禽传染性支气管炎病毒N蛋白的T细胞抗原表位多肽及其应用

本发明属于多肽疫苗制备
技术领域：
，具体涉及禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽及其应用。
背景技术：
：禽传染性支气管炎(avianinfectiousbronchitis,ib)是由禽传染性支气管炎病毒(avianinfectiousbronchitisvirus,ibv)引起的一种急性、高度接触性传染病。该病可发生于各年龄段的鸡，其中雏鸡感染后临床症状最为严重，主要表现为甩头、咳嗽和呼吸困难等症状，某些肾型ibv毒株感染也可造成鸡只的严重肾炎。ibv传播速度快、传播范围广，给世界养禽业造成巨大经济损失。ibv属于单股、正链rna病毒，基因组长度约为27.6kb，编码四个主要的结构蛋白，分别为纤突蛋白(s)、膜蛋白(m)、核衣壳蛋白(n)和小膜蛋白(e)。n蛋白是ibv复制过程中编码产生的早期蛋白，其主要功能是与病毒rna结合形成核衣壳，该蛋白在不同毒株间相对保守，且在诱导宿主细胞免疫方面起到重要作用。目前，临床上使用的ibv疫苗主要是弱毒活疫苗和灭活疫苗两大类，弱毒疫苗对相同血清型的毒株保护性较好，但是这类型疫苗在临床应用中存在返毒风险，而灭活疫苗主要倾向于诱导体液免疫，诱导细胞免疫的能力较差。ibv血清型多，不同血清型毒株之间交叉保护力差，给临床防控该病带来了很大障碍，因此，研制具有交叉保护性的ibv疫苗迫在眉睫。研究表明，体液免疫不足以提供完全免疫保护，细胞免疫对ibv的免疫保护具有重要作用。鸡只过继转移特异性的效应t细胞或记忆t细胞足以抵抗ibv的致死性感染，表明t细胞在ibv的清除过程中起关键作用。表位又称抗原决定簇，是决定适应性免疫应答的关键氨基酸序列。根据识别受体的不同，表位又分为b细胞表位和t细胞表位两种。t细胞表位能被t细胞受体识别，从而刺激特异性t细胞的增殖与分化，产生抗病毒免疫。目前，ibv的表位研究主要集中在s蛋白上，s蛋白在不同毒株间变异程度较大，提供的交叉保护能力可能有限，而n蛋白相对保守，且被认为是诱导细胞免疫的重要蛋白。因此，筛选鉴定n蛋白上的t细胞抗原表位多肽对研发ibv通用表位疫苗具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供具有开发为禽传染性支气管炎病毒多肽疫苗潜力的禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽及其应用。为了达到以上目的，本发明根据ibv的n蛋白氨基酸序列，设计一系列覆盖全长氨基酸序列的重叠肽段，将这些重叠多肽分别刺激淋巴细胞，检测ibv特异性t细胞受多肽刺激后分泌ifn-γ的水平，初步筛选出功能性t细胞抗原表位多肽，将该功能性t细胞抗原表位多肽分别刺激免疫鸡脾脏淋巴细胞，通过ifn-γ胞内细胞因子染色试验获得能有效诱导cd8+t淋巴细胞分泌ifn-γ的肽段。本发明筛选获得的禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽，其为以下任一或多个表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如seqidno.1-4的所示；或将seqidno.1-4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由seqidno.1-4衍生的且保持seqidno.1-4所示的蛋白功能的氨基酸序列。其中，seqidno.1-4所示的四个肽段包含cd8+t细胞表位，seqidno.2所示的肽段(n261-280)能明显诱导cd4+t细胞分泌ifn-γ，说明n261-280同时包含cd4+和cd8+t细胞表位，是一个双特异性表位。优选地，本发明提供了一种禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽，其为双特异性表位，其氨基酸序列如seqidno.2所示。更优选地，本发明提供了一种禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽组合，其含有4个表位多肽，其氨基酸序列分别如seqidno.1-4的所示。本发明提供了上述禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽的编码基因。含有上述禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽编码基因的生物材料属于本发明的保护范围，所述生物材料为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。本发明进行多肽疫苗的研究，选择相应的佐剂对定量的多肽进行乳化；选择合理数量的实验动物进行程序化免疫；免疫前后适当时间采血，分离外周血淋巴细胞，通过流式细胞术检测多肽引起的cd8+t细胞数量的变化以及elispot方法检测多肽特异性t细胞反应。