活性成分，或者也可以是与其它预防和/治疗呼吸系统疾病的药物联合作为活性成分，例如其他预防和/治疗肺纤维化、急性肺损伤和/或急性呼吸窘迫综合征等呼吸系统疾病的药物联合作为活性成分。
22.较佳地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。所述可特异性结合ripk3的多肽可以和药学上可接受的载体制备预防和/或治疗例如肺纤维化、急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征等呼吸系统疾病。其中所述的药学上可接受的载体可根据药物剂型进行常规选择，如稀释剂、填充剂等。
23.较佳地，所述药物组合物为通过注射给药或口服给药的药物组合物。
24.为解决上述技术问题，本发明第八方面提供了一种如本发明第一方面所述的多肽、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第三方面所述的基因、如本发明第四方面所述的重组表达载体和/或如本发明第五方面所述的转化体在制备药物中的应用。
25.较佳地，所述药物为预防和/或治疗与ripk3蛋白及mlkl蛋白相关的疾病的药物。
26.较佳地，所述药物为预防和/治疗呼吸系统疾病的药物；所述呼吸系统疾病优选包括肺纤维化、急性肺损伤和/或急性呼吸窘迫综合征。
27.较佳地，所述药物为能够抑制上皮细胞的坏死性凋亡、恢复急性肺损伤动物的肺功能、改善肺纤维化的程度和/或降低肺组织的羟脯氨酸含量的药物。
28.为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的多肽、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第三方面所述的基因、如本发明第四方面所述的重组表达载体和/或如本发明第五方面所述的转化体在预防和/或治疗与ripk3蛋白及mlkl蛋白相关的疾病中的应用、在预防和/治疗呼吸系统疾病中的应用、在抑制上皮细胞的坏死性凋亡、恢复急性肺损伤动物的肺功能、改善肺纤维化的程度、和/或降低肺组织的羟脯氨酸含量中的应用。
29.较佳地，所述呼吸系统疾病包括肺纤维化、急性肺损伤和/或急性呼吸窘迫综合征。
30.本发明中，所述的肺纤维化包括特发性肺纤维化及其它肺部疾病所致的肺纤维化。
31.本发明中所述的“急性肺损伤”、“急性呼吸窘迫综合征”是指：各种直接或者间接因素导致的肺泡上皮细胞损伤、肺部表面活性物质降低，大量蛋白聚集造成的急性肺水肿，导致的严重的急性呼吸衰竭，氧合指数(动脉氧分压/吸入氧分数)＜300，影像学表现为两肺渗出性病变。急性呼吸窘迫综合征较急性肺损伤为更严重的疾病阶段，氧合指数一般＜200。基本可分为两个阶段，第一阶段为早起渗出期，表现为肺泡损伤、肺水肿、上皮细胞坏死，炎症细胞聚集。第二阶段为纤维增生期，表现为成纤维细胞增生，aec ii增生，修复重塑肺组织。
32.本发明所述多肽、所述融合蛋白等作为活性成分用于制备预防和/或治疗例如肺纤维化、急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征等呼吸系统疾病的药物。其中，所述的预防和/或治疗例如肺纤维化、急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征等呼吸系统疾病的药物中包含预防或治疗有效量的本发明所述多肽、所述融合蛋白中的一种或多种。其中，“预防和/或治疗有效量”是指在给予所需对象足以有效预防或治疗本技术所述的疾病或病症的多肽、或融合蛋白的量。虽然构成“预防或治疗有效量”的多肽包含其的融合蛋白的量将根据多肽或包含其的融合蛋白、病症及其严重度、以及欲治疗所需对象的年龄而变化，但可由本领域技术人员以常规方式确定。本发明所述的药物在治疗时的使用剂量较佳地为0.1～15mg/kg,更佳为5～10mg/kg,优选为5mg/kg，给药次数较佳为一天一次或者数次。
[0033]“所需对象“是指在任何可能的呼吸系统疾病(例如肺纤维化、急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征)因素的存在下，可能患有本技术所述疾病或者病症的温血动物；或者患有本技术所述疾病和病症的温血动物，如哺乳动物，本发明优选人类或小鼠。
[0034]
本发明所述的预防或者治疗呼吸系统疾病(例如肺纤维化、急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征)的药物的剂型没有特别限制，为本领域常规剂型，如固体、半固体、液体，水溶液、非水溶液或者混悬液，较佳为固体、半固体，更佳为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂。所述的药物给药途径为本领域常规给药途径，较佳为注射给药或者口服给药。其中注射给药包括：静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或者皮下静脉注射途径。
