一种应用鸡法氏囊原代细胞培养禽脑脊髓炎病毒的方法与流程

本发明创造属于生物
技术领域：
，尤其是涉及一种应用鸡法氏囊原代细胞培养禽脑脊髓炎病毒的方法。
背景技术：
：禽脑脊髓炎又称流行性震颤，是由小rna病毒科肠道病毒属的禽脑脊髓炎病毒引起的。该病主要危害4周龄以下雏鸡，引起雏鸡共济失调，头颈部快速振颤，产蛋鸡产蛋一过性下降且孵育后代发病等，给养禽业造成严重经济损失。禽脑脊髓炎病毒目前多采用卵黄囊接种6日龄spf鸡胚进行增殖，该方法可保证病毒滴度，但培养时间长，收获工艺繁琐，鸡胚质量不易控制，成本高等缺点给规模生产带来不便。部分文献报道该病毒可在鸡胚成纤维细胞，鸡肾细胞，鸡胚脑神经细胞上生长，但生长过程中不产生细胞病变且增殖后病毒滴度低，亦不利于规模化培养。因此，选取适于禽脑脊髓炎病毒增殖的细胞，不仅可提高病毒滴度且生产过程易于控制，培养时间短，成本低，有利于禽脑脊髓炎病毒的规模培养。技术实现要素：有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种应用鸡法氏囊原代细胞培养禽脑脊髓炎病毒的方法。为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：一种培养禽脑脊髓炎病毒的方法，所述方法中应用鸡法氏囊原代细胞作为体外培养体系，将鸡法氏囊组织按照组织细胞原代培养方法制备培养成原代细胞，向鸡法氏囊原代细胞接种预先制备的禽脑脊髓炎病毒种毒进行培养，接入后收获时经冻融即得禽脑脊髓炎病毒，制得的禽脑脊髓炎病毒的滴度达到106.5～7.0eid50/0.2ml。优选的，培养禽脑脊髓炎病毒过程中的细胞培养浓度为1×106/ml～6×106/ml，细胞维持液血清浓度为1％～3％。更优选的，培养禽脑脊髓炎病毒过程中的细胞培养浓度为2×106/ml～4×106/ml，细胞维持液血清浓度为2％～3％。优选的，所述禽脑脊髓炎病毒种毒的接种量为3％～9％。更优选的，所述禽脑脊髓炎病毒种毒的接种量为5％～7％。优选的，病毒收获时间为接种后1d～9d。更优选的，病毒收获时间为接种后3d～7d。优选的，所述鸡法氏囊原代细胞的制备方法包括如下步骤：无菌采集7～14日龄spf鸡法氏囊6个，加入适量pbs(ph＝7.0)，用无菌剪子将法氏囊剪碎，然后3000rpm，离心5min，弃去pbs，加入适量0.25％胰酶，37℃消化5～10min，将消化下来的细胞悬液用8层纱布过滤至装有6％新生牛血清的dmed/f12培养基中终止消化，将细胞轻轻吹打混匀，计数后接种于5％多聚赖氨酸预处理的细胞瓶中，37℃，5％co2培养箱中培养。优选的，上述培养禽脑脊髓炎病毒的方法中禽脑脊髓炎病毒种毒的制备方法包括如下步骤：将禽脑脊髓炎病毒vr株用pbs(ph＝7.0)溶解，然后脑内接种1日龄雏鸡，0.1ml/只，接种后观察21d，将出现共济失调，头颈部震颤的鸡只处死，无菌收集发病鸡脑，称重并加入适量pbs(ph＝7.0)制成20％的脑组织悬液，冻融3次后，4000rpm离心30min，吸取上清，卵黄囊接种6日龄鸡胚，0.2ml/枚，37℃孵育至16日龄，无菌收取胚体，称重，加入适量pbs(ph＝7.0)制成10％的组织悬液，-20℃保存备用，保存期为6个月，即为禽脑脊髓炎病毒种毒。本发明还提供一种上述的方法制备而得的禽脑脊髓炎病毒在制备禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗中的应用。相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：本发明创造所述的培养方法培养周期短，成本低，质量可控；培养后病毒滴度高。附图说明图1为不同细胞培养浓度和血清浓度对细胞生长的影响(图中a-l的细胞培养浓度依次为为1×106/ml、1×106/ml、1×106/ml、2×106/ml、2×106/ml、2×106/ml、4×106/ml、4×106/ml、4×106/ml、6×106/ml、6×106/ml、6×106/ml，血清浓度依次为1％、2％、3％、1％、2％、3％、1％、2％、3％、1％、2％、3％)。