一种FZD7鼠源单克隆抗体及其制备方法和应用

一种fzd7鼠源单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种fzd7鼠源单克隆抗体及其制备方法和应用；特别是高效价的fzd7鼠源单克隆抗体，其制备方法和用途；本发明同时提供了该抗体的编码核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达该抗体的方法。


背景技术：

2.卷曲蛋白frizzleds(fzds)受体家族为g蛋白偶联受体(gpcr)f家族成员，有10个亚型，广泛表达于心血管系统等。已有报道证实fzds在肿瘤中的靶向作用。
3.frizzled7(fzd7)基因定位于染色体2q33，由574个氨基酸组成。其在黑色素瘤、肺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肝癌以及淋巴细胞白血病等均有高表达(khan ni等，br j haematol,2007,138:338-348)。研究证实，fzd7是多种癌症发生过程中必不可少的生物标记物(yang l等，oncogene,2011,30(43):4437-4446)，是体内潜在的癌症治疗靶点之一。
4.市面上暂无fzds相关药物上市，全球在研的fzds最高临床阶段为临床一期，为靶向wnt、fzds、β-catenin信号的多靶点药物vantictumab，并无特异性靶向fzd7的药物临床在研。因此，针对fzd靶点fzd7亚型开发单抗是十分必要的，具有重要医疗价值。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中缺乏有效的fzd7抗体药物的缺陷，提供一种fzd7鼠源单克隆抗体及其制备方法和应用。
6.本发明解决上述技术问题的技术方案如下。
7.本发明的技术方案之一为：一种fzd7鼠源单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如seq id no:1所示的氨基酸序列或与seq id no:1所示序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如seq id no:2所示的氨基酸序列或与seq id no:2所示序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
8.本发明所述的抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区；较佳地，所述重链恒定区的亚类为igg1，且所述轻链恒定区为kappa链。
9.在本发明一优选实施方案中，所述fzd7鼠源单克隆抗体靶向的目的蛋白含有如seq id no:3所示的氨基酸序列。
10.本发明中的所述fzd7鼠源单克隆抗体可存在于全长抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv、双特异性抗体或多特异性抗体中，即：其可为全长抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv、双特异性抗体或多特异性抗体的形式。
11.本发明中，术语“全长抗体”可互换地用来指包含由二硫键相互连接的至少两条重链(hc)和两条轻链(lc)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本发明中缩写为vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域ch1、ch2和ch3组成。每条轻链由轻链可变区(本发明中缩写为vl)和轻链恒定区(本发明中缩写为cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ。哺乳动物轻链分类为λ或κ。包含α、δ、ε、γ和μ重链的免疫球蛋
白分类为免疫球蛋白(ig)a、igd、ige、igg和igm。完全抗体形成“y”形状。y的茎由两条重链的第二和第三恒定区(并且对于ige和igm，第四恒定区)结合在一起组成，并且二硫键(链间)在铰链中形成。重链γ、α和δ具有由三个串联(成一行)ig结构域构成的恒定区，和用于增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域构成的恒定区。第二和第三恒定区分别称为“ch2结构域”和“ch3结构域”。y的每个臂包括结合到单个轻链的可变和恒定区的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。
