用于脑膜炎诊断的标志物组合及其应用

1.本发明涉及生物医药领域，具体地涉及用于脑膜炎诊断的标志物组合及其应用。


背景技术：

2.细菌性脑膜炎(bacterial meningitis，bm)是儿童特别是婴儿群体的一种中枢神经系统传染性疾病，其在发展中国家的发病率远远高于发达国家。随着脑膜炎球菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌等的疫苗接种的发展，该病的死亡率已显著降低，但仍在5％至15％之间。
3.及早且准确地诊断对细菌性脑膜炎的有效治疗(如抗生素治疗)至关重要。但由于传统方法在灵敏度、培养时间和可培养细菌少等方面的局限性，往往无法实现短时间内的精确诊断。目前，细菌性脑膜炎的诊断范例主要依赖患者病史、临床表现、影像学检测以及实验室检测。由于缺乏对罕见病原微生物的诊断检测，而且侵入性操作(如腰椎穿刺)有机体损伤风险，脑脊液样本的采集量有限，导致传统方法在脑膜炎病原菌的精准检测中面临重大挑战。因此，在大部分脑膜炎的真正病因仍然无法解释。
4.宏基因组新一代测序(mngs)能够在一次试验中检测到几乎所有可能的微生物，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫。然而，大多数已发表的研究主要是描述mngs以诊断报告的形式，对患者逐例展开病原菌诊断的适用性。目前还没有研究报道药物干预后的细菌性脑膜炎患者群体的病原微生物特征。
5.因此，本领域迫切需要区分不同感染和炎症状态的患者亚群，开发新的预测脑膜炎患者临床表型的生物标志物。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于区分不同感染和炎症状态的患者亚群；评估细菌性脑膜炎的感染及炎症程度和抗生素干预效果；提高临床药物干预的精准度，开发新的预测脑膜炎患者临床表型的生物标志物。
7.在本发明的第一方面，提供了一种生物标志物集合，所述的集合包括两种或多种选自下组的生物标志物：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌。
8.在另一优选例中，所述生物标志物集合用于(a)脑膜炎分型；和/或(b)诊断脑膜炎或评估脑膜炎感染炎症程度和抗生素干预效果；和/或(c)提高临床药物干预的精准度，或用于制备一试剂盒或试剂，所述的试剂盒或试剂用于(i)脑膜炎分型；和/或(b)诊断脑膜炎或评估脑膜炎感染炎症程度和抗生素干预效果；和/或(c)提高临床药物干预的精准度。
9.在另一优选例中，所述生物标志物集合还包括嗜酸乳杆菌、溶血葡萄球菌。
10.在另一优选例中，所述脑膜炎包括细菌性脑膜炎。
11.在另一优选例中，所述脑膜炎分型包括肺炎克雷伯菌占优势的脑膜炎和大肠杆菌占优势的脑膜炎。
12.在另一优选例中，所述的生物标志物或生物标志物集合来源于脑脊液或血浆样
本。
13.在另一优选例中，通过下组的一种或多种方法对所述标志物组合中的各个标志物的水平(如相对丰度或绝对丰度)进行检测：测序、pcr。
14.在另一优选例中，所述测序包括高通量测序。
15.在另一优选例中，所述测序包括非靶向宏基因组测序。
16.在另一优选例中，对所述生物标志物水平检测的方法还包括选自下组的一种或多种方法：全基因组学分析、宏基因组学分析、特征序列pcr。
17.在另一优选例中，当与一参考值进行比较时，所述标志物组合中的各标志物的水平(如相对丰度)增加，则表明待测对象具有脑膜炎患病风险或患有脑膜炎；或患有肺炎克雷伯菌占优势的脑膜炎或大肠杆菌占优势的脑膜炎。
18.在另一优选例中，所述的评估脑膜炎的患病风险包括脑膜炎的早期筛查。
19.本发明第二方面提供了一种用于(i)脑膜炎分型；和/或(b)诊断脑膜炎或评估脑膜炎感染炎症程度和抗生素干预效果；和/或(c)提高临床药物干预的精准度的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包括用于检测本发明第一方面所述的集合中各个生物标志物的试剂。
20.在另一优选例中，所述的试剂包括用选自下组的一种或多种方法检测本发明第一方面所述的集合中各个生物标志物的水平的物质：测序、pcr。
21.在另一优选例中，所述的试剂还包括用选自下组的一种或多种方法检测本发明第一方面所述的集合中各个生物标志物的水平的物质：全基因组学分析、宏基因组学分析、特征序列pcr。
22.在另一优选例中，所述试剂用于检测各个生物标志物的水平(如相对丰度或绝对丰度)。
23.本发明第三方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括本发明第一方面所述的集合和/或本发明第二方面所述的试剂组合。
24.在另一优选例中，本发明第一方面所述的集合中各个生物标志物用作标准品。
25.在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一说明书，所述的说明书记载了来源于脑膜炎患者和/或健康对照者的如本发明第一方面所述集合中各个生物标志物的水平的参考数据集。
26.本发明第四方面提供了一种生物标志物集合的用途，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒用于(a)脑膜炎分型；和/或(b)诊断脑膜炎或评估脑膜炎感染炎症程度和抗生素干预效果；和/或(c)提高临床药物干预的精准度，其中，所述生物标志物集合包括两种或多种选自下组的生物标志物：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌。
