1.本发明涉及低聚寡糖材料技术领域，更具体地，涉及一种具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖的制备方法、海洋低聚寡糖及其应用。
背景技术：
2.海洋糖是指从海洋动物、藻类和微生物中提取获得的一种糖类物质，海洋寡糖则是通过化学或生物酶法降解海洋长链多糖而获得的由2-20个单糖分子构成的低聚糖。海洋长链多糖由于分子量大，在生命体中的生物活性很低，大部分也就仅仅作为能量物质和结构物质。然而，如将这些长链糖进行定向断键制备成低聚糖，其生物学活性将发生突变，其与生物体受精、发育、分化、免疫、神经系统的识别与调控有密切联系，在动物衰老、癌症过程中也发现涉及寡糖链在生物分子信息传递有关。海洋低聚寡糖已有大量的研究证明其具有调节肠道、降血糖、降血脂、增强免疫及抗肿瘤等功能。由于海洋寡糖具有这些突出功能，如何制备高纯度高活性低聚寡糖也是世界科技工作者关注的热点。
3.目前壳聚寡糖的制备方法包括化学法和生物酶法。化学法包括浓盐酸催化水解法、双氧水氧化降解法以及微波辐射法等，化学法反应条件苛刻，不易控制，产物分子量较大，杂质多，盐离子无法去除，产品品质低等缺点，同时产生的工业废水污染大、腐蚀设备。生物酶法是目前工业生产的主要方法，酶解法耦合膜过滤技术，包括采用专一酶壳聚糖酶，非专一酶淀粉酶、脂肪酶、复合酶、纤维素酶等，或辅助超声波、微波等酶解，再结合纳滤膜、过滤膜、喷雾干燥等技术获得纯度较高的壳寡糖。如日本将生物酶固载在膜反应器上，可制备高纯壳寡糖，并通过控制膜孔径大小实现了壳寡糖分子量的筛分。我国有报道采用酶反应分离耦合技术制备壳寡糖，酶水解壳聚糖后耦合多组膜分离器浓缩壳寡糖再通过喷雾干燥获得壳寡糖粉末，酶解法是目前生产优质壳寡糖的技术，但该技术存在工序复杂，反应时间长、产物得率低，产品后续处理复杂及成本高，难以实现大规模生产等缺点。如专利技术“一种基于膜分离的壳寡糖制备方法”，该专利技术以壳聚糖为原料，通过纤维素酶解、离心去酶、添加甲醛丙酮、膜过滤、真空干燥等制备壳寡糖；专利技术“一种复合酶制备的壳寡糖及其制备方法”，该专利技术以壳聚糖为原料，加入复合酶，然后透析膜透析、喷雾干燥制备壳寡糖。也有酶解法耦合膜过滤再结合离子交换色谱、层析等方法分离纯化壳寡糖，但这些技术效率极低、工艺技术复杂及生产成本极高等特点仅限于实验室或小试规模，如专利技术“一种采用离子交换树脂脱酸制备中性壳寡糖的方法(201510396557.6)”，将壳聚糖溶解在酸液中进行酶解，纳滤膜分离浓缩，再通过阴离子交换层析柱及喷雾干燥活性中性壳寡糖粉末。专利技术“一种无酸壳寡糖的制备方法(201811573112)”，该专利技术将壳聚糖溶于盐酸溶液，加入固化酶酶解，超声辅助酶解，再进行过滤膜、纳滤膜浓缩、过阴离子交换柱及喷雾干燥获得中性壳寡糖。还有酶解协同微波制备壳寡糖的方法，如专利技术“壳寡糖的制备方法(201610318583.1)”，该专利技术以壳聚糖为原料，添加过氧化氢并协同微波降解、再醇析、过滤、烘干得到壳寡糖；“一种制备水溶性壳寡糖的方法(201310019782.9)”，该
专利技术壳聚糖水溶液通过隧道式连续微波处理，再采用双氧水降解、纳米膜分离、提纯得壳寡糖成品。
4.然而，现有的壳寡糖制备技术大多存在分离复杂、生产效率低及难以大规模产业化生产、产物分子量不均等难题。
5.超高压技术是近些年来食品工业种出现的一种新型技术，由于其可改变改变溶剂和目标分子间的亲和力，具有提取时间短、能耗低、不引入杂质等独特的优势，目前超高压技术已广泛应用在杀菌保鲜、酒类催陈、活性成分提取等领域，超高压技术已在国内外应用并产业化，但目前还未见超高压技术应用在将多糖降解为寡糖方面的研究报道。
技术实现要素：
6.本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖的制备方法，所述具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖的制备方法工艺简单，条件温和，且无溶剂残留及无任何杂质引入，效率高，通过该方法制备的成品具有纯度高、活性强等特点。