12.本发明中，“fab片段”由一条轻链和一条重链的ch1及可变区组成。fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“fc”区含有包含抗体的ch2和ch3结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过ch3结构域的疏水作用保持在一起。“fab’片段”含有一条轻链和包含vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成f(ab’)2分子。“f(ab’)2片段”含有两条轻链和两条包含ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此f(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个fab’片段组成。术语“fv”意指向抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段，但缺少恒定区。
13.本发明中，所述的scfv(single chain antibody fragment，单链抗体)可为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。其中vl和vh结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子[参见，例如，bird等人，science 242:423-426(1988)和huston等人，proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988)]。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头由重复的g4s氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(g4s)4或(g4s)3接头，但也可使用其变体。
[0014]
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的抗体，其中该vh-vl单元具有多表位特异性；具有两个或多个vl和vh区的抗体，每个vh-vl单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双特异性抗体(diabodies)、和三抗体(triabodies)、共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
[0015]
在本发明一优选实施方案中，所述fzd7鼠源单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
[0016]
(1)构建表达载体以表达如seq id no:4所示fzd7基因的部分dna序列，得fzd7 linker蛋白；
[0017]
(2)使用步骤(1)所得的fzd7 linker蛋白免疫小鼠；
[0018]
(3)取免疫合格的小鼠，制备脾脏细胞悬液与sp2/0骨髓瘤细胞融合制成杂交瘤细胞；
[0019]
(4)腹水制备抗体。
[0020]
本发明的技术方案之二为：一种分离的核酸，其编码如技术方案之一所述的fzd7鼠源单克隆抗体。
[0021]
本发明的技术方案之三为：一种重组表达载体，其包含技术方案之二所述的分离
的核酸；优选地，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，所述病毒载体优选逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体；所述重组表达载体的骨架优选质粒pet28a-sumo。
[0022]
在本发明中术语“宿主细胞”可包括已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本发明包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。
[0023]
本发明的技术方案之四为：一种转化体，其在宿主细胞中包含如技术方案之三所述的重组表达载体。
[0024]
如本发明所用，“载体”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的dna或rna表达载体、包囊化于脂质体中的dna或rna表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。
[0025]
本发明的技术方案之五为：一种嵌合抗原受体，其包含如技术方案之一所述的fzd7鼠源单克隆抗体。
[0026]
本发明的技术方案之六为：一种基因修饰的细胞，其包含如技术方案之五所述的嵌合抗原受体；优选地，所述基因修饰的细胞为真核细胞，优选分离的人细胞；更优选免疫细胞如t细胞，或nk细胞。
[0027]
本发明的技术方案之七为：一种fzd7鼠源单克隆抗体的制备方法，其包含培养如技术方案之四所述的转化体，从培养物中获得fzd7鼠源单克隆抗体。
[0028]
本发明的技术方案之八为：一种抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及如技术方案之一所述的fzd7鼠源单克隆抗体；优选地，所述细胞毒性剂为mmaf或mmae。
[0029]
本发明的技术方案之九为：一种药物组合物，其包含如技术方案之一所述的fzd7鼠源单克隆抗体和/或如技术方案之八所述的抗体药物偶联物，以及药学上可接受的载体，所述药物组合物优选特异性靶向fzd7的癌症相关治疗药物；
[0030]
