一种通过线粒体标记快速鉴别油松种群的方法

1.本发明属于植物分子鉴定技术领域，尤其涉及一种通过线粒体标记鉴别油松种群的方法。


背景技术：

2.油松pinus tabulaeformiscarr是我国特有并且是中国北方的主要针叶林树种，是我国北方广大地区最主要的造林树种之一，有着重要的生态和经济价值。为了使其能够在分布区稳定、健全地发展，其遗传改良研究工作一直处于有序开展状态，主要集中在种源试验，苗木繁育，造林技术，树木生理等方面。但是长期的野外实验和观察，耗时长也耗费人力物力。
3.另一种互补的方法是通过分子标记技术来鉴定种源，了解不同地理分布的油松的遗传变异。利用分子标记技术研究油松种质资源多样性也已有很多报道和研究，但是多集中在讨论油松的谱系遗传结构和分化历史。并且线粒体标记nad1-2、nad4-3和nad5-1，以及叶绿体基因片段rpl16和trns-trng反映的遗传变异水平低，其中nad1,nad4,nad5线粒体片段单独使用时只有2-4个单倍型，将这三个片段联合起来使用一共才有10个单倍型。分辨率低信息量小，很难定位古油松的起源地。相对的，简化基因组测序技术得到的核基因组提供的遗传变异的数据虽然分辨率高，但是测序经费相对较高，对数据分析也有较高的技术要求。
4.基于我们在油松的线粒体nad7区域发现了高变异水平，约是线粒休nad1,nad4,nad5片段单倍型总和的两倍，且分辨率达到基因组的水平，可以鉴定中国19个不同来源的油松种源的母本来源，却比基因组测序更加高效且低成本。
5.本发明应用线粒体nad7区域的分子标记，提供了一种分辨率高、快速且成本低的油松种源鉴定方法。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供油松线粒体nad7区域的pcr特异性扩增引物；本发明所要解决的另一技术问题是油松线粒体的nad7区域pcr扩增特异性引物的应用，具体涉及一种检测试剂盒。
7.本发明解决第一个技术问题采用的技术方案为：
8.用于鉴别油松种群的线粒体标记特异性引物，其上游引物核苷酸序列如seq id no.1所示，即：5
’‑
gagggacaaccctggaata-3’；其下游引物核苷酸序列如seq id no.2所示，即：5’aaggcctctccatttccaat-3’。
9.一种利用上述引物通过线粒体标记快速鉴别油松种群的方法，其特征在于：所述方法包括下列步骤：油松样品中的总dna的提取；pcr扩增；pcr产物电泳及染色，根据电泳结果判别油松种。
10.油松总dna提取方法，针叶保存在-20℃用以提取植物总dna。采用天根n96植物总
dna提取试剂盒提取dna。
11.所述pcr扩增，其pcr反应体系为：25μl的pcr反应体系中包括提取的dna溶液1μl,10nmol/l上游引物1μl、10nmol/l下游引物1μl，2.5mmol/l dntp2μl,10
×
pcr buffer2.5μl,taqdna聚合酶1u；
12.pcr反应程序为：98℃预变性3min，94℃变性30秒，69℃退火30秒，72℃延伸10分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环30次；最后再72℃延伸3min。
13.所述pcr扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，形成特定的单倍型条带。根据单倍型条带的长度即可油松种源进行鉴定。
14.本发明还提供了一种油松种源快速鉴定试剂盒，所述的试剂盒包含上述引物对。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
16.线粒体基因遗传稳定，易于扩增，进化速度快，适于作为分子标记物。本发明设计了特异性的引物，所述引物扩增效果良好，扩增出19个单倍型产物，且19个单倍型之间长度变异差性大，长度从786bp到1835bp不等，其分辨率达到基因组的水平，通过琼脂糖凝胶电泳就可以有效区别，无需测序便可达到鉴定的目的，节省了大量的人力，物力。可为后续油松人工林的种群溯源工作提供引物支撑和方法借鉴，将为推广油松种质资源的鉴定和利用，选择育种和杂交育种，提供有力工具和分析平台。
附图说明
17.图1为油松种群线粒体nad7-1单倍型的电泳图谱；
18.图2为油松样品及对照样品pcr产物凝胶电泳图；
具体实施方式
19.从2005年到2010年对油松进行了覆盖全分布区的大规模采样。在油松分布区一共收集到17个代表群体，每个群体选取8-20棵树，一共216个样本，取其针叶保存在-20℃用以提取植物总dna。采用天根n96植物总dna提取试剂盒提取dna后，进行pcr扩增和测序，得到不同单倍型，再将不同的单倍型再分别扩增，然后进行凝胶电泳，构建一个油松线粒体nad7-1单倍型的电泳参照图谱。
