本发明涉及实验室生物安全领域，特别涉及一种四级生物安全实验室病毒化学淋浴消毒验证方法。
背景技术：
bsl-4实验室是防护水平最高的实验室，是国之重器，通常用于开展危险度1级微生物分离培养、诊断、鉴定、疫苗研发和评价等等研究工作。正压防护服是bsl-4实验室关键个人防护装备，正压防护服一般与生命支持系统一起使用，正压防护服内的正压差一般超过+100pa，这样既满足了实验人员的呼吸要求，也保证了实验人员的安全。
实验人员穿着正压防护服完成实验后要经过化学淋浴消毒后才能脱去正压防护服，才能保证实验室生物安全。
cnas-cl53:2004中第5.10.2项正压防护服表面(头部、前胸、后背、腋下、裤裆、脚底)消毒验证，所有样本的杀灭对数值均≥3。tcid50对数值≥3即可满足消毒要求。消毒技术规范2002版中2.1.2.9消毒剂对其它表面消毒模拟现场鉴定试验中评价规定试验重复3次，阳性对照组菌数符合要求，阴性对组无菌生长，所有样本的杀灭对数值均≥3.00，可判为消毒合格。
与此同时，在对正压服进行消毒验证时，由于正压防护服的材质一般为pvc，表面比较光滑，表面消毒验证点比较隐秘，有褶皱，病毒或者其他生物指示剂很难附着在其表面进行验证，没有办法真实的进行消毒验证实验，可能造成模拟实验误差较大。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种四级生物安全实验室病毒化学淋浴消毒验证方法，能够有效模拟四级生物安全实验室病毒化学淋浴消毒验证，实验结果可靠性高，可以充分保证实验室生物安全。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一种四级生物安全实验室病毒化学淋浴消毒验证方法，包括如下步骤：
(1)病毒原液制备
(2)病毒载体的制备：取适量事先配制好的粘附基质加至1.5*1.5cm的正方形载体上，后再加100ul上述病毒原液至表面，然后送入安全柜内干燥；
(3)化学淋浴：将干燥好的病毒载体粘粘在正压防护服头部、左腋下、前胸、后背、裤裆、右脚底、左手臂、右膝盖以及左膝盖位置处，同时设置阴性对照点；人穿着正压防护服进入化学淋浴间，按照化学淋浴程序进行化学淋浴消毒；
(4)采样、稀释待测病毒液以及接种培养：对经化学淋浴结束以后的病毒载体进行采样，并对所采样进行稀释，将稀释以后的样液进行接种培养；
(5)观察细胞病变、计数以及计算细胞病变率：对步骤(4)中接种培养后的病毒，在显微镜下面观察细胞病变率；计数以后计算lgtcid50；
其中，所述粘附基质为5％bsa+7％蛋白胨+20％黏蛋白，且1.5*1.5cm的正方形载体其材质与步骤(3)化学淋浴步骤中所穿的正压防护服材质相同。
优选的，所述步骤(1)中病毒原液制备具体流程为：将细胞接种于t75细胞培养瓶中，待形态良好、长成单层时，去除原始培养基，用pbs液洗3遍，每管加入病毒后放置在二氧化碳培养箱中孵育1h，每瓶加20ml维持液，细胞培养箱中培养，每日观测并记录细胞病变(cpe)，待cpe出现+++～++++号时，将细胞冻融1-2次，收集上清，离心，超滤，收集病毒上清液，即得病毒原液。
优选的，所述步骤(3)中化学淋浴消毒程序为消毒剂160s-暴露维60s-清水淋浴220s+洗刷辅助。
优选的，所述步骤(4)的具体过程为：
对步骤(3)的化学淋浴后的病毒载体进行采样，将各位置的载体取下分别放入一次性平皿内，转移至实验室核心间的生物安全柜内，将平皿内的病毒载体用消毒过剪刀将涂抹区域剪下，分别放入装有1.5mldmem缓冲液的离心管内，震荡混匀，然后将离心管内液体吸入到新的离心管中；
对上述采样的液根据接种的孔数进行稀释，每个稀释度接种4孔，每个稀释度配1000μl，即10-1为100μl加入900μl的孵育液中，以此类推，稀释至10-5；
将上述稀释后待测病毒液接种到96孔细胞培养板(60％-90％丰度)，细胞培养板用多道加样器吸去96孔板中的培养液，用pbs洗两次，将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度(10-5，10-4，10-3，10-2，10-1)以及原液加样，然后在摇床轻柔摇晃孵育1h，加入维持液(1％双抗+4％fbs的dmem培养基)100μl继续在37℃co2培养箱中培养。
优选的，所述接种培养的时间为5d。
优选的，所述震荡混匀的时间为30s-60s。
优选的，所述100ul病毒原液中含病毒超过106cfu。
优选的，所述病毒原液为新冠病毒、尼帕病毒或者是埃博拉病毒原液。
本发明的有益效果是：