较佳地，所述药物组合物还含有由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
[0031]
在一些实施方案中，本发明的药物组合物或药物制剂包含合适的药学上可接受的载体例如药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。如本发明所用，“药学上可接受的载体”或“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“handbook of pharmaceuticalexcipients”,第五版,r.c.rowe,p.j.seskey和s.c.owen,pharmaceutical press,london,chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。这些组合物可以采用溶
液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体或其抗原结合片段与一种或多种任选的药用辅料(remington’s pharmaceutical sciences，第16版，osol，a.编(1980))混合来制备包含本发明所述的药物制剂或药物组合物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗感染活性成分，例如其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的抗体或其抗原结合片段的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
[0032]
本发明的技术方案之十为：如技术方案之一所述的fzd7鼠源单克隆抗体、技术方案之八所述的抗体药物偶联物和/或技术方案之九所述的药物组合物在制备诊断、预防和/或治疗特异性靶向fzd7相关癌症的药物中的应用；优选地，所述肿瘤为fzd7阳性肿瘤。
[0033]
本发明采用以下技术方案：
[0034]
一种能与fzd7特异性结合的鼠源抗体，其氨基酸序列来源于小鼠制备。
[0035]
抗fzd7的单克隆抗体制备方法：通过构建的pet28a-sumo表达载体免疫小鼠，转化并诱导表达。小鼠血清效价超过1:10000后，取小鼠脾脏制成脾细胞悬液，于sp2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，elisa筛选及亚克隆获得稳定分泌fzdt抗体的杂交瘤细胞株。将筛选出的杂交瘤细胞注射至石蜡油致敏的小鼠腹腔中，小鼠濒死前取腹水，腹水抗体经纯化后即为fzd7鼠源单克隆抗体。
[0036]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0037]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0038]
本发明的积极进步效果在于：
[0039]
本发明用来制备fzd7鼠源单克隆抗体的免疫原是利用基因体外合成，构建pet28a-sumo表达载体后，表达重组，经验elisa证为目标蛋白。抗体制备方法是基于杂交瘤细胞技术来制备单克隆抗体。体外sec结合实验和western blot验证结合均证实本发明所获得的fzd7鼠源单克隆抗体能与fzd7蛋白结合。活细胞结合实验也证实本发明所获得的fzd7鼠源单克隆抗体能与fzd7蛋白结合。推测本发明所获得的fzd7鼠源单克隆抗体具有临床开发价值。
附图说明
[0040]
图1为fzd7 dna模板的质粒图谱。
[0041]
图2为分析性分子筛实验峰图。
[0042]
图3为蛋白免疫印迹实验验证结合。
[0043]
图4显示流式细胞(facs)结合实验。
具体实施方式
[0044]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0045]
实施例1 fzd7 dna模板构建
[0046]
按照目的蛋白的表达基因(seq id no:4)，构建pet28a-sumo表达载体(图1)，表达fzd7 linker区域蛋白。
[0047]
实施例2杂交瘤细胞的制备
[0048]
1、动物免疫
[0049]
为获得靶向试别fzd7 linker蛋白的单克隆抗体，该发明选用实施例1所得表达蛋白作为抗原，免疫小鼠(6-8周balb/c小鼠，上海西普尔-必凯实验动物有限公司)。每只小鼠免疫2ml，首次免疫抗原与等量完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹腔注射。间隔两周取1ml免疫抗原与1ml不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹腔注射，共免疫四次。第三个免疫一周后小鼠眼眶静脉采血，收集血清，elisa检测小鼠血清效价。选定免疫四次的合格小鼠，腹腔注射40μg抗原，三天后进行细胞融合。
[0050]
2、elisa检验
[0051]
1)包被：抗原用cbs稀释至1μg/ml，加入酶标板，每孔100μl，4℃过夜；
[0052]
2)封闭：弃包被液，每孔加200μl封闭液(5％脱脂奶粉)，37℃放置1.5h；