27.在另一优选例中，所述脑膜炎包括细菌性脑膜炎。
28.在另一优选例中，所述脑膜炎分型包括肺炎克雷伯菌占优势的脑膜炎和大肠杆菌占优势的脑膜炎。
29.在另一优选例中，所述的诊断包括早期诊断、辅助性诊断、或其组合。
30.在另一优选例中，所述评估或诊断包括步骤：
31.(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中所述生物标志物集合中各个生物标志物的水平(比如，相对丰度或绝对丰度)进行检测；
32.(2)将步骤(1)测得的水平(比如，相对丰度或绝对丰度)与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较；
33.较佳地，所述的参考数据集包括来源于脑膜炎患者和健康对照者的如所述生物标志物集合中各个生物标志物的水平(如相对丰度或绝对丰度)。
34.在另一优选例中，当与一参考值进行比较时，所述生物标志物集合中的各生物标志物的水平(如相对丰度或绝对丰度)增加，则表明待测对象具有脑膜炎患病风险或患有脑膜炎；或患有肺炎克雷伯菌占优势的脑膜炎或大肠杆菌占优势的脑膜炎。
35.在另一优选例中，所述的将步骤(1)测得的水平与一参考数据集进行比较，还包括建立一多元统计模型从而输出患病可能性的步骤，较佳地，所述的多元统计模型为随机森林模型和edger差异分析方法。
36.在另一优选例中，如果所述的患病可能性≥0.96(即主要致病菌测序读数所占比例达到生物标记集合所有物种测序读数的比例)，所述的对象被判定为具有脑膜炎患病风险或患有脑膜炎；或患有肺炎克雷伯菌占优势的脑膜炎或大肠杆菌占优势的脑膜炎。
37.在另一优选例中，如果所述的患病可能性≥0.96(即主要致病菌测序读数所占比例达到生物标记集合所有物种测序读数的比例)，且所述生物标志物集合中测序读数总和最小的成分所占最低相对丰度值≥0.01，所述的对象被判定为具有脑膜炎患病风险或患有脑膜炎；或患有肺炎克雷伯菌占优势的脑膜炎或大肠杆菌占优势的脑膜炎。
38.在另一优选例中，所述的样品选自脑脊液和血浆样品。
39.在另一优选例中，通过下组的一种或多种方法对所述生物标志物集合中的各生物标志物的水平(如相对丰度或绝对丰度)进行检测：测序、pcr。
40.在另一优选例中，所述测序包括高通量测序。
41.在另一优选例中，所述测序包括非靶向宏基因组测序。
42.在另一优选例中，对所述生物标志物水平检测的方法还包括选自下组的一种或多种方法：全基因组学分析、宏基因组学分析、特征序列pcr。
43.在另一优选例中，在步骤(1)之前，所述的方法还包括对样品进行处理的步骤。
44.本发明第五方面提供了一种用于(a)脑膜炎分型；和/或(b)诊断脑膜炎或评估脑膜炎感染炎症程度和抗生素干预效果；和/或(c)提高临床药物干预的精准度的方法，包括步骤：
45.(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中本发明第一方面所述集合中各个生物标志物的水平进行检测；
46.(2)将步骤(1)测得的水平与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较；
47.较佳地，所述的参考数据集包括来源于脑膜炎患者和健康对照者的如本发明第一方面所述集合中各个生物标志物的水平。
48.本发明第六方面提供了一种筛选治疗脑膜炎的候选化合物的方法，包括步骤：
49.(1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样品中本发明第一方面所述集合中各个生物标志物的水平v1；在对照组中，向待测对象施用空白对照(包括溶媒)，检测对照组中来源于所述对象的样品中本发明第一方面所述组合中各个生物标志物的水平v2；
50.(2)比较上一步骤检测得到的水平v1和水平v2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是治疗脑膜炎的候选化合物。
51.在另一优选例中，所述的待测对象为脑膜炎患者。
52.在另一优选例中，所述脑膜炎选自下组：细菌性脑膜炎、肺炎克雷伯菌占优势的脑膜炎、大肠杆菌占优势的脑膜炎、或其组合。
53.在另一优选例中，如果所述集合中各个生物标志物的水平v1显著低于水平v2，表明测试化合物为治疗脑膜炎的候选化合物。
54.在另一优选例中，所述“显著低于”指水平v1/水平v2的比值≤1/25，较佳地，≤1/50。
55.本发明第七方面提供了一种本发明第一方面所述的集合和/或本发明第二方面所述的试剂组合的用途，用于筛选治疗脑膜炎的候选化合物和/或用于评估候选化合物对脑膜炎的治疗效果。
56.本发明第八方面提供了一种建立(i)脑膜炎分型；和/或(ii)诊断脑膜炎或评估脑膜炎感染炎症程度和抗生素干预效果；和/或(iii)提高临床药物干预的精准度的模型的方法，所述的方法包括识别患者和健康对照者之间，样品中差异表达物质的步骤，其中，所述的差异表达物质包括两种或多种本发明第一方面所述集合中的生物标志物。
57.在另一优选例中，所述样品来源于脑脊液或血浆。
58.本发明第九方面提供了一种用于(i)脑膜炎分型；和/或(ii)诊断脑膜炎或评估脑膜炎感染炎症程度和抗生素干预效果；和/或(iii)提高临床药物干预的精准度的系统，所述系统包括：
59.(a)特征接收模块，所述特征接收模块用于接收某一对象的组织样本的特征数据；其中所述的组织样本的特征数据包括选自下组的两种或多种生物标志物各自的定量信息：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌；
