1.一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法,其特征在于:包括如下步骤:
s1、血液样本初次裂解:将血液样本中加入血液选择裂解液a和病原微生物助沉剂充分混匀后得到裂解物并使所述裂解物中的大分子有机物溶解,高速离心后弃除部分上清液,得到血液初次裂解样本;所述裂解物包括裂解的血细胞和未裂解但表面特性改变的病原微生物,所述血细胞包括红细胞和白细胞,高速离心沉降用于使所述病原微生物富集沉淀;
s2、血液样本再裂解:加入血液选择裂解液b使残留的大分子有机物进一步溶解,高速离心后弃除所述微生物助沉剂与水性溶液界面上的部分上清液,得到血液再次裂解样本;
s3、洗涤:加入洗涤液混匀后离心弃除部分上清液得到包含所述病原微生物的血液裂解样本,所述洗涤液用于清洗杂质;
s4、核酸提取:在所述血液裂解样本中加入核酸提取试剂,高速离心后弃除部分上清,将剩余溶液进行电裂解或加入不同粒径组合的研磨珠振荡后高温加热、离心,使所述病原微生物裂解并促使所述病原微生物中的核酸释放、溶解,得到病原微生物核酸样本。
2.根据权利要求1所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法,其特征在于:步骤s1中,所述血液选择裂解液a包括:浓度为10~100mm的缓冲液、质量体积百分比为0%~6.5%的辅助裂解盐、质量体积百分比为5%~65%的主要裂解盐、质量体积百分比为0%~5%的表面活性剂、浓度为0~10mm的螯合剂和体积百分比0%~0.5%的消泡剂,所述血液选择裂解液a的ph为4~8;
所述病原微生物助沉剂为不溶于水的生物惰性有机溶剂;
所述血液样本为1~10ml,加入所述血液选择裂解液a和所述病原微生物助沉剂后常温振荡混匀或常温颠倒混匀1~5分钟,所述血液选择裂解液a的用量为所述血液样本体积的0.5~5倍,所述病原微生物助沉剂的用量为所述血液样本体积的0.5%~5%。
3.根据权利要求1所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法,其特征在于:步骤s2中,所述血液选择裂解液b包括:浓度为10~100mm的缓冲液、质量体积百分比为0%~3%的辅助裂解盐、质量体积百分比为0%~40%的主要裂解盐、质量体积百分比为0%~2%的表面活性剂、浓度为0~10mm的螯合剂和体积百分比0%~0.5%的消泡剂,所述血液选择裂解液b的ph为5~8;
所述血液选择裂解液b的用量为所述血液初次裂解样本体积的2~10倍;
步骤s3中,所述洗涤液包括:浓度为10~100mm的所述缓冲液、质量体积百分比为0%~5%的促进杂质溶解盐和浓度为0~10mm的所述螯合剂,所述洗涤液的ph为5~9;
所述洗涤液的用量为所述血液再次裂解样本体积的5~10倍,所述洗涤液的使用方法为常温震荡混匀或常温颠倒混匀;
步骤s2、s3可重复多次。
4.根据权利要求1所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法,其特征在于:步骤s4中,所述核酸提取液包括:浓度为0.5~20mm的缓冲液、质量体积百分比为0~5%的促进核酸溶解盐、质量体积百分比为0.01%~5%的表面活性剂、浓度为0~3mm的螯合剂和体积百分比0%~0.5%的消泡剂,所述核酸提取液的ph为7~9;
所述表面活性剂为阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂;
所述核酸提取液的用量为所述血液裂解样本体积的5~10倍,所述电裂解使用mems加工的电裂解装置,所述研磨珠为粒径0.1~3mm的酸洗玻璃珠、氧化锆珠、石英砂中的一种或几种,所述研磨珠的用量为20~150mg、振荡时间为5~15分钟,所述高温加热的温度为85~100℃、加热时间为3~15分钟。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法,其特征在于:
所述缓冲液为以下任意一种:磷酸缓冲液、乙酸钠乙酸缓冲液和三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液;
所述辅助裂解盐、所述促进核酸溶解盐和所述促进杂质溶解盐为以下一种或多种:氯化钠、氯化钾和硫酸铵;
所述主要裂解盐为以下一种或多种:氯化锂、碘化钠、碘化钾、盐酸胍和异硫氰酸胍;
所述消泡剂为以下任意一种:聚二甲基硅氧烷、聚丙二醇、聚醚改性聚硅氧烷和聚氧丙烯甘油醚;
所述螯合剂为柠檬酸三钠;
所述阴离子表面活性剂为以下任意一种:十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠和脱氧胆酸钠,所述非离子表面活性剂为以下一种或多种:吐温20、吐温80、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇和十六醇聚氧乙烯醚brijc20;
步骤s1、s2、s3和s4中,离心转速为10000~16000×g,离心时间为1~5分钟。