本发明随机选择20只14日龄的鸡只进行试验，其中实验组和对照组各10只。免疫程序选择常规免疫程序，免疫前取消所有免疫程序，首免后21天进行加强免疫。通过cd3、cd4、cd8特异性单抗进行流式细胞术检测，关注cd4+、cd8+阳性t淋巴细胞数量以及相应比值的变化。选择检测ifn-γ的elispot试剂盒，检测多肽刺激产生的ifn-γ的细胞数。发现本发明筛选获得的禽传染性支气管炎n蛋白的t细胞表位多肽或其编码基因或含有其的生物材料能够提高机体cd8+t、cd4+t细胞数量，以及促进机体分泌ifn-γ。基于上述发现可知这些禽传染性支气管炎n蛋白的t细胞表位多肽具有潜在的制备多肽疫苗的能力。本发明进一步提供了含有所述禽传染性支气管炎n蛋白的t细胞表位多肽的药物。优选地，所述药物为多肽疫苗。本发明提供一种药物，含有所述禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽。本发明提供一种多肽疫苗，含有所述禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽。所述多肽疫苗还含有佐剂，所述佐剂包括壳聚糖、载体蛋白。本发明提供了所述禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽或其编码基因或所述的生物材料在提高机体产生cd8+t细胞数量、或提高机体产生cd4+t细胞数量、或提高机体分泌ifn-γ细胞数量中的应用。本发明提供了所述禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽或其编码基因或上述生物材料在制备预防禽传染性支气管炎病毒感染的疫苗中的应用。本发明提供了所述禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽或其编码基因或上述生物材料在制备治疗禽传染性支气管炎病毒感染的药物中的应用。本发明提供了所述禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽或其编码基因或上述生物材料在制备检测禽传染性支气管炎病毒的试剂或试剂盒中的应用。本发明基于提高疫苗对禽传染性支气管炎病毒多血清型的交叉保护力的目的，从细胞免疫的角度考虑研究具有诱导t细胞效应的表位多肽，本发明筛选得到的多肽具有刺激机体特异性产生细胞毒性t淋巴细胞反应的能力，能够启动cd8+t细胞和cd4+t产生免疫应答，并促进机体分泌ifn-γ，基于相应的动物实验，验证了多肽疫苗的安全性及激活细胞毒性t淋巴细胞免疫反应的可靠性。本发明提供的多肽可用于制备禽传染性支气管炎病毒特异性抗原表位疫苗或多肽疫苗，安全性高，特异性好，在禽传染性支气管炎的防控工作中具有广阔的应用前景。附图说明图1为elispot筛选ibvn蛋白功能性抗原表位肽结果图。横坐标为刺激物名称，其中cona为阳性对照，nc1为不相关肽刺激免疫鸡脾脏淋巴细胞，nc2为肽库刺激阴性鸡脾脏淋巴细胞，nc3为不加刺激物的免疫鸡脾脏淋巴细胞。纵坐标为斑点数，表示为spots/106cells。“***”代表差异极其显著(p＜0.001)。图2为ifn-γ胞内细胞因子染色试验结果图。a图表示功能性抗原表位多肽刺激cd8+t淋巴细胞分泌ifn-γ的结果，b图表示功能性抗原表位多肽刺激cd4+t淋巴细胞分泌ifn-γ的结果。左图是流式结果示意图，右图表示三个重复试验的结果。cona是阳性对照，nc表示阴性对照。“***”表示差异极其显著(p＜0.001)，“**”表示差异极显著(p＜0.01)。图3为cfse细胞增殖试验结果图，a图表示功能性抗原表位多肽诱导cd8+t淋巴细胞增殖的结果，b图表示功能性抗原表位多肽诱导cd4+t淋巴细胞增殖的结果。左图是流式结果示意图，右图表示三个重复试验的结果。cona是阳性对照，nc表示阴性对照。“***”表示差异极其显著(p＜0.001)，“**”表示差异极显著(p＜0.01)，“*”表示差异显著(p＜0.05)。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。本发明实施例记载的数据均为平行试验5次后的平均值，且各平行试验数据之间差异不显著。本申请中所述的n1-n409分别对应genbank的ibvsd株(ky421673)的n蛋白氨基酸序列第1-第409位。实施例1禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位的筛选1、n蛋白肽库的合成参照genbank发表的ibvsd株(ky421673)的n蛋白氨基酸序列，设计一系列覆盖全长氨基酸序列的重叠肽段，每个肽段长度为20aa，相邻肽段间重叠10aa，一共40个肽段，由金斯瑞生物科技公司合成。同时合成一条非ibv蛋白的肽段(禽流感病毒h5n8的ha蛋白多肽，序列为wtilkpsdtinfesn)作为不相关对照。合成多肽纯度≥95％，溶解在dmso中，-80℃保存。