[0053]
3)加样：弃封闭液，加入样品，每孔100μl，37℃放置1h；
[0054]
4)洗涤：洗涤液洗涤3次，拍干；
[0055]
5)二抗：酶标羊抗鼠用封闭液稀释至工作浓度，每孔100μl，37℃放置30min；
[0056]
6)洗涤：洗涤液洗涤3次，拍干；
[0057]
7)显色：每孔加入100μl tmb显色底物，37℃放置15min；
[0058]
8)终止：每孔加入50μl终止液；
[0059]
9)读数：酶标仪od450nm读数。
[0060]
3、细胞融合：按照本领域标准流程进行。
[0061]
3.1 sp2/0细胞收集：
[0062]
3.1.1收集50ml处于对数生长期，状态良好的sp2/0细胞，1200rpm离心5min；
[0063]
3.1.2弃上清，吸取1ml预热的融合剂(peg1450)并逐滴加至细胞，37℃水浴反应1min后加入终止液(25ml dmem培养基)，1200rpm离心5min。
[0064]
3.2融合板检测：
[0065]
3.2.1融合后每天观察96孔板中克隆的生长状况、有无污染，保证细胞正常生长；
[0066]
3.2.2待克隆团细胞数目达数百个以上后换液，每孔补200μl新鲜的ht培养基，置孵箱中培养(37℃，5％co2)；
[0067]
3.2.3 2天后换液，每孔吸100μl上清至包被的96孔酶标板板elisa检测；
[0068]
3.2.4 elisa检测出含细胞的阳性孔，弃孔内培养液并补200μl新鲜ht培养基，置孵箱中培养(37℃，5％co2)；
[0069]
3.2.5 2天后换液，elisa复检。复检阳性的孔，准备进行亚克隆。
[0070]
实施例3 fzd7鼠源单克隆抗体的制备
[0071]
1、腹水制备抗体
[0072]
1.1提前7天腹腔注射石蜡油到小鼠体内；
[0073]
1.2待杂交瘤细胞基本布满瓶底，细胞状态良好时收集细胞，1200rpm离心5min，腹腔注射入石蜡鼠体内(每只小鼠注射2
×
106细胞)；
[0074]
1.3每天观察小鼠状态，在小鼠濒死前颈椎脱臼处死，用手术剪剪开皮肤，撕开皮肤暴露腹膜，再在腹膜上剪一小口，用滴管将腹水吸出；
[0075]
1.4腹水3000rpm离心30min，取上清，分装冻存于-80℃，并取少量elisa检测腹水效价。
[0076]
2、抗体纯度鉴定
[0077]
2.1取1ml腹水，12000rpm离心4min，取上清加pbs稀释；
[0078]
2.2用10ml pbs平衡1ml柱体积的proteing柱，腹水上样过柱，收集流穿；
[0079]
2.3 pbs洗涤后，2.5ml 0.1m ph2.5甘氨酸溶液洗脱，洗脱液加入250μl 1m tris溶液(ph8.8)中和。
[0080]
2.4抗体洗脱液pbs透析过夜，elisa检测亲和力。
[0081]
elisa所用试剂如下：
[0082]
1)pbs(磷酸缓冲盐)液：
[0083]
①
pbs贮存液(10
×
)配法：
[0084][0085]
溶于100ml去离子水中，调节ph值至7.2。
[0086]
②
pbs使用液配法(1
×
)：
[0087]
取贮存液50ml加去离子水450ml即可，置室温或4℃保存备用
[0088]
2)抗原包被液(cbs，1
×
)：
[0089]
称取na2co
3 1.59g，nahco
3 2.93g，去离子水950ml，调节ph值至9.6，加去离子水定容至1000ml，4℃保存。
[0090]
3)封闭液
[0091]
称取5g脱脂奶粉，溶解于100ml pbs中，混匀，4℃保存备用(4℃保存不宜超过3天)
[0092]
4)tmb显色液
[0093]
①
tmb贮存液：称取tmb粉末，用dmso配成1.5mg/ml的贮存液，-20℃分装保存
[0094]
②
naac缓冲液：配制200mm的naac溶液，用hac调节ph值至5.3
[0095]
③
h2o2溶液：配制0.03％的h2o2溶液
[0096]
④
使用时按照tmb贮存液:naac缓冲液:h2o2溶液＝1:4:5的比例配制显色液，现配现用
[0097]
5)终止液(2m硫酸)
[0098]
将100ml浓硫酸缓慢加入900ml水中(注意：必须往水中滴加浓硫酸)，室温保存备
用
[0099]
具体操作如下：
[0100]
1)包被：将抗原用cbs稀释，一般为1μg/ml，加入酶标板中，每孔100μl，4℃过夜。
[0101]
2)封闭：将包被液弃去，每孔加入200μl封闭液，37℃放置1.5小时
[0102]
3)加入样本：弃去封闭液，加入样品(稀释的血清或者一抗)，每孔100μl加入酶标板，37℃放置1小时
[0103]
4)洗涤：自来水冲洗10次，拍干
[0104]
5)加入二抗：二抗用封闭液稀释至工作浓度，每孔100μl加入酶标板，37℃放置30分钟
[0105]
6)洗涤：自来水冲洗10次，拍干
[0106]
7)加入显色底物：每孔100μl加入酶标板，37℃放置15分钟
[0107]
8)加入终止液：每孔加入2m h2so
4 50μl
[0108]
9)读数：酶标仪od450 nm读数
[0109]
抗体elisa检测数据报告
[0110]