7.本发明的另一目的在于提供由所述制备方法制备得到的具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖。所制备得到的海洋低聚寡糖分子量分布窄，产物纯度高，抗肿瘤活性强。
8.本发明的另一目的在于提供所述抗肿瘤活性海洋低聚寡糖的应用。
9.本发明采取的技术方案是：
10.一种具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖的制备方法，包括如下步骤：
11.s1、将壳聚糖与有机酸溶液混合均匀，配制成体积浓度为3～5％的壳聚糖溶液；
12.具体的，将脱乙酰度90％以上的壳聚糖添加到体积浓度为3％-5％的有机酸溶液中，配制成质量浓度为3～5％的壳聚糖溶液；
13.s2、将壳聚糖溶液加入超高压中，反应温度45～55℃，反应压力250～400mpa的条件下，保温时间15min～30min，得到壳聚糖降解反应溶液，离心过滤、浓缩及干燥，得到具有抗肿瘤活性的海洋低聚寡糖。
14.具体的，步骤s2中得到壳聚糖降解反应溶液后，离心过滤，将上清液进行低温浓缩至其体积的三分之一后低温干燥，得到具有抗肿瘤活性的海洋低聚寡糖。
15.本发明制备海洋低聚寡糖的方法是先通过有机酸溶液使壳聚糖充分溶解，然后利用超高压使壳聚糖进行降解，再通过温度、压力等的条件控制，能得到均匀的低聚壳寡糖，再离心过滤、浓缩及干燥，使得最终得到的海洋低聚寡糖分子量均匀、分子量可控性好。整个反应过程工艺简单，条件温和，反应时间短且整个制备过程无溶剂残留、无任何杂质引入，提取率高、纯度高、活性强且分子量可控。
16.优选地，所述有机酸溶液为乙酸溶液或乳酸溶液中的一种或者两种。
17.优选地，所述有机酸溶液的体积浓度为3～5％。
18.由所述的具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖的制备方法制备得到的具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖。
19.优选地，所述具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖的分子量分布为不超过1.04-1.08。
20.更优选地，所述具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖的分子量分布为1.04-1.08，重均分子量为2000-2500da，分子量800-1200da占比60％以上。
21.所述的具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖在抗肿瘤药物和功能食品中的应用。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
23.(1)本发明使用超高压反应釜作为反应仪器，单次处理时间短，可规模化生产；
24.(2)本发明使用的溶剂仅是有机酸溶液，不会对环境造成污染，不危害人体健康，完全绿色环保，适合工业化生产；
25.(3)本发明制备的具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖分子量分布非常窄，pdi不超过1.08，分子量800-1200da的占比达60％以上，产品分子量均一性好，获得的壳寡糖分子量差异比较小，更有利于壳寡糖功能的发挥，纯度高达95％以上，活性强，其对小鼠移植性h22抗肿瘤活性高达44.3％。
具体实施方式
26.下面将结合具体实施例对本发明进行了说明，但本发明并不局限于下述实施例，应当理解，所附权利要求概括了本发明的范围，在本发明构思的引导下本领域的技术人员应意识到，对本发明的各实施例所进行的一定的改变，都将被本发明的权利要求书的精神和范围所覆盖。实施例1
27.一种具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖，其制备方法如下步骤：
28.s1、将6kg壳聚糖加入到适量的体积浓度为3％乙酸溶液，待完全溶解后加入纯化水至200l，搅拌均匀，静置消泡，配制成质量浓度为3％(w/v)的壳聚糖溶液；
