一种水稻内生真菌稻镰状瓶霉的工厂化液体发酵培养基及培养方法

一种水稻内生真菌稻镰状瓶霉的工厂化液体发酵培养基及培养方法
【技术领域】
1.本发明涉及稻镰状瓶霉的技术领域，特别是一种水稻内生真菌稻镰状瓶霉的工厂化液体发酵培养基及培养方法的技术领域。


背景技术：

2.植物内生真菌是指至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物组织中，宿主无明显病症的一类真菌(wilson d,1995.endophyte
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the evolution of a term,and clarification.oikos,73:274
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276)，其普遍存在于各种植物中，与宿主植物保持着协同进化和互惠共生等多种共生关系。植物内生真菌从寄主植物中获取水分和矿物营养等生长所需的养分(usuki f,narisawa k,2007.a mutualistic symbiosis between a dark septate endophytic fungus,heteroconium chaetospira,and a nonmycorrhizal plant,chinese cabbage.mycologia,99:175
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184)，同时赋予寄主植物丰富多样的生物学功能，可促进植物生长、提高植物生物量、增强寄主植物抗生物和非生物胁迫能力(arnold ae,mej
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a lc,kyllo d,rojas ei,maynard z,robbins n,herre ea,2003.fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree.proceedings of the national academy of sciences of usa,100:15649
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15654)。
3.稻镰状瓶霉(falciphora oryzae)，菌株标号为a20
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1(cctcc no：m 2020201)，是从疣粒野生稻根部分离的一株内生真菌。盆栽试验表明，稻镰状瓶霉根部定殖能够显著提高水稻叶宽、茎秆直径、植株鲜(干)重、叶绿素含量和光合强度等多种农艺性状指标，通过上调表达营养元素吸收相关基因，促进根系对营养元素的吸收，进而促进水稻植株生长(苏珍珠，冯晓晓，汪彦欣，刘小红，章初龙，林福呈.稻镰状瓶霉促进水稻生长的机制，菌物学报，2019，38(11)：2007
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2015)。稻镰状瓶霉菌株还能够诱导水稻产生系统抗病性，抵抗稻瘟病菌的叶部侵染(su zz,mao lj,li n,feng xx,yuan zl,wang lw,lin fc,zhang cl,2013.evidence for biotrophic lifestyle and biocontrol potential of dark septate endophyte harpophora oryzae to rice blast disease.plos one,8:e61332)；稻镰状瓶霉田间对水稻苗叶瘟的防效达到70％以上，可用于稻瘟病防治(王国迪，陈瑞，汪彦欣，冯晓晓，章初龙，林福呈.内生真菌稻镰状瓶霉对直播稻稻瘟病的防治效果，中国稻米，2019，25(4)：68
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69)。苏珍珠等(2019)还发现稻镰状瓶霉对水稻白叶枯病的防治效果高达80.75％(苏珍珠，冯晓晓，汪彦欣，刘小红，章初龙，林福呈.稻镰状瓶霉对水稻白叶枯病的生物防治，菌物学报，2019，38(6)：802
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810)。此外，申请号为201410068912.2的专利申请中公开了稻镰状瓶霉具有降低烟草中重金属镉含量的用途，而申请号为201910044093.0的专利申请中公开了稻镰状瓶霉在防治水稻白叶枯病中的应用。
4.基于水稻内生真菌稻镰状瓶霉的生物学作用，特别是对水稻重要病害的生物防治，建立稻镰状瓶霉的工厂化液体发酵培养基配方及培养方法，具有重要的经济效益和社会效益。