60.(b)计算处理模块，用于计算来自所述特征接收模块的特征数据，从而获得各个特征的相对丰度；并且基于所获得的相对丰度，与脑膜炎分型或特征表征(临床检测指标)的标准值进行组件差异分析，从而得出生物标志物组成模式与脑膜炎分型；和/或脑膜炎感染炎症程度和抗生素干预效果；和/或提高临床药物干预的精准度的判断结果；和
61.(c)结果输出模块，所述输出模块用于接收并输出判断结果。
62.在另一优选例中，所述的对象是人。
63.在另一优选例中，所述的对象包括婴幼儿、儿童和青少年(比如，0-14岁)。
64.在另一优选例中，所述定量信息包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌各自的水平(如相对丰度)。
65.在另一优选例中，所述系统可对脑膜炎至少分为两型，即肺炎克雷伯菌占优势的脑膜炎、大肠杆菌占优势的脑膜炎。
66.在另一优选例中，所述定量信息的获取方法包括：测序、pcr。
67.在另一优选例中，所述定量信息的获取方法还包括：全基因组学分析、宏基因组学分析、特征序列pcr。
68.在另一优选例中，所述的特征接收模块所接收的特征还包括所能获得的第一次血液白细胞数、血液中中性粒细胞比例、血液中c反应蛋白水平、入院时血红蛋白浓度、所能获
得的第一次脑脊液白细胞数量、脑脊液粒细胞比例、脑脊液单核细胞比例、脑脊液蛋白质浓度、脑脊液葡萄糖浓度和hts系统评分。
69.在另一优选例中，所述特征接收模块包括样本采集仪、特征信号输入端、数据预处理模块、特征构建模块、特征可视化模块。
70.在另一优选例中，所述的计算处理模块包括一超级计算机，以及一储存器，其中所述的储存器中存储有脑膜炎原始测序数据、生物标志物种分类信息、脑膜炎患者临床信息、脑膜炎分型信息。
71.在另一优选例中，所述的输出模块包括任何终端，优选显示器、打印机。
72.在另一优选例中，所述的各模块通过有线或无线方式连接。
73.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
74.图1显示了细菌性脑膜炎宏基因组学研究框架。
75.图2显示了不同儿童血液和脑脊液分组中的微生物群特征。
76.图3显示了脑膜炎相关的微生物群与代谢途径显著相关。图4显示了差异致病菌群在患者群体检出率更高且其组成特征呈特定趋势。
77.图5显示了差异致病菌群能够将患者分为不同亚群，且和血液crp及脑脊液粒细胞比例显著相关。
78.图6显示了肺炎克雷伯菌为优势致病菌的患者，其血液具有和脑脊液相同的检测效力。
79.图7显示了大肠杆菌和肺炎克雷伯菌集合的患者分型效果与大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和嗜热菌集合的分群效果相似。
具体实施方式
80.本发明人经过广泛而深入地研究，首次发现大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌可用于(a)脑膜炎分型；和/或(b)诊断脑膜炎或评估脑膜炎感染炎症程度和抗生素干预效果；和/或(c)提高临床药物干预的精准度，并且本发明还首次发现了一种新的生物标志物集合：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌。本发明的生物标志物集合可用于(a)脑膜炎分型；和/或(b)诊断脑膜炎或评估脑膜炎感染炎症程度和抗生素干预效果；和/或(c)提高临床药物干预的精准度并且具有高灵敏性、高特异性的优点，具有重要的应用价值。在此基础上，发明人完成了本发明。
81.术语
82.本发明所用术语具有相关领域普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，对一些定义和相关术语的解释如下：
83.根据本发明，术语“生物标志物集合”是指一种生物标志物、或两种及两种以上生物标志物的组合。
84.根据本发明，标志物质的水平通过微生物的绝对丰度、相对丰度和平均相对丰度
确定。
85.根据本发明，术语“个体”指动物，特别是哺乳动物，如灵长类动物，最好是人。
86.根据本发明，术语如“一”、“一个”和“这”不仅指单数的个体，而是包括可以用来说明特定实施方式的通常的一类。
87.如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
88.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
89.需要说明的是，在此提供术语的解释仅为了使本领域技术人员更好地理解本发明，并非对本发明限制。
90.根据本发明，参考集指训练集。
91.根据本发明，由现有技术可知，训练集和验证集具有相同的含义。在本发明的一个实施方式中，训练集指脑膜炎患者和健康对照生物样品中的标志物水平的集。在本发明的一个实施方式中，验证集是指用于测试训练集性能的数据集。在本发明的一个实施方式中，标志物的水平可以根据测定的方法代表为绝对值或相对值。例如，当用质谱来测定标记物的水平时，峰的强度可以代表标记物水平，这是一个相对值的水平；当用pcr来测定标志物的水平时，基因的拷贝数或基因片段的拷贝数可以代表的标志物的水平。
92.在本发明的一个实施方式中，参照值是指健康对照的参考值或正常值。本领域的技术人员清楚，在样品数量足够多情况下，每个每个生物标记的正常值(绝对值)的范围可以通过检验和计算方法得到。因此，当利用除质谱以外的其他方法来检测生物标志物的水平时，这些生物标志物水平的绝对值，可以直接与正常值比较，从而评价患有脑膜炎或肺炎克雷伯菌占优势的脑膜炎或大肠杆菌占优势的脑膜炎的风险，以及诊断或早期诊断脑膜炎或肺炎克雷伯菌占优势的脑膜炎或大肠杆菌占优势的脑膜炎。任选地，还可以使用统计方法。
