一种可表达人源IgA1蛋白的鼠模型及其构建方法和应用

一种可表达人源iga1蛋白的鼠模型及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及人源化小鼠模型，尤其涉及人源化可表达人源iga1蛋白的小鼠模型及其构建方法和应用。


背景技术：

2.iga肾病(iga nephropathy,igan)是目前全球最常见的原发性肾小球疾病。根据来自于中国、韩国及日本的临床数据，在亚洲人群中，iga肾病约占所有肾小球疾病的30-40％。而在北欧和美国人群统计中，iga肾病约占所有肾小球疾病的25-30％。其中超过30％的患者会在发病10-20年后进展至终末期肾脏病(end-stage renal disease,esrd)，使得iga肾病成为引起青壮年尿毒症最常见的病因之一。
3.人源化抗体小鼠是开发全人源化抗体药物的核心工具动物，在iga肾病的发病机制和iga肾病模型研究、以及人源iga1抗体的发展和效价验证领域都具有很高的推广应用价值。
4.现有技术中，iga1小鼠的构建过程通常基于es同源重组技术，且将igha1基因替换了小鼠原有的igm重链区域，有免疫代偿机制，不能完全表现人源iga1的生理功能。例如，duchez等的工作(duchez,s.,et al.(2010)."premature replacement of mu with alpha immunoglobulin chains impairs lymphopoiesis and mucosal homing but promotes plasma cell maturation."proc natl acad sci u s a 107(7):3064-3069.)证明替代了igm的iga1蛋白主要表达在脾脏而非粘膜淋巴器官，igm成熟后再向粘膜募集，这与人iga1的主要分布在粘膜系统进行天然免疫的生理功能相悖，未获得完整意义上的人源iga1小鼠。
5.因此有必要通过新的构建方法提供一种可表达人源iga1蛋白的小鼠模型，用于iga肾和相关药物的研究。