29.s2、将壳聚糖溶液包装后，放置于超高压反应釜中，反应温度为45～55℃，反应压力为250～400mpa的条件下，保温时间15min～30min，得到壳聚糖降解反应溶液；
30.s3、将步骤s2得到的壳聚糖降解反应溶液离心过滤，将上清液浓缩至其体积的三分之一，再低温干燥，得到具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖。实施例2
31.一种具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖，其制备方法如下步骤：
32.s1、将8kg壳聚糖加入到适量体积浓度为4％的乙酸溶液，待完全溶解后加入纯化水至200l，搅拌均匀，静置消泡，配制成质量浓度为4％(w/v)的壳聚糖溶液；
33.s2、将壳聚糖溶液静置消泡后加入超高压反应釜中，反应温度为45～55℃，反应压力为250～400mpa的条件下，保温时间15min～30min，得到壳聚糖降解反应溶液；
34.s3、将步骤s2得到的壳聚糖降解反应溶液离心过滤，将上清液浓缩至其体积的三分之一，再低温干燥，得到具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖。实施例3
35.一种具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖，其制备方法如下步骤：
36.s1、将10kg壳聚糖加入到适量体积浓度为5％的乙酸溶液，待完全溶解后加入纯化水至200l，搅拌均匀，静置消泡，配制成质量浓度为5％(w/v)的壳聚糖溶液；
37.s2、将壳聚糖溶液静置消泡后加入超高压反应釜中，反应温度为45～55℃，反应压力为250～400mpa的条件下，保温时间15min～30min，得到壳聚糖降解反应溶液；
38.s3、将步骤s2得到的壳聚糖降解反应溶液离心过滤，将上清液浓缩至其体积的三分之一，再低温干燥，得到具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖。
对比例1
39.s1、将8kg壳聚糖加入到适量体积浓度为4％的乙酸溶液，待完全溶解后加入纯化水至200l，搅拌均匀，静置消泡，配制成质量浓度为4％(w/v)的壳聚糖溶液；
40.s2、将壳聚糖溶液静置消泡后加入超高压反应釜中，反应温度为常温，反应压力为100mpa的条件下，保温时间5min，得到壳聚糖降解反应溶液；
41.s3、将步骤s2得到的壳聚糖降解反应溶液离心过滤，将上清液浓缩至其体积的三分之一，再低温干燥，得到海洋低聚寡糖。实施例4
42.对实施例1至3所述制备方法制备得到的具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖和对比例1所得的低聚寡糖进行分子量及分子量分布测试，经检测得实施例1至实施例3和对比例1所制备的具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖的重均分子量分别为2500、2240、2410和5330，分子量800-1200da占比62.12％、65.63％、68.51％和17.82％，分子量分布(pdi)分布为1.08、1.06、1.04和1.20。
43.将按照实施例1所述制备方法制备得到的具有抗肿瘤活性海洋低聚寡糖送往广州市体育科学研究所广州实验测试中心进行壳聚糖的辅助抗肿瘤功能实验。检验报告内容如下：
44.(一)材料和方法
45.1.1受试样品：壳寡糖，黄色溶液，由深圳市深博泰生物科技有限公司制备。
46.1.2实验动物及饲养
47.1.2.1动物：spf级昆明种小鼠，雄性，体重20-22g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：scxk(粤)2013-0002，于spf动物室内进行实验，实验环境：室温20-26℃，相对湿度40-70％。
48.1.2.2瘤株：小鼠肝癌h22，由广东省医学实验动物中心提供。
49.1.3饲养：喂以全价颗粒饲料，由广东省医学实验动物中心提供。自由进食饮水，饮用纯净水，由饮水瓶自由摄取。