[0035]
本发明所述“预防“是指在可能的呼吸系统疾病(例如肺纤维化、急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征)因素的存在下，使用后放置或者降低呼吸系统疾病(例如肺纤维化、急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征)的产生。本发明所述”治疗“是指减轻呼吸系统疾病(例如肺纤维化、急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征)的疾病情况或者使之正常化，或者是延缓疾病进程。
[0036]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0037]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0038]
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的多肽、融合蛋白与ripk3蛋白特异性结合且具有较高的亲和力，能够阻断ripk3蛋白和mlkl蛋白的结合，能够与mlkl竞争性地结合ripk3，抑制ripk3介导的mlkl信号轴。将本发明所述的多肽、融合蛋白应用于制备预防和/
或治疗疾病的药物特别是制备预防或治疗呼吸系统疾病例如肺纤维化、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等的药物中时，能够显著改善肺功能，疗效显著，包括能够显著抑制上皮细胞的坏死性凋亡、显著恢复急性肺损伤动物的肺功能、改善肺纤维化的程度、降低肺组织的羟脯氨酸含量等优点。
具体实施方式
[0039]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0040]
实施例中所述的pbs，指浓度为0.1m，ph值为7.2的磷酸盐缓冲液。
[0041]
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，较佳地为20～30℃。
[0042]
实施例中所述的小鼠均为c57bl/6小鼠，均购自于斯贝福(北京)生物技术有限公司。
[0043]
实验结果用均值
±
标准误表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p《0.05认为有显著性差异，p《0.01认为有极其显著性差异。
[0044]
实施例1多肽合成
[0045]
使用多肽固相合成仪进行多肽合成与ripk3蛋白结合的mlkl蛋白的假激酶结构域具有的8条α螺旋肽，此过程的多肽均由安徽省国平药业有限公司合成并纯化。其具体步骤如下：
[0046]
1.称量rink树脂0.5g，放入反应器中，用二氯甲烷浸泡10min后用二甲基甲酰胺洗涤2次，再用二氯甲烷洗涤一次，脱fmoc(20％哌啶+80％二甲基甲酰胺)，脱保护20min后用二甲基甲酰胺洗涤5次，每次30s。取少量树脂100℃茚三酮检测显色。
[0047]
2.称量第一个aa[fmoc-his(trt)-oh,n-fmoc-n'-三苯甲基-l-组氨酸]和hobt(羟基苯并三唑)(0.5g*0.3mmol/g*1.33＝0.1995mmol),用二氯甲烷溶解，加入1ml二异丙基碳二亚胺,摇匀后加入装有树脂的反应器中，摇晃或氮气鼓泡反应90min，反应过程中二氯甲烷挥发，需要补加二氯甲烷。
[0048]
3.反应结束后，用二甲基甲酰胺洗涤5次，加入1ml醋酸酐和5ml二氯甲烷，1ml的二异丙基乙胺封闭反应30min后，二甲基甲酰胺洗涤树脂三次。
[0049]
4.脱fmoc(20％哌啶+80％二甲基甲酰胺),脱保护20min后用二甲基甲酰胺洗涤5次，每次30s。取少量树脂100℃茚三酮检测显色。
[0050]
5.称量下一个氨基酸(0.15mmol*3＝0.45mmol)和0.45mmol hobt,用二甲基甲酰胺溶解加入2ml二异丙基碳二亚胺，活化1min加入反应器中反应1h。反应结束后取少量树脂检测无色即可，若有颜色需要重复投料。
[0051]
6.重复4和5，直到肽链合成结束。
[0052]
7.最后加入1ml醋酸酐和5ml二甲基甲酰胺，1ml的diea封闭反应30min后二甲基甲酰胺洗涤树脂三次。
[0053]
8.用甲醇洗涤三次抽干称重，然后加入切割液(95％三氟乙酸-2％三异丙基硅烷2％1,2-乙二硫醇1％纯水)比例1g树脂：10ml切割液。室温裂解2h，后过滤得到裂解液，加入乙醚(1ml裂解液:8ml乙醚)摇匀离心得到粗品肽。