93.脑膜炎
94.脑膜炎是脑膜的弥散性炎症病变，其中，脑膜是覆盖大脑和脊髓的三层膜，由外向内分别为硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。当大脑和脊髓周围的液体受到细菌或病毒感染时可引发脑膜炎，通常会伴随脑膜肿胀。脑膜炎的早期症状与流感相似，可能会持续几个小时或几天，但其在不同年龄阶段的患者群体的具体症状又有所差别。其中，新生儿和婴儿可能会出现以下症状：持续高烧、不停哭泣、过度困倦、易怒、嗜睡、活动迟缓、厌食、喂养困难、呕吐、婴儿头顶囟门隆起、身体和颈部僵硬、难以安慰，甚至在被抱着时哭得更厉害等。脑膜炎在年龄超过2岁的人群中可能出现的体征和症状包括：突然高烧、脖子僵硬、严重头痛、恶心呕吐、混乱或难以集中注意力、癫痫发作、困倦嗜睡、对光线敏感、没有食欲或口渴、皮疹(球菌性脑膜炎)等。脑膜炎的常见病因是病毒和细菌感染，此外，癌症、化学刺激、真菌感染、药物过敏等因素也会导致脑膜炎。脑膜炎在人群中的异质性较明显：有些脑膜炎病例在未经治疗的情况下可能几周内就会好转；有些患者的症状可能危及生命，需要紧急的抗生素治疗；有些脑膜炎病人存在严重的后遗症。因此，脑膜炎的早期精确诊断和及时治疗尤为重要。根据其具体病因的不同，我们将脑膜炎分为细菌性脑膜炎、病毒性脑膜炎、真菌性脑膜炎、寄
生性脑膜炎、阿米巴脑膜炎、非感染性脑膜炎，其中，影响最为严重，致死率最高的类型为细菌性脑膜炎。
95.细菌性脑膜炎分型
96.细菌性脑膜炎的常见症状包括：突然发作、发热、头疼、颈部僵硬、恶心、呕吐、畏光症(眼睛对光更敏感)、精神状态改变(混乱)。但是，新生儿和婴幼儿可能没有或很难观察到上述的典型症状。相反，婴幼儿的常见表现为：反应迟钝或不活跃、易怒、呕吐、不易喂养。对于幼小的婴儿，可能会出现囟门肿胀或异常反射。总之，细菌性脑膜炎的临床表型无特异性，尚无准确的群体特征，给临床诊断带来巨大挑战。在本发明中，通过宏基因组学分析，细菌性脑膜炎可进一步细分为肺炎克雷伯菌占优势的脑膜炎和大肠杆菌占优势的脑膜炎。以肺炎克雷伯菌为优势菌的患者亚群，其血液中c反应蛋白水平相对较高，而以大肠杆菌为优势致病菌的患者群体该临床指标水平较低。其次，以肺炎克雷伯菌为优势菌的患者亚群，其脑脊液中粒细胞比例明显高于以大肠杆菌为优势菌的患者群体；脑脊液单核细胞比例显著低于大肠杆菌为优势致病菌的患者亚群。
97.大肠杆菌
98.大肠杆菌(escherichia coli)是一种存在于环境、食物、人和动物肠道中的细菌。其种类繁多，尽管大多数大肠杆菌菌株是无害的，但也有一些菌株会导致疾病。大肠杆菌感染可引起胃痉挛、腹泻、发烧、恶心和/或呕吐、尿路感染、呼吸道疾病、肺炎和其他疾病。比如一种被称为溶血尿毒症综合征(hus)的肾衰竭，或者发展为高血压、慢性肾病和神经系统疾病。
99.大肠杆菌是引起脑膜炎的最常见的革兰氏阴性细菌，大肠杆菌脑膜炎仍然是全世界脑膜炎发病和死亡的重要原因。有报道称，大肠杆菌菌株能产生ctx-m型或tem型广谱β-内酰胺酶。血脑屏障模型的研究表明，大肠杆菌脑膜炎伴随着高度的菌血症和血脑屏障的入侵。
100.肺炎克雷伯菌
101.肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)是一种革兰氏阴性细菌，可导致多种疾病，包括肺炎、血液感染、伤口或手术部位感染以及脑膜炎。肺炎克雷伯菌通常存在于人类的肠道和粪便中(它们不会引起疾病)。肺炎克雷伯菌感染通常发生医疗机构因其他疾病接受治疗的病人群体中。如需要使用呼吸机或静脉导管等设备的患者，以及长期服用某些抗生素的患者，最容易感染肺炎克雷伯菌。随着抗生素的广泛使用，肺炎克雷伯菌逐渐产生了高度耐药性，尤其是碳青霉烯类抗生素(carbapenems)。当肺炎克雷伯菌产生碳青霉烯酶时，碳青霉烯类的抗生素将不能杀死这类细菌和治疗感染。更遗憾的是，碳青霉烯类抗生素往往是抵御对其他抗生素产生耐药性的革兰氏阴性感染的最后一道防线。
102.嗜热菌
103.嗜热菌(thermothelomyces thermophila)是指适宜生长温度在45℃以上的微生物。嗜热菌不仅能耐受高温，而且能在高温下生长繁殖。这与普通芽孢细菌的耐热性不同，普通芽孢细菌在高温下形成芽孢抵抗逆境，待环境条件恢复，芽孢萌发成营养体，而芽孢不具有繁殖能力，只是抗逆性休眠体2016年有团队报道了法国巴斯德研究所的5例嗜热菌感染病例。
104.嗜酸乳杆菌
105.嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)是一种自然存在于体内的细菌，主要存在于肠道和阴道中。2013年有关于一名老年糖尿病患者感染嗜酸乳杆菌菌血症和鼠李糖乳杆菌假瓣膜感染性心内膜炎的案例报道。
106.溶血葡萄球菌
107.溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)是葡萄球菌属的凝固酶阴性成员。该细菌可在正常人皮肤菌群中发现，并可从腋窝、会阴部和腹股沟区分离。溶血链球菌也是出现在人类血液中的第二大凝固酶阴性葡萄球菌。溶血葡萄球菌是医院感染的主要致病菌之一，其感染可引起败血症、腹膜炎、尿路感染等症状。在少数情况下,溶血葡萄球菌会导致感染性心内膜炎从而引起严重的并发症，如心力衰竭或死亡。溶血链球菌感染的常见临床表现是发热和白细胞数量增加。
108.试剂盒
109.在本发明中，本发明的试剂盒包括本发明第一方面所述的生物标志物集合和/或本发明第二方面所述的试剂组合。
110.在另一优选例中，本发明第一方面所述的集合中各个生物标志物用作标准品。