20.为了研究nad7-1在松属物种中的进化，我们对油松全分布区17个种群以及两个近邻种高山松和云南松分布区的23个种群和11个种群进行采样，并通过文献检索调查了其他物种中nad7-1的变异水平和变异方式。我们在油松的nad7-1区域发现了独特的高变异水平，与其他物种的变异相比，发现这种高变异(变异类型和变异数量)是在油松中是特有的。
21.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
22.实施例1
23.1、样品采集、油松总dna提取以
24.本实施例从保存在-20℃的17个群体中分别随机抽取2-3个个体，以其针叶提取总dna
25.油松总dna提取方法：采用天根n96植物总dna提取试剂盒提取dna。
26.2、nad7-1 pcr扩增、测序及组装
27.本实施例所用引物，由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成，其上游引物核苷酸序列如seq id no.1所示，即：5
’‑
gagggacaaccctggaata-3’；其下游引物核苷酸序列如seq id no.2所示，即：5’aaggcctctccatttccaat-3’。
28.在ptc-100(mj research inc.usa)上进行pcr扩增，其pcr反应体系为：25μl的pcr反应体系中包括提取的dna溶液1μl,10nmol/l上游引物1μl、10nmol/l下游引物1μl，2.5mmol/l dntp2μl,10
×
pcr buffer2.5μl,taqdna聚合酶1u；
29.pcr反应程序为：98℃预变性3min，94℃变性30秒，69℃退火30秒，72℃延伸10分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环30次；最后再72℃延伸3min。
30.扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳进行初步检测。所有产物条带都进行了割胶，采用gfx pcr dna and gel band purification kit(amersham pharmacia biotech,england)纯化回收。纯化产物直接用abi 3730automated sequencer(pe applied biosystems)测序。
31.测得序列用clustalx 1.81来进行比对，对比完后适当进行人工校对，得到不同的序列，即不同的单倍型。
32.将不同的单倍型进行凝胶电泳，构建一个油松种群线粒体nad7-1单倍型的电泳参照图谱，如图1所示，图中1～19分别对应19个油松种群线粒体nad7-1分子标记的电泳图谱，图谱的信息可根据研究的深入进行扩展。当待测样品的凝胶电泳图与油松线粒体nad7-1单倍型的电泳图谱对比出现在相当的条带时，可以判定待测样品具有那个单倍型，进而判断其所属种群。
33.实施例2
34.1、样品来源：
35.检测样品：共3个，从油松17个种群中随机抽取
36.对照样品：共7个，高山松23个种群和云南松11个种群中随机抽取
37.2、实验方法：
38.上述样品采用天根n96植物总dna提取试剂盒提取dna后，利用引物对进行pcr扩增，其上游引物核苷酸序列为：5
’‑
gagggacaaccctggaata-3’；其下游引物核苷酸序列为：5’aaggcctctccatttccaat-3’，扩增产物用1.5％的常规琼脂糖凝胶电泳检测。
39.3、实验结果
40.如图2所示，21，22，23为油松检测样品，其余为高山松和云南松对照样品。
41.通过nad7-1引物对扩增结果图谱可以看出：参试所有品种可以分为反应与不反应两大类群，反应的类群为检测样品，不反应类群为对照样品，由该引物pcr扩增结果可看出nad7-1引物对油松品种有着显著的特异性。
42.从有反应的类群条带可以看出，3个检测品种均扩增出各自独特的条带，条带21，条带22和条带23，由该引物pcr扩增结果的可以明显区分种源差别。
43.与为油松线粒体nad7-1单倍型的电泳图谱对比，可以通过扩增产物的长度及带型，确定检测样品所属的种源。图2中条带21与图1中条带13长度及带型相一致，由此可判断条带21所属样品的种群为图1中条带13所确定的种群；图2中条带22与图1中条带5长度及带
型相一致，由此可判断条带22所属样品的种群为图1中条带5所确定的种群；图2中条带23与图1中条带8长度及带型相一致，由此可判断条带23所属样品的种群为图1中条带8所确定的种群。
44.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。