2、鸡群免疫及脾脏淋巴细胞的分离14日龄spf鸡(购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司)分为免疫组和对照组，免疫组鸡只滴鼻点眼106eid50/0.1mlibvsz株，首免后21天，用ibvsd株通过相同途径、相同剂量加强免疫一次。对照组首免和二免均滴鼻点眼相同体积的无菌pbs。二免后两周，将鸡只安乐死，无菌取脾脏，碾磨均匀后过200目网筛，将获得的组织匀浆小心加到淋巴细胞分离液(solarbio,p9120)上层，500g离心20min。小心吸取淋巴细胞层到另一15ml离心管，加入pbs洗涤三次，最后用完全培养基(rpmi1640+10％fbs)重悬细胞并计数。3、elispot试验初步筛选功能性表位肽鸡群二免后14天，分离脾脏淋巴细胞，分别用步骤1中覆盖n蛋白肽库的每一条多肽刺激淋巴细胞，通过elispot试验检测ibv特异性t细胞受多肽刺激后分泌ifn-γ的水平，从而初步筛选出功能性抗原表位多肽。96孔elispot板(millipore，msips4510)包被mouseanti-chickenifn-γ(invitrogen，cac1233)，终浓度为5μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜。弃去包被液，pbs洗涤两次，每孔加入100μl完全培养基，37℃封闭2h。弃去封闭液，每孔加入3×105脾脏淋巴细胞，再加入单个n蛋白肽刺激(终浓度为10μg/ml)，总体积200μl/孔。同时设立阳性对照孔：加入刀豆凝集素cona(5μg/ml)，设立三个阴性对照孔：加入步骤1中述及的不相关肽(10μg/ml)刺激免疫鸡脾脏淋巴细胞、不加刺激物的脾脏淋巴细胞以及用总肽库(步骤1中述及的40条多肽)刺激对照组鸡脾脏淋巴细胞(每个肽终浓度为10μg/ml)。置于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h。弃去细胞，每孔加入200μlpbst洗涤4次。每孔加入100ulmouseanti-chickenifn-γbiotin(invitrogen,cac1233),终浓度为1μg/ml，37℃孵育2h。pbst洗涤4次，每孔加入100μlstreptavidin-hrp(invitrogen,cac1233)，终浓度为2μg/ml，室温孵育1h。pbst洗涤4次，每孔加入100μlaec显色剂(bdbiosciencepharmingen，551951)，室温避光孵育20min。用清水冲洗elispot板终止反应，至于室温晾干。最后用elispot读板器分析计算每孔的斑点数。结果显示，肽段n211-230、n261-280、n271-290和n381-400能有效刺激脾脏淋巴细胞分泌ifn-γ，形成的平均斑点数分别为70、110、100和74个斑点/1×106细胞，显著高于不加刺激物的阴性对照孔细胞(10个斑点/1×106细胞)(p＜0.001)(图1)。同时，不相关肽刺激免疫鸡脾脏淋巴细胞和总肽库刺激阴性鸡脾脏淋巴细胞均不能有效诱导ifn-γ的产生，形成的斑点数分别为13和6个斑点/1×106细胞，与不加刺激物的阴性对照孔(10个斑点/1×106细胞)没有显著差异(p＞0.05)，表明肽段n211-230、n261-280、n271-290和n381-400诱导脾脏淋巴细胞分泌ifn-γ是ibv特异性t细胞激活的结果。功能性抗原表位肽氨基酸序列如表1所示。表1ibvn蛋白功能性抗原表位多肽氨基酸序列多肽名称多肽位置a多肽序列n211-230211-230gtritkakademahrrfckr(seqidno.1)n261-280261-280egikdgrvtamlnltpspha(seqidno.2)n271-290271-290mlnltpsphaclfgsrvtpk(seqidno.3)n381-400381-400eernnaqlefddepkvinwg(seqidno.4)注：a表示多肽在n蛋白全长氨基酸序列中的位置4、ifn-γ胞内细胞因子染色试验为进一步验证功能性抗原表位多肽所对应的t细胞表型，本试验将elispot筛选获得的4个功能性抗原表位多肽(n211-230、n261-280、n271-290和n381-400)分别刺激免疫鸡脾脏淋巴细胞，进行ifn-γ胞内细胞因子染色试验。24孔板中每孔加入1×106个脾脏淋巴细胞，再分别加入单个肽刺激(终浓度为10μg/ml)，同时设立阳性对照：cona刺激(5μg/ml)，阴性对照：不加刺激物。置于37℃，5％co2中培养2h后，每孔加入1:1000稀释的brefeldina(bdbiosciencepharmingen，555028)，37℃，5％co2中继续培养4h。培养结束后，收获培养细胞，用facs液(pbs+2％fbs+0.05％nan3)洗涤两次，每次300g离心5min。