111.相对丰度
112.在本发明中，相对丰度即一例患者临床样品中某种微生物的测序读数与该例样品中所有非人类测序读数总和的比值。
113.绝对丰度
114.在本发明中，绝对丰度即一例患者临床样品中某种微生物的测序读数。
115.平均相对丰度
116.在本发明中，平均相对丰度即某一患者群体所有患者临床样品中某种微生物的测序读数总和与该患者亚群中所有生物标志物集合的测序读数总和的比值。
117.本发明的主要优点包括：
118.(1)本发明首次发现，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌可用于(a)脑膜炎分型；和/或(b)诊断脑膜炎或评估脑膜炎的感染及炎症程度和抗生素干预效果；和/或(c)提高临床药物干预的精准度。
119.(2)本发明首次发现，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌与嗜酸乳杆菌、溶血葡萄球菌组合也可用于(a)细菌性脑膜炎分型；和/或(b)诊断脑膜炎或评估细菌性脑膜炎的感染及炎症程度和抗生素干预效果；和/或(c)提高临床药物干预的精准度。
120.(3)本发明首次发现，与未确诊患儿和健康儿童相比，细菌性脑膜炎儿童在脑脊液和血液中均表现出不同的微生物组特征。
121.(4)本发明首次发现，能够区分患者和不同对照的差异菌群，包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌、嗜酸乳杆菌和溶血性葡萄球菌，这些差异菌群能将患者分为不同的亚群，并且在不同亚群中的分布比例呈现过渡性动态变化。
122.(5)本发明首次发现，微生物组的组成变化与血液中的c反应蛋白水平以及脑脊液中的粒细胞比例相关。更重要的是，以肺炎克雷伯菌主，大肠杆菌和嗜热菌为辅的致病菌群的患者血液可以取代其脑脊液作为临床监测的主要载体。
123.(6)本发明首次发现，脑膜炎患儿的代表性致病菌群可区分患者的不同亚群。其中，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和嗜热菌群体组成与血液中的c反应蛋白水平相关性最高；大
肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌、嗜酸乳杆菌和溶血性葡萄球菌群体组成与脑脊液中的粒细胞比例显著相关。
124.(7)本发明首次发现，肺炎克雷伯菌为优势菌的患者亚群的血液可代替脑脊液，作为临床检测的主要载体，减轻了患儿腰椎穿刺的必要性及腰椎穿刺损伤的感染风险。总之，致病菌群的组成变化能够为患儿感染的临床监测和抗生素干预提供指导。
125.(8)本发明首次发现，目标微生物群的动态模式可以区分不同感染和炎症状态的患者亚群。这些结果为病原菌检测提供了重要参考，为预测患者预后提供了一种可行的方法，可能具有风险分层和进展监测的潜力。
126.(9)本发明的方法在患者接受治疗前可用于细菌性脑膜炎的病原微生物诊断，提高临床药物干预的精准度；在治疗过程中，可用于监测患者感染炎症程度及抗生素干预效果。
127.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
128.如无特别说明，本发明实施例中所用的试剂和材料均为市售产品。
129.材料和方法
130.患者信息和样本准备。研究对象于2014年8月至2017年2月在北京市儿童医院感染科就诊，年龄均处于0～14岁。其中，细菌性脑膜炎患者都接受过抗生素治疗。这项研究比较了31名细菌性脑膜炎患儿和10名健康儿童的血液微生物特征，31名脑膜炎患儿和30名未确诊患者的脑脊液微生物特征。常规脑脊液检测均由北京市儿童医院检验科完成。6例患者标本采集前病原学检测阳性，常规临床检测阳性率仅为18.75％。30例未确诊感染患者作为阳性对照，10名健康儿童作为阴性对照。
131.从72名儿童的102例血液和脑脊液样本(350μl)的dna提取工作，在中国科学院上海巴斯德研究所国家二级生物安全实验室(bsl-2)完成。微量核酸经过实验室扩增，测序文库构建后，进行非靶向宏基因组测序。通过样品和数据质量控制(qc)检查每个样本，获得足够高质量的测序数据。所有样本平均每个碱基位置覆盖11.69x，至少20.57％的全基因组区域(hg19)覆盖20x以上。
132.宏基因组生物信息学分析
133.测序得到fastq格式的原始数据，经过低质量序列、低复杂度序列过滤和数据接头去除等预处理后，进行宿主污染过滤，即将序列比对到人类参考基因组并去除宿主序列。将剩余非人序列通过kraken2直接比对到微生物参考基因组(包括病毒、古细菌、细菌和真菌)，进行分类学鉴定，序列被精确匹配到物种水平，物种丰度的评估依赖于bracken(bayesian reestimation of abundance with kraken)。同时，将非人序列通过diamond软件(blastx命令)[48]比对到本地服务器上的nr数据库。然后，将m8文件格式的比对结果输入到megan6(社区版)，以便对eggnog进行分析[14]。相对丰度数据基于血液和脑脊液展开同类样本比较分析，临床相关性分析主要在r语言中完成。α多样性的计算方法为：函数index＝-index+x[i]*log(x[i])。无约束加权bray-curtis距离的pcoa基于物种相对丰度。候选差异致病菌群与代谢之间的相关性通过wilcoxon秩和检验进行评估，并通过ggplot2进行可视化。聚类分析依赖k-means和hclust算法。
[0134]
实施例1研究概述和分析流程
[0135]