6.一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取试剂,其特征在于:包括体积为血液样本0.5~10倍的血液选择裂解液a、体积为所述血液样本0.5%~10%的病原微生物助沉剂、体积为所述血液样本1~10倍的血液选择裂解液b、体积为所述血液样本1~10倍的洗涤液和体积为所述血液样本0.5~2倍的核酸提取液;
所述血液选择裂解液a和所述血液选择裂解液b用于仅裂解血细胞保留病原微生物并将所述血液样本中以及所述裂解血细胞中释放的大分子有机物进行溶解;所述病原微生物助沉剂用于使病原微生物富集沉淀;所述洗涤液用于清洗杂质,所述核酸提取液用于使所述病原微生物富集、裂解并促使所述病原微生物中的核酸释放和溶解;
所述血液选择裂解液a包括:浓度为10~100mm的缓冲液、质量体积百分比为0%~6.5%的辅助裂解盐、质量体积百分比为5%~65%的主要裂解盐、质量体积百分比为0%~5%的表面活性剂、浓度为0~10mm的螯合剂和体积百分比0%~0.5%的消泡剂,所述血液选择裂解液a的ph为4~8;
所述病原微生物助沉剂为不溶于水的生物惰性有机溶剂;
所述血液选择裂解液b包括:浓度为10~100mm的所述缓冲液、质量体积百分比为0%~3%的所述辅助裂解盐、质量体积百分比为0%~40%的所述主要裂解盐、质量体积百分比为0%~2%的所述表面活性剂、浓度为0~10mm的所述螯合剂和体积百分比0%~0.5%的所述消泡剂,所述血液选择裂解液b的ph为5~8。
7.根据权利要求6所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取试剂,其特征在于:所述洗涤液包括:浓度为10~100mm的所述缓冲液、质量体积百分比为0%~5%的促进杂质溶解盐和浓度为0~10mm的所述螯合剂,所述洗涤液的ph为5~9;
所述核酸提取液包括:浓度为0.5~20mm的所述缓冲液、质量体积百分比为0~5%的促进核酸溶解盐、质量体积百分比为0.01%~5%的表面活性剂、浓度为0~3mm的所述螯合剂和体积百分比0%~0.5%的所述消泡剂,所述核酸提取液的ph为7~9;
所述生物惰性有机溶剂为氟油或hfe-7500或novec7500或fc-40。
8.根据权利要求6或7任意一项所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取试剂,其特征在于:
所述缓冲液为以下任意一种:磷酸缓冲液、乙酸钠乙酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液;
所述辅助裂解盐、所述促进核酸溶解盐和所述促进杂质溶解盐为以下一种或多种:氯化钠、氯化钾和硫酸铵;
所述主要裂解盐为以下一种或多种:氯化锂、碘化钠、碘化钾、盐酸胍和异硫氰酸胍;
所述消泡剂为以下任意一种:聚二甲基硅氧烷、聚丙二醇、聚醚改性聚硅氧烷和聚氧丙烯甘油醚;
所述螯合剂为柠檬酸三钠;
所述表面活性剂为阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂。
9.根据权利要求8所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取试剂,其特征在于:所述阴离子表面活性剂为以下任意一种:十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠和脱氧胆酸钠,所述非离子表面活性剂为以下一种或多种:吐温20、吐温80、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇和十六醇聚氧乙烯醚brijc20。
10.根据权利要求9所述的一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取试剂,其特征在于:所述血液选择裂解液a包括20mm三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、质量体积百分比0.5%的氯化钾、质量体积百分比65%的异硫氰酸胍、质量体积百分比0.2%的十二烷基肌氨酸钠、10mm柠檬酸三钠和体积百分比0.02%的聚氧丙烯甘油醚,所述血液选择裂解液a的ph为7.0;
所述血液选择裂解液b包括20mm三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液,质量体积百分比0.5%的氯化钾、质量体积百分比30%的异硫氰酸胍、质量体积百分比的0.1%十二烷基肌氨酸钠、10mm柠檬酸三钠和体积百分比0.02%的聚氧丙烯甘油醚,所述血液选择裂解液b的ph为7.0;
所述微生物助沉剂为novec7500;
所述洗涤液包括10mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、质量体积百分比的0.9%氯化钠、质量体积百分比的10%硫酸铵和3mm柠檬酸三钠,所述洗涤液的ph为7.0;
所述核酸提取液包括10mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、质量体积百分比0.45%的氯化钠、质量体积百分比0.1%的十二烷基硫酸钠、质量体积百分比2%的吐温20、1mm柠檬酸三钠和体积百分比0.02%的聚氧丙烯甘油醚,所述核酸提取液的ph为8.8。