(1)本发明将病毒原液滴加到含有粘附基质且与正压防护服相同pvc材质的载体上进行化学淋浴消毒验证，通过粘附基质能够将病毒液粘附在1.5*1.5cm的正方形载体上；该粘附基质不仅能将病毒粘附在光滑表面上，还能为病毒提供营养物质保证病毒的活性，在国标的要求下其能够真实模拟正压防护服的消毒效果。
(2)本发明操作简单易行，能够真实模拟四级生物安全实验室病毒化学淋浴消毒。该方法适用于covid-19、尼帕病毒、hiv以及埃博拉等高危险性的病毒在光滑表面的化学淋浴消毒，从而保证实验室生物安全。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
本实施例用于说明本发明针对病毒covid-19进行化学淋浴消毒验证方法，包括如下步骤：
(1)病毒原液制备：将veroe6细胞接种于t75细胞培养瓶中，待形态良好、长成单层时，去除原始培养基，用pbs液洗3遍，每管加入病毒后放置在二氧化碳培养箱中孵育1h，每瓶加20ml维持液，细胞培养箱中培养，每日观测并记录细胞病变(cpe)，待cpe出现+++～++++号时，将细胞冻融1-2次，收集上清，离心，超滤，收集病毒上清液，即得病毒原液；
(2)病毒载体的制备：取适量事先配制好的粘附基质加至1.5*1.5cm的正方形载体上，后再加100ul上述病毒原液至表面，然后送入安全柜内干燥1h；
(3)化学淋浴：将干燥好的病毒载体粘粘在正压防护服头部、左腋下、前胸、后背、裤裆、右脚底、左手臂、右膝盖以及左膝盖位置处，同时设置阴性对照点；人穿着正压防护服进入化学淋浴间，按照化学淋浴程序进行化学淋浴消毒；本实施例中化学淋浴消毒程序为消毒剂160s-暴露维60s-清水淋浴220s+洗刷辅助
(4)采样、稀释待测病毒液以及接种培养：对经化学淋浴结束以后的病毒载体进行采样，并对所采样进行稀释，将稀释以后的样液进行接种培养；
具体的，对步骤(3)的化学淋浴后的病毒载体进行采样，将各位置的载体取下分别放入一次性平皿内，转移至实验室核心间的生物安全柜内，将平皿内的病毒载体用消毒过剪刀将涂抹区域剪下，分别放入装有1.5mldmem缓冲液的离心管内，震荡混匀，然后将离心管内液体吸入到新的离心管中；
对上述采样的液根据接种的孔数进行稀释，每个稀释度接种4孔，每个稀释度配1000μl，即10-1为100μl加入900μl的孵育液中，以此类推，稀释至10-5；
将上述稀释后待测病毒液接种到96孔细胞培养板(60％-90％丰度)，细胞培养板用多道加样器吸去96孔板中的培养液，用pbs洗两次，将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度(10-5，10-4，10-3，10-2，10-1)以及原液加样，然后在摇床轻柔摇晃孵育1h，加入维持液(1％双抗+4％fbs的dmem培养基)100μl继续在37℃co2培养箱中培养。
(6)观察细胞病变、计数以及计算lgtcid50：对步骤(4)中接种培养后的病毒，培养5d后在显微镜下面观察细胞病变率；计数以后计算lgtcid50；
其中，特别地，本实施例中所述粘附基质为5％bsa+7％蛋白胨+20％黏蛋白，且1.5*1.5cm的正方形载体其材质与步骤(3)化学淋浴步骤中所穿的正压防护服材质相同。本实施例中通过粘附基质能够将病毒液粘附在1.5*1.5cm的正方形载体上；该粘附基质不仅能将病毒粘附在光滑表面上，还能为病毒提供营养物质保证病毒的活性，在国标的要求下其能够真实模拟正压防护服的消毒效果。
利用2％microchem-plustm复合季铵盐按照本发明中的方法对新冠病毒(sars-cov-2)进行化学淋浴消毒验证，在正压防护服上设置了1头部、2左腋下、3前胸、4后背、5裤裆、6右脚底、7左手臂、8右膝盖、9左膝盖设置阴性对照点，阳性对照设置3个重复，实验重复三次。其测定结果见下表所示：
表12％microchem-plustm复合季铵盐化学淋浴杀灭对数值(logtcid50/ml)
消毒技术规范2002版中2.1.2.9消毒剂对其它表面消毒模拟现场鉴定试验中评价规定试验重复3次，阳性对照组菌数符合要求，阴性对组无菌生长，所有样本的杀灭对数值均≥3.00，可判为消毒合格。cnas-cl53:2004中第5.10.2项正压防护服表面(头部、前胸、后背、腋下、裤裆、脚底)消毒验证，所有样本的杀灭对数值均≥3。tcid50对数值≥3即可满足消毒要求。本次消毒实验采用2％microchem-plustm复合季铵盐，消毒剂160s-暴露维60s-清水淋浴220s+洗刷辅助对新冠病毒(sars-cov-2)，其消毒效果指标均符合要求。
以上结合实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。