技术实现要素：

5.本发明针对水稻内生真菌稻镰状瓶霉的生物学功效，尤其是对水稻稻瘟病等生物防治上的现实作用，提供了一种水稻内生真菌稻镰状瓶霉的工厂化液体发酵培养基及培养方法，从而解决水稻生产过程中病害防治的难题。
6.为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
7.一种水稻内生真菌稻镰状瓶霉的工厂化液体发酵培养基，包括重量比例为3～5g/l的葡萄糖、3～5g/l的黄豆饼粉、8～12g/l的玉米粉、0.3～0.5g/l的蛋白胨、0.5～1g/l的酵母粉、0.5～1.5g/l的稻秆提取物、0.5～1g/l的磷酸二氢钾以及0.3～0.5g/l的硫酸镁，剩余为水。
8.作为优选，包括重量比例为3g/l的葡萄糖、3g/l的黄豆饼粉、10g/l的玉米粉、0.3g/l的蛋白胨、0.5g/l的酵母粉、0.5g/l的稻秆提取物、1g/l的磷酸二氢钾以及0.5g/l的硫酸镁，剩余为水。
9.作为优选，包括重量比例为4g/l的葡萄糖、4g/l的黄豆饼粉、10g/l的玉米粉、0.4g/l的蛋白胨、0.8g/l的酵母粉、0.5g/l的稻秆提取物、1g/l的磷酸二氢钾以及0.5g/l的硫酸镁，剩余为水。
10.作为优选，包括重量比例为4g/l的葡萄糖、4g/l的黄豆饼粉、10g/l的玉米粉、0.4g/l的蛋白胨、0.8g/l的酵母粉、1g/l的稻秆提取物、1g/l的磷酸二氢钾以及0.5g/l的硫酸镁，剩余为水。
11.一种水稻内生真菌稻镰状瓶霉的培养方法，包括如下步骤：
12.a)培养基的制备：称取重量比例为3～5g/l的葡萄糖、3～5g/l的黄豆饼粉、8～12g/l的玉米粉、0.3～0.5g/l的蛋白胨、0.5～1g/l的酵母粉、0.5～1.5g/l的稻秆提取物、0.5～1g/l的磷酸二氢钾以及0.3～0.5g/l的硫酸镁，剩余为水，混匀并灭菌，得到工厂化液体发酵培养基；
13.b)母种制备：将常温活化后的稻镰状瓶霉菌株菌种在无菌条件下接种于斜面培养基中进行培养，再将制备好的稻镰状瓶霉菌种斜面洗下，并接种至液体培养基之中进行培养，得到种子液；
14.c)菌种培养：将步骤b)中所制备的种子液接种至步骤a)中所制备的工厂化液体发酵培养基之中进行培养，得到稻镰状瓶霉菌球。
15.作为优选，所述步骤a)中，灭菌温度为121～126℃，灭菌压力为0.12～0.15mpa，灭菌时间为2～4h。
16.作为优选，所述步骤b)中，斜面培养时，培养温度为23～28℃，培养时间为72～96h，稻镰状瓶霉菌种斜面接种于液体培养基之中的接种量为0.5～1.5％，液体培养基为pda液体培养基，液体培养时，搅拌速度为100～200rpm，培养时间为10～14h。
17.作为优选，所述步骤c)中，采用摇瓶培养方式，种子液接种至工厂化液体发酵培养基之中的接种量为3～5％，培养温度为23～28℃，振荡速度为150～210rpm，培养时间为6～8天。采用该方法培养后，稻镰状瓶霉菌球细密，菌球生物量干重可达5g/l以上。
18.作为优选，所述步骤c)中，采用发酵罐培养方式，种子液接种至工厂化液体发酵培养基之中的接种量为0.2～0.6％，发酵罐通气为1：0.3～0.5，维持罐压为0.01～0.05mpa，发酵温度为23～28℃，发酵周期为10～14d。采用该方法培养后，稻镰状瓶霉菌球致密，大小
均一，菌球生物量干重达4.0千克/1000l以上。
19.本发明的有益效果：
20.1)采用本发明所提供的优化后的培养基及培养条件对菌株a20
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1进行摇瓶发酵试验，菌球生物量较现有技术中同一菌株的发酵水平显著提升，且培养基原料成分常规，配置方便，成本低廉，发酵条件可控，简单易行；
21.2)适合工厂化生产，生产成本低，操作简便，条件可控，效率高，适合于稻镰状瓶霉菌的产业化应用。
22.本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
23.图1是不同培养基的稻镰状瓶霉的生长状态示意图；
24.图2是不同培养基对稻镰状瓶霉液体发酵生物量的影响示意图；
25.图3是接种量对大型发酵罐(1000l)发酵稻镰状瓶霉菌生物量的影响示意图。
26.图中：a
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1号培养基、b
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2号培养基、c
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3号培养基、d
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对照培养基。
【具体实施方式】
27.稻镰状瓶霉菌株a20