[0054]
实施例2表面等离子共振法测定多肽与ripk3蛋白的结合能力
[0055]
表面等离子共振实验在表面等离子共振仪biacore s200中进行，操作步骤严格按照等离子共振仪biacore s200的说明书进行，具体步骤如下：
[0056]
1.将纯化的ripk3蛋白(购自mybiosource公司，货号：mbs1413422)通过氨基耦联到cm5芯片上(芯片购自ge公司，货号：br100012)，按10μl/min的流速洗脱除去未结合的蛋白，平衡芯片表面2小时。具体的氨基耦联、洗脱以及平衡的步骤参见ge公司cm5芯片的说明书。
[0057]
2.使用自动进样器进样150μl不同浓度(10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.15625,0.078125,0.0390625,0.01953125μm)的实施例1中所制备的8条α螺旋肽片段(如下述mk1-8所示)，所有实验均在25℃的条件下进行。实验中的缓冲液为pbs-ep缓冲液(0.001m pbs、0.15m nacl、3mm edta和0.005％表面活性剂)。用biacore s200自带分析软件模拟不同浓度多肽与ripk3的结合曲线，计算出多肽与ripk3蛋白的亲和力，得到与ripk3结合能力较强的多肽，其中mk5(seq id no:1)的亲和力最好，用以之后实验：
[0058]
mk1：glu-ser-val-gly-ile-val-arg-phe-thr-phe-asn-asp-glu-ile-lys-thr-met-lys-lys-phe(seq id no:4)
[0059]
kd＝1232
±
169nm,rmax(ru)＝46.73
±
7.6。
[0060]
mk2：asp-ser-lys-lys-ile-arg-glu-leu-val-ala-glu-asp(seq id no:5)
[0061]
kd＝1592
±
234nm,rmax(ru)＝27.4
±
3.3。
[0062]
mk3：pro-glu-leu-leu-arg-glu-ile-ile-asn-glu-cys-arg(seq id no:6)
[0063]
kd＝2730
±
113nm,rmax(ru)＝67.23
±
11.4。
[0064]
mk4：ser-gly-arg-glu-arg-ile-leu-glu-arg-leu-ser-ala-val-glu(seq id no:7)
[0065]
kd＝2140
±
423nm,rmax(ru)＝76.4
±
9.6。
[0066]
mk5：gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-ala-ala-arg-gly-leu-tyr-arg-leu-his-his(seq id no:1)
[0067]
kd＝690
±
133nm,rmax(ru)＝127.4
±
17。
[0068]
mk6：phe-thr-phe-asn-asp-glu-ile-lys-thr-met-lys-lys(seq id no:8)
[0069]
kd＝2223
±
321nm,rmax(ru)＝22.3
±
3.5。
[0070]
mk7：ser-lys-thr-gln-asn-ser-ile-ser-arg-thr(seq id no:9)
[0071]
kd＝1657
±
521nm,rmax(ru)＝48.4
±
6.7。
[0072]
mk8：his-leu-tyr-val-ser-pro-trp-ser-lys-thr-gln-asn-ser-ile-ser-arg-thr(seq id no:10)
[0073]
kd＝1986
±
107nm,rmax(ru)＝69.4
±
9.1。
[0074]
实施例3 elisa方法验证肽段与蛋白ripk3的结合
[0075]
具体操作步骤如下：
[0076]
1.将小鼠ripk3蛋白及牛血清白蛋白(bsa)用pbs稀释至10μg/ml,每孔添加100μl，4℃包被96孔板过夜。
[0077]
2.用含有0.1％tween-20 pbs洗板3次，每次5min,用200μl封闭液(10％牛血清pbs)包板，37℃包被3h。
arg-leu-his-his(seq id no:19)
[0096]
mk5mut10：gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-gly-ala-arg-gly-leu-tyr-arg-leu-his-his(seq id no:20)
[0097]
mk5mut11：gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-ala-gly-arg-gly-leu-tyr-arg-leu-his-his(seq id no:21)