技术实现要素：

6.鉴于上述背景，本发明提出的目的首先在于：提供一种小鼠模型，不仅能够有效表达重链为全人源iga1的免疫球蛋白，并且还能够实现人鼠杂合iga1抗体的生理完整性，保证小鼠体内人源iga1分子的功能性，进而更接近人iga1的天然性状。
7.本发明的目的还在于：提供构建所述鼠模型的方法，以及所述鼠模型在iga肾病相关领域的应用。
8.本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
9.首先，本发明第一个方面提供一种可表达人源iga1蛋白的小鼠模型，它是将人源igha1的基因序列整体导入小鼠igha基因区域、进而用人源iga1的重链区替代小鼠iga的重链区，从而表达带有o糖修饰的铰链区的人源iga1的小鼠；所述的人源iga1的序列整体是指人源igha1基因的全段，包含外显子和内含子。
10.本发明优选的小鼠模型方案中，导入所述小鼠igha基因区域的人源igha1的序列，
其核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.本发明优选的小鼠模型方案中，所述的导入是通过基因敲入的方式完成；进一步优选采用基于crispr/cas9基因编辑技术的基因敲入完成，由此可以将人源igha1基因定点敲入小鼠igha基因部分，以尽可能保证所得的鼠模型在人源iga1的同表达谱表达的同时，还会保持小鼠其它免疫球蛋白的稳定性和天然表达水平，更贴近iga1的粘膜抗体的生理功能。
12.在此基础上，本发明第二个方面提供一种构建所述可表达人源iga1蛋白的小鼠模型的方法，是采用基因定点敲入的方式，选择人源igha1基因组全序列作为敲入序列，以鼠igha基因序列作为目标替换序列，将人源igha1基因组全序列导入小鼠基因，经过常规鉴定、繁育得到可表达人源iga1蛋白的小鼠；所述的人源igha1基因组全序列中包含外显子和内含子。
13.本发明优选的所述构建方法，具体包括：
14.1.利用cas9/rna系统基因编辑技术，构建针对小鼠igha基因的grna，用于指导cas9蛋白在crrna引导序列靶标的特定位点剪切dna双链，得到cas9打靶载体；
15.2.制作供体载体(donor vector)，使donor vector携带靶位点同源臂及敲入元件，所述的敲入元件为人源igha1基因组全序列；将所述donor vector与步骤1得到的cas9打靶载体共同进行受精卵注射，cas9打靶载体切开小鼠igha基因的上游一号外显子和下游4号外显子，产生一个双链断点，将人源igha1基因组全序列通过同源重组的方式修饰入小鼠的igha基因位点；
16.3.将步骤2所得的注射后受精卵通过移植、代孕得到小鼠；
17.4.通过基因鉴定和可遗传性检测从步骤3得到的小鼠中筛选出合格的杂合子小鼠，即为可表达人源iga1蛋白的小鼠模型。
18.本发明优选的所述构建方法中，因为转入基因较大，步骤2所述的受精卵注射采用大量多次注射，优选进行至少两批次注射，每批次注射至少500枚胚胎，以保证阳性鼠的成功构建。
19.本发明优选的所述构建方法中，步骤2所述注射用的受精卵为c57bl/6jnju背景。
20.本发明优选的所述构建方法中，步骤4所述的基因鉴定包括pcr测序和插入序列的全长测序，可以进一步保证每一只向下繁育和留存精子的杂合子小鼠均具有完整且正确的插入序列。
21.此外，本发明第三个方面提供所述可表达人源iga1蛋白的小鼠模型作为实验材料在iga肾病的预防、诊断或治疗相关研究中的应用。
22.所述的iga肾病的预防、诊断或治疗相关研究优选包括以下任意一种研究：
23.人源iga1与肠道菌群相关的粘膜免疫过程的研究；
24.iga肾病的发病机制和iga肾病模型的研究；
25.人源iga1抗体的发展和效价验证；
26.iga1的o糖基化或n糖基化水平受粘膜免疫刺激的影响的研究；
27.人鼠杂合的iga1分子的免疫组库在不同刺激条件下的多样性的研究；
28.或者，
29.iga1分子在循环、肠道、脾脏的免疫复合物成分分析研究。
30.现有技术中，通常将人源igha1基因外显子筛选出来敲进小鼠体内，或通过同源重组技术将人源igha1基因插入小鼠的ighm基因。而本发明将人源igha1基因组的全序列(包含外显子和内含子)同时通过cas9/rna系统基因编辑技术定点替换小鼠体内igha基因。将所述人源igha1基因组的全序列整体敲入后，在可以获得iga1分子铰链区表达的同时还尽可能地保留了iga1抗体的基因信息，能够实现人鼠杂合iga1抗体的完整性，保证小鼠体内人源iga1分子的功能性，比现有常规的构建方法更加具有特异性，并更接近人iga1的天然性状。具体讲，本发明选取包含内含子的人源igha1基因组全序列替换小鼠igha基因组全序列可以最大程度保证鼠模型中iga1抗体的功能完整性和表达性；敲入方法选择cas9/rna系统基因编辑技术可以将人源igha1基因定点敲入小鼠igha基因部分，能尽量保证得到的小鼠模型除表达人源iga1之外还能保持小鼠其它免疫球蛋白的稳定性和天然表达水平，更符合iga1的生理功能。
31.总之，本发明的构建方法获得的小鼠模型能够表达人源iga1蛋白，通过rna和蛋白水平对f1代杂合子和n2代纯合子小鼠进行蛋白表达验证，表明本发明的f1代杂合子小鼠对人源iga1具有稳定的表达，比现有的其他转基因iga肾病小鼠模型具有显著的优势，能够最大程度地表现人iga1蛋白的生理功能，获得了意料不到的效果。
附图说明
32.图1为实施例1所述构建方法的基因敲入方案示意图。
33.图2是实施例1构建方法得到的f1代杂合子小鼠鉴定策略示意图。
34.图3是实施例1构建方法得到的f1代阳性鼠基因鉴定pcr鉴定电泳结果照片。
35.图4-图5是实施例1构建方法得到的f1代杂合子小鼠基因测序结果图。
36.图6是实施例1构建方法得到的f1代杂合子小鼠蛋白验证结果图。
具体实施方式
37.下面通过实施例结合附图进一步说明本发明。但本发明的技术方案涵盖的范围不限于所列举的实施例。