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1由浙江大学水稻生物学国家重点实验室分离自野生稻根系，于2020年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：m 2020201。
28.实施例一、液体发酵培养基的筛选：
29.一种水稻内生真菌稻镰状瓶霉的工厂化液体发酵培养基，包括重量比例为3～5g/l的葡萄糖、3～5g/l的黄豆饼粉、8～12g/l的玉米粉、0.3～0.5g/l的蛋白胨、0.5～1g/l的酵母粉、0.5～1.5g/l的稻秆提取物、0.5～1g/l的磷酸二氢钾以及0.3～0.5g/l的硫酸镁，剩余为水。
30.申请人在前期发酵试验研究中发现，葡萄糖3～5g/l，蛋白胨0.3～0.5g/l，酵母粉0.5～1g/l，稻秆提取物0.5～1.5g/l，均可影响菌体的生长，并初步筛选了几个有利于菌体生长的培养基组合进行摇瓶发酵培养，并与专利申请201910044093.0提供的培养基进行对比，为培养基的进一步优化提供依据，供试4种发酵培养基如下：
31.1号培养基：
32.重量比例为3g/l的葡萄糖、3g/l的黄豆饼粉、10g/l的玉米粉、0.3g/l的蛋白胨、0.5g/l的酵母粉、0.5g/l的稻秆提取物、1g/l的磷酸二氢钾以及0.5g/l的硫酸镁，剩余为水。
33.2号培养基：
34.重量比例为4g/l的葡萄糖、4g/l的黄豆饼粉、10g/l的玉米粉、0.4g/l的蛋白胨、0.8g/l的酵母粉、0.5g/l的稻秆提取物、1g/l的磷酸二氢钾以及0.5g/l的硫酸镁，剩余为水。
35.3号培养基：
36.重量比例为4g/l的葡萄糖、4g/l的黄豆饼粉、10g/l的玉米粉、0.4g/l的蛋白胨、0.8g/l的酵母粉、1g/l的稻秆提取物、1g/l的磷酸二氢钾以及0.5g/l的硫酸镁，剩余为水。
37.对照培养基：
38.重量比例为4g/l的黄豆饼粉、10g/l的玉米粉、1g/l的磷酸二氢钾以及0.5g/l的硫酸镁，剩余为水。
39.将上述培养基按比例分别溶解于水中，自然ph，混匀并灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌压力为0.12～0.15mpa，灭菌时间为0.5h。待物料冷却至22～28℃后，在所得到的工厂化液体发酵培养基之中按3％的接种量接入母种，再将接种后的摇瓶置于恒温摇床中进行培养，培养温度为25℃，振荡速度为180rpm。试验重复3次，7天后取样并收集菌球，于50℃干燥称重。
40.其中，母种的制备方式为，将稻镰状瓶霉菌株r5
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1菌种经常温活化后，在无菌条件下接种于斜面培养基中进行培养，在25℃培养箱培养72～96h后，得到稻镰状瓶霉菌种斜面，再将制备好的稻镰状瓶霉菌种斜面用50ml无菌水洗下，并按1％的接种量接种至pda液体培养基之中150rpm培养12h，得到种子液。
41.参阅图1和图2，结果表明，采用3号培养基发酵获得的稻镰状瓶霉菌生物量干重4.68g/l。后期的发酵条件优化在3号培养基基础上进行。
42.实施例二、摇瓶发酵条件的优化：
43.采用实施例一所筛选出的3号培养基进行摇瓶培养，统一采用1000ml锥形瓶按600ml装液量进行摇瓶试验，研究接种量(3％、4％和5％)、转速(120rpm、150rpm和180rpm)、培养温度(23℃、25℃和27℃)对稻镰状瓶霉菌液体发酵生物量的影响。
44.参阅下表1和表2，结果发现，在接种量4％、转速150rpm和培养温度25℃条件下培养7天，稻镰状瓶霉菌干生物量可达5.26g/l。
45.表1正交试验的因素与水平
[0046][0047]
表2接种量、转速或培养温度对生物量的影响
[0048][0049]
实施例三、稻镰状瓶霉菌工厂化大型发酵罐(1000l)发酵方法：
[0050]
采用实施例一所筛选出的3号培养基和实施例二所筛选出的最佳配方，在大型发酵罐(1000l)上进行5次以上发酵试验，确定最佳发酵工艺。接种量分别为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％和0.6％，每个试验三个重复，发酵罐通气为1：0.4，维持罐压0.05mpa，发酵温度为25℃，发酵周期为12天。
[0051]
试验结果表明，随着接种量的增加，稻镰状瓶霉菌干生物量逐渐升高，但接种量超过0.4％以上，增加幅度减少。为了节约菌种使用量，降低生产成本，工厂化发酵选用0.4％的接种量。当采用以上工艺参数时，发酵获得稻镰状瓶霉菌球致密，大小均一，菌球生物量干重可达4.2千克/1000l。
[0052]
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。