[0098]
mk5mut12：gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-ala-ala-ala-gly-leu-tyr-arg-leu-his-his(seq id no:22)
[0099]
mk5mut13：gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-ala-ala-arg-ala-leu-tyr-arg-leu-his-his(seq id no:23)
[0100]
mk5mut14：gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-ala-ala-arg-gly-ala-tyr-arg-leu-his-his(seq id no:24)
[0101]
mk5mut15：gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-ala-ala-arg-gly-leu-ala-arg-leu-his-his(seq id no:25)
[0102]
mk5mut16：gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-ala-ala-arg-gly-leu-tyr-ala-leu-his-his(seq id no:26)
[0103]
mk5mut17：gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-ala-ala-arg-gly-leu-tyr-arg-ala-his-his(seq id no:27)
[0104]
mk5mut18：gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-ala-ala-arg-gly-leu-tyr-arg-leu-ala-his(seq id no:28)
[0105]
mk5mut19：gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-ala-ala-arg-gly-leu-tyr-arg-leu-his-ala(seq id no:29)
[0106]
实施例5 elisa方法验证肽段mk5突变体与蛋白ripk3的结合按照实施例3中的方法验证肽段mk5突变体与蛋白ripk3的结合。
[0107]
结果表明：mk5突变体与ripk3蛋白均有一定结合能力，且亲和力较mk5相当。结果以各孔od450来反应，见表2。
[0108]
表2多肽与ripk3蛋白的亲和力
[0109][0110][0111]
实施例6蛋白免疫印迹检测多肽打断ripk3蛋白与mlkl蛋白的结合的影响
[0112]
具体操作步骤如下：
[0113]
1.收集对数生长的293细胞，用imdm培养基调整调整细胞浓度，制备成细胞悬液，细胞浓度为2x106个/ml。
[0114]
2.将细胞均匀铺置10cm皿中，待细胞贴壁完全后，使用ripk3-myc，mlkl-ha的过表达质粒进行转染，转染36小时后，收集细胞。
[0115]
3.使用co-ip裂解液裂解细胞，将所得的裂解液上清均匀分成3份，分别标号1，2，3。各取50μl裂解液上清，加入12.5μl的5x蛋白loading。98℃变性10min。
[0116]
4.在3号管中加入mk5多肽，浓度为1μg/ml，并且在2，3号管中加入anti-myc的一抗，1号管中不加多肽，4℃旋转过夜。
[0117]
5.按照《分子克隆》所述方法进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，进行免疫印迹检测。
[0118]
6.使用anti-ha的抗体检测mlkl的表达量，免疫印迹的结果利用image j软件进行定量分析，通过与2号管样品的比值，来确定mk5对ripk3-mlkl相互作用的打断能力。结果见表3。
[0119]
表3体外验证多肽mk5打断ripk3-mlkl相互作用能力
[0120]
管号灰度值与对照组的比值1-2130.2
[0121]
结果表明：mk5多肽具有打断ripk3-mlkl相互作用的能力。
[0122]
实施例7竞争性elisa法验证多肽mk5可竞争mlkl与ripk3蛋白的结合
[0123]
具体操作步骤如下：
[0124]
1.将小鼠ripk3蛋白及牛血清白蛋白(bsa)用pbs稀释至10μl/ml,每孔添加100μl，4℃包被96孔板过夜。
[0125]
2.用含有0.1％tween-20 pbs洗板3次，每次5min,用200μl封闭液(10％牛血清pbs)包板，37℃包被3h。