具体实施方式除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下面结合实施例来详细说明本发明创造。实施例1禽脑脊髓炎种毒制备：将禽脑脊髓炎病毒vr株(由天津瑞普生物技术股份有限公司空港经济区分公司提供)用pbs(ph＝7.0)溶解，然后脑内接种1日龄雏鸡，0.1ml/只，接种后观察21d，将出现共济失调，头颈部震颤的鸡只处死，无菌收集发病鸡脑，称重并加入适量pbs(ph＝7.0)制成20％的脑组织悬液，冻融3次后，4000rpm离心30min，吸取上清，卵黄囊接种6日龄鸡胚，0.2ml/枚，37℃孵育至16日龄，无菌收取胚体，称重，加入适量pbs(ph＝7.0)制成10％的组织悬液，-20℃保存备用，保存期为6个月。此即为禽脑脊髓炎病毒种毒。实施例2法氏囊原代细胞制备：无菌采集10日龄spf鸡法氏囊6个，加入适量pbs(ph＝7.0)，用无菌剪子将法氏囊剪碎，然后3000rpm，离心5min，弃去pbs，加入适量0.25％胰酶，37℃消化5～10min，将消化下来的细胞悬液用8层纱布过滤至装有6％新生牛血清的dmed/f12培养基中终止消化。将细胞轻轻吹打混匀，计数后接种于5％多聚赖氨酸预处理的细胞瓶中，37℃，5％co2培养箱中培养。实施例3不同细胞培养浓度和细胞维持液血清浓度对细胞生长的影响：取实验用细胞培养瓶(t25)12瓶，分别按照细胞培养浓度为1×106/ml、1×106/ml、1×106/ml、2×106/ml、2×106/ml、2×106/ml、4×106/ml、4×106/ml、4×106/ml、6×106/ml、6×106/ml和6×106/ml加入细胞，其血清浓度依次为1％，2％，3％，1％，2％，3％，1％，2％，3％，1％，2％和3％，然后每24h观察一次，记录细胞生长情况并拍照记录。详细结果见图1。从图1中可以看出，最佳细胞培养浓度2×106/ml～4×106/ml，最佳细胞维持液血清浓度为2％～3％。实施例4不同病毒接种量和收获时间对病毒效价的影响取实验用细胞培养瓶(t25)15瓶，按照细胞培养浓度2×106/ml，血清浓度2％接入细胞，接种后24h细胞形成单层，按照3％，5％，7％，9％比例分别接种5瓶细胞。4个接毒比例于接毒后1d，3d，5d，7d，9d分别收取1瓶细胞，冻融3次后用鸡胚法测其效价。详细结果见表1。从表1中的数据可以看出，最佳病毒接种量为5％～7％，最佳病毒收获时间为接种后3d～7d。表1不同病毒接种量和收获时间对病毒效价的影响实施例5比较细胞法和鸡胚法培养对病毒效价的影响鸡胚法：取6日龄spf鸡胚10枚，经卵黄囊接种20倍稀释的禽脑脊髓炎种毒，0.2ml/枚，37℃孵育至16日龄，无菌收取胚体，称重，加入适量pbs(ph＝7.0)制成10％的组织悬液，冻融3次后，-20℃保存备用。细胞法：使用实验用细胞培养瓶(t25)，按照细胞培养浓度2×106/ml，血清浓度2％接入细胞，接种后24h细胞形成单层，按照5％接毒比例接种禽脑脊髓炎种毒，接入后5d收获病毒，冻融3次后，-20℃保存备用。将两种禽脑脊髓炎病毒用鸡胚法测效价，详细结果见表2。从表2的数据可以看出，利用细胞法培养禽脑脊髓炎病毒的效价远高于现有技术中的鸡胚法培养，禽脑脊髓炎病毒滴度可达106.5～7.0eid50/0.2ml，较鸡胚培养的禽脑脊髓炎病毒滴度高100.5～1.0eid50/0.2ml。表2比较细胞法和鸡胚法培养对病毒效价的影响样品类别效价(/0.2ml)细胞法培养106.8eid50鸡胚法培养105.9eid50综上，本发明提供了一种应用鸡法氏囊原代细胞培养禽脑脊髓炎病毒的方法。该方法培养的禽脑脊髓炎病毒滴度高，培养周期短，成本低，质量可控，有利于禽脑脊髓炎病毒的规模培养。以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。当前第1页12