每孔细胞染色鼠抗鸡cd4-apc(southernbiotech，8210-11)和鼠抗鸡cd8α-pe(southernbiotech，8220-09)以及fixableviabilitydyeefluor780(ebioscience，65-0865-14)，冰上孵育30min。facs液洗涤细胞两次后，按照bdcytofix/cytopermpluskit(bdbiosciencepharmingen，555028)说明书进行胞内细胞因子染色，即每孔加入200μlfixation/permeabilizationsolution，冰上孵育20min，然后用perm/washtmbuffer洗涤细胞2次，每次300g离心5min。用perm/washtmbuffer稀释鼠抗鸡ifn-γbiotin(浓度为2μg/ml)，每孔加入100μl，冰上孵育30min。perm/washtmbuffer洗涤细胞2次后，每孔加入100μl用perm/washtmbuffer稀释的streptavidin-fitc(invitrogen，434311)，终浓度为2μg/ml，冰上孵育30min。perm/washtmbuffer洗涤细胞两次后，每孔加入200μlfacs重悬细胞，最后进行流式分析。结果发现n211-230、n261-280、n271-290和n381-400分别能有效诱导0.90％、1.07％、1.00％和0.78％的cd8+t淋巴细胞分泌ifn-γ(图2的a)，与阴性对照(0.29％)相比差异显著(p＜0.05)，说明这四个肽段包含cd8+t细胞表位。同时n261-280也能明显诱导0.99％的cd4+t细胞分泌ifn-γ(图2的b)，与阴性对照(0.4％)相比差异显著(p＜0.05)说明n261-280同时包含cd4+和cd8+t细胞表位，是一个双特异性表位。5.cfse细胞增殖试验检测表位肽诱导的细胞增殖采用cfse标记的淋巴细胞增殖试验进一步探究功能性抗原表位多肽刺激特异性t淋巴细胞增殖的能力。将分离的脾脏淋巴细胞调整浓度为2×107个/ml，加入2μm的cfse(ebioscience，65-0850-84)标记细胞，室温避光孵育7min。加入5倍体积预冷的完全培养基(rpmi1640+10％fbs)终止标记，300g离心5min。弃上清，用完全培养基再洗涤两次，重悬细胞后计数。将细胞浓度调整为1×106个/ml，24孔板每孔加入1ml标记的细胞，分别加入单个肽刺激(10μg/ml)，阳性对照孔加入5μg/ml的cona，阴性对照孔不加任何刺激物。将细胞置于37℃，5％co2中避光培养6天。培养结束后，收集细胞，facs洗涤两次后，染色鼠抗鸡cd4-apc、鼠抗鸡cd8α-pe和fixableviabilitydyeefluor780，冰上孵育30min。facs洗涤两次后，重悬细胞，流式细胞术分析。根据cfse标记的特点，染料随细胞增殖均匀地从母代细胞分配到子代细胞，此时荧光强度减半。因此，流式分析结果中cfse荧光减弱的细胞即为发生增殖的细胞。结果显示，肽段n211-230、n261-280和n271-290均能有效诱导cd8+t淋巴细胞发生增殖(图3的a)，同时，肽段n261-280也能诱导cd4+t，淋巴细胞的增殖反应(图3的b)，进一步证明该肽段是一个双特异性表位。本发明在ibvn蛋白上筛选鉴定了4个t细胞抗原表位多肽，均能有效诱导特异性cd8+t细胞产生ifn-γ，说明它们均包含cd8+t细胞表位，同时，肽段n261-280也能有效诱导cd4+t细胞分泌ifn-γ，说明该肽段同时包含cd8+和cd4+t细胞表位。细胞增殖试验结果进一步证明筛选的抗原表位多肽具有强免疫原性。这为ibv表位疫苗的研发提供了基础。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>中国农业大学<120>禽传染性支气管炎病毒n蛋白的t细胞抗原表位多肽及其应用<130>khp211111929.7<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1glythrargilethrlysalalysalaaspglumetalahisargarg151015phecyslysarg20<210>2<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gluglyilelysaspglyargvalthralametleuasnleuthrpro151015serprohisala20<210>3<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3metleuasnleuthrproserprohisalacysleupheglyserarg151015valthrprolys20<210>4<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4glugluargasnasnalaglnleuglupheaspaspgluprolysval151015ileasntrpgly20当前第1页12