38.实施例1.
39.一种可表达人源iga1蛋白的小鼠模型，它是采用基因定点敲入的方式(敲入策略如图1所示)，选择人源igha1基因组全序列作为敲入序列，以鼠igha基因序列作为目标替换序列，将人源igha1基因组全序列导入小鼠基因得到重组质粒，将所得重组质粒注射入受精卵，经过常规鉴定、繁育得到的可表达人源iga1蛋白的小鼠；所述的人源igha1基因组全序列中包含外显子和内含子，其核苷酸序列如seq id no.1所示；所述小鼠模型按照以下方法构建：
40.1.利用cas9/rna系统基因编辑技术，针对c57bl/6jnju品系小鼠的igha基因(核苷酸序列如seq id no.6所示)构建grna(核苷酸序列如下表1和seq id no.2-seq id no.5所示)用于指导cas9蛋白在crrna引导序列靶标的特定位点剪切dna双链，得到cas9打靶载体；
41.表1
42.[0043][0044]
2.制作donor vector，使donor vector携带靶位点同源臂及敲入元件，所述的敲入元件为人源igha1基因组全序列(核苷酸序列如seq id no.1所示)；
[0045]
3.将步骤2所得donor vector和步骤1得到的cas9打靶载体共同注射入受精卵，受精卵为c57bl/6jnju背景，分两批次注射，每批次注射500枚胚胎；如图1所示，cas9蛋白切开小鼠igha基因的上游1号外显子和下游4号外显子，产生一个双链断点，这个断点会被大小约为5.2kb的igha1基因通过同源重组的方式修饰入小鼠的igha基因位点；
[0046]
4.将步骤3所得经注射的受精卵进行移植、代孕，得到编号为1-230的230只小鼠；
[0047]
5.对4得到的230只小鼠剪取部分鼠尾通过pcr扩增并对扩增产物做dna测序来选择阳性基因型小鼠，引物序列如下表2和seq id no.7-seq id no.12所示：
[0048]
表2
[0049]
①
5'armf1-5tf1aatgagctgggttgagctgaac(seq id no.7) r1-5tr1cccagcaacatggtttctgaac(seq id no.8)
②
3'armf2-3tf1gttcacagactctgaatgaggagac(seq id no.9) r2-3tr1atacatcaagagatccagtggcag(seq id no.10)
③
wtf3 wt-tf1atggctggctacaaggatgaac(seq id no.11) r3 wt-tr1agaagagtttgaacccaaggctc(seq id no.12)
[0050]
经过上述基因鉴定，得到3只阳性小鼠，即为f0代阳性小鼠。
[0051]
6.对5得到的f0代阳性小鼠进行可遗传性检测鉴定，鉴定策略如图2所示，pcr鉴定结果如图3所示，测序结果如图4和图5所示，得出编号为1、2、6、8和12的小鼠为f1代杂合子小鼠。
[0052]
7.通过rna和蛋白水平对6得到的f1代杂合子小鼠及n2代纯合子小鼠进行蛋白表达验证，结果表明本发明构建的小鼠模型能够稳定地表达人iga1。
[0053]
因此，本实施例的小鼠模型能够作为药物动力学验证模型和药物发现模型用于人iga肾病治疗或诊断药物的研发。
[0054]
对比例1.
[0055]
按照duchez等(duchez,s.,et al.(2010)."premature replacement of mu with alpha immunoglobulin chains impairs lymphopoiesis and mucosal homing but promotes plasma cell maturation."proc natl acad sci u s a 107(7):3064-3069.)公开的方法，将人源igha1全长基因转入小鼠替代小鼠igm基因，构建转基因鼠模型。检测结果如该文献中的图2(fig.2)所示，浆细胞正常分布于脾脏边缘区和红髓，肠黏膜固有层沿肠隐窝分布。表达α基因的细胞只能在脾浆细胞库中检测到，而在黏膜相关淋巴组织中几乎没有表达，这表明在微环境的影响下，igm+细胞优先进入黏膜相关淋巴组织，局部发生免疫球蛋白类别转换至iga。证明了替代鼠igm基因的iga1蛋白主要表达在脾脏而非粘膜淋巴器官，igm成熟后再向粘膜募集，这与人iga1的生理功能相悖，因此该方法未获得完整意义上
的人源iga1小鼠。
[0056]
对比例2.
[0057]
按照low等(low,b.e.,et al.(2020)."functional humanization of immunoglobulin heavy constant gamma 1fc domain human fcgrt transgenic mice."mabs 12(1):1829334.)公开的方法，将鼠ighg1铰链区(2号外显子)、ch2(3号外显子)和ch3(4号外显子)区域替换成人对应区域的人源基因，也就是向鼠转入人源ighg1非全序列基因(其中人源ighg1基因的可变区域未转入，即只将人源ighg1基因的ch2、ch3插入，而模型的ch1区域依然保留小鼠的基因序列)，构建转基因鼠模型(参见该文献中的fig.1)。检测结果如该文献中的图2(fig.2)所示，由于该文献中的背景小鼠本身已经为人源抗体药物药物动力学的模型鼠，引入不完全转化的人源igg1后，依然不能改变此功能，并只能进一步加强该模型。总结而言，即该文献中得到的人源化igg1的模型，只能作为药物动力学验证模型，而不能作为药物发现模型。
[0058]
除非特殊定义，本发明描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。
[0059]
除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可按照本领域公知的技术和方法进行。