本发明招募了32名细菌性脑膜炎儿童、30名感染但未确诊的儿童和10名健康对照儿童，其中，所有细菌性脑膜患儿童都接受了抗生素治疗，且出院诊断为病情好转。从我们共收集了102份dna样本用于微生物组研究，其中包括10例正常儿童的血液样本(nb)、31例细菌性脑膜炎患儿的血液(pb)、31例细菌性脑膜炎患儿的脑脊液(pc)，30例未确诊感染儿童的脑脊液(in)(图1、左侧)。由于血脑屏障(bbb)和血脑脊液屏障(bcsfb)的阻碍作用，血液和脑脊液在微生物组成方面可能存在差异。基于此，我们对同类型样本展开后续研究，如差异分析和临床关联分析等(图1、右侧)。
[0136]
实施例2细菌性脑膜炎儿童血液和脑脊液中的微生物群与健康对照组和未确诊儿童相比有明显不同
[0137]
为了探究细菌性脑膜炎的微生物组特征，我们检测了不同儿童群体的微生物多样性。我们发现在患者脑脊液(pc)和未确诊个体脑脊液(in)之间，样本内多样性(α-多样性)显示出显著差异(shannon指数，p＝5.3e-05；simpson指数，p＝0.0078)(图2a)。细菌性脑膜炎患者脑脊液中的微生物群多样性显著低于未确诊患者脑脊液的，其血液中的微生物多样性与正常对照组相比，无显著差异(图2a)。这一结果可能与脑膜炎患者经过抗生素治疗导致致病菌减少，而未确诊的患者无抗生素治疗影响有关。患者(pb,pc,in)和对照组(nb)之间相对丰度较高的致病菌差异明显，(图2b)，患者群体相对丰度较高的致病菌主要有肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等，而健康对照中相对丰度较高的是细小病毒。基于这些结果，我们进一步比较了血液和脑脊液分组中所有微生物的差异。正如我们所料，患者血液中微生物组成与健康对照相比有差异明显。基于bray-curtis相异度的无约束主坐标分析(pcoa)分析结果显示，健康对照组(nb)和患者血液(pb)中的微生物群形成两个不同的集群，沿着第一个坐标轴分离(图2c)。研究表明，对血液微生物群相异度贡献较大的是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、四汇假单胞菌、金黄色葡萄球菌和小动物病毒，而患者群体的脑脊液微生物群相似(图2d)。我们的研究结果表明,患者血液样本中微生物的组成和相对丰度和正常对照相比明显不同；患者脑脊液中的微生物组成相似，但多样性差异显著。这些结果表明微生物的种类和丰度一定程度上反映了患者的健康状态和抗生素干预情况。
[0138]
实施例3脑膜炎相关的代表性致病菌群可作为患者群体的微生物特征
[0139]
考虑到血液和脑脊液中不同的微生物组成，我们想知道是否有一种或多种致病菌能够作为区分患者(pb)和正常对照(nb)，以及确诊(pc)和感染未确诊患者(in)的生物标志物。为此，我们使用随机森林机器学习方法建立了一个模型，在物种水平上将患者和对照组与血液和脑脊液中的微生物群数据关联起来。我们进行了5个重复的10倍交叉验证，以评估指示致病菌的重要性。基于随机森林预测中前10的平均下降精度值(mda)筛选出几种病原菌(表1)，血液中mda最低值为0.43，脑脊液中mda最低值为0.002。此外，最近的研究指出，edger在鉴定宏基因组差异基因方面有出色的表现。我们采用edger(p《0.05)过滤筛选不同分组间的差异微生物。edger推荐根据cpm(count-per-million，每百万碱基中目标基因的read count值)值进行过滤，并使用cpm值为1作为标准，即当某个基因在read count最低的样本(文库)中的count值大于1(read count最低的样品count总数/1000000)，则保留。然后，将读取计数转换为log2-cpm(logcpm)，通过估计均值-方差关系计算出合适的观测级权
重，并进行线性建模。结果显示，患者中大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌、嗜酸乳杆菌、溶血葡萄球菌和乳酸乳球菌的相对丰度与健康儿童和未确诊对照组相比有显著差异(表1)。
[0140]
取以上两种筛选方式的交集(p值《0.01，mda值取前10位)，我们得到了几种与脑膜炎相关的差异微生物，这些代表性差异物种被认为是抗生素干预后的患儿区别于其他对照群体和的特征，可作为识别脑膜炎患者的生物标志物。本发明最重要的三种微生物是基于mda值排序和差异分析p值的交集筛选出来的，mda值是参考之一，除此之外，我们还参考了组间差异p值的排序，得出在血液和脑脊液分组中，重要性都较高的为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌。
[0141]
表1、基于随机森林和edger筛选出脑膜炎相关致病菌群
[0142][0143][0144]
mda：平均下降精度值；p：p值；血液组：nb和pb组间比较；csf：in和pc组间比较。
[0145]
表1的结果展示细菌性脑膜炎相关的代表性致病菌群，并且表1中的no.1、no.2、no.3代表该生物标志物平均下降精度值排序，即模型预测中的重要性排序。
[0146]
实施例4脑膜炎相关的微生物群与代谢途径相关
[0147]