[0126]
3.弃去包被液，对应加入1μg/ml的ripk3蛋白溶液200μl，37℃孵育2h。
[0127]
4.用含有0.1％tween-20 pbs洗5次，每次3min。每孔加入100μl封闭液作为对照及100μl使用封闭液稀释的辣根过氧化氢酶标记的多肽mk5，室温孵育1h。
[0128]
5.用含有0.1％tween-20 pbs洗5次，每次3min。配制底物显色液(100mmol/l乙酸钠，ph 6.0，每50ml缓冲液加入10μl 30％过氧化氢，100μg/ml tmb)，每孔加入100μl，室温孵育5min。每孔加入50μl 0.1m稀硫酸，终止反应。
[0129]
6.结果以样品孔的od450来反映，结果见表4。
[0130]
结果表明mk5可以竞争mlkl蛋白与ripk3蛋白的结合。
[0131]
表4多肽mk5竞争mlkl结合ripk3的结合
[0132]
mk5(od450数值)bsa(od450数值)p值2.060.12《0.00012.210.11 2.140.14 [0133]
实施例8流式细胞术检测多肽的穿膜能力
[0134]
由于用于体外的mk5不能穿过细胞膜，故在mk5肽段n端加上穿膜肽，其序列为hlyvspw(seq id no:3)，组成新的衍生物，命名为pmk5，其序列为:his-leu-tyr-val-ser-pro-trp-gly-gly-arg-ser-leu-leu-val-leu-arg-ala-ala-arg-gly-leu-tyr-arg-leu-his-his(seq id no:2)，该多肽由安徽省国平药业有限公司合成并纯化，纯度＞95％。使用多肽pmk5进行体内生物学验证。
[0135]
流式细胞术检测多肽穿过细胞膜的能力，其具体步骤如下：
[0136]
1.收集对数生长期的293细胞，用imdm培养基调整细胞浓度，制成2x105个/ml的细胞悬液。
[0137]
2.将2ml步骤1所制得的细胞悬液加入6孔板进行培养，12小时后换液，在每孔中分别加入1μg/ml用fitc荧光基团标记的多肽pmk5及未加穿膜肽的多肽mk5。
[0138]
3.6小时后，收集细胞，离心后用pbs重悬细胞。
[0139]
4.使用流式细胞仪，激发光488nm，发射波长为530nm，测定细胞内荧光的强弱，计算荧光阳性细胞占总细胞的百分比。结果如表5所示。
[0140]
结果表明：与对照肽相比，pmk5穿膜能力显著增加。
[0141]
表5流式细胞术检测mk5、pmk5的穿膜能力
[0142] mk5pmk5fitc阳性细胞占比2.7％82％
[0143]
实施例9 pmk5抑制小鼠原代二型上皮细胞坏死性凋亡的比例
[0144]
本例实验均在小鼠原代二型上皮细胞上进行，具体操作步骤如下：
[0145]
a.小鼠解剖
[0146]
1.使用三溴乙醇麻醉小鼠。
[0147]
2.解剖小鼠，打开胸腔，暴露肺以及心脏。
[0148]
b.心脏灌流
[0149]
1.剪开右心耳。
[0150]
2.使用1ml注射器的针头，20ml注射器进行灌注20ml生理盐水。
[0151]
3.肺部变成白色后停止灌注。
[0152]
c.气管插管
[0153]
1.翻转解剖板，使小鼠的头部接近操作人员。
[0154]
2.使用镊子与剪刀暴露气管。
[0155]
3.使用细线将气管插管置于适当位置，不能太深，防止气管插管进入分支，不能太浅，防止气管插管滑出。
[0156]
d.分散酶以及琼脂糖灌注
[0157]
1.使用5ml注射器吸取2ml配置好的分散酶。
[0158]
2.使用1ml注射器吸取500μl琼脂糖，琼脂糖提前于金属浴中加热
[0159]
3.缓慢注入分散酶，肺充分鼓起后，快速更换注有琼脂糖的注射器，可以用拇指抵住套管针口，防止分散酶溢出，而后将琼脂糖轻轻注入肺中，将注射器留在原位，用碎冰覆盖肺部使琼脂糖固化。
[0160]
4.松开手术线，将注射器与套管取出。
[0161]
e.分散酶消化
[0162]
1.在培养皿中用生理盐水冲洗肺部表面，分离单个肺叶，同时取出其余组织与肺外气道。
[0163]
2.将肺叶放入含有2ml分散酶的50ml离心管中
[0164]
3.37℃150rpm摇床孵育30min。
[0165]
f.制备单细胞悬液
[0166]
1.将消化的肺移至装有7ml dmem培基(10％fbs,1％p.s，dnase i:4ml培基加10μl dnase i)。
[0167]
2.用镊子分离大气管，并分离肺液中的细胞。
[0168]
3.过70μm滤器，第一遍用2ml培基重悬并冲洗。
[0169]
4.过40μm滤器，制成粗制单细胞悬液。
[0170]
5.300g，4℃离心15min。
[0171]
6.将底部的细胞轻轻弹起，加入10ml破红液，室温破红10min。
[0172]
7.300g,4℃离心15min,弃去破红液。