50.1.4检疫：对购入spf级sd大鼠检疫3d，期间每日检查动物一次，未发现不健康动物，全部健康大鼠纳入实验。
51.1.5实验方法
52.主要仪器与试剂：电子天平、解剖器械。环磷酰胺：临床化学抗癌药物，临用时配制。
53.1.5.1肿瘤模型：在屏障系统下喂饲维持饲料观察3d，适应期结束后，挑选体重在20-22g的小鼠50只，小鼠右上肢腋下注射肿瘤细胞数量为106的肿瘤液0.1ml，然后按体重随机分成5组，每组10只，分别为阴性对照组，阳性对照组和壳聚糖组低、中、高三个剂量组(100mg/kg﹒bw、150mg/kg﹒bw和300mg/kg﹒bw)，各剂量组灌胃给予不同剂量的受试样品，阳性对照组灌胃给予20mg/kg﹒bw环磷酰胺，阴性对照组灌胃给予蒸馏水，受试样品给予14天，每天记录1次体重。14天后处死动物，解剖剥离瘤体、取胸腺和脾脏，承重，计算肿瘤抑制率，胸腺和脾脏系数。
54.1.5.2肿瘤抑制率的测定：按下式计算药物对肿瘤生产的抑制率：肿瘤抑制率％＝(1－(给药组平均瘤重(t)/对照组平均瘤重(c)))
×
100％。
55.1.5.3胸腺系数、脾脏系数的测定：颈椎脱臼处死小鼠，解剖小鼠，摘取胸腺和脾脏，用滤纸吸干残血，分析天平承重。胸腺指数＝胸腺重量(g)/体重(g)；脾脏指数＝脾脏重量(g)/体重(g)。
56.1.6统计学处理实验数据以均数
±
标准差表示，应用spss11.5统计学软件进行数据处理，组间比较采用方差分析，p＜0.05为差异具有统计学意义。
57.(二)结果
58.2.1壳寡糖对h22小鼠肿瘤生长的影响
59.与阴性对照组对比，阳性对照组小鼠肿瘤重量显著降低(p＜0.01)，100mg/kg﹒bw、150mg/kg﹒bw和300mg/kg﹒bw壳寡糖对h22荷瘤小鼠的抑瘤率分别为25.31％、31.65％和44.30％，与阴性对照组比较，具有显著性差异(p＜0.05～0.01)，表明该样品明显抑制小鼠肿瘤的生长，见表1。
60.表1壳寡糖对小鼠h22小鼠肿瘤生长的影响组别剂量(mg/kg﹒bw)肿瘤重量(g)肿瘤生长抑制率(％)阴性对照组—1.58
±
0.24——壳寡糖1001.18
±
0.2225.31壳寡糖1501.08
±
0.16
*
31.65壳寡糖3000.88
±
0.17
*
44.30环磷酰胺200.59
±
0.22
**
62.66注：*p＜0.05，**p＜0.01，与阴性对照组比较。
61.2.2壳寡糖对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响
62.与阴性对照组相比，阳性对照组小鼠胸腺指数、脾脏指数均显著降低(p＜0.01)。壳寡糖各组除小剂量组小鼠胸腺指数明显低于阴性对照组外，其余各组胸腺、脾指数均无明显差异。但与阳性药物对照相比重量明显增加。表明小鼠经壳寡糖可以增加小鼠免疫器官的质量。见表2。
63.表2壳寡糖对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响组别剂量(mg/kg﹒bw)胸腺指数(g/100g体重)脾脏指数(g/100g体重)阴性对照组—0.24
±
0.020.36
±
0.05壳寡糖1000.15
±
0.02
*
0.27
±
0.01壳寡糖1500.18
±
0.01
#
0.29
±
0.03
#
壳寡糖3000.23
±
0.02
#
0.36
±
0.04
##
环磷酰胺200.12
±
0.02
**
0.20
±
0.01
**
注：*p＜0.05，**p＜0.01，与阴性对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01，与阳性对照组比较。
64.根据《抗肿瘤药物药效学指导原则》，天然药物肿瘤抑制率大于30％并且有统计学意义，即为有抗肿瘤作用。因此，根据实验结果可知，本发明所述的壳寡糖对小鼠实验性h22肿瘤有明显抑制作用，具有较好辅助抗肿瘤活性。
65.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。