研究表明，微生物失调可引起全身代谢紊乱。碳水化合物和氨基酸代谢功能在脑膜炎中占多数。肺炎球菌性脑膜炎的动物模型中产生大量活性氧(ros)、活性氮(rns)和过氧亚硝酸盐，这些过氧化物能够刺激细胞能量耗竭，进而导致大量脑膜炎症。基于之前的研究结果，我们猜想脑膜炎相关致病菌群是否有可能影响机体代谢相关通路，从而引起脑膜炎症。我们使用了交互式分析宏基因组数据综合分析工具megan6对数据进行eggnog功能注释。正常儿童和脑膜炎儿童血液样本中非人序列作为输入文件，使用megan6中的默认参数进行蛋白功能注释。从注释结果文件中提取差异菌群的比对结果，用于下游相对丰度评估。我们比较了差异菌群在不同通路中的富集比例，发现相比于细胞过程和信号传递、信息存储和处理通路，代谢功能相关的基因表达量在患者和正常对照中显著富集(图3 a and b，p＝0.00014,wilcoxon秩和检验)。
[0148]
值得注意的是，相较于氨基酸运输与代谢、核苷酸运输与代谢、碳水化合物运输与
代谢、辅酶运输与代谢、脂类运输与代谢、无机离子运输与代谢和次级代谢产物通路，绝大多数的细菌性脑膜炎相关致病菌群富集在能量生产和转换相关代谢途径中(图3.c,平均相对丰度:nb＝37.37％，pb＝95.75％)。这些发现提示，患者群体的特征致病菌群和机体代谢异常，尤其是能量产生和转化代谢途径紊乱显著相关。它们极有可能通过影响机体代谢功能异常，引起大量炎症，最终侵袭脑膜。
[0149]
实施例5差异致病菌群可作为临床分层的特定标志
[0150]
除了上述功能富集分析外，我们进一步探究目标致病菌群在不同群体中的分布差异。根据各物种的非冗余频数之和统计不同组内候选菌群的检出率。其中，大肠杆菌和肺炎克雷伯菌在患者群体的检出率明显高于正常儿童群体，溶血性葡萄球菌、嗜热菌和嗜酸乳杆菌只在患者群体出现(图4a)。用过比较差异致病菌群在患者和样本数量水平的检出阳性率，发现mngs的致病菌检出效率显著高于传统诊断方式。在患者数量层面，mngs阳性检出率为0.875(图4b，左侧组，组内右侧柱子)，常规方法阳性检出率仅为0.188(图4b，左侧组，组内左侧柱子)。在标本数量层面，mngs阳性检出率为0.758(图4b，右侧组，组内右侧柱子)，常规方法阳性检出率仅为0.194(图4b，右侧组，组内右侧柱子)。这些结果表明mngs具有相当的检测效率，可作为临床病原微生物检测方法的重要补充。
[0151]
为了进一步探究目标致病菌群在患者中的分布，我们检测了每个患者中每种目标致病菌的相对丰度(物种counts/差异致病菌群counts)。有趣的是，我们发现目标致病菌群的特定组合模式，且表现出一定的规律。脑膜炎患者中细菌的数量和种类明显不同(如pc03,p_10,p_22,pb08和pb29),但他们表现出一定的趋势,一些患者大肠杆菌为优势种，而其他肺炎克雷伯菌为优势种(如pc03,pb30,p_21,p_11:大肠杆菌占主导地位；pc01、pb05、pb08、pb13:肺炎克雷伯菌居多；图4c)。这些结果有力地表明，具有代表性的微生物群可以作为临床分层的标志。
[0152]
实施例6具有代表性的微生物群可以反映炎症状态和感染程度
[0153]
基于以上研究结果，我们尝试利用致病菌群在患者群体的规律性分布将患者群体分为不同亚群。幸运的是，我们在血液和脑脊液中确定了能够区分患者亚群的最最优代表致病菌群体。在患者血液中，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和嗜热菌的不同组合，基于k-means聚类算法能将患者分为四个不同的亚群(pb_red,pb_green,pb_blue,pb_purple；图5a).每个亚群的致病菌群组成模式通过所有患者中每种差异微生物的平均相对丰度(每个细菌的平均counts/候选致病菌群的平均counts数之和)进行评估。考虑到pb_blue(n＝1)和pb_purple(n＝2)的样品量较小，我们仅对pb_red和pb_green的微生物组成特征进行了详细分析。数据显示pb_red中的菌群特征(图5b，左；表s4)和pb_green(图5b右)差异显著，优势致病菌分别为大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。两个患者亚群的主要优势致病菌的占比总和分别达到总体的0.96(图5b，左，85％+11％)和0.99(图5b，右，87％+12％)。选取0.96为标准阈值，即主要致病菌占比达到生物标记集合的96％(0.96)即可考虑诊断为具有脑膜炎患病风险或患有脑膜炎。随后根据其中占比最高的物种类型区分细菌性脑膜炎的亚型，包括肺炎克雷伯菌占优势的细菌性脑膜炎和大肠杆菌占优势的细菌性脑膜炎。需要指出的是，所有患者亚群中，原始测序读数最小的微生物种需达到生物标记集合中所有物种读数之和的1％，即0.01。
[0154]
同样基于k-means聚类，脑脊液中的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜热菌、溶血性葡萄
球菌和嗜酸乳杆菌能够将患者分为四个不同的亚群(pc_red,pc_green,pc_blue,pc_purple；图5c)。此外，基于脑脊液的分析结果，未确诊患者(in)可将同一亚群的细菌性脑膜炎患者作为临床参考。采用相同的方法，以每种致病微生物的平均相对丰度评价各患者亚群的致病菌群组成模式。考虑到pc_red的样本量较小(n＝2)，我们仅详细分析了pc_green、pc_blue和pc_purple的细菌组成特征。数据显示pc_green(图5d，左侧饼图)、pc_blue(图5d，中间饼图)和pc_purple(图5d，右侧饼图)中的微生物特征有明显差异，分别以肺炎克雷伯菌为优势菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌同为优势菌、大肠杆菌为优势菌。三个患者亚群的主要优势致病菌的占比总和分别达到总体的0.99(图5d，左，99％)、0.99(图5d，中，51％+48％)和1(图5d，右，96％+4％)。结合之前的血液样品分析结果，仍旧以0.96为标准阈值，即主要致病菌占比达到生物标记集合的96％(0.96)即可考虑诊断为具有脑膜炎患病风险或患有脑膜炎。随后根据其中占比最高的物种类型区分细菌性脑膜炎的亚型，包括肺炎克雷伯菌占优势的细菌性脑膜炎和大肠杆菌占优势的细菌性脑膜炎。需要指出的是，所有患者亚群中，原始测序读数最小的微生物种需达到生物标记集合中所有物种读数之和的1％，即0.01。