(1)融合小鼠elisa检测数据(小鼠三免检测结果)
[0111]
表1
[0112][0113]
elisa检测显示，3301-m1和3301-m3两个抗体检测值最高。所以选择这两组小鼠的脾脏细胞与sp2/0细胞融合，制备杂交瘤细胞。
[0114]
制备得到如下7种单抗。
[0115]
(2)腹水抗体elisa检测结果
[0116]
表2
[0117][0118]
实施例4抗体的体外结合测定
[0119]
1、分析型分子筛实验
[0120]
1)洗膜：在细胞匀浆器中，分别加入含蛋白酶抑制剂(cocktail，bimake)的低盐及高盐洗膜，35 000rpm离心保留沉淀。
[0121]
10
×
低盐溶液(ph7.4)：1l溶液中含100ml 1m hepes,20.3g mgcl2·
6h2o,14.9g kcl。
[0122]1×
高盐溶液(ph7.4)：5l溶液中含50ml 1m hepes,10.165g mgcl2·
6h2o,7.45g kcl,292.5g nacl。
[0123]
2)溶膜：沉淀用低盐溶液匀浆重悬后，加入20mg/ml碘乙酰胺孵育后，加溶膜溶液4℃孵育2h。
[0124]
2x溶膜溶液：1m hepes，5m nacl，2％ddm,0.4％chs。
[0125]
3)亲和层析：35 000rpm离心取上清，加入钴介质(co
2+
resin)和20mm咪唑，4℃孵育过夜。
[0126]
4)纯化：将集合膜蛋白的钴介质转移至纯化柱，依靠重力依次加入w1液和w2液移除与钴介质非特异性结合的杂蛋白。最后用elute液将膜蛋白从钴介质上洗脱下来，并收集到离心管中备用。
[0127]
w1液：50mm hepes ph7.4，500mm nacl，10％甘油，0.1％ddm，0.02％chs，20mm咪唑
[0128]
w2液：50mm hepes ph7.4，500mm nacl，10％甘油，0.005％ddm，0.001％chs，50mm咪唑
[0129]
elute液：50mm hepes ph7.4，500mm nacl，10％甘油，0.025％ddm，0.005％chs，50mm咪唑
[0130]
由昆虫系统表达膜蛋白，经洗膜、溶膜、亲和层析、纯化等步骤获得fzd7膜蛋白。取30μg fzd7膜蛋白与120μg 5#抗体(3301-05单抗)在4℃冰箱孵育过夜。使用nanofilm sec-250柱子(sepax)，利用蛋白质中所含芳香族氨基酸在紫外280nm处有吸收峰的特征来检查。结合实验使用agilent technology 1260 infinity仪器来检测fzd7膜蛋白和5#抗体(3301-05单抗)的结合情况。
[0131]
图2的分析型分子筛(analytic size-exclusive chromography，asec)显示，在同等量fzd7膜蛋白的情况下，与5#抗体(3301-05单抗)结合的fzd7膜蛋白曲线与单fzd7膜蛋白的曲线比较，明显有峰值的偏移。证明5#抗体(3301-05单抗)能在体外与fzd7膜蛋白结合。
[0132]
2、蛋白免疫印迹实验(western blot，wb)
[0133]
一抗：5#抗体(3301-05单抗)
[0134]
二抗：monoclonal anti-flag(r)m2 antibody produced in mouse 1mg/ml,clone m2,affinity isolated antibody,buffered aqueous solution(sigma)
[0135]
抽提fzd7膜蛋白，经sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，sds-page)后，电转膜(pvdf膜)，含5％牛奶的tbst溶液封闭，一抗孵育，洗膜(tbst溶液)，二抗孵育，洗膜(tbst溶液)，hrp显色，即可验证抗体与fzd7膜蛋白的结合情况(图3)，可见5#抗体(3301-05单抗)能与fzd7膜蛋白有效结合。
[0136]
3、流式细胞(facs)实验
[0137]
收集10
×
106个瞬时转染fzd7受体的293f/293t细胞(购自atcc)，加5#抗体(3301-05单抗)作一抗孵育30min，洗涤后加二抗(a31571 alexa647donkey anti-mouse igg(h+l)，1∶2 000)孵育30min，洗涤后上机检测(密理博guava)。阴性对照为仅加二抗。
[0138]
图4中的a、b和c用polyethylenimine、linear(pei、polysciences)瞬时转染fzd7质粒至293f细胞。其中，a显示，转染效率达63.6％。与仅加入二抗的对照b相比，加入5#抗体(3301-05单抗)和二抗后，在较强红色荧光(647)处可见细胞。暗示瞬时转染并表达fzd7的293f活细胞可以5#抗体(3301-05单抗)结合(图4中c)。
[0139]
图4中d、e用lipofectamine 2000(thermofisher)瞬时转染fzd7质粒至293t细胞。与对照d相比，瞬时转染并表达fzd7的293t活细胞可以5#抗体(3301-05单抗)结合(图4中的e)，结合效率达6.5％(图4中的f，594个细胞/9132个细胞)。