[0173]
8.使用1ml培基重悬底部细胞，过70μm滤器于1.5ml的离心管中。
[0174]
g.dynabeads磁珠阴性筛选
[0175]
1.在1.5ml的离心管中加入生物素标记的抗体，分别如下：
[0176]
anti-cd45:hematopoietic cells；alveolar macrophages(货号：103104)
[0177]
anti-cd16/32:alveolar macrophages(货号：101303)
[0178]
anti-cd31:endothelial cells(货号：102504)
[0179]
anti-ter119：erythroid cells(货号：116204)
[0180]
anti-integrinβ4：club cells；distal lung progenitor cells(货号：123603)
[0181]
置于冰上孵育45-60min，期间轻轻混匀。
[0182]
2.孵育结束后离心300g,4℃离心15min。
[0183]
3.1ml pbs中加入40μl的dynabeads磁珠，用磁力架吸附磁珠，而后换成完全培基。
[0184]
4.弃去细胞的上清，将加好beads的培基加入到细胞中，充分混匀后置于匀速转盘上4℃旋转60min。
[0185]
5.使用磁力架吸附磁珠，培基洗3遍，每次2min。
[0186]
6.在大皿中加7ml培养基，将过完磁力架的培基加入到大皿中，贴壁60分钟，进一步进行筛选。
[0187]
7.将贴壁完的细胞收集后均匀铺在用于免疫荧光实验的小圆片上，待贴壁后进行下一步实验。
[0188]
h.pmk5抑制二型上皮细胞的坏死性凋亡比例
[0189]
1.实验分为3组，nc组，对照组，治疗组。
[0190]
2.nc组不做处理，对照组及治疗组使用10ng/ml tnf-α(货号：315-01a-5)及10μm z-vad-fmk(货号：s8102)诱导坏死性凋亡，治疗组加入终浓度为5μm的pmk5多肽，培养48小时后，进行tunel染色，使用tunel阳性比例来代表细胞的坏死性凋亡程度。
[0191]
表6 pmk5抑制坏死性凋亡的比例
[0192] nc组对照组治疗组p值tunel阳性细胞占比2.1％77.2％19.8％＜0.05
[0193]
注：p值为治疗组与对照组的t检验结果
[0194]
结果表明：pmk5能够显著抑制坏死性凋亡的比例，见表6。
[0195]
实施例10利用肺纤维化动物模型验证多肽治疗急性肺损伤的作用
[0196]
a.急性肺损伤小鼠模型构建
[0197]
雄性c57bl/6小鼠，6-8周龄，三溴乙醇麻醉，气管注射脂多糖lps(2.5mg/kg)，具体方法如下：
[0198]
1.使用电子天平精密称取脂多糖10mg，溶解于10ml的pbs中，浓度为1mg/ml
[0199]
2.腹腔注射300μl三溴乙醇进行麻醉，使用弯头眼科镊暴露气管口，使用套管针辅助，使用微量进样器，通过气管向肺内注入约50μl的lps，迅速旋转并直立3分钟左右，以使lps能够均匀地进入左右肺叶。整个操作在约60℃的手术操作台进行。对照组使用气管内注射等量的生理盐水。
[0200]
b.多肽治疗
[0201]
操作步骤如下：
[0202]
1.实验动物分组：将6-8周龄已经注射lps的模型小鼠随机分为3组，每组10只，分
别为对照组、lps组、lps+pmk5组。
[0203]
2.在注射lps之后1h后，进行第1次多肽治疗,12h,24h后，进行第2,3次多肽治疗，剂量为5mg/kg体重，第48小时取材，取材前对每只小鼠进行肺功能测定，结果见表6。
[0204]
3.每组取3只小鼠的肺组织进行多聚甲醛固定，包埋，石蜡切片后进行he染色及masson染色，结果见表7，每组取3只小鼠的右侧肺组织进行羟脯氨酸的测定，结果见表8。
[0205]
结果表明：pmk5能够显著恢复急性肺损伤小鼠的肺功能，改善小鼠肺纤维化的程度，降低小鼠肺组织羟脯氨酸含量，见表7，8，9。
[0206]
表7 pmk5恢复急性肺损伤小鼠模型肺功能
[0207][0208]
表8 pmk5改善急性肺损伤小鼠模型肺纤维化程度
[0209]
组别ashcroft评分p值对照组0.39 lps组4.42 lps+pmk51.93《0.001
[0210]
表9 pmk5降低急性肺损伤小鼠模型羟脯氨酸含量
[0211]
组别羟脯氨酸(微克/右肺重)p值对照组30.45 lps组77.23 lps+pmk539.78《0.001
[0212]
上述实例的结果表明，本发明的多肽具有显著的抗肺损伤/急性呼吸窘迫症的作用，可作为活性成份用于制备抗肺损伤/急性呼吸窘迫症的药物。
[0213]
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。