[0155]
我们想知道不同的微生物组成特征是否与患者的临床状态相关。为了证实目标微生物群与患者感染状态的相关性，我们分别分析了其在血液和脑脊液中的分布模式与临床检验指标之间的潜在相关性(表2)。结果表明,和大肠杆菌为优势菌的患者亚群(左pb_red,图5b，左侧饼图)相比，优势致病菌为肺炎克雷伯菌的患者亚群的(pb_green,图5b，右侧饼图)血液c反应蛋白水平较高(图5e，crp)。有研究报道c反应蛋白作为一种重要的炎症介质,在脑膜炎儿童脑脊液中的特异性较高。这些结果表明，血液中致病菌群的不同组成模式可以反映患者的炎症程度。肺炎克雷伯菌的丰度越高，表明bm患者炎症程度越高。
[0156]
同样的,优势菌为肺炎克雷伯菌的患者亚群(pc_green，图5d，左侧饼图；pc_blue,图5d，中间饼图)脑脊液中的粒细胞比例(图5f)明显高于以大肠杆菌为优势致病菌的患者亚群(pc_purple,图5d，右侧饼图)。粒细胞包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，粒细胞比例增高一定程度上指征细菌感染趋向严重。因此，肺炎克雷伯菌占据优势提示严重感染，提示目标致病菌群的组成特征可作为细菌性脑膜炎患儿感染和炎症的指标。
[0157]
表2细菌性脑膜炎患者的临床病理特征
[0158][0159]
表2的结果表明细菌性脑膜炎患者的临床病理特征。
[0160]
前四行表示血液临床检测指标，它们分别是：
[0161]
blood_leukocyte：所能获得的第一次血液白细胞数；
[0162]
neutrophils(％)：血液中中性粒细胞比例；
[0163]
crp：血液中c反应蛋白水平：
[0164]
hemoglobin(g/l)：入院时血红蛋白浓度。
[0165]
后六行表示脑脊液临床检测指标，它们分别是：
[0166]
csf_leukocyte(
×
10^6/l)：所能获得的第一次脑脊液白细胞数量；
[0167]
csf_granulocyte(％)：脑脊液粒细胞比例；
[0168]
csf_monocyte(％)：脑脊液单核细胞比例；
[0169]
csfprotein(mg/l)：脑脊液蛋白质浓度；
[0170]
csf_glu(mmol/l)：脑脊液葡萄糖浓度；
[0171]
hts_score：hts系统评分。
[0172]
实施例7肺炎克雷伯菌为优势致病菌的患者，其血液具有和脑脊液相同的检测效力
[0173]
以上结果表明，标本中候选致病菌群的组成特征可以反映脑膜炎患儿的感染和炎症状态。我们想进一步探索血液是否具有与脑脊液相同的检测效力，即血液能否代替脑脊液作为临床病原微生物检测载体。接下来，我们以患者群体的血液分群结果(pb_green和pb_red，图6，左侧柱子)为参考，分析候选致病微生物菌群体在不同患者亚群中的分布一致性。结果显示，所有pb_green组(左上柱子)(n＝9,100％)的患者被分配到pc_blue组(右上)(n＝20)，这两组患者亚群的优势致病菌均为肺炎克雷伯菌。大多数以大肠杆菌为主的pb_red(左下，n＝17,76.47％)脑膜炎儿童被分配到pc_blue(右上，n＝20)和pc_purple(右下，n＝2)亚群；然而，pb_red中有4例(n＝17，-23.53％)归属于优势菌为肺炎克雷伯菌的pc_green(右中)群体。简言之，以肺炎克雷伯菌为主要差异菌的患者亚群，其血液和脑脊液的一致性为100％，而以大肠杆菌为主要致病菌的患者群体，其血液和脑脊液的一致性仅为52.94％。因此，以肺炎克雷伯菌为优势致病菌的患者群体的血液具有与脑脊液相同的检测效力。
[0174]
此外，本发明尝试了生物标志物的子集即两种主要致病菌进行患者分群，结果显示大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的组合可以将患者分为4个清晰的亚群(图7a)。其中一个患者亚群优势物种为大肠杆菌(图7b,左侧饼图)，其平均相对丰度为97.70％。另一患者亚群优势致病菌为肺炎克雷伯菌(图7b,右侧饼图)，其平均相对丰度为82.55％。一致的是，以肺炎克雷伯菌为优势病原菌的患者群体的c反应蛋白水平更高(图7c)，指示患者感染炎症程度相对更高。这些发现和大肠杆菌、肺炎克雷伯菌及嗜热菌组成的生物标志集合的分析结果一致。从主要患者亚群的区分结果来看，两种微生物集合(大肠杆菌和肺炎克雷伯菌)和三种微生物集合(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和嗜热菌)的分群相似度为90.32％，即有3例患者(pb06、pb07、pb19)的亚群分布出现变化，其他28例患者的分群结果无变化。因此可以得出，大肠杆菌和肺炎克雷伯菌两种生物标志集合的患者分群(脑膜炎分型)效果能达到三个物种集合分群效果的90.32％。
[0175]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可
以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。